CN103215345A - 抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 - Google Patents
抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103215345A CN103215345A CN2012100197364A CN201210019736A CN103215345A CN 103215345 A CN103215345 A CN 103215345A CN 2012100197364 A CN2012100197364 A CN 2012100197364A CN 201210019736 A CN201210019736 A CN 201210019736A CN 103215345 A CN103215345 A CN 103215345A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- gene
- influenza virus
- expression
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Abstract
本发明公开了抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用。本筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法,包括从感染流感病毒的组织或者细胞中提取总mRNA,用基因组表达谱芯片筛选出表达量和未感染流感病毒细胞相比较上升或者下降的基因。本发明还提供了将所得基因应用于筛选或制备抗流感药物以及抑制流感病毒复制的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用。
背景技术
病毒感染宿主后需要利用宿主细胞的代谢过程完成病毒自身的复制,在这一过程病毒必然会调控宿主细胞内基因组的表达,抑制抗病毒基因表达,增强对病毒复制有益的基因表达。因此,病毒感染宿主细胞后,宿主细胞内表达变化的这些基因往往和病毒复制有密切的关系。通过生物学手段筛选宿主细胞内这些基因,具有机体针对病毒免疫和病毒复制机制的研究价值,同时具有潜在预防和治疗流感病毒感染的应用价值。
病毒入侵宿主过程伴随着宿主基因表达变化,最终决定感染细胞和病毒各自的命运。DNA微阵列技术结合生物信息学技术的数据分析方法,为研究细胞基因表达谱变化提供了前所未有的高通量的研究工具。微阵列已广泛的应用于人、小鼠和大鼠基因表达领域的研究,高密度微阵列已越来越多的用来分析病毒感染宿主诱导的宿主细胞基因表达差异,例如,艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)(Solis et al.(2006)Virology.352(1):86-99)登革热病毒(Dengue virus,DV)(Fink et al.(2007)PLoS Negl Trop Dis.1(2):e86)麻疹病毒(Measles virus,MV)(Sato et al.(2008)Virology.375(2):321-330)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)(Ubol et al.(2005)Microbiol Immunol.49(5):423-431)和猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)(George et al.(2003)Virology.312(1):84-94)。
由于动物基因组信息数据库的不完善,应用特异性的动物基因组微阵列研究一直滞后于人或小鼠相关领域的进展。早期曾用人基因组的微阵列(Affymetrix Human)研究牛、猪和犬等的基因表达情况(Ji et al.(2004)Int J Cancer.112(5):803-814;Shah et al.(2004)Clin Transplant.Suppl 12:76-80),直到Qiagen公司研制的(Qiagen-NRSP8 array)第一代大规模的猪基因表达谱分析芯片出现,微阵列上固定了13297cDNAs和ESTs数据库中挑选的猪基因组探针(Zhao et al.(2005)Genomics.86(5):618-625)。现在使用的Affymetrix猪全基因组芯片广泛用来研究猪全基因组转录谱,获得了众多研究成果(Tsai et al.(2004)J Virol.78(20):11360-11370;Shi et al.2009)J Genvirol.90(Pt 7):1670-1680)。
流感病毒为正粘病毒科流感病毒属分节段单股负链RNA病毒。病毒粒子刚分离时呈多晶形,在体内传代后变成球形,直径80-120nm(Palese,et al.,2007)。病毒粒子由质量比分别是0.8-1%的RNA、70-75%的蛋白质、20%的脂类和5-8%的糖类组成。
流感病毒分为A、B、C三型,其中A型(甲型)最为重要。甲型流感病毒能引起人类、猪、马和各种禽类的自然感染和发病。由于其表面抗原HA和NA容易变异,已知HA有16个亚型(H1-H16),NA有9个亚型(N1-N9),它们之间的不同组合,使甲型流感病毒有许多亚型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等),在猪体中主要流行H1N1和H3N2亚型。一般来说,流感病毒具有宿主种的适应性。在同种动物的个体之间容易发生传播。不同动物有不同的流感病毒,如猪流感、人流感、马流感,一般情况下这些流感只感染各自的本属动物。但是流感病毒有个特性是不同动物的流感间可以互相组合,形成感染多种动物的新流感病毒。另一个特点是猪这种动物比较特殊,猪对其它动物的流感病毒也易感,这是其它动物不具有的特性。所以一旦猪同时感染了人流感、猪流感、禽流感等,这多种病毒会在猪体内发生重组,可能就会出来一种既能感染猪、人、禽的流感病毒。所以狭义的猪流感不是人兽共患病。流感在人与人之间传播范围很有限,跟流感的传播途径有关。比如2009年甲型流感,就是人流感、猪流感、禽流感共同感染猪后产生的新流感病毒,最开始感染的人基本都是接触过或跟猪关系密切的人感染了。人类发展史上流感病毒的大爆发都给社会经济发展、人类健康带来重大危害。为预防和治疗流感,各国都投入了大量人力物力,不断研究治疗方法和药物。近年来,从宿主细胞内寻找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一个热门领域。
以细胞内功能分子作为抗病毒治疗的靶点具有广谱抗病毒、不易产生耐药毒株的优势,逐渐成为研究开发抗病毒治疗药物的热点途径。近年来国际高水平论文多次报道在宿主细胞内信号通路中筛选具有潜在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如,锌指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein,ZAP)能通过降解特异病毒RNA进而抑制鼠白血病病毒等多种病毒的复制,被证明是一种重要的抗病毒因子(Chen et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.105,4352-4357)。利用锌指蛋白为载体携带特异的酶阻断T细胞中的CCR5表达,可促进T细胞清除HIV病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28,839-847)。E3泛素连接酶RNF5定位于线粒体,通过泛素化修饰MITA(也称为STING)并引起其降解而负调控病毒感染后I型干扰素表达(Zhong et al.(2009)Immunity.30,397-407)。Tetherin(宿主细胞蛋白)以二聚体锚定HIV在其复制的细胞膜上,阻断病毒从胞浆膜出芽释放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139,499-511)。APOBEC3G(Apolipoprotein BmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可诱导HIV基因变(Perez-Caballeroet al.(2009)Cell.139,499-511),使病毒不能复制(Shirakawa et al.(2008)Nat.Struct.Mol.Biol.15,1184-1191)。目前细胞周期素依赖激酶、前列腺素、热休克蛋白作为药靶分子广泛用于如,HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳头状瘤等病毒病治疗。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题就是,针对现有流感病毒感染后筛选宿主体内表达量发生改变基因的方法和手段的缺陷和不足,提供一种高通量,高效率的筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法。
本发明的技术方案如下:
本发明的技术方案之一是:一种筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法,包括从感染流感病毒的组织或者细胞中提取总mRNA,用基因组表达谱芯片筛选出表达量和未感染流感病毒细胞相比较上升或者下降的基因。
其中,所述的组织或细胞是离体培养的组织或细胞,或者是从感染流感病毒的动物上取下来的组织或细胞,优选后者。所述的组织或细胞可以是感染流感病毒的动物的任何组织或细胞,组织如肺脏、心肌等,细胞如血细胞、肝细胞、肌肉细胞等,优选肺脏巨噬细胞。所述的动物可以是各种能够感染流感病毒的动物,优选哺乳动物或者禽类,更优选如人、猪、鸡等,最优选猪。
其中,所述的流感病毒选自己知的各型流感病毒,包括A、B、C型流感病毒,也包括各种亚型流感病毒,优选H1N1和H3N2亚型,该两亚型流感病毒是在猪中主要流行的流感病毒亚型。
其中,所述的表达量的比较是比较基因的mRNA浓度,优选表达量升高或者下降2倍以上的基因为抑制病毒复制相关基因。本发明中所述的“以上”包括本数。本发明更优选表达量升高或降低2-5倍以上的基因为抑制病毒复制相关基因。研究发现,并不是倍数变化越高,抑制病毒功能越强。有些非常重要的基因并不需要变化太多倍数就能有显著抑制作用,抑制病毒作用与这个基因在细胞中发挥的功能有关。
其中,所述的基因组表达谱芯片是常规的基因组表达谱芯片,优选猪基因组表达谱芯片,更优选猪全基因组表达谱芯片。
本发明的技术方案之二是:选自表1和表2中所述的基因在筛选或制备抗流感药物中的用途。
本发明的技术方案之三是:一种筛选抗流感药物的方法,包括:
(1)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触,所述的细胞是表达选自表1和表2中所述的基因的细胞:
(2)测试流感病毒滴度;
(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。
其中,所述的筛选抗流感药物的方法中,对于表达选自表1第1组的56个基因的细胞,优选所述基因表达被抑制的细胞。
其中,所述的基因表达被抑制的细胞优选通过使该细胞含有所述siRNA或者是含有编码有所述siRNA的重组载体使该基因沉默。
其中,所述的筛选抗流感药物的方法中,对于表达选自表1第2组的99个基因的细胞,优选过表达所述基因的细胞。
其中,所述的过表达基因的细胞优选通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件,如使用强启动子,或者使用增强子的方法,使该基因过表达。
本发明的技术方案之四是:一种抑制流感病毒复制的方法,包括利用分子生物学方法使宿主细胞内的相关基因过表达,所述的相关基因选自表1第1组的56个基因中的一种或多种;或者使宿主细胞内的相关基因沉默或敲除,所述的相关基因选自表2第2组的99个基因中的一种或多种。
其中,所述的基因优选第1组中的转录因子A基因和对氧磷酸酶3基因。
其中,所述的基因优选第2组中的小窝蛋白2基因和表面活性蛋白D基因。
其中,所述的基因过表达方法是常规方法,优选通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件,如使用强启动子,或者使用增强子的方法,使基因过表达。
其中,所述的基因沉默或敲除的方法也是常规方法,优选通过使宿主细胞含有所述基因的小干扰RNA(siRNA)或者是含有编码有所述小干扰RNA的重组载体使该基因沉默,或者利用基因打靶技术将目标基因敲除。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外,均市售可得。
相比于现有技术,本发明的有益效果如下:本发明中的筛选方法可以大规模,高通量筛选流感病毒感染后宿主体内表达量发生改变的基因,并分别得到表达量上调和下调2倍的两组基因。通过该方法,一方面我们可以更加深刻了解宿主对流感病毒的免疫机制;另一方面,我们可以利用这种方法开发更好的抗流感药物。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1是Western-blot检测沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达的结果,其中1:siRNA-小窝蛋白2;2:siRNA-小窝蛋白2对照;3:未接毒对照;4:正常细胞。
图2是Western-blot检测沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D表达的结果,其中1:siRNA-表面活性蛋白D;2:siRNA-表面活性蛋白D对照;3:未接毒对照;4:正常细胞。
图3是沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达后流感病毒滴度图。
图4是沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D表达后流感病毒滴度图。
图5是构建的pCDNA 3.1-转录因子A载体图谱。
图6是构建的pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3载体图谱。
图7是细胞中转录因子A和对氧磷酸酶3免疫印迹检测结果,其中
1:pCDNA 3.1-转录因子A;2:pCDNA 3.1空载体对照;3:正常细胞
4:pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3;5:pCDNA 3.1空载体对照;6:正常细胞。
图8是外源提高表达犬肾细胞中转录因子A后流感病毒滴度结果。
图9是外源提高表达犬肾细胞中对氧磷酸酶3后流感病毒滴度结果。
图10是小窝蛋白2沉默的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。
图11是表面活性蛋白D沉默的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。
图12是外源提高转录因子A表达的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。
图13是外源提高对氧磷酸酶3表达的犬肾细胞中加入金刚烷胺后流感病毒滴度图。
具体实施方式
本发明人利用基因组表达谱芯片,将病毒感染前后的细胞的基因表达谱进行分析,筛选表达量改变的基因,并对这些基因进行了进一步的抗流感病毒功能验证,发现这些流感病毒复制相关基因,进而提供了这些基因用于抗流感病毒药物的筛选和制备的方法,从而完成了本发明。
筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法
本发明提供一种筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法,包括从感染流感病毒的组织或者细胞中提取总mRNA,用猪基因组表达谱芯片筛选出表达量和未感染流感病毒细胞相比较上升或者下降的基因。
本发明通过将感染流感病毒细胞和未感染流感病毒细胞进行比较,比较这些细胞中的各基因的表达量变化来筛选相关基因。流感病毒感染细胞后,直接或间接地影响细胞内基因的表达及蛋白质的生成。通过对宿主被流感病毒感染前后两组样品进行表达谱生物芯片检测,可以反映出流感病毒作用后相应组织或细胞中基因表达谱及蛋白质等的变化,从而筛选出抑制病毒复制相关基因。
其中,所述的组织或细胞可以是离体培养的组织或细胞,也可以是从感染流感病毒的动物身上取出来的组织或细胞,优选后者。所述的组织或细胞可以是感染流感病毒的动物的任何组织或细胞,组织如肺脏、心肌等,细胞如血细胞、肝细胞、肌肉细胞等,优选肺脏巨噬细胞。流感病毒主要引起呼吸系统感染,肺脏是流感病毒聚集的器官,肺泡巨噬细胞是流感很易感的细胞,比较有代表性。其它组织类型也可选择,气管、支气管这些气管上皮细胞也是流感病毒非常易感细胞。所述的动物可以是各种能够感染流感病毒的动物,优选哺乳动物或者禽类,更优选如人、猪、鸡等,最优选猪。
其中,所述的流感病毒选自己知的各型流感病毒,包括A、B、C型流感病毒,也包括各种亚型流感病毒,优选H1N1和H3N2亚型,该两亚型流感病毒是在猪中主要流行的流感病毒亚型。
其中,所述的表达量的比较是比较基因的mRNA浓度,优选表达量升高或者下降2倍以上的基因为抑制病毒复制相关基因。本发明中所述的“以上”包括本数。本发明更优选表达量升高或降低2-5倍以上的基因为抑制病毒复制相关基因。
其中,提取总mRNA的方法是常规技术,一般可以采用商品试剂盒,用Trizol法提取。其中采用的基因组表达谱芯片是常规的基因组表达谱芯片,是指采用光导原位合成或微量点样等方法,将基因组所有的转录子序列以阵列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析来判断样品中靶分子的种类和数量,从而实现对mRNA的检测。较佳的如Affymetrix公司生产的猪全基因组表达谱芯片。本发明利用基因组表达谱对感染流感病毒前后的细胞的表达谱进行分析。该方法将样品制备、生化反应和结果检测3个部分有机的结合起来,具有快速、高通量、高信息量、平行化、集约化、微型化、自动化、成本低、污染少等优点。
本发明从感染流感病毒的猪中提取总mRNA,用基因组芯片筛选出表达量和未感染流感病毒细胞相比较上升或者下降2倍的基因。这些基因如表1和表2中所示。其中,第1组(表1)中共56个基因是猪感染流感病毒后表达倍数升高2倍以上的基因,第2组(表2)中共99个基因是猪感染流感病毒后表达倍数下降2倍以上的基因。
本发明利用分子生物学方法调控宿主细胞内这些基因或包括这些基因的一组基因的表达,发现可以抑制宿主细胞内流感病毒复制,因此这些基因是抑制流感病毒复制相关基因。所述的分子生物学方法是常规方法,包括使宿主细胞过表达基因,可以通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件,如使用强启动子,或者使用增强子的方法,使该基因过表达。还包括使宿主细胞中该基因的表达被抑制,可以通过使宿主细胞含有所述基因的小干扰RNA(siRNA)或者是含有编码有所述小干扰RNA的重组载体使该基因沉默。
表1.(第1组)基因信息
表2.(第2组)基因信息
筛选抗流感药物的方法
本发明提供一种筛选抗流感药物的方法,包括:
(1)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触,所述的细胞是表达选自表1和表2中所述的基因的细胞;
(2)测试流感病毒滴度;
(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。
表1第1组的56个基因,是猪感染流感病毒后表达上升的基因,对于表达选自表1第1组的56个基因的细胞,优选所述基因被过表达的细胞,该细胞使流感病毒对抗流感病毒药物更敏感,从而快速筛选到目标抗流感病毒药物。其中,所述的过表达基因的细胞,可以通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件,如使用强启动子,或者使用增强子的方法,使该基因过表达。本发明优选的是第1组中的转录因子A基因和对氧磷酸酶3基因被过表达的细胞。
表2第2组的99个基因,是猪感染流感病毒后表达下降的基因。在本发明的筛选抗流感药物的方法中,对于表达选自表2第2组的99个基因的细胞,优选所述基因被抑制的细胞,通过抑制所述表2中99个基因表达使细胞中的流感病毒对抗流感病毒药物更敏感,从而可以快速筛选到目标抗流感病毒药物。其中,所述的基因表达被抑制的细胞,可以通过使该细胞含有所述siRNA或者是含有编码有所述siRNA的重组载体使该基因沉默。本发明优选的是第2组中的小窝蛋白2基因和表面活性蛋白D基因被抑制的细胞株。
本发明中,测试流感病毒滴度的方法是本领域常规方法,如很多文献所述。
抑制流感病毒复制的方法
本发明提供一种抑制流感病毒复制的方法,包括利用分子生物学方法使宿主细胞内的相关基因过表达,所述的相关基因选自表1第1组的56个基因中的一种或多种;或者使宿主细胞内的相关基因沉默或敲除,所述的相关基因选自表2第2组的99个基因中的一种或多种。
本发明中,所述的基因是选自表1第1组的56个基因中的一种或多种;或者是选自表2第2组的99个基因中的一种或多种。优选的是第1组中的转录因子A基因和对氧磷酸酶3基因,宿主中的这两个基因中的任何一个或两个被过表达后,宿主能够抑制流感病毒复制。优选的也可以是第2组中的小窝蛋白2基因和表面活性蛋白D基因,宿主中的这两个基因中的任何一个或两个被抑制后,宿主能够抑制流感病毒复制。
小窝蛋白2基因,Genbank数据库登录号:NM_001123091.1;
表面活性蛋白D基因,Genbank数据库登录号:NM_214110.1;
转录因子A基因(TFAM),Genbank数据库登录号:NM_001130211.1;
对氧磷酸酶3基因(PON3),Genbank数据库登录号:NM_001044604.1。
其中,所述的基因过表达方法是常规方法,可以通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件,如使用强启动子,或者使用增强子的方法,使基因过表达。
其中,所述的基因沉默或敲除的方法也是常规方法,可以通过使宿主细胞含有所述基因的小干扰RNA(siRNA)或者是含有编码有所述小干扰RNA的重组载体使该基因沉默。或者利用基因打靶技术将目标基因敲除。所述的基因打靶技术是现有技术,一般通过敲除载体经同源重组双交换将基因敲除。
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。实施例中所用的试剂除特别说明之外,均市售可得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所用猪流感病毒H3N2 Swine/Guangdong/1/2006(SwGD1/05)毒株,其生物学特性能代表我国的猪流感病毒特点。
6孔细胞培养板,美国Corning产品。
DMEM培养基,美国GIBCO产品,REF:16000-044。
青霉素,美国GIBCO公司产品,REF:15140-122。
链霉素,美国GIBCO公司产品,REF:15140-122。
犬肾细胞(MDCK细胞),购自中科院上海生命科学研究院细胞库。
1.5ml离心管,美国Axygen公司产品。
丙酮,江苏强盛化工有限公司,许可证号:XK13-201-00227。
PBS,购自美国GIBCO公司,REF:20012-027。
PBST:配制方法参考《分子克隆实验指南》第三版。
羊抗小鼠FITC标记的荧光抗体,美国Invitrogen公司产品,Code:CA11034s。
100%甘油,国药集团化学试剂有限公司。
实施例1宿主细胞内抑制流感病毒复制相关基因筛选
(1)实验猪分组
挑选6头生长状况良好,50-60日龄三元杂交长白猪。确保这些猪未注射任何流感病毒疫苗,并无猪肺炎支原体,败血性巴氏杆菌,支气管败血菌,胸膜肺炎感染,无H1和H3流感病毒抗体。在猪舍进行一周适应性饲养后,平均分成2组,每组3头猪。分别隔离饲养在攻毒猪舍(猪编号为:攻毒猪1#、攻毒猪2#和攻毒猪3#)和对照猪舍(猪编号为:对照猪1#、对照猪2#和对照猪3#)。
(2)猪肺脏巨噬细胞收集
对3头对照组猪颈部肌肉注射0.5ml陆眠宁I麻醉剂(吉林省华牧动物保健品有限公司,生产许可证号:2006兽药生产证字07001号),10min后猪处于全身麻醉状态。鼻腔接种SPF(无特定病原)鸡胚尿囊液1ml,猪约10min后完全清醒。
对3头攻毒组猪颈部肌肉注射0.5ml陆眠宁I麻醉剂,10min后猪处于全身麻醉状态。鼻腔接种H3N2猪流感病毒SPF(无特定病原)鸡胚毒1ml(病毒滴度108EID50),猪约10min后完全清醒。
H3N2猪流感病毒鸡胚尿囊液制备:无特定病原鸡蛋(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)放于35℃温箱孵育至9-11日胚龄,用照卵灯检测鸡胚,在气室上与胚头相对的一侧划线。用碘酒、酒精消毒气室部位,然后在划线处打孔。将H3N2病毒用1ml注射器,5号针头深入约0.5-1cm注入0.2ml病毒液,最后用蜡封口。接种后的鸡胚放置35℃温箱孵育四天,每天照视一次,观察鸡胚死活情况,24小时前死亡的鸡胚弃去,24小时后死亡的鸡胚或不死亡的胚在72小时收获。收获前先将鸡胚移至4℃过夜,75%酒精消毒鸡胚气室部分。用无菌镊子将消毒过的壳打碎,再用另一把无菌镊子将壳膜和绒毛尿囊膜撕开,并将鸡胚轻轻推向一侧,压住。用毛细吸管收尿囊液,3000转离心5分钟去除尿囊液中沉淀。收获后的尿囊液放-70℃低温冰箱保存备用。
按照如上方法,不接种H3N2病毒正常的无特定病原鸡胚制备的尿囊液作为对照样品。
每天观察猪临床症状,测定体温。攻毒后第3天,攻毒组3头猪出现体温升高至40.0-41.0℃范围,多数猪出现呼吸困难、频率超过45次/min,经常听到攻毒组猪有咳嗽、喷嚏音。剖杀攻毒组猪和对照组猪,取肺脏,分离肺脏巨噬细胞(可参考文献:肖燕.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后猪肺泡巨噬细胞差异表达基因的研究[D].北京:中国农业科学院,2009.p20;Kim et al.(2008)J virol.82(9):4265-4274)。巨噬细胞样品分别编号为:攻毒组猪1#巨噬细胞、攻毒组猪2#巨噬细胞和攻毒组猪3#巨噬细胞,对照组猪1#巨噬细胞、对照组猪2#巨噬细胞和对照组猪3#巨噬细胞。
(3)宿主细胞内抑制流感病毒基因筛选
将攻毒组猪和对照组猪共6个巨噬细胞样品各用一张Affymetrix公司猪全基因组表达谱芯片(产品编号:AFF-900623)检测,攻毒组猪和对照组猪肺泡巨噬细胞内基因表达变化检测由上海博豪生物技术有限公司完成。
具体步骤:(1)样品RNA的放大和标记。实验样品RNA采用Affymetrix表达谱芯片配套试剂盒,GeneChip 3′IVT Express Kit(Cat#901229,Affymetrix,Santa Clara,CA,US)和标准操作流程对样品total RNA中的mRNA进行放大、标记和纯化,获得带有生物素(biotin)标记的cRNA。
(2)芯片杂交。按照Affymetirx表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒,GeneChip Hybridization,Wash and Stain Kit(Cat#900720,Affymetrix,Santa Clara,CA,US),在滚动杂交炉,Hybridization Oven 645(Cat#00-0331-220V,Affymetrix,Santa Clara,CA,US)中45℃,16小时滚动杂交,杂交完成后在洗涤工作站Fluidics Station 450(Cat#00-0079,Atfymetrix,Santa Clara,CA,US)按照Affymetrix提供的标准操作流程进行芯片的洗涤。
(3)结果扫描。芯片结果采用GeneChip Scanner3000(Cat#00-00212,Affymetrix,Santa Clara,CA,US)读取原始数据,质控合格的数据采用Gene Spring Software 11.0(Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)进行归一化处理,所用的算法为MAS5.0。最终获得的是巨噬细胞中全基因组表达变化的数值,该值以倍数表示。
抑制流感病毒宿主相关基因的筛选按照如下方法:(1)攻毒组猪和对照组猪相比表达倍数升高2倍的基因,这些基因形成第1组(见表1);(2)攻毒组猪和对照组猪相比表达倍数下降2倍的基因,这些基因形成第2组(见表2)。
实施例2调控宿主细胞内基因表达抑制流感病毒复制
1siRNA(小干扰RNA)沉默第2组中基因表达抑制流感病毒复制
(1)siRNA分子设计
随机选取第2组中基因(本实施例选择小窝蛋白2,Genbank数据库登录号:NM_001123091.1;表面活性蛋白D,Genbank数据库登录号:NM_214110.1,但不局限于这两个基因),使用Dharmacon在线设计软件设计siRNA分子,设计小窝蛋白2基因特异性的siRNA干扰序列;并以“siRNA-小窝蛋白”随意打乱序列作为对照。设计表面活性蛋白D基因特异性的siRNA干扰序列;并以“siRNA-表面活性蛋白D”随意打乱序列作为对照。设计的siRNA双链干扰分子主体序列为19个碱基,正义链3′端多加两个UU,反义链3′端多加两个TT。
设计的序列如下:
针对小窝蛋白2靶序列5’-GCAAATACGTGATCTACAA-3’;
siRNA-小窝蛋白2正义链序列5’-GCAAAUACGUGAUCUACAAUU-3’;
siRNA-小窝蛋白2反义链序列3’-TTCGUUUAUGCACUAGAUGUU-5’;
siRNA-小窝蛋白2对照正义链序列5’-CGAUAGAUGUACACAUACAUU-3’;
siRNA-小窝蛋白2对照反义链序列3’-TTGCUAUCUACAUGUGUAUGU-5’;
针对表面活性蛋白D靶序列5’-GAGCAGAAATGAAGACCTA-3’;
siRNA-表面活性蛋白D正义链序列5’-GAGCAGAAAUGAAGACCUAUU-3’;
siRNA-表面活性蛋白D反义链序列3’-TTCUCGUCUUUACUUCUGGAU-5’;
siRNA-表面活性蛋白D对照正义链5’-CAGAGUGACAGAAGACAUAUU-3’;
siRNA-表面活性蛋白D对照反义链3’-TTGUCUCACUGUCUUCUGUAU-5’。
经NCBI blast分析干扰序列与“小窝蛋白或表面活性蛋白D”以外的基因同源性小于50%,对照序列与猪基因组所有序列同源性小于50%。
根据该设计的siRNA序列,由Dharmacon公司体外人工合成双链siRNA。
(2)siRNA分子转染细胞
将胰酶消化的MDCK细胞用无血清的DMEM(含100个单位青霉素和100个单位链霉素)传于6孔细胞培养板中,细胞密度4×106细胞/孔,继续培养于37℃、5%CO2温箱中。待细胞生长满培养板底的80-90%,将本发明所述siRNA用FuGENE HD试剂(Roche公司,美国,产品编号:04709705001)转染到MDCK细胞中,操作过程按说明书。同时设转染对照干扰序列样品siRNA-小窝蛋白2对照、未转染对照、正常细胞对照。
(3)siRNA转染细胞接毒及样品收集
MDCK细胞转染siRNA分子后24h接种流感病毒H3N2,接种剂量1×103EID50/孔(6孔板)。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000g/min离心10min,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版),2007年》。
细胞中小窝蛋白2被siRNA分子沉默后(如上接种病毒后第24h样品),Westem-blot检测结果见图1,结果表明沉默组中小窝蛋白2表达水平明显低于对照。
细胞中表面活性蛋白D被siRNA分子沉默后(如上接种病毒后第24h样品),Western-blot检测结果见图2,结果表明沉默组中表面活性蛋白D表达水平明显低于对照。
实验结果如图1、2所示,表明MDCK细胞中小窝蛋白2、表面活性蛋白D表达被siRNA分子沉默后接种流感病毒,在24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度和对照组相比显著降低,并且差异显著。siRNA-小窝蛋白2和siRNA-小窝蛋白2对照组相比p值分别为p=0.0004(24h)、0.001(48h)、0.015(72h);siRNA-表面活性蛋白D和siRNA-表面活性蛋白D对照组相比p值分别为p=0.004(24h)、0.001(48h)、0.009(72h)。
上述实验结果证明调控第2组中小窝蛋白2和表面活性蛋白D基因表达能够抑制宿主细胞内流感病毒的复制。
2外源性提高宿主细胞内第1组中基因表达抑制流感病毒复制
(1)外源表达第1组中基因表达载体的构建
将转录因子A(TFAM)(Genbank数据库登录号:NM_001130211.1)基因的开放阅读框(连接到pCDNA 3.1(+)载体(Invitrogen公司,美国;货号:V790-20)HindIII和EcoR V酶切位点间,操作过程参考《分子克隆实验指南》第三版。具体方法为:把Genbank中登录号为NM_001130211.1的转录因子A基因序列输入到DNAStar软件(DNASTAR公司,美国)EditSeq中,选取序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列741bp碱基。分别在5′和3′端设计扩增全长PCR引物,上游引物5′端添加HindIII酶切位点,CGG作为保护性碱基,下游引物5′端添加EcoR V酶切位点。上下游引物序列如下:上游引物
5′-CGGATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGT-3′(双划线为HindIII酶切位点);下游
引物5′-CGGTCAACACTCCTCAGTGTCTTTC-3′(双划线为EcoR V酶切位点)。以猪肺巨噬细胞提取总RNA反转录产物为模板,用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列,然后经过酶切后连接到pCDNA 3.1(+)载体相应酶切位点。构建成功的载体命名为pCDNA 3.1-转录因子A,见图5。
将对氧磷酸酶3(PON3)(Genbank数据库登录号:NM_001044604.1)基因开放阅读框连接到pCDNA 3.1(+)载体(Invitrogen公司,美国;货号:V790-20)HindIII和EcoRI酶切位点间,操作过程参考《分子克隆实验指南》第三版。具体方法为:把Genbank中登录号为NM_001044604.1的对氧磷酸酶3基因序列输入到DNAStar软件(DNASTAR公司,美国)EditSeq中,选取从序列中从起始密码子“ATG”到终止密码子“TGA”、“TAG”或“TAA”之间最长的序列1065bp碱基。分别在5′和3′端设计扩增全长PCR引物,上游引物5′端添加HindIII酶切位点,CGG作为保护性碱基,下游引物5′端添加EcoR I酶切位点。上下游引物序列如下:上游引物
5′-CGGATGGGGAAGCTGGTGGCTCTGA-3′(双划线为HindIII酶切位点);下游引物5′-CGGCTAGAGCACACAGTACAGAGCT-3′(双划线为EcoR I酶切位点)。以猪肺巨噬细胞提取总RNA反转录产物为模板,用设计的上下游引物PCR扩增得到转录因子A序列,然后经过酶切后连接到pCDNA 3.1(+)载体相应酶切位点。构建成功的载体命名为pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3,见图6。
(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白
将胰酶消化的MDCK细胞用无血清的DMEM(含100个单位青霉素和100个单位链霉素)传于6孔细胞培养板中,细胞密度4×106细胞/孔,继续培养于37℃、5%CO2温箱中。待细胞生长满培养板底的80-90%,用FuGENE HD试剂(Roche公司,美国,产品编号:04709705001)把pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3载体分别转染到MDCK细胞中,操作过程按说明书。同时设转染pCDNA 3.1(+)空载体的细胞对照。
细胞转染后24h,收集转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3、pCDNA3.1(+)空载体和正常细胞样品。细胞总蛋白提取:用PBS漂洗6孔细胞板中细胞2次,然后加1ml PBS将细胞用细胞刮铲刮下,4℃,3000g离心5min沉淀细胞,弃上清。向细胞沉淀加入100μl的细胞裂解液(碧云天公司,产品编号:P0013),重悬细胞,在冰上裂解5min,然后用超声波细胞破碎仪(Sonics公司,美国,型号VCX105PB)瞬时破碎(40HZ,1S),沸水煮5min,4℃下13000g离心10min,弃去沉淀。取2μl蛋白上清用BCA试剂盒(碧云天公司,产品编号:P0012)测定蛋白浓度,按照说明书操作。余下蛋白上清加入5×SDS PAGE buffer(配制方法见《分子克隆实验指南》第三版),沸水煮5min,4℃下13000g离心5min,取上清进行蛋白质电泳。
变性SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白转印(步骤参考《分子克隆实验指南》第三版):每个蛋白样品上样量为30μg,SDS-PAGE电泳仪(北京六一仪器厂)80V电压层积蛋白,120V电压分离蛋白,直至电泳结束。蛋白转印使用硝酸纤维素膜(Whatman公司,美国,产品型号:10401396)。伯乐电泳槽恒压65V,2h。转印结束后NC膜浸入5%(w/v)TBST-脱脂乳中进行封闭。室温作用2h后,弃去封闭液,用含1%(v/v)吐温20的TBST(pH7.6)缓冲液漂洗3次,洗去残留脱脂乳,即用于抗体孵育。
抗体反应及显色:加入一抗,对氧磷酸酶3抗体(Abcam,美国,产品编号:ab40969),转录因子A抗体(antikoerper-online.de公司,德国,产品编号:ABIN484435)。4℃下轻摇振荡过夜(12h-16h),然后用100%TBST洗3次后,每次5min。之后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗,室温作用2h,用TBST漂洗3次后,每次5min。ECL试剂盒(Pierce公司,美国,产品编号:32106)显色在暗室中操作。操作按照ECL试剂盒说明书。
检测内参对照:将已显色的膜浸入抗体剥脱液(碧云天公司,产品编号:P0025)中,50℃孵育30min,每10min震荡一次,然后用TBST缓冲液(配制方法:参考《分子克隆实验指南》第三版)漂洗3次,加入封闭液再封闭15min,使用抗β-actin抗体(碧云天公司,产品编号:AA128)作为一抗检测样品中蛋白量。
检测结果见图7,表明MDCK细胞中转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3后,细胞中“转录因子A”和“对氧磷酸酶3”的表达量高于转染pCDNA 3.1(+)空载体组和正常细胞组。
(3)外源性提高MDCK细胞中“转录因子A”或“对氧磷酸酶3”具有抑制流感病毒作用
细胞转染pCDNA 3.1-转录因子A、pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3或pCDNA 3.1(+)空载体后24h,接种剂量1×103EID50/孔(6孔板)猪流感病毒。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000转/min离心10min,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版),2007年》。
实验结果(图8、9)表明,MDCK细胞中转录因子A、对氧磷酸酶3被外源性提高表达,在24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度和对照组相比显著降低,并且差异显著。转染pCDNA 3.1-转录因子A组与转染pCDNA 3.1(+)空载体组相比p值分别为p=0.002(24h)、0.014(48h)、0.0005(72h);转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3组和转染pCDNA3.1(+)空载体组相比p值分别为p=0.015(24h)、0.008(48h)、0.012(72h)。转染pCDNA3.1(+)空载体组和正常细胞中病毒滴度差异不显著(p>0.05)。
上述实验结果表明调控第一组中转录因子A和对氧磷酸酶3基因表达能够抑制宿主细胞内流感病毒的复制。
实施例3调控宿主细胞内基因表达显著提高流感病毒药物的抗病毒效果
本实施例中通过调节犬肾细胞中蛋白表达后再感染H3N2猪流感病毒,利用向细胞培养液中加入金刚烷胺,研究调控细胞中蛋白对金刚烷胺抗流感病毒增强效果。金刚烷胺通过干扰流感病毒粒子M2蛋白离子通道,抑制病毒的复制的功能。
1沉默犬肾细胞中小窝蛋白2显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果
(1)沉默犬肾细胞中小窝蛋白2表达。具体步骤同实施例2。
(2)金刚烷胺准备。盐酸金刚烷胺购自阿法埃莎(天津)化学有限公司,用生理盐水配制成20mg/ml,过滤除菌,4℃保存。
(3)siRNA分子转染细胞。具体步骤同实施例2。联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺,终浓度至0.4μg/ml,分组如下:siRNA-小窝蛋白+金刚烷胺(0.4μg/ml)、siRNA-小窝蛋白2对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)。
(4)siRNA转染细胞接毒及样品收集。同实施例2。实验结果如图10所示,表明MDCK细胞中小窝蛋白2表达被siRNA分子沉默后能显著提高金刚烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度siRNA-小窝蛋白+金刚烷胺(0.4μg/ml)组显著低于siRNA-小窝蛋白2对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)组,p值分别为p=0.016(24h)、0.001(48h)、0.001(72h)。
上述实验结果证明调控小窝蛋白2基因表达能够提高金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。
2沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果
(1)沉默犬肾细胞中表面活性蛋白D表达。具体步骤同实施例2。
(2)金刚烷胺准备。盐酸金刚烷胺购自阿法埃莎(天津)化学有限公司,用生理盐水配制成20mg/ml,过滤除菌,4℃保存。
(3)siRNA分子转染细胞。具体步骤同实施例2。联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺,终浓度至0.4μg/ml,分组如下:siRNA-表面活性蛋白D+金刚烷胺(0.4μg/ml)、siRNA-表面活性蛋白D对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)。
(4)siRNA转染细胞接毒及样品收集。同实施例2。实验结果如图11所示,表明MDCK细胞中表面活性蛋白D表达被siRNA分子沉默后能显著提高金刚烷胺抑制流感病毒的效果。24h、48h、72h细胞中流感病毒滴度siRNA-表面活性蛋白D+金刚烷胺(0.4μg/ml)组显著低于siRNA-表面活性蛋白D对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)组,p值分别为p=0.020(24h)、0.025(48h)、0.130(72h)。
上述实验结果证明调控表面活性蛋白D基因表达能够提高金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。
3外源性提高宿主细胞内转录因子A表达显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果
(1)外源表达第1组中基因表达载体的构建。具体步骤同实施例2。
(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白。具体步骤同实施例2。
(3)外源性提高MDCK细胞中转录因子A后金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。
细胞转染pCDNA 3.1-转录因子A或pCDNA 3.1(+)空载体后24h,接种剂量1×103EID50/孔,联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺,终浓度至0.4μg/ml,设置以下实验组:转染pCDNA 3.1-转录因子A+金刚烷胺(0.4μg/ml)、转染pCDNA 3.1(+)空载体+金刚烷胺(0.4μg/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000转/min离心10min,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版),2007年》。
实验结果如图12所示,MDCK细胞中转录因子A被外源性提高表达,在24h、48h、72h细胞中转染pCDNA 3.1-转录因子A+金刚烷胺(0.4μg/ml)组和转染pCDNA 3.1(+)空载体+金刚烷胺(0.4μg/ml)相比显著降低,并且差异显著,p值分别为p=0.310(24h)、0.013(48h)、0.007(72h)。
上述实验结果表明调控转录因子A基因表达能够显著增强金刚烷胺抑制流感病毒复制。
4外源性提高宿主细胞内对氧磷酸酶3表达显著提高金刚烷胺抑制流感病毒效果
(1)外源表达第1组中基因表达载体的构建。具体步骤同实施例2。
(2)重组载体转染细胞及表达宿主蛋白。具体步骤同实施例2。
(3)外源性提高MDCK细胞中对氧磷酸酶3后金刚烷胺抑制流感病毒复制的效果。
细胞转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3或pCDNA 3.1(+)空载体后24h,接种剂量1×103EID50/孔,联合用药组在细胞培养液中加金刚烷胺,终浓度至0.4μg/ml,设置以下实验组:转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3+金刚烷胺(0.4μg/ml)、转染pCDNA 3.1(+)空载体+金刚烷胺(0.4μg/ml)、未转染对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)和正常细胞对照+金刚烷胺(0.4μg/ml)。在接种病毒后第24h、48h、72h收取样品。方法如下:将细胞培养板中细胞、连同细胞培养液冻融3次,5000转/min离心10min,保留上清,弃沉淀。测定上清中流感病毒滴度。病毒滴度测定方法参考《国家流感中心标准操作规程(修订版),2007年》。
实验结果13表明,MDCK细胞中对氧磷酸酶3被外源性提高表达,在24h、48h、72h细胞中转染pCDNA 3.1-对氧磷酸酶3+金刚烷胺(0.4μg/ml)组和转染pCDNA 3.1(+)空载体+金刚烷胺(0.4μg/ml)相比显著降低,并且差异显著,p值分别为p=0.042(24h)、0.088(48h)、0.069(72h)。
上述实验结果表明调控氧磷酸酶3基因表达能够显著增强金刚烷胺抑制流感病毒复制。
所有利用实施例1筛选到的基因(总结于“第1组”和“第2组”),通过调控其表达量都具有抑制流感病毒复制的作用。本发明实施例不局限于实施例2采用的调控宿主细胞内基因、蛋白表达的方法,所有能提高或降低宿主细胞内蛋白表达的方法都可以发挥本发明的效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇被单独应用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种筛选抑制流感病毒复制相关基因的方法,其特征在于,包括从感染流感病毒的组织或者细胞中提取总mRNA,用基因组表达谱芯片筛选出表达量和未感染流感病毒细胞相比较上升或者下降的基因。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的细胞是从感染流感病毒的动物上取下来的肺脏巨噬细胞。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的动物是哺乳动物或者禽类。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的动物是猪。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的表达量的比较是比较基因的mRNA浓度,选择表达量升高或者下降2倍以上的基因。
6.选自表1和表2中所述的基因在筛选或制备抗流感药物中的用途。
7.一种筛选抗流感药物的方法,其特征在于,包括:
(1)使候选药物与感染流感病毒的细胞接触,所述的细胞是表达选自表1和表2中所述的基因的细胞;
(2)测试流感病毒滴度;
(3)选择使流感病毒滴度下降的候选药物。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的筛选抗流感药物的方法中,对于表达选自表1第1组的56个基因的细胞,该细胞是所述基因表达被抑制的细胞;对于表达选自表2第2组的99个基因的细胞,该细胞是过表达所述基因的细胞。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的基因表达被抑制的细胞是通过使该细胞含有siRNA或者是含有编码siRNA的重组载体使该基因沉默;所述的过表达基因的细胞是通过增加细胞内该基因的拷贝数或者改良该基因的调控元件使该基因过表达。
10.一种抑制流感病毒复制的方法,其特征在于,包括利用分子生物学方法使宿主细胞内的相关基因过表达,所述的相关基因选自表1第1组的56个基因中的一种或多种;或者使宿主细胞内的相关基因沉默,所述的相关基因选自表2第2组的99个基因中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210019736.4A CN103215345B (zh) | 2012-01-20 | 2012-01-20 | 抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210019736.4A CN103215345B (zh) | 2012-01-20 | 2012-01-20 | 抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103215345A true CN103215345A (zh) | 2013-07-24 |
CN103215345B CN103215345B (zh) | 2018-04-06 |
Family
ID=48813495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210019736.4A Expired - Fee Related CN103215345B (zh) | 2012-01-20 | 2012-01-20 | 抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103215345B (zh) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134939A2 (en) * | 2008-12-19 | 2010-11-25 | Zirus, Inc. | Mammalian genes involved in infection |
-
2012
- 2012-01-20 CN CN201210019736.4A patent/CN103215345B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010134939A2 (en) * | 2008-12-19 | 2010-11-25 | Zirus, Inc. | Mammalian genes involved in infection |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
MIRCO SCHMOLKE等: "Essential Impact of NF-kB Signaling on the H5N1 Influenza A Virus-Induced Transcriptome", 《THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY》, no. 183, 28 September 2009 (2009-09-28), pages 5180 - 5889 * |
万玉立: "甲型流感病毒感染A549细胞的表达谱分析及相关基因功能研究", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, 15 December 2011 (2011-12-15), pages 059 - 65 * |
胡晓芬: "高致病性禽流感病毒H5N1安徽株A/Anhui/1/2005感染人肺癌上皮细胞(A549)的差异表达分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 050 - 5 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103215345B (zh) | 2018-04-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yuan et al. | Genome analysis of newly emerging goose-origin nephrotic astrovirus in China reveals it belongs to a novel genetically distinct astrovirus | |
CN106103715A (zh) | 沙门氏菌的非编码性rna及其鉴定和应用 | |
Wang et al. | Differential expression of microRNAs in avian leukosis virus subgroup J-induced tumors | |
Zhu et al. | Mammalian-adaptive mutation NP-Q357K in Eurasian H1N1 swine influenza viruses determines the virulence phenotype in mice | |
CN109609651A (zh) | 一种诊治胶质瘤的分子标志物及其应用 | |
Vascellari et al. | Pathologic findings of highly pathogenic avian influenza virus A/Duck/Vietnam/12/05 (H5N1) in experimentally infected pekin ducks, based on immunohistochemistry and in situ hybridization | |
CN112587663B (zh) | 长链非编码RNA-lncIVRL在防治甲型流感病毒感染中的应用 | |
Hao et al. | Internal gene cassette from a genotype S H9N2 avian influenza virus attenuates the pathogenicity of H5 viruses in chickens and mice | |
Barnard et al. | Sequence dynamics of three influenza A virus strains grown in different MDCK cell lines, including those expressing different sialic acid receptors | |
Xu et al. | Infection and innate immune mechanism of goose astrovirus | |
CN105814203B (zh) | 禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用 | |
Tian et al. | Isolation and selection of duck primary cells as pathogenic and innate immunologic cell models for duck plague virus | |
CN103215267B (zh) | 抑制流感病毒相关基因的siRNA及其应用 | |
CN106103714B (zh) | 体内感染微生物、寄生微生物、共生微生物的非编码性rna及其鉴定和应用 | |
Sun et al. | H9N2 viruses isolated from mammals replicated in mice at higher levels than avian-origin viruses | |
CN103215345A (zh) | 抑制流感病毒复制的宿主相关基因及其筛选方法和应用 | |
Nishiura et al. | Neuropathogenicity of newly isolated avian leukosis viruses from chickens with osteopetrosis and mesenchymal neoplasms | |
CN107488660A (zh) | 回文与互补回文小rna及其应用 | |
Yang et al. | Foot-and-mouth disease virus VP1 promotes viral replication by regulating the expression of chemokines and GBP1 | |
Dong et al. | miR-155-1 as a positive factor for novel duck reovirus replication by regulating SOCS5-mediated interferons | |
CN107513571A (zh) | miRNA的应用 | |
Liang et al. | Single-cell analysis of the in vivo dynamics of host circulating immune cells highlights the importance of myeloid cells in avian flaviviral infection | |
Koch et al. | Influenza-induced activation of recruited alveolar macrophages during the early inflammatory phase drives lung injury and lethality | |
CN104673759A (zh) | 表达外源基因的重组流感病毒及其制备方法和应用 | |
CN108728542A (zh) | 检测长链非编码rna bc200的制剂及其应用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20180406 Termination date: 20190120 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |