CN103211803A - 他莫昔芬在治疗蛛网膜下腔出血后发生的早期脑损伤的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种他莫昔芬在制备用于治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）的药物组合物中的应用。他莫昔芬通过抑制SAH后早期激活的TLR4/NF-κB信号通路，从而抑制激活其下游的细胞活素/趋化因子诱导炎症反应，从而对SAH后EBI起到神经保护作用。

Description

他莫昔芬在治疗蛛网膜下腔出血后发生的早期脑损伤的应用

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及一种他莫昔芬在治疗蛛网膜下腔出血后发生的早期脑损伤的应用。

背景技术

在我国，颅内动脉瘤破裂导致的蛛网膜下腔出血（subarachnoidhemorrhage，SAH）年发病率约为10.5/10万人口，仅次于脑血栓形成和高血压脑出血，居脑血管病的第3位。SAH的病理生理机制复杂，且致死、致残率较高，约50％的患者在发生SAH后30天内死亡，其中2/3的死亡发生在SAH后48小时内，此期的死亡主要归咎于SAH所致的早期脑损伤(early brain injury,EBI)。因此，临床寻找有效干预EBI的措施显得尤为重要。SAH后的EBI一般鉴定为SAH后48小时内所发生的脑部损伤，此时迟发性的脑血管痉挛尚未发生，有关SAH后EBI的机制目前尚不清楚，目前多数学者认为可能与SAH后早期出血引起的脑部病理生理改变关系密切。主要包括：SAH后动脉血进入蛛网膜下腔，导致颅内压(intracranialpressure,ICP)急性升高，继而致使脑血流量(cerebral blood flow,CBF)减少。这些变化一开始都是减少颅内出血的生理调节机制，但是往往在动脉瘤出血后这一调节机制突破了正常的调节范围，造成失调，引起脑灌注压(cerebral perfusion pressure,CPP)明显不足，从而导致脑缺血(cerebralischemia)、脑肿胀(brain swelling)、脑水肿(brain edema)、神经元凋亡，其中炎症反应起到了很重要作用。

SAH后EBI机制的研究，主要来自于Loma Linda大学Zhang JH的团队。早期的研究证实，caspase信号通路和丝裂原蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）信号通路在SAH后EBI中起重要作用，应用caspase的抑制剂z-VAD-FMK和MAPK的抑制剂PP1之后，EBI的各项指标明显好转，这些指标包括了神经元的凋亡、脑水肿和神经功能评分。该团队后续的一些研究逐步证实，炎症反应亦参与了EBI的发生过程，如白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和核因子κB（nuclearfactor-kappaB，NF-κB）所介导信号通路。2003年左右，Science等杂志报道了Toll受体（Toll-like receptor，TLR）及其下游的MAPK及NF-κB信号通路，到目前为止，人们已在多种疾病中进行了TLR/NF-κB/MAPK信号通路的相关研究。近期的文献也报道了TLR-4（Toll-4，Toll样受体4）在SAH后EBI中的可能作用机制，该团队认为TLR-4/NF-κB信号通路在SAH后EBI中被激活，抑制该信号通路，能够显著提升大鼠SAH后早期的神经功能评分。最新的文献归纳了EBI的可能发病机制，主要包括了7个方面的内容：（1）脑缺血；（2）血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)破坏及脑水肿；（3）蛛网膜下腔的血液及血液分解产物；（4）氧自由基产生；（5）炎症反应；（6）一氧化氮（NO）途径；（7）凋亡机制。因此寻找干预SAH后EBI发病机制的药物，从多个途径抑制EBI的进程，阻止或减轻脑损害，可能是治疗SAH的一个新的方向及方法。

Tamoxifen（TMX）又称三苯氧胺（Triphenylethylene），是一种人工合成的非甾体类三苯乙烯衍生物，化学名为（Z）-1，2-二苯基-1[4(2-N,N-二甲基氨基乙氧基)苯基]-1-丁烯，为白色或淡黄色结晶性粉末，无臭，溶于甲醇、乙醇而难溶于水，由帝国化学工业公司研制开发，具有抗雌激素和雌激素样双重作用。作为抗雌激素药物，Tamoxifen于1971年首次应用于临床，并于1978年获美国FDA批准用于治疗绝经前后各期乳腺癌。以往Tamoxifen在临床上主要用于治疗乳腺癌、卵巢癌，此外TMX对大肠癌、肺癌等均有一定的治疗作用。

SAH后EBI的机制极为复杂，对于迟发性血管痉挛的治疗并不能很好的改善患者的预后，EBI可能才是SAH患者死亡的主要原因。现在几乎没有针对发病机制中信号转导的药物，另一方面，关于SAH后EBI对患者预后长期影响的研究也还没有开展。目前还需要继续深入研究EBI的分子机制，找到有潜力的抑制因子，从多个途径抑制EBI的进程，进而阻止或减轻SAH后脑损害的危害，这将成为未来研究的主要目标，还需人们的共同努力。虽然目前已有文献报道他莫昔芬在脑出血所致脑损伤中的保护作用，及其对炎症和凋亡的拮抗作用，但在SAH后EBI的作用中未见报道。本发明因此而来。

发明内容

本发明目的在于提供一种他莫昔芬在治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的新用途，揭示了一种治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的新治疗途径。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是：

一种他莫昔芬在制备用于治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）的药物组合物中的应用。

优选的，所述药物组合物用于蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）进行神经保护和/或干预大脑皮层炎症信号通路。

优选的，所述药物组合物包含药学上有效量的他莫昔芬和药学上可接受的载体。

优选的，所述早起脑损伤为自发性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）。优选的，所述早起脑损伤为动脉瘤性自发性蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）。

本发明技术方案应用蛛网膜下腔出血后早期脑损伤模型，探讨他莫昔芬对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤是否具有神经保护作用。通过48只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组（n=12），SAH组（n=12），安慰剂组（n=12）和他莫昔芬治疗组（n=12）。应用视交叉前池一次注血法制成SAH后EBI模型，在蛛网膜下腔出血后2h、24h及36h分别腹腔注射他莫昔芬，48小时后处死大鼠，取颞底皮层脑组织做标本，测定脑水肿变化及血脑屏障变化，探讨他莫昔芬对大鼠SAH后EBI是否具有神经保护作用。结果证实：与对照组相比，SAH组大鼠脑组织含水量明显增加，48h时水肿百分数达到82.51%，血脑屏障破坏明显，48h时测定皮层脑组织EB含量达到21.5ng/mg；与SAH组相比，他莫昔芬治疗后大鼠脑水肿指数降低，48h时水肿百分数80.55%，血脑屏障功能改善，48h时测定皮层脑组织EB含量13.2ng/mg；安慰剂组与SAH组相比改善不明显。

本发明人通过构建大鼠SAH模型，能够观察到大鼠SAH后48h脑组织水肿含量增加明显，血脑屏障破坏明显，说明SAH后存在EBI。本发明人惊奇的发现应用他莫昔芬治疗后，能有效降低SAH后脑水肿、改善血脑屏障，则证实他莫昔芬对大鼠SAH后EBI也具有神经保护作用。

另外，本发明人通过60只健康成年雄性SD大鼠随机分为：对照组(n=15),SAH组(n=15),SAH+安慰剂组(n=15)和SAH+他莫昔芬治疗组(n=15)。采用立体定向注射技术，构建视交叉前池一次注血SAH模型，对照组开骨窗但不注入动脉血，他莫昔芬治疗组给予他莫昔芬腹腔注射治疗，每次注射剂量5mg/kg，在SAH后2h、24h、36h分别腹腔注射。安慰剂组注射等容量溶剂，溶剂为1%乙醇。48小时后处死大鼠，取颞底皮层脑组织做标本，采用Western blot法测定TLR4、NF-κB及ICAM-1（Intercellularadhesion molecule，细胞间粘附分子1）表达情况；免疫组化法检测TLR4、NF-κB及ICAM-1表达，EMSA测定NF-κB的DNA活性。通过ELISA方法分析大鼠脑皮层中细胞活素因子IL-1β,TNF-α和IL-6表达情况比较。

Western blot结果显示对照组TLR4、NF-κB及ICAM-1蛋白水平较弱；与对照组相比，SAH组TLR4、NF-κB及ICAM-1蛋白水平明显增高(P<0.05)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；他莫昔芬治疗组中TLR4、NF-κB及ICAM-1蛋白水平明显低于安慰剂组(P<0.01)。免疫组化（TLR4、NF-κB及ICAM-1蛋白免疫反应性主要在神经元细胞，细胞质棕色黄染代表阳性）结果显示对照组TLR4、NF-κB及ICAM-1阳性率较低；与对照组相比，SAH组TLR4、NF-κB及ICAM-1阳性率明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；他莫昔芬治疗组中TLR4、NF-κB及ICAM-1阳性率低于SAH组及安慰剂组(P<0.05)。EMSA结果显示对照组NF-κB的结合活性较弱；与对照组相比，SAH组NF-κB的结合活性明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；他莫昔芬治疗组中NF-κB的结合活性明显低于SAH+Vehicle组（P<0.01）。与对照组相比，SAH组IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显低于安慰剂组(P<0.01)。

本发明人通过研究SAH后大脑皮层TLR4（Toll样受体4）/NF-κB（核因子κB）信号通路及其下游炎症因子及细胞活素的表达变化，惊奇的发现他莫昔芬通过抑制SAH后早期激活的TLR4/NF-κB信号通路，从而抑制激活其下游的细胞活素/趋化因子诱导炎症反应，从而对SAH后EBI起到神经保护作用。

本发明中，可将本发明中的他莫昔芬采用本领域常规的方法制备成适用于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将他莫昔芬制备成注射给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规注射剂型。在本发明中他莫昔芬药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1%～99%，优选为10%～90%；本发明所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。

本发明中，组合物的制备方法没有限制，他莫昔芬直接做成制剂，或者分别或/和辅料混合后做成制剂，然后安装本领域常规的方式进行包装，与其他辅料混合制成制剂。本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明通过应用SAH后活体EBI模型，观察他莫昔芬对神经细胞的保护作用，并评估TLRs/NF-κB信号通路的改变，了解下游炎性细胞因子和趋化因子的表达，分析SAH后EBI的各项指标，从而阐明他莫昔芬干预SAH后EBI的作用机制。SAH后早期能激活TLR4/NF-κB传导通路，激活其下游的细胞活素/趋化因子诱导炎症反应，可能是引起SAH后EBI的重要机制，而Tamoxifen通过对此传导通路的抑制，减轻免疫炎症的发生，这可能是Tamoxifen对SAH后EBI神经保护作用重要机制之一。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组脑水肿指数比较(平均值±标准差)；

图2为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组EB含量比较(平均值±标准差)；

图3为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组中TLR4、NF-κB、ICAM-1的表达情况比较；

图4为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组中皮层中TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白表达水平；

图5为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组NF-κB结合活性通过EMSA法检测结果；

图6为对照组、SAH组、SAH+vehicle组、他莫昔芬治疗组皮层炎症因子变化通过ELISA法检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例1他莫昔芬对大鼠SAH后EBI神经保护作用的探测试验

本实施例利用大鼠视交叉前池一次注血法制得SAH后EBI模型，并通过测定脑水肿变化及血脑屏障变化，研究他莫昔芬对EBI是否也具有神经保护作用。

1．材料

1.1常规试剂及设备

10%中性甲醛、50%三氯乙酸（TCA）溶液、无水乙醇、生理盐水、蒸馏水、安尔碘消毒液、10%水合氯醛、匀浆玻璃皿、精密电子称、烘干器、紫外分光光度仪、离心机、手术器械一套。

1.2实验对象

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,由苏州大学医学院实验动物研究中心提供(苏SYXK2002～2011，清洁级：2级)，雄性，体重280～350g。术前单笼饲养，保持室温18～22℃，自由饮食饮水，安静、避光环境中饲养。

2.实验方法

2.1实验动物分组

SD大鼠48只，随机分为以下三组，具体如下：

（1）对照组：12只，对照组颅骨顶部开骨窗但不注入动脉血

（2）SAH组：12只，通过视交叉前池一次注血0.3ml构建SAH后活体EBI模型

（3）SAH+vehicle组：12只，在SAH后2h、24h及36h分别腹腔注射安慰剂（等容量溶剂，溶剂为1%乙醇）。

（4）他莫昔芬治疗组即SAH+tamoxifen组，或tamoxifen治疗组：12只，在SAH后2h、124h及36h分别腹腔注射，每次注射剂量5mg/kg，共注射他莫昔芬3次。

2.2、大鼠蛛网膜下腔出血模型的制作

2.2.1术前准备:

SD大鼠，天平，安尔碘，手术刀、剪、镊和拉钩，1ml、5ml注射器，27A留置套管针，10%水合氯醛，500ml容器+输液管，托盘，10%中性甲醛。

2.2.2手术步骤

将大鼠用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉成功后，俯卧固定于操作台上，头顶部备皮，安尔碘常规消毒。采用立体定向注射技术，构建视交叉前池一次注血SAH模型。大鼠颅骨顶部前囟前方7.5mm开骨窗，骨窗直径约2mm，出血较多时可用骨蜡压迫止血，翻转大鼠，使其仰卧位，消毒后解剖大鼠腹侧部尾动脉，1ml注射器不抗凝下抽取动脉血0.35ml，采用立体定向注射技术，矢状面进针，方向与冠状面呈45度角，进针约10-12mm至视交叉前池，300ul的非肝素化动脉血经立体定向方式20s内注射入视交叉前池，注血后穿刺点压迫2min，缝合切口。大鼠背部皮下注射10ml生理盐水防止术后脱水。大鼠保温复苏至清醒后自由饮食饮水。对照组开颅骨顶部开骨窗但不注入动脉血。他莫昔芬治疗组在SAH后2h、24h、36h分别腹腔注射，共注射3次。视交叉前池注入动脉血后，所有大鼠会停止呼吸约30s，其中对照组无死亡(0/12rats大鼠)，蛛血模型组死亡率29%(20/68大鼠)。

2.3动物的处死方法及标本留取

2.3.1各组动物在不同时间分批次于SAH后48h再次以10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，断颈方法处死大鼠，取血凝块周围皮层组织（颞底皮层脑组织）用于分析脑水肿变化。

2.3.2各组动物在不同时间分批次于SAH后47h再次以10%水合氯醛麻醉后，经股静脉注射2%伊文氏蓝（EB，Evans blue）生理盐水溶液（2ml/kg），1h后解剖开胸并行左心室灌注以100cmH₂O的压力进行灌注，排出全身血液直至流出液体清亮。开颅行大体观察并快速切取颞底皮层脑组织，用于分析血脑屏障变化。

2.4脑水肿测定

各组大鼠于SAH后47h水合氯醛麻醉，开颅取全脑，切取颞底脑皮质迅速放入预先称好重量的玻片上称重，此重量减去玻片重量即为湿重，随后放入烤箱中在100°C条件下烘72h后再次称重，此重量减去玻片重量即为干重，脑水肿指数即可用下述公式求得。脑水肿指数=[(湿重-干重)/湿重]×100%。

2.5血脑屏障渗透性测定

（1）血脑屏障通透性的检测首先建立标准曲线：取EB10mg溶于100ml生理盐水中取0.1ml加入1.9ml甲酰胺中混匀作为第一管，从中取0.1ml加入1.9ml甲酰胺中混匀作为第二管，从中取1ml加入1ml甲酰胺中混匀作为第三管，依次类推，共做6管，浓度分别为5mg/l，0.25mg/l，0.125mg/l，0.0625mg/l，0.0313mg/l，0.0156mg/l，37℃水浴48h，应用荧光分光光度仪610nm进行比色，蒸馏水做空白。

（2）大鼠麻醉后经股静脉注射EB（2ml/kg），1h后处死，为清除血液中染料，向左心室灌注生理盐水直至右心室流出透明液体为止，开颅快速切取颞底皮层脑组织并称重。将样品放入盛有50%三氯乙酸（TCA）溶液1.5ml的匀浆器中，匀浆和离心（10000r/min，20min），取上清液1.0ml，放入1.5ml混合液（50%TCA和无水乙醇按1:3比例配制而成），充分混匀。应用紫外分光光度仪进行比色，波长设定610nm。根据标准曲线计算出EB含量，结果以ng/mg表示。

3统计学分析

本实验所有数据以均数±SD表示，采用SPSS13.0统计软件，行单因素方差分析或t检验，P<0.05为差异，有统计学意义。

4、结果

（1）.动物存活情况

对照组全部成活，SAH模型组死亡率29%(23/78大鼠)，在注血后呼吸、心跳停止而死亡。死亡动物后随机增补动物至各组。

（2）.脑水肿

2.1大体观察

对照组大鼠脑表面及血管周围均未见到积血，SAH组大鼠可见在颞底皮层表面明显积血，血块分布均匀；他莫昔芬治疗组颞底皮层表面积血较SAH组明显减少。

2.2表1各组水肿指数

注：SAH组与对照组相比，^*p<0.01；安慰剂组与SAH组相比，ns p＞0.05，他莫昔芬治疗组与SAH组相比，#p<0.01。

如图1所示，图1为各组脑水肿指数比较(平均值±标准差)。SAH组与对照组相比，^*p<0.01；他莫昔芬治疗组与SAH相比，#p<0.01；安慰剂组与SAH组相比，nsp>0.05。

（3）.血脑屏障渗透性变化

3.1大体观察

对照组大鼠脑表面及血管周围颜色正常，SAH组大鼠可见在颞底皮层表面明显蓝色；他莫昔芬治疗组颞底皮层表面蓝色不明显。

3.2表2各组EB含量

注：SAH组与对照组相比，^**p<0.01；安慰剂组与SAH组相比，ns p＞0.05，他莫昔芬治疗组与SAH组相比，##p<0.01。

如图2所示，图2为各组EB含量比较(平均值±标准差)。SAH组与对照组相比，^**p<0.01；安慰剂组与SAH组相比，ns p＞0.05，他莫昔芬治疗组与SAH组相比，##p<0.01。

本实验应用视交叉前池注血模型，原因在于经典的枕大池注血模型因血液无法直接进入Willis环所在的区域，而无法模仿临床真实状态；而血管内线刺模型，死亡率往往大于50％，同时出血量等实验指标无法精确控制，亦不宜用于实验研究。大量预实验已证实，0.3ml动脉血经立体定向注射注入视交叉前池，能导致明显脑损伤。因此本实验采用SD雄性大鼠视交叉前池一次注血法建立大鼠SAH后EBI模型。

SAH后EBI的病理生理机制复杂，是多种因素共同作用的结果。本实验通过构建大鼠SAH后EBI模型，SAH后皮层脑组织水含量明显，48h时水肿百分数达到82.51%，血脑屏障破坏明显，48h时测定皮层脑组织EB含量达到21.5ng/mg，提示SAH后存在EBI。

本实验通过构建大鼠SAH后EBI模型，腹腔5mg/kg TMX注射治疗后，大鼠神经功能明显改善，脑水肿指数降低，48h时水肿百分数80.55%，血脑屏障功能改善，48h时测定皮层脑组织EB含量13.2ng/mg，进一步证实了TMX对大鼠SAH后EBI具有神经保护作用。

实施例2Tamoxifen对蛛网膜下腔出血后脑部炎症信号通路的干预试验

本实施例旨在研究TMX是否通过对大鼠SAH后EBI大脑皮层TLR4/NF-κB传导通路及其下游因子表达的调控作用来实现神经保护作用。

1.材料

1.1试剂及实验设备

PBS（phosphate buffered solution，磷酸盐缓冲液）、DAB显色剂、石蜡切片机（Leica3215，德国）、自动脱水机（Leica1020，德国）、石蜡包埋机（BMJ-III，中国，常州）、Olympus BX40光学显微镜、图像摄影软件（LOGENE-I Path PRT诊断报告工作站）、安尔碘消毒液、10%水合氯醛、液氮罐、手术器械一套等。

1.1.l主要药品及试剂

一抗：抗TLR4,抗NF-κB,抗ICAM-1亲和纯化抗体(Santa Cruz,CA,USA)；二抗：HRP标记IG抗体（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,California,USA)；GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，Sigma-Aldrich,Inc.,St.Luis,MO,USA)。

1.2实验动物

成年健康雄性SD大鼠，由苏州大学医学院实验动物研究中心提供(苏SYXK2002～2011，清洁级：2级)，体重280～350g。术前单笼饲养，保持室温18～22℃，自由饮食饮水，安静、避光环境中饲养3天，以避免非特异性因素的干扰。

2.实验方法

2.l实验动物分组。

SD大鼠60只。随机分成以下4组：

（1）对照组：15只，对照组颅骨顶部开骨窗但不注入动脉血；

（2）SAH组：15只，视交叉前池一次注血后48h处死；

（3）SAH+安慰剂组：15只，安慰剂组注射等容量溶剂，溶剂为2-羟丙基-β-环糊精；

（4）SAH+Tamoxifen治疗组:15只，Tamoxifen注射治疗，每次注射剂量5mg/kg，在SAH后2小时、12小时、36小时分别腹腔注射，共注射3次。

大鼠于SAH后48h再次以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血凝块周围皮层组织（颞底皮层脑组织），一部分以体积分数10%中性甲醛固定，一部分冷冻于液氮罐中。

2.2大鼠蛛网膜下腔出血模型的制备

2.2.1术前准备:

SD大鼠，天平，安尔碘，手术刀、剪、镊和拉钩，1ml、5ml注射器，27A留置套管针，10%水合氯醛，500ml容器+输液管，托盘，10%中性甲醛。

2.2.2手术步骤

将大鼠用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔注射麻醉成功后，俯卧固定于操作台上，头顶部备皮，安尔碘常规消毒。采用立体定向注射技术，构建视交叉前池一次注血SAH模型.。大鼠颅骨顶部前囟前方7.5mm开骨窗，骨窗直径约2mm，出血较多时可用骨蜡压迫止血，翻转大鼠，使其仰卧位，消毒后解剖大鼠腹侧部尾动脉，1ml注射器不抗凝下抽取动脉血0.35ml，采用立体定向注射技术，矢状面进针，方向与冠状面呈45度角，进针约10-12mm至视交叉前池，300ul的非肝素化动脉血经立体定向方式20s内注射入视交叉前池，注血后穿刺点压迫2min，缝合切口。大鼠背部皮下注射10ml生理盐水防止术后脱水。大鼠保温复苏至清醒后自由饮食饮水。对照组开颅骨顶部开骨窗但不注入动脉血。他莫昔芬治疗组在SAH后2h、24h、36h分别腹腔注射，共注射3次。视交叉前池注入动脉血后，所有大鼠会停止呼吸约30s，其中对照组无死亡，蛛血模型组死亡率29%。

3．免疫组化分析

①取4μm的石蜡切片,经二甲苯、乙醇脱蜡水化。

②3%H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，常温5min，双蒸水漂洗5min后，磷酸盐缓冲液漂洗15min。

③抗原修复:切片置于10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，微波炉加热（温度95℃），30min，自然冷却至室温，磷酸盐缓冲液漂洗20min。

④封闭非特异性结合位点：滴加5%小牛血清，常温湿盒内孵育40min。

⑤滴加抗TLR4、抗NF-κB、抗MCP-1亲和纯化兔抗体(一抗)，工作效价1：200,，37℃湿盒内孵育1h，磷酸盐缓冲液漂洗15min；滴加HRP标记IG抗体（二抗），工作效价1：500,，室温湿盒内孵育60min。

⑥二氨基联苯胺(DAB)显色

⑦衬染:切片经乙醇、二甲苯脱水、透明，滴加中性树脂封片，加盖玻片。

评价方法:在400倍显微镜下随机选择10个高倍视野,细胞核呈棕色的细胞为阳性,根据阳性细胞的比率进行评估(阳性细胞数占总细胞数<10％为1分，阳性细胞数占总细胞数10％～25％为2分，阳性细胞数占总细胞数26％～50％为3分，阳性细胞数占总细胞数>50％为4分)。

4.Western blot分析

①蛋白样品获得：将液氮中脑组织滴加匀浆缓冲液20mM Tris,，pH7.6，通过电泳上样裂解细胞；4℃，12,000g离心15min。取上清液为样品。

②电泳、转移：样品通过8%SDS-PAGE分离，电泳转移至PVDF膜。

③免疫反应：转移通过滴加5%脱脂乳阻断，室温2h；滴加抗TLR4,抗NF-κB,抗ICAM-1和抗MCP-1亲和纯化抗体(一抗),4℃湿盒孵育，24h。工作效价1:200,1:150,1:200,and1:150。GAPDH做对比。采用PBS+Tween20(PBST)分别洗膜，10min×6次；滴加HRP标记二抗，工作效价1：400,室温孵育2h。

④显色拍照。

5．EMSA

通过EMSA方法分析大鼠脑皮层中NF-κB DNA结合活性，按照试剂盒操作步骤进行。

6．ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附）

通过ELISA方法分析大鼠脑皮层中细胞活素因子IL-1β,TNF-α（tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子）和IL-6（Interleukin-6，白细胞介素-6）表达情况比较。取冰冻脑组织于玻璃搅拌器中，加入1mlPBS缓冲液中（1mmol/L of PMSF,1mg/L胃酶抑素A，1mg/L抑酶肽和1mg/L亮肽酶素），搅匀；4℃，12,000g离心20min；定量计算，结果以ng/g表示。（TNF-α：Diaclone Research,France；IL-1β,IL-6：Biosource Europe SA，Belgium）

7.统计学分析

本实验所有数据以均数±SD表示，采用SPSS13.0统计软件，行单因素方差分析或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

8、结果

1）动物存活情况

视交叉前池一次注入动脉血后，所有大鼠会停止呼吸约30s，其中对照组无死亡(0/15大鼠)，SAH组死亡率31%(16/61大鼠)。

2）大鼠的神经功能评分

注：SAH组与对照组相比，*P<0.01，SAH+Tamoxifen治疗组与安慰剂组相比，△P<0.01SAH+安慰剂组与SAH组相比，＃P>0.05。

3．免疫组化结果

TLR4,NF-κB,和ICAM-1蛋白免疫反应性主要在神经元细胞及小角质细胞。细胞核棕色黄染代表阳性。对照组TLR4,NF-κB,和ICAM-1阳性率较低；与对照组相比，SAH组TLR4,NF-κB,和ICAM-1阳性率明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中TLR4,NF-κB,和ICAM-1阳性率低于SAH组及安慰剂组(P<0.01)。见图3所示。

图3为TLR4、NF-κB、ICAM-1的表达情况比较：对照组中未见明显阳性细胞；与对照组相比，SAH组TLR4、NF-κB、ICAM-1的阳性率明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中TLR4、NF-κB、ICAM-1的阳性率低于SAH组及安慰剂组(P<0.01)。

4.Western blot分析

对照组中TLR4,NF-κB,ICAM-1的蛋白水平较弱；与对照组相比，SAH组TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白水平明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白水平明显低于安慰剂组(P<0.01)。见图4所示。

图4为各组皮层中TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白表达水平。其中图4上图中可以看出：TLR4位于95kDa，NF-κB位于50kDa，ICAM-1位于60kDa，对比GAPDH位于36kDa。对照组位于条带1，蛛血组位于条带2，安慰剂组位于条带3，Tamoxifen治疗组位于条带4。图4下图中可以看出：SAH组TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白水平明显增高(P<0.01)，SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中TLR4,NF-κB,ICAM-1蛋白水平明显低于安慰剂组(P<0.01)。

5.EMSA结果分析：对照组中NF-κB结合活性较低，与对照组相比，SAH组NF-κB结合活性明显增高；SAH组与安慰剂组对比无明显差异；Tamoxifen治疗组中NF-κB结合活性明显低于安慰剂组。见图5所示。

图5为各组NF-κB结合活性通过EMSA法检测结果。与对照组相比，SAH组NF-κB结合活性明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中NF-κB结合活性明显低于安慰剂组(P<0.01)。

6.ELISA结果分析：对照组中IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平较低(21.56±4.18,10.54±1.59and40.08±5.06ng/g)，与对照组相比，SAH组炎症因子IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显增高；SAH组与安慰剂组对比无明显差异；Tamoxifen治疗组中IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显低于安慰剂组。见图6所示。

图6为各组皮层炎症因子变化通过ELISA法检测：与对照组相比，SAH组IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显增高(P<0.01)；SAH组与安慰剂组对比无明显差异(P>0.05)；Tamoxifen治疗组中IL-1β,TNF-α和IL-6表达水平明显低于安慰剂组(P<0.01)。

颅内动脉瘤破裂导致的蛛网膜下腔出血病理机制复杂，目前现有技术认为EBI及CVS是SAH后影响患者预后极为重要的两点。SAH后的EBI是指在SAH后的48小时内所发生的脑部损伤，而此时迟发性的脑血管痉挛尚未发生，所以脑损伤的机制主要是出血后引起的脑部病理生理改变。EBI的一系列分子机制，包括缺血途径、凋亡途径及炎症途径等，最终导致细胞调亡，BBB的破坏，脑水肿或者神经元的损伤。

通过实验本发明人发现，SAH后EBI脑皮层中TLR4、NF-κB、ICAM-1水平明显升高，但应用TMX治疗后，TLR4、NF-κB及ICAM-1水平明显下降，这说明SAH能激活TLR4/NF-κB传导通路，此通路作为炎症反应最为关键的转录前信号通路，激活其下游的细胞活素/趋化因子诱导炎症反应可能是引起SAH后EBI的重要机制，而TMX通过对此通路的抑制，实现EBI后炎症反应的下调，这可能是TMX对SAH后EBI的神经保护机制之一。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种他莫昔芬在制备用于治疗蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）的药物组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物组合物用于蛛网膜下腔出血后早期脑损伤（SAH后EBI）进行神经保护和/或干预大脑皮层炎症信号通路。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物组合物包含药学上有效量的他莫昔芬和药学上可接受的载体。

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