CN103254447A

CN103254447A - 含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN103254447A
Application number: CN2012102798040A
Authority: CN
Inventors: 张飞; 李森; 张洪斌
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-08-08
Filing date: 2012-08-08
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明涉及一透明质酸凝胶及其制备方法，尤其是采用冷冻解冻方法制备的含有多羧基小分子的透明质酸物理凝胶。将透明质酸配成不同浓度的水溶液，然后将不同含量的多羧基小分子加入的溶液中，完全溶解后再调节其pH值至3.0以下，经一次或多次冷冻解冻循环形成含有多羧基小分子的透明质酸冷冻解冻凝胶。特定多羧基小分子可以参与凝胶的形成，在一定浓度范围内可以提高凝胶力学强度和抗降解性能。本发明不添加任何具有生物毒性的交联剂，具有良好的生物相容性。

Description

含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一透明质酸凝胶及其制备方法，尤其是采用冷冻解冻方法制备的含有多羧基小分子的透明质酸物理凝胶。

背景技术

透明质酸 (Hyaluronan，简称HA)是一种天然聚阴离子粘多糖，由D-葡萄糖醛酸（glucuronic acid）和D-N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine）以β-1，4和β-1，3糖苷键交替连接而成。透明质酸几乎存在于所有的哺乳动物体中，通常以盐的形式存在。在人体内HA分布广泛，例如在眼玻璃体、关节液、脐带和皮肤中均存在较高浓度的HA，肺、肾脏、大脑和肌肉组织里也发现有HA的存在。透明质酸因具有独特、多样化的理化性质和生理功能而广泛应用于生物医药等领域。但是透明质酸易降解、在组织中停留时间短的特点在很大程度上限制了其医学应用。因此对透明质酸进行化学或者物理改性，以提高其抗降解性能显得尤为重要。

化学交联是提高透明质酸抗降解能力最常用的方法。公开号为CN1774450A的中国专利申请公开了采用1，4-丁二醇二环氧甘油醚作交联剂制备透明质酸凝胶的方法。公开号为CN102226009A的中国专利报道了采用二乙烯基砜先与聚乙二醇结合成新的交联剂制备化学交联透明质酸凝胶的方法。公开号为CN101759881A的中国专利采用环氧化物、醛等作为化学交联剂制备了HA凝胶颗粒。公开号为CN101153061中国专利采用缩水甘油醚类交联剂对透明质酸进行二次交联，制备出了含交联剂的残留相对较少的HA凝胶。张文强，黄岳山等人（张文强，黄岳山，材料导报，2010（24）：91-93）采用三偏磷酸钠对透明质酸进行交联，制备出了化学交联透明质酸凝胶薄膜，改善了透明质酸的耐降解性能，提高了聚合物在体内的留存时间。虽然采用化学交联的透明质酸的分子量得以提高，形成的凝胶力学性能和抗降解性能也得以改善，但是在化学交联或衍生化的过程中，往往不可避免会有化学物质的残留而使产品具有潜在的细胞毒性。这会极大地限制透明质酸凝胶的实际应用。

与化学凝胶通过共价键交联，凝胶过程不可逆不同，物理凝胶的交联作用力是物理作用力，例如微结晶、疏水作用力、氢键、静电作用力等，其凝胶化过程一般是可逆的。冷冻解冻法制备凝胶是一种简单易行的物理方法。这种方法是将一定浓度的高分子水溶液在低温下冷冻一段时间，再在较高温度下解冻，而形成的物理交联的高分子水凝胶。这种水凝胶具有一定的强度，在水中只能溶胀而不溶解，而且经过多次冷冻解冻循环制备的水凝胶强度还可得到较大提高。透明质酸物理凝胶的制备和研究已经有一些报道。如日本专利ZL 98808365.5、ZL 99813261.6、ZL 00818800.9、ZL 00803894.9和ZL 00803894.5等都采用冷冻解冻的方法制备了只含有透明质酸或透明质酸与其它高分子聚合物混合的物理凝胶，并指出该凝胶具有良好的生物相容性，难溶于水，抗酸降解等优良的性能。特别是，栾途等（Luan, T., Wu, L., Zhang, H., and Wang, Y. (2012), Carbohydrate Polymers, 2012(87): 2076-2085）系统研究了冷冻解冻透明质酸凝凝胶的凝胶机理，指出了该凝胶形成的驱动力主要为羧基参于的多重氢键作用。据此，多羧基小分子由于羧基的存在可以参与透明质酸冷冻解冻物理凝胶网络的构建，并且可以推测，在一定浓度范围内，多羧基小分子可促进网络结构的形成。此外，多羧基小分子如丁二酸、柠檬酸、酒石酸等在生物医药等方面均有着广泛的应用，如丁二酸在医药上有抗痉挛、祛痰、利尿、抗菌和抗溃疡等药理作用，还可作为食品调味剂或食品酸味剂用于酒、饲料、糖果等的调味；苹果酸，柠檬酸等广泛存在于生物体内并且已应用在医药、食品、化妆品等各个领域。将这些带有羧基的小分子加入到透明质酸冷冻解冻凝胶体系中，在一定的浓度范围内这些小分子既可以作为交联点参与网络结构的构建以提高凝胶的抗降解性，同时还会保留本身的一些生物活性，从而可以获得具有多重活性和功能的物理凝胶。

发明内容

本发明的目的是将多羧基小分子引入到透明质酸冷冻解冻凝胶体系中，制备出含有多羧基小分子的透明质酸物理凝胶。其中的小分子在一定的浓度范围内，既可以作为交联点参与网络结构的构建以提高凝胶的抗降解性，同时还保留了多羧酸小分子本身具有的一些生物活性，从而可以获得具有多重活性、多种功能的物理凝胶。

本发明提供的技术方案是：采用冷冻解冻法制备含多羧基小分子的透明质酸物理凝胶,即在不添加任何化学交联剂的情况下，首先将透明质酸配成不同浓度的水溶液，然后将不同含量的多羧基小分子加入的溶液中，完全溶解后再调节其pH值，继而将所得溶液置于低温下冷冻一段时间后再在室温下解冻，通过一次或多次冷冻解冻循环，最终制得含有多羧基小分子的透明质酸冷冻解冻凝胶。

实验结果表明，多羧基小分子参与了透明质酸物理凝胶的构建，它们通过物理相互作用包裹在透明质酸物理凝胶中，适当浓度的小分子可以提高透明质酸物理凝胶的力学强度和热稳定性。

透明质酸水溶液的pH值对凝胶形成与否至关重要。本发明中也提供凝胶形成条件，即在透明质酸水溶液pH小于3.0的条件下才能形成凝胶。这是由于pH的降低使得透明质酸分子中的羧基负离子转化为羧酸根，降低了分子间的静电排斥作用，进而导致分子间氢键作用形成而形成凝胶网络结构。为调整透明质酸水溶液的pH值而使用的酸只要是可将其pH调整到3.0以下的酸即可。为减少酸的用量，最好使用强酸，如盐酸，硫酸等。

加入的多羧基小分子的种类和浓度对凝胶的形成，力学强度和热稳定性有很大的影响，可以促进凝胶网络结构的形成，提高凝胶力学强度和抗降解性能。本发明通过测试其凝胶的流变学性能、溶胀性能以及不同温度下的酸溶液中凝胶的溶解和降解来评价上述性能。形成的多羧基小分子-透明质酸物理水凝胶难溶于中性水溶液中，并且在37℃下放置15天也未完全溶解，大部分依然呈现凝胶状态。

为了避免含多羧基小分子的透明质酸物理凝胶的酸水解，所制得的物理凝胶必须要除去调整酸性时所使用的酸等组分。一般可将制得的凝胶在水、生理盐水或磷酸缓冲液中浸泡或透析以除去酸组分。调节成中性的物理凝胶可通过冷冻干燥或减压干燥等处理制成干凝胶。

对于凝胶的形态也可通过改变冷冻时使用的容器和方法，制成片状、薄膜状、粉末状、海绵状、块状等形态。例如透明质酸和多羧基小分子的混合水溶液在平板上延展后冷冻解冻可制成片状或薄膜状凝胶。

本发明所提及的多羧基小分子是指包含两个以上（包含两个）羧基的小分子，例如丙二酸，丁二酸，戊二酸，己二酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸等。所指的小分子是指其分子量不超过10000。

本发明所述的多羧基小分子-透明质酸物理凝胶的制备方法，包括如下具体步骤：

（1）将不同质量的透明质酸溶于二次蒸馏水中，搅拌使其完全溶解，配成不同浓度的透明质酸水溶液；

（2）将不同质量的多羧基小分子加入到上述透明质酸溶液中，搅拌使其完全溶解，配制成含有不同浓度的多羧基小分子的透明质酸溶液；

（3）用酸调节步骤（2）制得的透明质酸溶液的pH值，使其pH值小于3.0，静置备用；

（4）将步骤（3）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-18～-80℃温度下冷冻24～72小时，然后取出在0～40℃下解冻1～24小时。这个过程称为一次冷冻解冻过程。反复进行上述冷冻解冻过程1～5次后，对所得凝胶在去离子水中浸泡，然后在pH=7的缓冲溶液中浸泡足够长的时间，得到中性水凝胶，然后采用冷冻干燥的方法去除水分，得到干燥凝胶。

本发明涉及的物理凝胶及其制备方法与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

（1）特定多羧基小分子可以参与凝胶的形成，在一定浓度范围内可以提高凝胶力学强度和抗降解性能。

（2）将一些具有生物活性的多羧基小分子加入到凝胶体系中，所形成的凝胶既保留了透明质酸物理凝胶本身的性能，又兼具有多羧基小分子本身的优良性能。形成的含某些多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶抗酸降解和酶降解能力，均比透明质酸本身或者单纯透明质酸冷冻解冻物理凝胶有所提高。

不添加任何具有生物毒性的交联剂，具有良好的生物相容性。

附图说明

图1 透明质酸-丁二酸物理水凝胶（b:实例4，c:实例5，d:实例6）以及透明质酸物理凝胶(a:比较例1)照片。

图2透明质酸物理凝胶(a:比较例1)以及透明质酸-丁二酸物理水凝胶(b:实例5)局部显微镜照片。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

实施例1-3：

（1）准确称取一定质量的透明质酸溶于二次蒸馏水中，配制浓度为1%的透明质酸水溶液。

（2）在上述溶解的透明质酸溶液中，加入不同质量的丙二酸，分别形成对应丙二酸浓度为0.01M (实例1),0.05M (实例2)和0.50M (实例3)的混合溶液。

（3）用1M的HCl调节步骤（2）制得的含不同浓度丙二酸的透明质酸水溶液的pH值，使其pH=1.50，静置备用。

（4）将步骤（3）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-24℃温度下冷冻72小时，然后取出置于室温下解冻12小时，将经过一次冷冻解冻循环的凝胶取出，先利用二次蒸馏的去离子水浸泡样品2h，再用配制好的磷酸盐缓冲液(PBS，摩尔比Na₂HPO₄·12H₂O:NaH₂PO₄·2H₂O=3:2，pH≈7.0）浸泡4～5h，最后将取出凝胶样品冷冻干燥，即可得到干燥后的透明质酸冷冻解冻凝胶。

实施例4-6：

制备过程与实例1-3相同，只是步骤2中加入的小分子羧酸更换为0.01M丁二酸(实例4),

0.05M丁二酸(实例5), 0.50M丁二酸(实例6)。

实施例7-9：

制备过程与实例1-3相同，只是步骤2中加入的小分子羧酸更换为0.01M戊二酸(实例7),

0.05M戊二酸(实例8), 0.50M戊二酸(实例9)。

实施例10-12：

制备过程与实例1-3相同，只是步骤2中加入的小分子羧酸更换为0.01M苹果酸(实例10),

0.05M苹果酸(实例11), 0.50M苹果酸(实例12)。

实施例13-15：

制备过程与实例1-3相同，只是步骤2中加入的小分子羧酸分别为0.01M酒石酸(实例13),

0.05M酒石酸(实例14), 0.50M酒石酸(实例15)。

实施例16-18：

制备过程与实例1-3相同，只是步骤2中加入的小分子羧酸更换为0.01M柠檬酸(实例16),

0.05M柠檬酸(实例17), 0.50M柠檬酸(实例18)。

实例19

（2）在上述溶解的透明质酸溶液中，加入一定质量的丁二酸，形成的丁二酸浓度为0.05M。

（3）用1M的HCl调节步骤（2）制得的丁二酸与透明质酸混合水溶液的pH值，使其pH=1.50，静置备用。

（4）将步骤（3）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-24℃温度下冷冻72小时，然后取出置于室温下解冻12小时，将经过5次上述冷冻解冻循环的凝胶取出，先利用二次蒸馏的去离子水浸泡样品2h，再用配制好的磷酸盐缓冲液(PBS，摩尔比Na₂HPO₄·12H₂O:NaH₂PO₄·2H₂O=3:2，pH≈7.0）浸泡4-5h，最后将取出凝胶样品冷冻干燥，即可得到干燥后的透明质酸冷冻解冻凝胶。

实例20

（2）在上述溶解的透明质酸溶液中，加入一定质量的丁二酸，形成的丁二酸浓为0.05M。

（4）将步骤（3）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-24℃温度下冷冻288小时，然后取出置于室温下解冻12小时，将经过冷冻解冻循环的凝胶取出，先利用二次蒸馏的去离子水浸泡样品2h，再用配制好的磷酸盐缓冲液(PBS，摩尔比Na₂HPO₄·12H₂O:NaH₂PO₄·2H₂O=3:2，pH≈7.0）浸泡4-5h，最后将取出凝胶样品冷冻干燥，即可得到干燥后的透明质酸冷冻解冻凝胶。

比较例1：

（2）用1M的HCl调节步骤（1）制得的透明质酸水溶液pH值，使其pH=1.50，静置备用。

（3）将步骤（3）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-24℃温度下冷冻72小时，然后取出置于室温下解冻12小时，将冷冻解冻的凝胶取出，先利用二次蒸馏的去离子水浸泡样品2h，再用配制好的磷酸盐缓冲液(PBS，摩尔比Na₂HPO₄·12H₂O:NaH₂PO₄·2H₂O=3:2，pH≈7.0）浸泡4-5h，最后将取出凝胶样品冷冻干燥，即可得到干燥后的透明质酸冷冻解冻凝胶。

比较例2：

（1）准确称取一定质量的透明质酸溶于二次蒸馏水中，配制浓度为1%的透明质酸水溶

液。

（2）将步骤（1）制得的溶液密封，置于低温恒温槽中，在-24℃温度下冷冻72小时，

然后取出置于室温下解冻12小时，将经过一次冷冻解冻循环的样品冷冻干燥，，即

可得到干燥后的海绵状透明质酸。

凝胶强度测试：

将制备的干燥凝胶，在0.1MPBS中水合48h，形成浓度为1.5%的凝胶溶液。然后采用流变仪（ARG2流变仪，TA Instruments, Waters Co., USA）对其凝胶强度进行测试。实验中选用夹具为直径40mm的平板，间距为1mm，实验温度由循环水浴及帕尔贴（Peltier）系统控制在25℃。实验选择动态流变学测试模式，在样品的线性粘弹区范围内进行。为避免实验过程中溶剂的挥发，测试前先用一薄层轻质硅油（聚二甲基硅氧烷，25℃时粘度为10mPas）覆盖其表面。凝胶强度以频率为1rad/s下的弹性模量G￠来表示。

凝胶溶解性能测试：

称取干燥的透明质酸干胶样品（实例1，4，7，10，13，16，比较例1，比较例2）20 mg，37℃下在100mlPBS中溶胀15天，然后取一定体积的磷酸缓冲溶液,通过GPC（Malvern Instruments, UK）测定样品溶解的含量。每个样品平行进行三次测试，取平均值作为测试结果。

凝胶溶胀性能测试：

准确称取干燥的透明质酸干胶样品（实例1，4，7，10，13，16，比较例1，比较例2）质量为m₀，将上述样品在37℃下10ml PBS中溶胀48h，将凝胶提出溶液，用滤纸擦干表面的水，进行称重的质量为m₁。以 m₁/m₀计算溶胀度。每个样品平行进行三次测试，取平均值作为测试结果。

光学显微镜观察：

将凝胶用盖玻片压成薄层放置的显微镜（Leica DM LP 热台偏光显微镜：Leica Microsystems GmbH, Germany）样品台上，选择合适的放大倍数，在25℃对样品进行形貌观察。

凝胶酸降解测试：

1) 将待测样品置于一定体积的去离子水中，配制成3mg/mL；

2) 加入一定量1M HCl使其浓度为0.1M，置于37℃下恒温；

3) 每到一定反应时间后，取出1mL溶液，并加入100μL中性缓冲溶液（2M NaOH+磷酸盐缓冲液（PBS pH=7），体积比为1:1），使之达到中性，停止反应，并置于-20℃下冷冻；

4) 冷冻一段时间后取出解冻，用一次性针筒及水相针式滤器将溶液过滤入GPC样品瓶中，用GPC测量分子量，以凝胶降解得到可溶性HA分子量的变化来表征其降解性能。

凝胶酶降解测试

1) 准确称取1mg透明质酸酶（300IU/mg）于15ml pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，配制成20U/ml的透明质酸酶溶液，并将此溶液置于37℃下，使其与反应温度达到一致；

2) 将18mg的透明质酸或其冷冻解冻凝胶溶解在3ml pH=7.0的磷酸盐缓冲液中，配制成为反应底物溶液，并将此溶液置于37℃下，使其与反应温度达到一致；

3) 向底物溶液中加入3ml已配置好的透明质酸酶溶液，并置于37℃下；

4) 控制不同反应时间，取出1ml溶液于样品瓶中；

5) 将样品瓶置于100℃油浴中，加热10min使酶失活；

6) 用一次性针筒及水相针式滤器将溶液滤入GPC样品瓶中，用GPC测量分子量，以凝胶降解得到可溶性HA分子量的变化来表征其降解性能。

表1 含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的凝胶强度和溶胀性：

表2 含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的溶解性：

表3 含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的酸降解性能：

表4 含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的酶降解性能：

Claims

1.一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，将透明质酸配成不同浓度的水溶液，然后将不同含量的多羧基小分子加入的溶液中，完全溶解后再调节其pH值至3.0以下，经一次或多次冷冻解冻循环形成含有多羧基小分子的透明质酸冷冻解冻凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的多羧基小分子是分子中含有两个及以上羧基且分子量小于10000的小分子，

多羧基小分子是烷烃基多元酸或烷烃基多元羟基酸。

3.根据权利要求1所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的烷烃基多元酸是丙二酸、丁二酸或戊二酸。

4.根据权利要求1所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的烷烃基多元羟基酸是柠檬酸、苹果酸或酒石酸。

5.根据权利要求1所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的冷冻解冻循环条件为：-18～-80℃温度下冷冻24～72小时，0～40℃温度下解冻1～24小时。

6.根据权利要求1所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述制得的含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶在去离子水或磷酸盐缓冲液中浸泡至中性，得到中性水凝胶。

7.根据权利要求6所述的一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶的制备方法，其特征在于，将中性水凝胶经采用冷冻干燥的方法去除水分，得到干燥凝胶。

8.一种含多羧基小分子的透明质酸物理水凝胶，其特征在于，以权利要求1的制备方法制得。