本申请是申请人于2009年5月26日提交的申请号为200910051968.6、发明名称为“调控FAF1基因的方法和组合物及所述组合物的用途”的发明专利申请的分案申请。
具体实施方式
FAF1基因又称为FAS结合因子1,是细胞凋亡诱导信号复合体(DISC)的一个成分,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1(Genebank登录号NM_007051)所示,氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。SEQ ID NO:1中的第454-2406位为编码蛋白的开放阅读框区域。FAF1基因在多数哺乳动物如人和大小鼠等动物中的正常组织中都有表达,包括在哺乳动物各种组织的各种细胞中表达,但在恶性间皮瘤等肿瘤细胞中表达量会降低。
本发明第一方面一种分离的FAF1基因,其编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列,其中,该核苷酸序列中对应于SEQ ID NO:1第1650-1670位和/或第2128-2148位碱基的碱基中有一个或多个碱基与SEQ ID NO:1的所述第1650-1670位和/或第2128-2148位碱基相比发生了同义突变。同义突变可以是相同的,也可以是不同的:即发生突变的碱基所处的位置可以是相同的,也可以是不同的;和/或发生突变的碱基的数量可以是相同的,也可以是不同的。优选的,每个结合位点中发生突变的碱基数量为1-21个,例如为2-18个、2-15个、2-12个、2-10个、2-8个、2-7个、2-5个等。优选地,所述突变发生在对应的两个区域中的第2到第8位(从3’到5’)上,即第2-8位中的1个或几个碱基发生了突变。
同义突变指由于生物的遗传密码子存在兼并现象,在某一碱基改变后,在原来的某种氨基酸的位置译成同一种氨基酸,即称为同义突变。当涉及一种多肽时,“分离”意味着所述的分子从发现该分子天然存在的整个生物体中分离和分开,或基本不存在其它相同类型的生物大分子。术语“分离”对于核酸是:一种核酸分子,它完全或部分缺乏与其天然结合的序列;或一个序列,因为它天然存在,但具有与其结合的异源序列;或从染色体分离的分子。
更具体而言,本发明的分离的FAF1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1第454-2406位所示,但其中的第1650-1670位和/或第2128-2148位中的一个或多个核苷酸发生了同义突变。所述核苷酸编号都是以SEQ ID NO:1中的编号为准。
所述第1650-1670位和第2128-2148位中发生的同义突变可以是相同的,也可以是不同的:即发生突变的碱基所处的位置可以是相同的,也可以是不同的;和/或发生突变的碱基的数量可以是相同的,也可以是不同的。优选的,每个结合位点中发生同义突变的碱基数量为1-21个,例如为2-18个、2-15个、2-12个、2-10个、2-8个、2-7个、2-5个等。优选地,所述同义突变发生在两个结合位点区域中的第2到第8位(从3’到5’)上,即第2-8位中的1个或几个碱基发生了同义突变。本发明FAF1基因中,可仅在两个结合位点中的任一个发生同义突变,也可在两个结合位点都发生同义突变。
除上述第1650-1670位和/或第2128-2148位中发生同义突变外,本发明FAF1基因的其它位置的核苷酸,例如第454-1649位、1671-2127位和第2149-2406位核苷酸中的一个或多个核苷酸也可以发生突变,只要这种突变不影响到所得FAF1基因在本发明中所具有的功能。具体而言,本发明还包括编码下述蛋白质的FAF1基因:在所述第454-1649位、1671-2127位和第2149-2406位核苷酸编码的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且仍保留有SEQ ID NO:2所示蛋白的活性的由SEQ ID NO:2所示蛋白衍生的蛋白质。
在一优选实施例中,本发明的FAF1基因如SEQ ID NO:12中的第454-2406位所示。
可采用各种方法制备本发明的蛋白质。通常用重组方法制备本发明的蛋白质。可以用标准分子生物学方法制备编码本发明蛋白质的多核苷酸。例如,用重组方法可以获得编码上述分子的多核苷酸序列,例如通过从表达该基因的细胞筛选cDNA和基因组文库,或通过从已知的包括该基因的载体衍生该基因。也可合成而非克隆制备感兴趣的基因。可用适当的特定序列的密码子消化该分子。然后将用标准方法制备的重叠的寡核苷酸装配完整的序列,并装配入完整的编码序列中。参见如Edge(1981)Nature292:756;Nambair等(1984)Science223:1299;和Jay等(1984)J.Biol.Chem.259:6311。
因此,从携带所需序列的载体可获得具体的核苷酸序列,或用本领域已知的各种寡核苷酸合成方法,如定位诱变和聚合酶链式反应(PCR),完全或部分合成。参见如Sambrook,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:a Laboratory Manual),第二版,1989。具体说,获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是用常规的自动多核苷酸合成仪制备的退火补集的重叠的合成的寡核苷酸,然后用适当的DNA连接酶连接,并用PVR扩增连接的核苷酸序列。参见如Jayaraman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4084-4088。另外,在本发明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等,(1986)Nature54:75-82)、先有核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(Riechmann等,(1988)Nature332:323-327和Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536)和用T4DNA聚合酶进行的酶促补平带缺口的寡核苷酸合成(Queen等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033)。
一旦制备或分离了编码序列,就可将这些序列克隆入任何合适的载体或复制子中。对本领域技术人员而言,各种克隆载体是已知的,且适当的克隆载体的筛选只是选择问题。合适的载体包括(但并非限制于):质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或当与适当的控制元件结合时能复制的病毒。
然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下,这取决于用于表达的系统。因此,可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下,从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。参见如美国专利No.4,431,739;4,425,437;4,338,397。
除了控制序列外,可以添加调节序列,从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列的表达。调节序列是本领域技术人员已知的,其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)启动或关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的调节元件。例如,可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBO J.4:761);从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6777);和从人CMV衍生的元件(Boshart等,(1985)Cell41:521),如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专利No.5,688,688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多种可选择的标记物、一个或多个限制酶切位点、高拷贝数量的势能和强启动子。
构建表达载体,使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中,与控制序列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即,结合于控制序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行修饰来实现此目的。例如,在一些情况中可能需要修饰该序列,从而使其连接于适合取向的控制序列,即维持读框。在插入到载体之前,控制序列和其它调节序列可能连接于编码序列。或者,可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体中。
通过缺失一部分编码感兴趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代该序列内的一个或多个核苷酸,可以制备用于分析的本发明蛋白的突变体或类似物。修饰核苷酸序列的方法,如定向诱变等是本领域技术人员所熟知的。参见如Sambrook等,上述;Kunkel,T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoder等(1987)BioiTechniques5:786;Zoller和Smith(1983)MethodsEnzymol.100:468;Dalbie-McFarland等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA79:6409。
这种分子可以在各种系统中表达,包括本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。例如,昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的,描述于如Summers和Smith,Texas Aguricultural Experiment StationBulletin No.1555(1987)。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法都是可以试剂盒形式购得的,尤其是Invitrogen,San Diego CA("MaxBac"试剂盒)。类似地,细菌和哺乳动物细胞表达系统也是本领域熟知的,其描述见如Sambrook等,如上。酵母表达系统也是本领域熟知的,其描述见如《酵母遗传工程》(Yeast GeneticEngineering)(Barr等编辑,1989)Butterworths,London。
许多用于上述系统的适合的宿主细胞也是已知的。例如,哺乳动物细胞系是本领域已知的,其包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化的细胞系,如(但并非限制于)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾("MDBK")细胞等。类似地,在本发明的表达构建物中也可使用细菌宿主,如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌。在本发明中还可用酵母宿主,特别包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙氏毕赤酵母(Pichiaguillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和yarrowia lipolytica。可与杆状病毒表达系统一起使用的昆虫细胞特别包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿丫纹夜蛾(Autographacalifornica)、家蚕(Bombyx mori)、黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。
用本领域熟知的各种基因送递的方法,可将包含感兴趣的核苷酸序列的核酸分子稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中的稳定的附加型元件上维持。参见如美国专利No.5,399,346。
根据所选用的表达系统和宿主,在表达蛋白质的条件下,培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞制备该分子。然后从宿主细胞分离出表达的蛋白质并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到培养基中,则直接从培养基纯化产物。如果不是分泌的,则从细胞裂解液分离。适合的培养条件和回收方法的选择都是在本领域技术人员能力之内。
因此,本发明也包括含有本发明FAF1基因的表达载体。
本发明第二方面涉及调控FAF1基因表达的方法,该方法包括调节对象的miR-24的表达。
miR-24是与人类肿瘤相关性很大的一个microRNA,其核苷酸序列为5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’(SEQ ID NO:3)。现有技术已发现,miR-24不仅能够抑制抑癌基因p16的表达,它在一些肿瘤类型中也有异常表达。我们的研究发现miR-24能够通过结合到FAF1的ORF框上两个结合位点对FAF1基因进行调控。这两个位点在SEQ IDNO:1中所处位置分别为第1650-1670位和第2128-2148位。通常,一个miR-24结合一个位点。在将FAF1基因的某一个位点突变的情况下,单个miR-24也能结合到该突变的FAF1基因的另一未突变位点上,且该突变的FAF1基因的表达仍受到miR-24的调控。在这种情况下,与无突变的FAF1基因相比,超表达突变的FAF1基因诱导DU-145细胞凋亡的能力相对于超表达没有突变的FAF1基因增强。
在本文中,对象包括哺乳动物、其组织或细胞。哺乳动物包括人、大鼠、小鼠等。“调节”包括上调和下调。调节可以是体内调节或体外调节。体内调节时,可将本发明的组合物通过各种熟知的方式,例如注射等,给予对象。体外调节时,可将含miR-24抑制剂的本发明组合物与对象如离体组织或细胞共培育,使组合物中的活性成分进入离体组织或细胞中;或者采用已知的技术将活性成分转染入对象如离体组织或细胞中。调节还包括超表达miR-24。
在本发明中,组合物的活性成分包括miR-24的激动剂和抑制剂。激动剂可增强miR-24的表达,从而可更好地抑制FAF1的表达,结果抑制了细胞的凋亡。在另一实施例中,通过给予miR-24抑制剂来实现对FAF1的调节。抑制剂可抑制miR-24的表达,增加FAF1的表达,导致FAF1蛋白表达量增加,从而促进细胞的凋亡。任何可增强miR-24的表达的激动剂以及任何可抑制miR-24的表达的抑制剂都可用于本发明。
本发明第三方面涉及调节细胞凋亡的方法,该方法包括调节FAF1基因的表达。
在这方面,调节也包括上调和下调,即相对于一定总量的细胞而言,减少细胞凋亡数量或比例,或增加细胞凋亡数量或比例。调节FAF1基因表达的方法包括(1)对FAF1基因ORF框上两个miR-24结合位点实施同义突变,以阻止miR-24对FAF1基因的抑制;和/或(2)施加miR-24的激动剂或抑制剂;(3)施加本发明的FAF1基因或含有该基因的载体,或者施加FAF1基因表达产物;和/或(4)超表达miR-24。
细胞可以是哺乳动物例如人、小鼠、大鼠等的细胞。通过调节细胞的凋亡,可以治疗肿瘤。或者,通过调节细胞的凋亡,可以构建各种肿瘤动物模型,用于开发新药等。
施加miR-24的激动剂或抑制剂的方法包括提供含有miR-24的激动剂或抑制剂的组合物,并将该组合物体内或体外给予细胞;或者体内或体外转染入细胞。
将外源DNA转染入哺乳动物细胞的方法是本领域周知的,大致可分为两大类,即生物方法和物理化学方法。物理化学方法中常用的有磷酸钙法、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染,以及最近出现的以高分子聚合物为载体的基因传递技术。生物方法则主要是以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中,其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。
磷酸钙在良好的转染条件下,可以在293T等细胞的转染达到较高的转染效率。此外,转染方法还包括阳离子脂质体法,具体为带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。适用于阳离子脂质体法的阳离子脂质体是本领域周知的,并且可从各种商业途径购得。
本发明第四方面包括治疗癌症的方法,该方法包括调节FAF1的表达,促使癌症细胞凋亡,从而治疗癌症。癌症包括各种具有经由FAF1介导的细胞凋亡的癌症,包括但不限于恶性间皮瘤、激素非依赖性前列腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌等。调节FAF1的表达的方法包括(1)对FAF1基因ORF框上两个miR-24结合位点实施同义突变,以阻止miR-24对FAF1基因表达的抑制;和/或(2)施加miR-24抑制剂;(3)和/或施加本发明的FAF1基因或含有该基因的载体,或施加FAF1基因的表达产物。
本发明第五方面涉及miR-24抑制剂在制备治疗FAF1基因异常表达的癌症中的用途。
miR-24抑制剂在本文中指能够结合miR-24从而能阻止其与FAF1结合的物质,包括其反义核酸,例如SEQ ID NO:4所示反义核酸。可对反义核酸实施不同的修饰,如本文中使用的锁核苷酸修饰及其它文献中出现过的2’-甲氧基修饰等,或者针对反义核酸上不同的位点进行修饰。一般情况下可对miR-24的反义序列上每个碱基都用甲氧修饰。也可以选择性修饰若干位点。具体可参考文献:Angie M.Cheng、Mike W.Byrom、JeffreyShelton和Lance P.Ford.,“Antisense inhibition of human miRNAs and indicationsfor an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis”,Nucleic Acids Res.,2005;33(4):1290–1297;以及Wang Q、Huang Z、Xue H、Jin C、Ju XL、Han JD和ChenYG,“MicroRNA miR-24inhibits erythropoiesis by targeting activin type I receptorALK4”,Blood,2008Jan15;111(2):588-95.Epub2007Sep28。
在一个实施例中,miR-24的反义核酸是针对miR-24第2-8位(从5’到3’)碱基的反义核酸,其序列为5’-CTGAGCC-3’。可在此序列的任意一侧或两侧加入对应于miR-24对应位置的配对碱基。例如,所述反义核酸可以是SEQ ID NO:4所示序列从3’起的第2位到第8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22位碱基之间的序列,或者是SEQ ID NO:4从3’起第1位到第8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21位碱基之间的序列。
本发明包括SEQ ID NO:4以及由SEQ ID NO:4衍生得到的上述miR-24反义核酸,以及含有任一上述反义核酸的表达盒。
本发明第六方面包括一种药物组合物,该组合物含有安全有效量的miR-24抑制剂和/或未突变的FAF1基因或含有此基因的表达载体、本发明的FAF1基因或含有该基因的载体和/或FAF1基因的表达产物(即FAF1蛋白)以及药学上可接受的运载体或赋形剂。如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释剂。这类运载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。
本发明的药物组合物中还可以含有各种合适的化疗剂,例如用于治疗各种FAF1基因异常表达的癌症用的化疗剂,例如诱导细胞凋亡的试剂星胞菌素、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素等。
在一优选实施例中,本发明药物组合物含有miR-24的抑制剂和细胞凋亡诱导剂。在一个具体实施方式中,所述诱导剂为星胞菌素。
在一优选实施例中,本发明药物组合物含有miR-24的抑制剂和FAF1基因的超表达载体。所述超表达载体中的FAF1基因可为未突变的FAF1基因。
本发明第七方面涉及FAF1基因或其表达产物在制备治疗或预防由FAF1基因异常表达的癌症用的药物中的用途。所述癌症包括但不限于恶性间皮瘤、激素非依赖性前列腺癌、宫颈癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌等。在这方面,所述FAF1基因包括本发明所述的miR-24的结合位点存在同义突变的基因,也包括所述结合位点无突变的基因。尤其是,本发明包括FAF1基因或其表达产物在制备治疗或预防前列腺癌用的药物中的用途。
本发明第八方面提供一种制备用于研究癌症机理的动物模型的方法以及由此获得的动物模型。该方法包括对该动物的FAF1基因进行调节,从而使该动物长出肿瘤,并以该动物模型进行肿瘤研究,包括药物筛选等。本发明还包括使用该动物模型筛选治疗FAF1介导的癌症的药物,包括给予该动物模型待筛选的药物,以及判断该药物能否使该动物模型的肿瘤消退或治愈,其中能够使动物模型的肿瘤消退或治愈的药物为所需的药物。药物既可以是核酸分子,也可以是化学化合物分子。给予的方法既包括直接的给予,例如口服、注射等,也包括采用遗传工程等生物技术的方法的给予。本领域技术人员对这种采用肿瘤动物模型来筛选新药的方法是周知的。
本发明第九方面还涉及一种试剂盒,该试剂盒含有miR-24抑制剂以及转染该抑制剂所需的试剂。任选地,该试剂盒还包括使用该miR-24抑制剂转染动物细胞的说明书。或者,试剂盒含有诱变剂,用于对细胞的FAF1基因ORF框上两个miR-24结合位点实施同义突变,以及如何使用所述诱变剂实施所述突变的说明书。或者,该试剂盒同时包括miR-24的抑制剂,转染该抑制剂所需的试剂,以及用于对细胞的FAF1基因ORF框上两个miR-24结合位点实施同义突变的诱变剂或诱变工具,以及任选的关于转染的说明书和关于诱变的说明书等。
本发明的方法包括非治疗目的的方法。本领域技术人员将明白,上述在某个方面中描述的内容虽然可能在其它另外的方面中没有描述,但是所述内容同样也适用于所述其它方面的技术方案;例如,在本发明第二方面中描述转染的内容同样也可用于其它方面,等等。即,将在上述各具体方面中描述的各具体特征组合起来所得的技术方案也在本发明范围之内。下文将以具体实施例的方式对本发明进行详细描述。下述实施例仅是示例性的,而非限制性的。本领域技术人员在不偏离本申请精神和范围的情况下,可采用各种替换方式及其组合实施本申请的技术方案。
实施例1:在DU-145细胞中使用miR-24的反义核酸(miR-24-ASO,SEQ ID NO:4)可以导致细胞凋亡并影响DU-145细胞的增殖
在DU-145细胞中使用Interfer IN转染试剂(PolyPlus-transfection)转染20nM浓度的miR-24-ASO(由TaKaRa公司合成,序列为5′-ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA-3′,即SEQID NO:4,其中小写字母表示锁核酸标记的位置),转染48小时后使用PI(Sigma)和标记了FITC的膜联蛋白V(Sigma)染色。通过流式细胞仪检测,发现miR-24-ASO可以导致DU-145细胞的凋亡,凋亡的比例约为10%左右(图1a)。
为了进一步检测转染了miR-24-ASO的DU-145细胞对诱导凋亡试剂星胞菌素的耐受程度,在DU-145细胞中使用Interfer IN转染试剂转染20nM浓度的miR-24-ASO,转染48小时后向培养液中加入中浓度1μM的星胞菌素(Sigma)诱导凋亡2小时。结果发现转染了miR-24-ASO的细胞凋亡比例约为49%,而没有转染的凋亡比例只有12%左右。证明转染了miR-24-ASO的DU-145细胞对星胞菌素的敏感性显著增强(图1b)。
然后,我们进一步检测了miR-24-ASO对DU-145细胞凋亡的影响。结果显示,在转染了miR-24-ASO以后,DU-145细胞的增殖能力明显减弱(图1c)。在DU-145细胞中转染了miR-24-ASO和miR-24-mimics(Ambion)以后检测了caspase8的成熟水平。结果显示转染了miR-24-ASO以后成熟的caspase8明显增多。切原体的caspase8水平明显降低。说明miR-24-ASO可能是通过caspase8通路诱导细胞凋亡(图1d)。
实施例2:miR-24通过结合FAF1基因的开放阅读框(ORF)上的两个靶位点对FAF1基因进行调控
使用如下实验方法,我们发现了FAF1基因可能是miR-24的一个靶基因。
使用IBM公司的RNA22软件,没有在FAF1的3′非翻译区预测到miR-24的结合位点,但是在FAF1的开放阅读框上发现了两个miR-24的结合位点,分别是SEQ ID NO:1第1650-1670位和第2128-2148位。通过同源性比对发现,miR-24的结合位点在人、鼠、牛等八个物种中都很保守,尤其是miRNA的5′端第2到第8位所结合的“种子”区域上几乎都是完全保守的(见下文),进一步说明了miR-24可以通过这两个位点调控FAF1基因(图2a)。
3'-GACAAGGACGACUUGACUCGGU-5' has-miR24
|||||||||||||||||
5'-
UGUU CUUA
U---
CUGAG CA-3' 智人(Homo sapiens)B-1
GCAAGCCCUGCCUC-CUGAGCCA 智人(Homo sapiens)B-2
U
CUGA
UA-
UG CUC
A UGAGCCA 老鼠(Mus musculus)B-1
CCA
UUG
UU
CCU
AU
CUGAG CA 老鼠(Mus musculus)B-2
GCAGGCC UGCCUC-CUGAGCCA 牛(Bos taurus)B-1
CUA
UUG
CU
CUU
AU
CUGAG CA 牛(Bos taurus)B-2
GCAAGCCCUGCCUC-CUGAGCCA 黑猩猩(Pan troglodytes)
CUA
UUG
CU
CUU
AU
CUGAG CA 马(Equus caballus)
CUA
UUG
CU
CAU
AC
CUGAG CA 非洲负子蟾(Xenopus tropicali)
CUA
UUG
CU
CAU
AC
CUGAG CA 非洲爪蟾(Xenopus laevis)
CCCCGCCGCAGCGG—CUGAGCCA 果蝇(Drosophila melano)
上述序列比对中,黑体字“U”表示G:U配对,下划线表示完全互补的序列。
为了进一步验证这一预测,我们将含有这两个结合位点的序列克隆到了pGL3质粒(Promega)的荧光素酶的3′非翻译区域。然后将含有结合位点的质粒转染进入293T细胞并在24小时以后对荧光素酶相对活性进行了检测。结果显示相对于转染NC-mimics(Ambion)的细胞,转染miR-24-mimics的细胞中荧光素酶的相对活性明显降低(图2b)。这说明miR-24可以结合到FAF1基因上预测的两个结合位点并对FAF1进行调控。
为了检测miR-24是否体内对FAF1基因进行调控,我们使用pcDNA3.1-FAF1质粒在293T细胞中超表达FAF1基因,并同时转染miR-24-mimics及NC-mimics。简言之,使用PCR的方法,以人的cDNA文库为模板将FAF1基因扩增后克隆到pCDNA3.1质粒,得到pcDNA3.1-FAF1质粒,然后使用转染试剂Lipofectamin2000(Invitrogen)转染到细胞。
如下构建该pcDNA3.1-FAF1质粒:将FAF1cDNA(NM_007051)克隆入pcDNA3.1(-)(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位点之间。使用以下引物从人cDNA文库中克隆该FAF1cDNA:
5′-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3′ (SEQ ID NO:5)
5′-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3′(SEQ ID NO:6)
合成结合位点并克隆到pGL3荧光酶载体(Promega)中荧光酶的3’UTR区域中。然后如前文所述,将所获得的构建物与PRL-SV40和miR-24-mimics或NC-mimics(Ambion)共转染入293T细胞中。48小时后,使用双重荧光酶报道子检测系统(Promega)测定荧光酶活性(三组平行试验的平均值)。
结果显示,在转染了miR-24-mimics的细胞中FAF1的表达水平明显低于转染NC-mimics的细胞以及只转染了pcDNA3.1-FAF1质粒的细胞。并且miR-24对FAF1蛋白水平的抑制是剂量依赖的(图2d)。同时,我们在转染了pcDNA3.1-FAF1质粒及miR-24-mimics以后又转染了miR-24-ASO,并以NC-ASO(由TaKaRa公司合成,5′-caCTTATCagtcAGACCAtcGT-3′,SEQ ID NO:11,小写字母表示LNA标记的位点)作为参照,结果发现转染miR-24-ASO明显恢复了miR-24对FAF1基因的下调(图2c)。这些结果证明,miR-24可以在体内对FAF1基因进行调控。
为了进一步证明miR-24是通过预测的两个结合位点对FAF1进行调控的,我们对FAF1上预测的两个位点尤其是“种子”区域做了同义突变:通过PCR将质粒扩增一圈的方法,我们在FAF1基因的miR-24结合区域构建了若干同义突变。使用了以下序列作为PCR引物:
FAF1-Mu-B1-FW:5′-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3′ (SEQ ID NO:7)
FAF1-Mu-B1-RV:5′-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG-3′ (SEQ ID NO:8)
FAF1-Mu-B2-FW:5′-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3′ (SEQ ID NO:9)
FAF1-Mu-B2-RV:5′-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3′ (SEQ ID NO:10)
然后向293T细胞中转入突变的FAF1基因(所发生的突变同实施例4的FAF1-M1和FAF1-M2),同时转入不同浓度的miR-24-mimics,结果显示,在转1nM或5nMmiR-24-mimics后突变的FAF1基因没有被下调,而转入20nM miR-24-mimics后FAF1基因开始下调。miR-24对突变的FAF1基因的调控能力明显减弱(图2e)。这些结果说明miR-24可以通过预测的两个结合位点调控FAF1基因的表达。
实施例3:miR-24通过靶向FAF1基因调控DU-145细胞的凋亡
为了检测miR-24对DU-145细胞凋亡的调控是否是通过FAF1基因进行的,我们在DU-145细胞中分别共转染了不同的试剂。结果发现转染pcDNA3.1-FAF1超表达FAF1基因可以向抑制miR-24的表达一样导致DU-145细胞的凋亡。然后我们转染miR-24-ASO抑制miR-24的表达,同时共转染pcDNA3.1-FAF1超表达FAF1。结果发现:在抑制了miR-24以后超表达FAF1基因可以很高效的诱导DU-145细胞的凋亡(48小时后约70%)。为进一步验证miR-24可以控制FAF1对DU-145细胞凋亡的调控,我们在超表达FAF1的同时转入了miR-24-mimics超表达miR-24,结果发现超表达miR-24可以很好的保护FAF1诱导的DU-145细胞不凋亡。这些结果证明miR-24是通过靶向FAF1基因对DU-145细胞的凋亡进行调控的(图3)。
实施例4:同义突变FAF1基因上的两个miR-24结合位点可以进一步诱导凋亡
为了进一步证实miR-24对DU-145细胞凋亡的影响是通过结合到FAF1基因的ORF框上的两个结合位点进行的,将突变的超表达载体pcDNA3.1-FAF1-M12转染DU-145细胞。
如下构建miR-24结合的两个位点种子区域突变的FAF1超表达载体pcDNA3.1-FAF1-M12:使用PCR方法分两步构建。突变使用的引物分别为:
FAF1-Mu-B1-FW:5′-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3′ (SEQ ID NO:7);
FAF1-Mu-B1-RV:5′-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG-3′ (SEQ ID NO:8);
FAF1-Mu-B2-FW:5′-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3′(SEQ ID NO:9);
FAF1-Mu-B2-RV:5′-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3′ (SEQ ID NO:10)。
以pcDNA3.1-FAF1质粒(如实施例2所示构建)为模板,构建第一个结合位点突变的FAF1表达质粒pcDNA3.1-FAF1-M1。PCR反应体系为:
10×KOD Buffer 5μl
dNTP(2mM) 5μl
MgSO4(20mM) 2μl
FAF1-Mu-B1-FW(20μM) 2μl
FAF1-Mu-B1-RV(20μM) 2μl
模板(pcDNA3.1-FAF1质粒) 1μl
KOD plus 1μl
加H2O至总体积 50μl
使用Eppendorf公司PCR仪两步法进行反应。PCR反应条件为:
1)94℃,5分钟;2)94℃,1分钟;3)68℃,10分钟;4)返回2),进行20轮;5)68℃,20分钟;7)维持10℃。
PCR后电泳胶回收。使用DpnI限制性内切酶37℃酶切4小时后转化DH5α菌株。鉴定得到第一个结合位点突变的FAF1表达载体pcDNA3.1-FAF1-M1。然后用构建第一个结合位点相同的反应体系和反应条件,以pcDNA3.1-FAF1-M1质粒为模板,以FAF1-Mu-B2-FW和FAF1-Mu-B2-RV为引物构建两个位点都有突变的FAF1表达载体pcDNA3.1-FAF1-M12。发生的突变为:
5'-uuguuAGCuaC---cuCaCGca-3' FAF1-M1
5'-gcaagcccugccuccGgaAccU-3' FAF1-M2
FAF1-M1和FAF1-M2是分别对应智人B-1和智人B-2两个结合位点的突变。其中大写字母表示突变的位点。具体序列可见SEQ ID NO:12中的第454-2406位。
将突变的超表达载体pcDNA3.1-FAF1-M12转染DU-145细胞,结果显示突变的FAF1在36小时以后可以诱导约34%左右的DU-145细胞凋亡,远高于转染相同量的未突变FAF1所诱导的凋亡。然后我们又进一步验证了miR-24是否可以对突变的FAF1基因进行调控。我们在转染了pcDNA3.1-FAF1-M12的同时共转染miR-24-mimics,结果发现尽管在前面的实验中超表达miR-24很好的保护了超表达FAF1的DU-145细胞不凋亡,但是miR-24超表达却不能阻止突变的FAF1超表达导致的DU-145细胞凋亡。这些结果表明miR-24是通过结合到FAF1基因的ORF框上的两个结合位点对DU-145细胞的凋亡进行调控的(图4)。
实施例5:miR-24-ASO同样可以诱导HeLa细胞凋亡并影响HeLa细胞的增殖
然后,我们在HeLa细胞中转染了miR-24-ASO抑制miR-24的表达,同时检测了miR-24-ASO对HeLa细胞增殖的影响。结果显示miR-24-ASO的转染抑制了HeLa细胞的增殖。我们在转染了miR-24-ASO的48小时以后加入1nM的星胞菌素诱导HeLa细胞凋亡,结果发现抑制miR-24的表达之后,HeLa细胞对星胞菌素的耐受性明显增强。这些数据告诉我们,miR-24对细胞凋亡的调控可能不仅仅局限于DU-145细胞。抑制miR-24的表达以后可能会导致多种肿瘤细胞的凋亡(图5)。
由于DU-145细胞是激素不敏感的细胞,因此这些数据给我们提供了一个用于激素不敏感类的前列腺癌甚至其它某些肿瘤的治疗提供了一个可能的靶点。
实施例6:miR-24-ASO抑制胃癌细胞内源miR-24的表达
使用Interfer IN转染试剂分别向两株胃癌细胞HGC-27和MGC-803中转染20nMmiR-24-ASO抑制内源miR-24的表达,同时转染“种子位点”突变的miR-24-ASO,即NC-ASO作为对照。转染36小时之后显微镜下观察细胞,结果发现抑制内源性miR-24的表达之后,这两株胃癌细胞相对于对照组均出现明显的凋亡。使用Annexin V-FITC和PI进行染色,然后使用流式细胞仪对凋亡程度进行定量分析。结果发现,两株胃癌细胞HGC-27和MGC-803转染miR-24-ASO所出现的凋亡相对于对照组的凋亡水平均明显增加。转染miR-24-ASO之后的HGC-27的早期凋亡率约为14%,晚期凋亡率约为10%。相对于对照组约高了3倍左右。转染miR-24-ASO之后的MGC-803的早期凋亡率约为13%,晚期凋亡率约为11%。相对于对照组分别约高了2倍和5倍左右。结果显示在图6和7中。
实施例7:miR-24-ASO以及AOS-miR-24治疗肿瘤的动物模型实验
1.材料和方法
(1)miR-24的序列如SEQ ID NO:3所示,是一条只有22个核苷酸的RNA序列。miR-24-ASO为miR-24的反义核酸,其序列与miR-24的互补,如SEQ ID NO:4所示。miR-24-ASO的序列是固定的。但是可以选择修饰不同的剪辑或者在碱基上选择不同的修饰方式,如除了文中所用的锁核酸修饰外,2’甲氧修饰也是常用的修饰。
(2)细胞培养和转染
从中国科学院的细胞库获得293T、HeLa和DU-145细胞,在补充了10%胎牛血清(FBS)的DMEM或DMEM/F12中在37℃、5%CO2下培养这些细胞。
对于瞬时转染,用Lipofectamine2000(Invitrogene)将铺满度为70%的细胞转染上不同浓度的合成miRNA-mimics、阴性对照(NC-mimics)(Ambion)、合成LNA标记的寡-核糖核苷酸miR-24-ASO和LNA标记的NC-ASO(TaKaRa)以及根据标准方案值得的质粒。转染后,在不同时间点收集细胞,进行生化或生物学分析。
LNA标记的NC-ASO的序列为5′-caCTTATCagtcAGACCAtcGT-3′(SEQ ID NO:11);LNA标记的寡核糖核苷酸miR-24-ASO的序列为5′-ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA-3′;上述序列中小写字母表示LNA标记的位点。
(3)质粒构建
如下构建该pcDNA3.1-FAF1质粒:将FAF1cDNA(NM_007051)克隆入pcDNA3.1(-)(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位点之间。使用以下引物从人cDNA文库中克隆该FAF1cDNA:
5′-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3′ (SEQ ID NO:5)
5′-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3′(SEQ ID NO:6)。
采用前述引物SEQ ID NOS:7-10,通过PCR方法构建在miR-24结合位点中存在突变的几个FAF1突变体。
(4)荧光酶检测
合成结合位点并克隆到pGL3荧光酶载体(Promega)中荧光酶的3’UTR区域中。然后如前文所述,将所获得的构建物与PRL-SV40和miR-24-mimics或NC-mimics(Ambion)共转染入293T细胞中。48小时后,使用双重荧光酶报道子检测系统(Promega)测定荧光酶活性(三组平行试验的平均值)。
(5)凋亡分析
用不同的合成寡核苷酸或不同的载体转染DU-145细胞和HeLa细胞。额外培育36小时或48小时后,收集细胞,用碘化丙锭和FITC标记的抗膜联蛋白-V抗体染色,然后用FACS分析。
(6)细胞增殖检测
使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo)进行细胞增殖检测。将细胞接种在24孔平板上,每孔约5×104个细胞,并在生长培养基中培育。在指定时间点以还原的WST-8〔2-(2-甲氧基-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐〕的吸光度(450nm)测量三组平行试验孔中细胞数量。
(7)蛋白质提取和蛋白质印迹
用1×SDS Loading缓冲液(Sigma)收集细胞。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白,然后转移到PVDF膜。然后,用TTBS(含1%吐温的Tris缓冲液)以5%脱脂牛奶粉末(使用PBST溶解)在室温下封阻膜1小时,接着使其在含第一抗体的TTBS(含1%吐温的Tris缓冲液)中的1%脱脂奶粉中4℃过夜。用过氧化物酶偶联的第二抗体(Sigma)和化学发光(ECL)(Pierce)检测第一抗体。使用以下第一抗体:兔抗FAF(Cell signaling)和GAPDH(Abcam)。
(8)动物模型试验
首先在裸鼠皮下接种前列腺癌瘤块比肿瘤细胞悬液,建立前列腺癌肿瘤模型。
成瘤后向实验组小鼠的瘤块内注射miR-24-ASO或者FAF1-M12基因的病毒载体或者两者同时注射,同时以NC-ASO和/或不含FAF1基因的病毒载体作为对照组。
若干天后,取出肿瘤肿块观察肿块大小及形状。另外检测实验组和对照组裸鼠的前列腺癌骨髓转移情况以验证药物对前列腺癌转移能力的作用。
2.实验结果
预期在注射miR-24-ASO或者FAF1-M12基因的病毒载体或者两者同时注射后的小鼠体内的瘤块相对于对照组的瘤块在体积和质量上会变小。注射药物组的肿瘤转移能力相对于对照组明显降低。
讨论
本申请发现miR-24能够通过结合到FAF1的CDS区域调控FAF1的表达水平,从而进一步调控DU-145细胞的凋亡。同时发现了miR-24-ASO可以诱导DU-145细胞及HeLa细胞的凋亡,加深了我们对Faf1调控细胞凋亡通路的理解。
DU-145细胞是从前列腺癌脑转移中分离出来的经典的人的前列腺癌细胞系。它有中能的转移性,不表达前列腺特异抗原(PSA)并且是非激素依赖性的前列腺癌细胞。对于激素依赖性前列腺癌,通过去势、抗雄激素药物等激素疗法可以达到很好的治疗效果。但是对非激素依赖性前列腺癌,目前尚没有比较好的疗法。本申请发现miR-24-ASO、pcDNA3.1-FAF1-M12以及在miR-24-ASO抑制miR-24表达之后超表达的FAF1基因均可以很好的诱导DU-145细胞的凋亡。尤其是后两者,凋亡率分别达到了34%和70%左右。这些实验结果为我们通过miR-24/FAF1通路治疗非激素依赖性前列腺癌提供了很好的线索。
miR24是与人类肿瘤相关性很大的一个microRNA。不仅仅是因为他能够抑制抑癌基因p16的表达,同时之前的一些研究也发现来miR-24在一些肿瘤类型中的异常表达。这些都显示出来miR-24可能是一个癌基因microRNA。我们的研究结果发现miR-24可以调控DU-145细胞以及HeLa细胞的凋亡,说明miR-24/FAF1通路调控肿瘤细胞凋亡可能是一个普遍的肿瘤细胞凋亡调控机制。
综上所述,我们的研究发现miR-24能够通过结合到FAF1的ORF框上两个结合位点对FAF1基因进行调控。同时miR-24-ASO抑制miR-24的表达能够诱导DU-145细胞的凋亡。我们的研究进一步证明了microRNA可以结合到3′非翻译区以外的区域调控把记忆的理论。同时,我们的研究为非激素依赖性前列腺癌以及其它癌症的治疗提控了潜在的靶位点以及药物应用前景。