CN103163076A - 一种运用圆二光谱检测l-半胱氨酸浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，属于分析化学技术领域。本发明通过将L-半胱氨酸与试剂按一定的体积比混合，使之发生自组装形成金纳米粒子二聚体，再将反应物置于圆二光谱分析仪下，检测主波长525nm处信号强度，从而测算出L-半胱氨酸的浓度大小。与传统的仪器方法相比，本发明在液体的环境下利用AuNPs和L-半胱氨酸反应形成金纳米粒子二聚体，二元组装体的形成可以放大L-半胱氨酸的手性，金纳米粒子二聚体在可见光区产生CD信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定L-半胱氨酸含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。

Description

一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法
技术领域
一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，涉及一种利用金纳米粒子自组装技术和等离子手性技术结合用于测定L-半胱氨酸浓度的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术
目前常用的半胱氨酸检测方法，都是基于物理或化学的方法，如电感藕合等离子发射光谱、流动注射原子吸收分光光度计、电感藕合等离子体质谱、极谱法和伏安电极、原子荧光光谱分析、原子炉吸收光谱。上述主要的仪器检测法的最大的优点就是准确，但这些传统方法均需要复杂的前处理，分析时间长，劳动强度大且成本昂贵，只能在实验室内由专业人员进行具体操作，需要专业的技术人员进行大量的样品预处理等缺陷，难以应用于现场检测。由于这些明显的缺点，所以检测的样品数一般达不到要求的最佳抽检量。
纳米颗粒(nanoparticles，Nas)一般是指尺寸至少有一维在l-100 nm间的粒子。纳米尺度是处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，处于这个区域的材料具有一些独特性质，如小尺寸效应、表面、界面效应和量子尺寸效应等。空气中纳米颗粒虽然浓度很低，但具有很高的颗粒物数目。将宏观物体细分成纳米颗粒后，它的光学、热学、电学、磁学、力学以及化学性质和大体积固体相比将会显著不同。纳米材料的小尺寸、化学成分、表面结构、溶解性、外形和聚集情况决定着它们特殊的物理化学性质，这些性质使得纳米材料在将来有着广泛的用途。
随着纳米科技的发展，纳米粒子组装体系的研究变得日益活跃。纳米粒子的二维和三维有序组装结构也因其重要的物理和化学性质近年来受到人们的广泛重视，它们在许多领域如：传感器、催化剂、磁化材料、表面增强拉曼和光学材料等有着潜在的应用。
金纳米材料自组装体，可通过表面等离子共振介导及手性分子诱导等机理产生圆二光谱（CD）信号。但通过这种组装系统结合L-半胱氨酸经典吸附原理用于构建L-半胱氨酸的检测方法尚属空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，运用圆二光谱高灵敏检测L-半胱氨酸。
本发明的技术方案：一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，用合成的金纳米粒子与待检测目标物L-半胱氨酸反应，L-半胱氨酸的加入，使其通过Au-S键修饰于金纳米粒子表面，利用L-半胱氨酸的静电相互作用在液体的环境下金纳米粒子与L-半胱氨酸反应形成金纳米粒子二聚体，金纳米粒子二聚体的形成可以导致等离子手性的产生，金纳米粒子二聚体在可见光区产生圆二光谱CD信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定L-半胱氨酸含量。
工艺步骤为 ：
（1）25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成；洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，加入0.8mL质量浓度 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1mL 质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min；
（2）金纳米粒子组装
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10 min，重悬至相同体积的0.01 M的pH6.0磷酸盐缓冲液中，加入100μL 50nM L-半胱氨酸溶液反应30 min，组装形成金纳米粒子二聚体；
pH缓冲液优化
对步骤（2）体系所用缓冲液体系进行优化。为了提高该法的灵敏度和稳定性，故需要对反应体系pH进行选择。最适宜的pH是在加标准溶液反应以后，圆二光谱测定后CD信号强度最大。具体的步骤是：
①分别向离心管中加入100μL金纳米粒子，各离心管分别再加入 10μL 0.01M 不同pH：pH 5.0，pH 5.5，pH 6.0，pH 6.5，pH 7.0，pH 8.5的磷酸盐缓冲液后，混匀，室温反应 30min；
②反应结束，用圆二光谱测定该反应液在525nm处的CD信号强度，重复两次；结果显示pH6.0反应体系中圆二光谱测定的CD信号强度最大。
（3）金纳米粒子二聚体结构的表征
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子与步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取10μL滴于铜网上进行电镜表征；
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子与步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取1000μL进行动态光散射表征；
（4）圆二光谱检测，绘制CD信号强度～L-半胱氨酸浓度标准曲线
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10 min，重悬至相同体积的0.01M的pH6.0磷酸盐缓冲液中；在该相同体系中分别加入100μL不同浓度0nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM的L-半胱氨酸标准品溶液反应30 min，加入到微量比色皿中，测CD信号，绘制525nm处CD信号强度与L-半胱氨酸浓度标准曲线。
对照组设置：分别以L-酪氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-苏氨酸，D-苏氨酸，L-谷氨酸，D-谷氨酸代替L-半胱氨酸，其它操作同上。结果如图5所示，这些氨基酸不影响L-半胱氨酸的灵敏度和稳定性。
本发明的有益效果：与传统的仪器方法相比，本发明在液体的环境下利用AuNPs和L-半胱氨酸反应形成金纳米粒子二聚体，二元组装体的形成可以放大L-半胱氨酸的手性，金纳米粒子二聚体在可见光区产生CD信号。通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定L-半胱氨酸含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1 典型的金纳米粒子二聚体电镜图。
图2  25nm金纳米粒子与金纳米粒子二聚体的动态光散射表征图。
图3 圆二光谱检测不同浓度L-半胱氨酸、在不同检测波长下的CD信号曲线图。
图4 在525nm处CD信号强度与L-半胱氨酸浓度标准曲线图。
图5 不同氨基酸在525nm处CD信号强度特异性图。
具体实施方式
实施例1
（1）25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子采用柠檬酸三纳一步法还原氯金酸法合成：洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，加入0.8mL 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min；透射电镜显示平均粒径为25nm；
（2）金纳米粒子组装
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10min，重悬至相同体积的0.01 M的pH6.0磷酸盐缓冲液中，加入100μL 50nM L-半胱氨酸溶液反应30min，组装形成金纳米粒子二聚体；
缓冲液pH的选择
为了提高该法的灵敏度和稳定性，故需要对反应体系pH进行选择。最适宜的pH是在加标准溶液反应以后，圆二光谱测定后CD信号强度最大。具体的步骤是：
①分别向离心管中加入100μL金纳米粒子，各离心管分别再加入 10μL 0.01M不同pH：pH 5.0，pH 5.5，pH 6.0，pH 6.5，pH 7.0，pH 8.5的磷酸盐缓冲液后，混匀，室温反应 30min；
②反应结束，用圆二光谱测定该反应液在525nm处的CD信号强度，重复两次。结果显示pH6.0反应体系中圆二光谱测定的CD信号强度最大。
（3）金纳米粒子二聚体结构的表征
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子和步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取10μL滴于铜网上进行电镜表征，如图1所示。
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子和步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取1000μL进行动态光散射表征，如图2所示。
（4）圆二光谱检测，绘制CD信号强度～L-半胱氨酸浓度标准曲线
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10min，重悬至相同体积的0.01 M的pH 6.0磷酸盐缓冲液中，在该相同体系中分别加入100μL不同浓度 0nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM的L-半胱氨酸标准品溶液反应30 min，加入到微量比色皿中，测CD信号，绘制525nm处CD信号强度与L-半胱氨酸浓度标准曲线，如图3、图4所示。
对照组设置：L-酪氨酸，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-苏氨酸，D-苏氨酸，L-谷氨酸，D-谷氨酸代替L-半胱氨酸，其它操作同上。结果如图5所示，这些氨基酸不影响L-半胱氨酸的灵敏度和稳定性。

Claims (1)

1.一种运用圆二光谱检测L-半胱氨酸浓度的方法，其特征在于用合成的金纳米粒子与待检测目标物L-半胱氨酸反应，L-半胱氨酸通过Au-S键修饰于金纳米粒子表面，利用L-半胱氨酸的静电相互作用在液体的环境下金纳米粒子与L-半胱氨酸反应形成金纳米粒子二聚体，金纳米粒子二聚体的形成导致等离子手性的产生，金纳米粒子二聚体在可见光区产生圆二光谱CD信号，通过圆二光谱测定液体环境中的CD信号强度来测定L-半胱氨酸含量；
工艺步骤为：
（1）25nm金纳米粒子的合成
25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成：洁净的三口烧瓶中加入47.5mL超纯水，加入0.8mL质量浓度 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1mL 质量浓度1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌30min；
（2）金纳米粒子组装
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10min，重悬至相同体积的0.01 M的pH6.0磷酸盐缓冲液中，加入100μL 50nM L-半胱氨酸溶液反应30 min，组装形成金纳米粒子二聚体；
（3）金纳米粒子二聚体结构的表征
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子与步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取10μL滴于铜网上进行电镜表征；
步骤（1）制备的25 nm金纳米粒子与步骤（2）制备的金纳米粒子二聚体各取1000μL进行动态光散射表征；
（4）圆二光谱检测，绘制CD信号强度～L-半胱氨酸浓度标准曲线
取1000μL步骤 （1） 制备出来的25nm金纳米粒子，8000 rpm离心10 min，重悬至相同体积的0.01M的pH6.0磷酸盐缓冲液中；在该相同体系中分别加入100μL不同浓度0nM、0.05nM、0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM的L-半胱氨酸标准品溶液反应30 min，加入到微量比色皿中，测CD信号，绘制525nm处CD信号强度与L-半胱氨酸浓度标准曲线。
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