CN103185696B - 一种固体样品载物台、分光光度计及lspr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于分光光度计的固体样品载物台，包括调节座和移动架；调节座呈“L”形，包括基底部和臂部，基底部具有凹槽，其上设有第一导轨槽，臂部上具有螺孔和顶针通孔；移动架呈“U”形，包括基底连接部、第一臂部和第二臂部；基底连接部嵌入调节座的基底部的凹槽中，且基底连接部开有第二导轨槽，第一导轨槽和第二导轨槽相匹配形成完整的导轨槽并嵌入导轨，第一臂部和基底连接部上侧均设置有卡槽，第二臂部上设有通孔和顶针通孔；移动旋钮与臂部的螺孔螺纹连接并穿过该螺孔和第二臂部的通孔，顶针穿过臂部的顶针通孔和第二臂部的顶针通孔。本发明还提供了相应的LSPR检测方法。本发明非常便于高通量检测且适合于测定宽度较小的样品。

Description

一种固体样品载物台、分光光度计及LSPR检测方法

技术领域

本发明涉及光学平台、分析化学等技术领域，具体地说，本发明涉及一种固体样品载物台、分光光度计及LSPR检测方法。

背景技术

分光光度计是一种通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光吸收度，进而对该物质进行定性和定量分析的仪器。目前，分光光度计已经被广泛地应用于分析化学、分子生物学等领域。它通常包括光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器、存储系统和显示系统。分光光度计所测定的对象的样态主要包括两大类：液体和固体。

其中，液体物质通常被置于比色皿中且在比色皿中均匀分布，因此一般一个样品室里只放入一个比色皿，而一个比色皿只能进行一种物质的测量。

而对于固体物质而言，其本身不具有可流动性且具有一定的机械强度，因此可以将其放于样品室内的某夹持物上进行测定。例如日本岛津公司生产的分光光度计中就配备有多种固体试样测定用的附件，可参考http://www.an.shimadzu.co.jp/uv/support/faq/op/solid.htm#206-16817(日语)、http://www.an.shimadzu.co.jp/uv/support/faq/op/uv-opsolid.htm(日语)、http://www.shimadzu.com/an/spectro/uv/accessory/solid/guide.html(英语)，例如，一种典型的用于测定厚度小于3mm的固体试样对光透射率的支架，测定时，固体样品被有弹性的金属片夹持于支架上。它具有两个明显的缺点。第一，固体样品一旦被固定住，就不能在测定的过程中灵活地移动，导致一次只能测量样品的一个固定区域，这样就难以利用分光光度计对样品进行高通量检测；第二，固体样品的宽度不能小于两弹性金属片间的空隙，否则固体样品将不能被金属片牢固地夹持住。而生物芯片的宽度一般较小，因此上述支架难以用于生物芯片的测定。

因此，当前迫切需要一种便于高通量检测、适用于具有较小宽度的固体样品的固体样品载物台、分光光度计及LSPR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种便于高通量检测、适用不同宽度的固体样品的固体样品载物台、分光光度计及LSPR检测方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种固体样品载物台，包括调节座和移动架；

所述调节座呈“L”形，包括基底部和臂部，所述基底部具有凹槽，所述凹槽上设有第一导轨槽，所述臂部上具有螺孔和顶针通孔；

所述移动架呈“U”形，包括基底连接部、第一臂部和第二臂部；所述基底连接部嵌入调节座的基底部的凹槽中，且所述基底连接部上开有第二导轨槽，所述第一导轨槽和第二导轨槽相匹配形成完整的导轨槽，所述完整的导轨槽中嵌入导轨，所述第一臂部内侧和基底连接部上侧均设置有用于安置固体样品的卡槽，所述第二臂部上设有移动旋钮通孔和顶针通孔；

移动旋钮与调节座臂部的所述螺孔螺纹连接并穿过所述螺孔和移动架第二臂部的移动旋钮通孔，顶针穿过所述调节座臂部的顶针通孔和移动架第二臂部的顶针通孔。

本发明还提供了一种分光光度计，该分光光度计包括上述固体样品载物台。

本发明还提供了一种利用具有所述固体样品载物台的分光光度计的LSPR检测方法，包括下列步骤：

1)对具有金纳米结构的玻璃基底进行修饰，得到抗原或抗体共价修饰的功能化基片，将该功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

2)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，功能化基片的每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

3)将具有多个平行管道的微流控芯片贴合至所述功能化基片上；

4)在微流控芯片的微流管道中通入各种溶液，溶液中含有待检测物质，孵育完毕后，将所有管道中的液体抽干净，揭去微流控芯片，将孵育完毕后的功能化基片洗净；

5)将孵育完毕且洗净后的功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

6)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述孵育完毕且洗净后的功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

7)对比孵育完毕且洗净后的功能化基片与原功能化基片各个区域的消光光谱，得出各个区域所对应的微流管道的溶液中是否存在待测物质。

所述步骤7)中，还包括对比孵育完毕且洗净后的功能化基片与原功能化基片各个区域的消光光谱，根据消光光谱吸收峰强度的增加量与待测物质浓度的相关曲线，得出各个区域所对应的微流管道的溶液中的待测物质的浓度。

与现有技术相比，本发明具有下列技术效果：

1、本发明的载物台可以使固体样品在垂直于光轴的平面内精确稳定地平移，在不干扰分光光度计的前提下使得入射光照到样品的不同区域，从而便于高通量检测。

2、本发明中固体样品被置于卡槽内，样品的宽度只要小于样品卡槽的宽度即可，因此适合于测定宽度较小的样品。生物芯片的尺寸通常不会很大，因此本发明非常适合用于生物芯片的测定。

3、本发明可以通过控制样品卡槽以及使用顶针来实现样品的垂直摆放，即使有些微的倾斜，也可以通过拧紧顶针保证样品在整个移动过程中保持一致的倾角，这将消除倾角不一致所带来的影响。

附图说明

图1(a)示出了本发明一个实施例的载物台的主视图；

图1(b)示出了本发明一个实施例的载物台的左视图；

图1(c)示出了本发明一个实施例的载物台的俯视图；

图1(d)示出了本发明一个实施例的载物台的立体示意图；

图2(a)示出了本发明一个实施例中调整座的主视图；

图2(b)示出了本发明一个实施例中调整座的左视图；

图2(c)示出了本发明一个实施例中调整座的俯视图；

图2(d)示出了本发明一个实施例中调整座的立体示意图；

图3(a)示出了本发明一个实施例中移动架的主视图；

图3(b)示出了本发明一个实施例中移动架的左视图；

图3(c)示出了本发明一个实施例中移动架的俯视图；

图3(d)示出了本发明一个实施例中移动架的立体示意图；

图4示出了现有技术中基于LSPR的测定所得出的不同待测物的消光光谱；

图5(a)示出了一个含有八个管道的微流控芯片；

图5(b)示出了一个功能化基片；

图5(c)示出了微流控芯片非共价地贴合到功能化基片上的示意图；

图6示出了本发明的测定实例中功能化基片的每个区域的350nm～850nm范围内的消光光谱；

图7示出了消光光谱吸收峰强度的增加量与待测物质浓度的相关曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步地描述。

根据本发明的一个实施例，提供了一种载物台。图1(a)～(d)示出了该载物台的结构。其中图1(a)示出了该载物台的主视图，图1(b)示出了该载物台的左视图，图1(c)示出了该载物台的俯视图，图1(d)示出了该载物台的立体示意图。参考图1(a)～(d)，所述载物台包括安装座1和安装在安装座上的两个样品台6，两个样品台6结构一致，对称地固定在安装座1上。具体地，样品台6包括底板2、调节座3、移动架4和光阑5。其中，底板2与安装座1匹配，用于将样品台6固定在安装座1上，本发明中将底板2与安装座1统称为基座。底板2上安装调节座3，移动架4安装在调节座3上并可沿着调节座3的凹槽滑动。光阑5安装在底板2上且在光路上位于移动架4的前端，用于初步地限制射到样品上的光束大小，同时可以一定程度地消除杂散光的射入。

图2(a)～(d)示出了本实施例中调节座3的结构。其中图2(a)示出了该调节座的主视图，图2(b)示出了该调节座的左视图，图2(c)示出了该调节座的俯视图，图2(d)示出了该调节座的立体示意图。参考图2(a)～(d)，调节座3呈“L”形，包括基底部31和臂部32。基底部31设有横截面大致为矩形的凹槽37，凹槽37的两个侧壁上分别设有横截面为半圆形的第一导轨槽38。臂部32上具有螺孔35，用于与螺杆状的移动旋钮33实现螺纹连接。臂部32上还具有顶针通孔36，用于容纳圆柱状顶针34。

图3(a)～(d)示出了本实施例中移动架4的结构。其中图3(a)示出了该移动架的主视图，图3(b)示出了该移动架的左视图，图3(c)示出了该移动架的俯视图，图3(d)示出了该移动架的立体示意图。参考图3(a)～(d)，移动架4呈“U”形，包括基底连接部41、第一臂部42和第二臂部43。基底连接部41的横截面大致为矩形且侧壁上开有横截面为半圆形的第二导轨槽46。基底连接部41可嵌入调节座3的基底部31的凹槽37中，在嵌入后，基底连接部41的第二导轨槽46和调节座3的第一导轨槽38相配合形成完整的圆形导轨槽，钢丝导轨嵌入该圆形导轨槽内，使得移动架4可以沿着钢丝导轨平稳地移动。第一臂部42与第二臂部43之间可设置固体样品44。固体样品44的外形可以为矩形片状。第一臂部42内侧(与第二臂部43相对的一侧)和基底连接部41上侧均设置有卡槽48，以便于固体样品44插入和固定。第二臂部43的外侧设有突台47，突台47上设有移动旋钮通孔47’用于与调节座3上安装的移动旋钮33连接，这样移动架4可在移动旋钮33的带动下沿着导轨在垂直于光轴的平面内移动。第二臂部43上还设置有顶针通孔49和拧紧旋钮45，顶针通孔49用于容纳顶针34，拧紧旋钮45为螺杆状，其螺杆的方向垂直于顶针的方向使其能固定穿过顶针通孔49的顶针34。

光阑5如图1(a)～(d)所示，在光路上它设置于移动架4的前端，用于限制入射光束的宽度。需要说明的是光阑5并不是载物台的必要部件，在本发明的其它实施例中，载物台可不包含光阑5。

另外，如图1(c)所示，还可以在底板2上安装直标尺7，该直标尺7与所述钢丝导轨平行，以便观察移动架4的移动距离，这个移动距离实际上就是固体样品在垂直于光轴的平面内移动的距离。进一步地，所述移动旋钮33上还可以设置螺旋标尺8，该螺旋标尺8与直标尺7配合使用，可以在旋转移动旋钮33的过程中精确控制移动架4的距离。

下面简要介绍本实施例的操作方法。首先将载物台(通过固定孔9)固定于分光光度计的样品室内，然后将待测固体样品和参比固体样品分别放置于测定光路和参比光路对应的移动架4的样品卡槽内，并用顶针34将待测固体样品和参比固体样品顶住，将拧紧旋钮45拧紧以固定顶针34。再调整光阑旋钮使得光阑的打开程度稍大于入射光经过光阑5时的光束宽度，尔后调节移动旋钮33使得固体样品在于光轴垂直的平面内作平移，移动时随时观察设置在移动架一侧的标尺，从而使得光束依照预先设定的距离依次扫过固体样品(包括待测固体样品和参比固体样品)上的不同区域，在每次测量中由分光光度计记录下待测固体样品每个区域光度信息或光谱信息，以及参比固体样品每个区域的光度信息或光谱信息，进而得出待测固体样品每个区域所特有的光度信息或光谱信息。

上述载物台可以作为分光光度计的一个附件来使用，拓宽分光光度计的应用范围。可以在生命科学、分析化学、医学检测等领域应用。可以在学校、研究所、医院、海关等地方得到应用。可以在与高通量生物芯片技术相结合，提供一种基于分光光度法的信号读出方式。

为便于理解，下面再结合一个测定生物芯片(以HIV gp41抗体测定为例)的过程对本实施例做进一步地描述。

下文中的测定基于SHIMAZU公司的型号为UV-2450的分光光度计进行。需要说明的是，载物台的一些设计尺寸受限于UV-2450分光光度计本身，但这并不影响这种载物台的普适性，针对任何一台具体的分光光度计，都可以设计、制造出符合其自身内部尺寸的具有能够在垂直光轴的平面内移动的样品室的载物台。

按前文介绍的方法将载物台安装于UV-2450分光光度计中，然后利用UV-2450分光光度计进行LSPR检测。首先简要介绍一下LSPR检测。在具有纳米金属结构的表面上，其表面等离子体被光激发的过程称为限域表面等离子体共振(Localized surface plasmon resonance，LSPR)，其现象之一是，某一波长处的光吸收会明显增强，表现为一个明显的吸收峰，且吸收峰所处的波长会因表面性质的不同而不同，而不同的物质在表面上的结合就有可能带来不同的表面性质。“Chemical Communications 2011年第47卷“High sensitivity and selectivity of human antibody attachment at theinterstices between substrate-bound gold nanoparticles”中披露了一种在玻璃基底上嵌入金纳米颗粒后用于LSPR传感检测方面的应用。这种具有金纳米结构的玻璃基底对物质的层层结合有响应性，表现为消光光谱上波峰的红移和波峰强度的增加。在该金纳米颗粒的玻璃间隙中修饰一种人免疫球蛋白G，当特异性地识别人免疫球蛋白G的抗体结合上去时，便会使得消光光谱的波峰发生红移、且波峰强度增加(见图4)。利用这种性质，即可对人免疫球蛋白G的抗体做定性和定量的检测。并且，这种检测方法可实现一步式反应(即无需对待检测物进行标记或二次放大)且无需抗体标记及后续的显色等常规免疫检测中繁琐的步骤。然而，由于现有分光光度计的局限，目前的LSPR检测技术一次只能测定一个待检测物的消光光谱，无法进行高通量检测，上述实施例所提供的载物台则可解决这一问题。

具体地，利用上述实施例所提供的载物台进行LSPR检测过程如下：

对具有金纳米结构的玻璃基底进行修饰，最终得到HIV gp41抗原共价修饰的功能化基片，将此基片放入样品测试光路所对应的样品卡槽内，同时在参比光路所对应的样品卡槽内放入没有抗原功能化的裸基片，依照微流管道的设计尺寸，观察两个标尺，移动样品台，使得光束依次扫到每个管道所应在的位置，记录下每个区域的350nm～850nm范围内的消光光谱，如图6各光谱图中的虚线所示。

第一次测定完成后，将具有多个平行管道的微流控芯片贴合至此基片上。微流控芯片的样式如图5(a)所示，图5(a)示出了一个含有八个管道的微流控芯片，各管道平行且管道方向平行于功能化基片所在的平面。图5(a)只是个例子，在图6中示出了另一个含有六个管道的微流控芯片，管道的数目视具体的需求而定。每个管道都有一个入口和一个出口，用于引入和引出流体。图5(b)示出了一个功能化基片。图5(c)示出了微流控芯片非共价地贴合到功能化基片上的示意图。对于每个管道，流体从一个入口流入、再从另一个出口流出，在孵育期间，少量多余的液体会在进出口处起到液封的作用。

参考图6，在管道a中通入人免疫球蛋白G作为阴性对照(也就是说它不会与HIV gp41抗原发生特异性结合)，在管道b～f中通入梯度稀释的抗HIV gp41抗体，共同孵育20min后，将所有管道中的液体抽干净，揭去微流控芯片，用磷酸缓冲液清洗基片3次，再用去离子水清洗基片3次，最后用N₂吹干。

将实验后的基片放入样品卡槽1内，完全按照第一次测量方式去测量每个区域的消光光谱，如图6各光谱图中实线所示。

对比每个光谱图的两条线，当待检测物被特异性地捕获至基片表面时，会引起吸收峰强度的增加，并且这种增强的程度与待测物质的浓度成正相关，可以据此做出相关曲线(Correlation curve)，如图7所示。在测定出相关曲线后，按照上述方法对未知浓度的待测物进行测定，得出其消光光谱吸收峰强度的增加量，再根据相关曲线上纵轴的数值，找到曲线上对应的横轴的数值，此数值就是待测物的浓度。

参考前述HIV gp41抗体测定的例子，下面给出一个利用本发明的用于分光光度计的固体样品载物台进行LSPR检测的一个实施例，该实施例包括下列步骤：

1)对具有金纳米结构的玻璃基底进行修饰，得到抗原或抗体共价修饰的功能化基片(当目标物为抗体时，用抗原共价修饰功能化基片，当目标物为抗原时，用抗体共价修饰功能化基片)，将该功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

2)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，功能化基片的每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

3)将具有多个平行管道的微流控芯片贴合至所述功能化基片上；

4)在微流控芯片的微流管道中通入各种溶液，溶液中含有待检测物质，孵育完毕后，将所有管道中的液体抽干净，揭去微流控芯片，将孵育完毕后的功能化基片洗净；

5)将孵育完毕且洗净后的功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

6)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述孵育完毕且洗净后的功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，孵育完毕且洗净后的功能化基片的每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

7)对比孵育完毕且洗净后的功能化基片与原功能化基片各个区域的消光光谱，得出各个区域所对应的微流管道的溶液中是否存在待测物质。所述步骤7)中，还包括对比孵育完毕且洗净后的功能化基片与原功能化基片各个区域的消光光谱，根据消光光谱吸收峰强度的增加量与待测物质浓度的相关曲线，得出各个区域所对应的微流管道的溶液中的待测物质的浓度。

容易看出，本发明可以实现在同一固体样品的不同区域进行分光光度测量。这拓宽了分光光度计的应用范围，使得基于高通量检测芯片的信号读出方式更加丰富。另外，基于本发明依赖于限域表面等离子体共振效应的检测是一种一步法无标检测，即无需对待检测物进行标记或二次放大，因此特别方便实际应用。

此外，本发明还可以应用于其他各类非均质的固体样品的分光光度测量。例如，台阶玻璃的厚度测定。只要满足光吸收与某种非均质性之间有相关性，就都可以用此载物台来实现对同一固体样品的不用区域的测定。

最后，上述的实施例仅用来说明本发明，它不应该理解为是对本发明的保护范围进行任何限制。而且，本领域的技术人员可以明白，在不脱离上述实施例精神和原理下，对上述实施例所进行的各种等效变化、变型以及在文中没有描述的各种改进均在本专利的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种固体样品载物台，其特征在于，所述固体样品载物台包括调节座(3)和移动架(4)；

所述调节座(3)呈“L”形，包括基底部(31)和臂部(32)，所述基底部(31)具有凹槽(37)，所述凹槽(37)上设有第一导轨槽(38)，所述臂部(32)上具有螺孔(35)和顶针通孔(36)；

所述移动架(4)呈“U”形，包括基底连接部(41)、第一臂部(42)和第二臂部(43)；所述基底连接部(41)嵌入调节座(3)的基底部(31)的凹槽(37)中，且所述基底连接部(41)上开有第二导轨槽(46)，第一导轨槽(38)和第二导轨槽(46)相匹配形成完整的导轨槽，导轨被嵌入所述完整的导轨槽中，所述第一臂部(42)内侧和基底连接部(41)上侧均设置有用于安置固体样品的卡槽(48)，所述第二臂部(43)上设有顶针通孔(49)，并且所述第二臂部(43)的外侧设有突台(47)，所述突台(47)上设有移动旋钮通孔(47’)；

移动旋钮(33)与调节座(3)臂部(32)的所述螺孔(35)螺纹连接并穿过所述螺孔(35)，再与移动架(4)第二臂部(43)处的突台(47)的移动旋钮通孔(47’)连接，顶针(34)穿过所述调节座(3)臂部(32)的顶针通孔(36)和移动架(4)第二臂部(43)的顶针通孔(49)。

2.根据权利要求1所述的固体样品载物台，其特征在于，所述导轨为钢丝导轨。

3.根据权利要求1所述的固体样品载物台，其特征在于，所述第一导轨槽(38)和第二导轨槽(46)的横截面均为半圆形。

4.根据权利要求1所述的固体样品载物台，其特征在于，所述第二臂部(43)上还设有用于固定穿过所述顶针通孔(49)的顶针(34)的拧紧旋钮(45)。

5.根据权利要求4所述的固体样品载物台，其特征在于，所述拧紧旋钮(45)为螺杆状，其螺杆的移动方向垂直于顶针的移动方向。

6.根据权利要求1所述的固体样品载物台，其特征在于，所述固体样品载物台还包括基座，所述基座上固定两个所述调节座(3)，每个调节座(3)上各自安装一个所述移动架(4)，分别用于放置参比固体样品和待测固体样品，所述固体样品载物台还包括在光路上设置于所述移动架(4)的前端的光阑(5)，所述光阑(5)安装在所述基座上。

7.根据权利要求6所述的固体样品载物台，其特征在于，所述基座上还安装直标尺(7)，所述直标尺(7)与所述导轨平行，所述移动旋钮(33)上设置螺旋标尺(8)。

8.一种分光光度计，其特征在于，所述分光光度计包括权利要求1～7中任一项所述的固体样品载物台。

9.一种利用权利要求8所述的分光光度计的LSPR检测方法，包括下列步骤：

1)对具有金纳米结构的玻璃基底进行修饰，得到抗原或抗体共价修饰的功能化基片，将该功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

2)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，功能化基片的每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

3)将具有多个平行管道的微流控芯片贴合至所述功能化基片上；

4)在微流控芯片的微流管道中通入各种溶液，溶液中含有待检测物质，孵育完毕后，将所有管道中的液体抽干净，揭去微流控芯片，将孵育完毕后的功能化基片洗净；

5)将孵育完毕且洗净后的功能化基片放入分光光度计的样品测试光路所对应的样品卡槽内；

6)在垂直光轴的平面内移动样品台，使得光束依次扫到所述孵育完毕且洗净后的功能化基片的各个区域，记录下每个区域的消光光谱，孵育完毕且洗净后的功能化基片的每个所述区域对应于微流控芯片的一个微流管道；

7)对比孵育完毕且洗净后的功能化基片与原功能化基片各个区域的消光光谱，根据消光光谱吸收峰强度的增加量与待测物质浓度的相关曲线，得出各个区域所对应的微流管道中溶液中是否存在待测物质和待测物质的浓度。

10.根据权利要求9所述的LSPR检测方法，其特征在于，所述基片是HIV gp41抗原共价修饰的功能化基片，所述待测物质是HIV gp41抗体。