CN103159841A - 一种99mTc标记Cys-Annexin V的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于单光子发射计算机断层（SPECT）显像技术领域，具体涉及一种^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，以及^99mTc-Cys-Annexin V作为显像剂在检测细胞凋亡方面的应用。本发明所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，首次实现了通过配体交换法进行对Cys-Annexin V的^99mTc标记技术，以乙二胺四乙酸盐作为配体交换法中的配体，整个反应交换效率极高，且标记产物与反应中可能出现的杂质能够明显区分，相对于现有技术中的标记方法具有明显的优势。

Description

一种99mTc标记Cys-Annexin V的方法及其应用

技术领域

本发明属于单光子发射计算机断层（SPECT）显像技术领域，具体涉及一种^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，以及^99mTc-Cys-Annexin V作为显像剂在检测细胞凋亡方面的应用。

背景技术

细胞凋亡（Apoptosis）又称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death，PCD），是细胞生命周期中的重要组成部分，是不同于坏死和意外死亡的由基因调控的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡涉及一系列生物分子及细胞形态学的改变，其中，细胞膜脂质双层中的磷脂酰丝氨酸（PS）由膜内层翻转至外层，暴露于细胞表面，是细胞凋亡早期事件，发生在凋亡细胞形态学改变之前，也是凋亡级联反应的初始事件，作为凋亡细胞被吞噬细胞识别的标志，从而进一步引起胞浆的皱缩、染色质的浓集及核内DNA降解等。因此，外翻的PS是目前研究最多并最有希望和应用前景的凋亡检测靶点，可早期检测凋亡，具有较高的时效性，国内外常利用同PS特异性结合的药物来检测细胞凋亡。

膜联蛋白V（Annexin V，又称Annexin A5和AnxA5）是一种人体内源性蛋白，属于Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白家族，最早是从胎盘中分离出来，具有一些抗凝固及抗炎的作用，曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示，Annexin V是由位于人的第四条染色体4q26-q28上的Annexin V基因编码，含有319各氨基酸，包括70-80个氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究证实Annexin V能与PS特异性结合，亲和力高达10^-9mol/L。因此，以放射性核素标记Annexin V作为显像剂进行体内凋亡显像，实现细胞凋亡的活体无创显像，以实时监测体内凋亡的发生，成为监测活体细胞凋亡领域的研究重点，并已取得了较大进展。

Annexin V类显像剂的合成关键是放射性核素的标记，既要获得较高的放射化学纯度，同时又不能损伤Annexin V的结合活性。目前，以^99mTc标记Annexin V研究最多，^99mTc的优点在于半衰期为6h，可以及时显像，又使病人受的剂量较小，而且可以由Mo/Tc发生器方便的获得。然而，^99mTc直接标记Annexin V比较困难，标记率低，且在标记过程中会产生一些变性蛋白，造成肝脏的放射性摄取增加。因此，Annexin V的^99mTc标记以间接标记为主，常用的双功能鳌合剂有N-1-亚氨基-4-巯基丁基（Imino）、乙二胺半胱氨酸（EC）、二硫二氮（N₂S₂、又称BTAP）等，以肼基烟酰胺（HYNIC）最为多见，标记得到的^99mTc-HYNIC-Annexin V比活度较高，放射化学纯度大于90%，并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估。但是这些间接标记方法过程比较复杂，对技术条件要求严格，产物需纯化，尤其是不易制成药盒，临床使用受到一定限制。

最新的研究表明，Annexin V在基因重组表达中经结构修饰后可有利于用^99mTc直接进行标记。Annexin V的三维结构显示，其N-端和C-端都位于分子膜结合点的对面，因此在重组过程中对Annexin V的修饰并不影响重组蛋白在Escherichia colli的表达或折叠，也不改变其与膜PS结合的亲合性。如国外学者Tait JF等在N-端添加了7个氨基酸，其中含1-2个半胱氨酸残基，得到的三种突变体，分别命名为： Annexin V-116，Annexin V-117和Annexin V-118，国内学者华子春教授等在Annexin V的N端添加10个连续的组氨酸，命名为His10-Annexin V，这些重组的Annexin V变体与膜的结合活性跟天然Annexin V的相一致，并且这些重组的Annexin V变体经^99mTc标记后与^99mTc-HYNIC-Annexin V有比较相似的生物分布。这些表明对Annexin V的蛋白质工程改造是可行的。

中国专利CN102690345A又进一步公开了一种在大肠杆菌中克隆、表达并纯化得到的新的Annexin V变体，该变体仅在天然Annexin V的C-末端添加了1个半胱氨酸（Cys-Annexin V）。实验结果显示，在SP柱纯化时，相对于单独的Annexin V，Cys-Annexin V与SP柱结合得更为牢固，需要用更高的离子强度才能被洗脱下来，这从一个侧面说明Cys-AnnexinV比Annexin V具有更强的金属离子结合能力。而采用直接标记法对Cys-Annexin V进行^99mTc标记的实验也证实^99mTc-Cys-Annexin V具有与Cys-Annexin V相近似的性能，并且标记率高达95%左右。

但申请人在研究中发现，该专利文献中记载的以现有技术中^99mTc标记的方法对Cys-Annexin V进行标记时，得到的标记产物^99mTc-Cys-Annexin V与其他放射性杂质（如原料Na^99mTcO₄和副产物^99mTc胶体等）很难区分开，不仅影响产物的纯度，而且严重影响后续的研究及利用。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中^99mTc标记Cys-Annexin V的方法中标记产物与放射性杂质难以分离的问题，进而提供一种步骤简单、标记率高、同时无需进一步分离的^99mTc标记Cys-AnnexinV的方法；

进一步的，本发明还提供了上述标记产物作为显像剂在检测细胞凋亡方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取含有乙二胺四乙酸钠（EDTA-2Na）的磷酸缓冲液，并依次加入Cys-Annexin V、以及氯化亚锡稀盐酸溶液反应；

（2）向步骤（1）的反应液中加入新淋洗的Na^99mTcO₄溶液，混匀后置35-37℃水浴反应，得到标记产物^99mTc-Cys-Annexin V。

本发明所述的标记方法不仅标记率较高，而且检测发现各个可能存在的标记杂质及标记产物之间能得到较好的分离，所述检测步骤以HPLC方法进行，所述HPLC法选用TSK GEL凝胶柱，以浓度为0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液为流动相，流速为0.8mL/min,紫外检测波长为278nm，所述^99mTc-Cys-Annexin V的保留时间为9.8min。

所述Na^99mTcO₄溶液可采用现有技术中本领域技术人员熟知的任意方法得到。

所述步骤（1）中，所述乙二胺四乙酸钠的浓度为5-25mg/ml。

所述乙二胺四乙酸盐为本领域常见的盐类，本发明优选为乙二胺四乙酸钠或乙二胺四乙酸钾。

所述步骤（1）中，所述含有乙二胺四乙酸盐的磷酸缓冲液的浓度为0.1M、pH7.4。

所述步骤（1）中，所述亚锡盐的浓度为1-5mg/ml。

所述亚锡盐为本领域常见的起到还原剂作用的亚锡盐，本发明优选氯化亚锡、氟化亚锡、酒石酸亚锡、溴化亚锡或柠檬酸亚锡中的一种或几种的混合物。

所述亚锡盐稀盐酸溶液中稀盐酸的浓度为1%。

本发明还提供了一种标记蛋白^99mTc-Cys-Annexin V，为上述的方法标记得到的标记产物。

本发明还公开了一种显像剂，即上述的标记蛋白^99mTc-Cys-Annexin V。

以及所述的标记蛋白在检测细胞凋亡中的应用。

进一步的，本发明还提供了一种检测细胞凋亡的技术，即以上述的显像剂进行放射性核素显像。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

1、本发明所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，在国内外首次实现了通过配体交换法进行对Cys-Annexin V的^99mTc标记技术，并通过高效液相色谱法验证可知，不仅产物的标记率较高（均可稳定达到95%以上），而且将标记产物^99mTc-Cys-Annexin V与标记反应中可能存在的其他放射性杂质（如原料Na^99mTcO₄和副产物^99mTc胶体等）明显区分开，不仅有利于分离纯化，同时也有效提高了标记的纯度；

2、本发明所述的方法以乙二胺四乙酸盐作为配体交换法中的配体，在这个标记反应中，首先是氯化亚锡将Na^99mTcO₄中的^99mTc从高价态还原位低价态，低价态的^99mTc先和乙二胺四乙酸盐反应络合成^99mTc-EDTA，^99mTc-EDTA再与标记前体Cys-Annexin V发生交换反应，生成^99mTc-Cys-Annexin V，整个反应过程简单、交换标记效率极高，且标记产物与反应中可能出现的杂质能够明显区分，相对于现有技术中的标记方法具有明显的优势；

3、本发明所述的方法适宜性的开发出易于将产物明显区分的HPLC法，使得标记产物和可能出现的杂质可以得到明显的区分，而且分离效果较好；

4、本发明所述的方法步骤简单易行，且标记结果直观准确，同时由于标记效率高达95%以上，无需特定纯化提取步骤即可直接使用，因此易于制备药盒，解决了现有技术中其他直接标记方法存在的标记产物与杂质易混淆的问题；

5、本发明所述的标记蛋白与Cys-Annexin V具有相近似的性能，标记后的^99mTc-Cys-Annexin V可作为显像剂应用于检测细胞的凋亡状况，而大鼠肝脏凋亡实验证明，本发明所述的标记蛋白可直观反映出细胞的凋亡情况，且显像结果与原位末端标记法检测细胞凋亡的结果相一致，结果准确。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为本发明标记前体Cys-Annexin V的HPLC色谱图；

图2为实施例1中标记蛋白^99mTc-Cys-Annexin V的HPLC色谱图；

图3为实施例2中^99mTc-EDTA的HPLC色谱图；

图4为实施例3中^99mTc胶体的HPLC色谱图

图5为实施例3中Na^99mTcO₄的HPLC色谱图;

图6为实施例4中反应液的HPLC图；

图7为实施例5中^99mTc-Cys-Annexin V在正常小鼠体内的分布图；

图8为实施例5中^99mTc-Cys-Annexin V在正常小鼠体内的血药清除曲线；

图9为实施例6中大鼠肝脏凋亡模型的^99mTc-Cys-Annexin V显像图；

图10为实施例7中原位末端标记法检测大鼠凋亡肝脏细胞的凋亡情况。

具体实施方式

实施例1

以^99mTc标记Cys-Annexin V

Cys-Annexin V由江苏靶标生物医药研究所有限公司提供。应用基因工程技术利用大肠杆菌克隆、表达并纯化，在Annexin V的C端添加1个半胱氨酸，用金属亲和层析纯化，重组制备Cys-Annexin V。具体制备步骤及特征见中国专利CN102690345A。

采用配体交换法对Cys-Annexin V进行^99mTc标记，具体步骤包括：

（1）取100μL 5mg/mL的乙二胺四乙酸钠（EDTA-2Na）的磷酸缓冲液（0.1M，pH7.4），依次加入50μL 1mg/mL Cys-Annexin V的磷酸缓冲液（0.1M，pH7.4）以及15μL 1mg/mL的氯化亚锡稀盐酸（1%盐酸）进行反应；

（2）取0.5mL新淋洗的Na^99mTcO₄溶液（由江苏省原子医学研究所临床部核医学科提供），放射量为18.5-555MBq，混匀后置35-37℃水浴中孵育30min，取出即可，得到标记产物^99mTc-Cys-Annexin V；

（3）采用高效液相色谱（HPLC）法，采用TSK GEL凝胶柱（SWG2000swxL），以浓度0.05M、pH7.0的磷酸缓冲液为流动相，流速0.8mL/min，紫外检测波长278nm，并设置有同位素检测仪。同时以相同的检测条件检测未标记的Cys-Annexin V。如图1-2所示，测得^99mTc -Cys-Annexin V的保留时间（t_R）为9.8min，与没有标记的Cys-Annexin V的保留时间相一致。通过HPLC色谱图分析，计算得到标记率为98.5%。

实施例2

按照实施例1中所述的方法进行标记处理，其区别仅在于为了将^99mTc-Cys-Annexin V与其他放射性杂质区分开来，在标记过程中不加入Cys-Annexin V，而其他操作不变，得到的反应产物主要是^99mTc-EDTA，以实施例1中步骤（3）中所述的检测条件进行HPLC检测，如图3所示，^99mTc-EDTA的保留时间（t_R）为13.4min。

实施例3

按照实施例1中所述的方法进行标记处理，其区别仅在于为了将^99mTc-Cys-Annexin V与其他放射性杂质区分开来，在标记过程中不加入Cys-Annexin V和乙二胺四乙酸钠，而其他操作不变，得到的反应产物主要是^99mTc胶体，以实施例1中步骤（3）中所述的检测条件进行HPLC检测，如图4所示，^99mTc胶体的保留时间（t_R）为12.5min。

以实施例1中步骤（3）中所述的检测条件进行HPLC检测，Na^99mTcO₄溶液的保留时间（t_R）为15.9min，如图5所示。

图1-5中说明^99mTc -Cys-Annexin V与其他放射性杂质（如^99mTc胶体，^99mTc-EDTA和Na^99mTcO₄）能完全分开，通过HPLC计算^99mTc -Cys-AnnexinV的标记率，不仅可行且直观准确。

实施例4

以现有技术方法对Cys-Annexin V进行标记

取3.5mg氯化亚锡溶于10ml pH7.4的PBS缓冲液中制成3.5mg/ml的SnCl₂备用。室温下，取100μL SnCl₂溶液向其中加入0.6μg/μL的Cys-Annexin V 20μL进行反应。向其中加入体积小于0.1ml，放射量为185MBq的Na^99mTcO₄溶液，然后滴入10mg/mL Vc 10μL静止30min反应。以实施例1中所述HPLC的条件检测反应液，结果如图6所示。可见，以现有技术中的方法进行Cys-Annexin V标记，方法中存在的杂质很难与标记蛋白区分，一方面容易影响产物标记率的检测，同时也使得产物的纯度受到影响。

实施例5

通过^99mTc-Cys-Annexin V在小鼠体内的生物分布，说明该标记化合物的生物学分布特点符合作为显像剂的要求。

取ICR小鼠35只，随机分为7组，每组5只，经尾静脉注射0.2 mL（3.7MBq）实施例1中标记得到的^99mTc-Cys-Annexin V，分别于注射后5，15，30，60，120，180，240min共7个时间点断头处死。取出血液，脑、心、肝、脾，肺，肾，胃，小肠，膀胱，肌肉和骨等脏器，称重后用γ计数仪测量放射性计数，计算每克脏器百分注射剂量率（%ID/g，每克脏器的放射性计数/注射入大鼠体内总放射性计数×100%），如图7所示，肾中摄取的放射性最高，其次是膀胱，肝脏和肺，在脑中的摄取很低。用DAS2.0软件拟合，分析^99mTc-Cys-Annexin V在正常小鼠体内的药代动力学曲线，如图8所示，符合二室模型特征，药代公式为：C=5.972e^-0.123t+0.877e^-0.005t，分布相半衰期（T_1/2α）为5.619min，清除相半衰期（T_1/2β）为129.465min，平均血浆清除率（CL）为0.084L/min/kg，药-时曲线下面积（AUC_0→∞值）为238.123%ID/g*min。

实施例6

大鼠肝脏凋亡模型的^99mTc-Cys-Annexin V显像

选择SD大鼠4只（卫生部核医学重点实验提供），体重280-290g，以5mg/kg的放线菌酮剂量制备大鼠肝脏凋亡模型，3只大鼠分别经尾静脉注射放线菌酮溶液，另1只大鼠注射生理盐水作对照。3小时后，4只大鼠分别经尾静脉注射0.2mL（18.5MBq）^99mTc-Cys-Annexin V，注射显像剂后3h进行前、后位静态平面显像，能峰140KeV，能窗20%，图像矩阵128×128，采集计数1000K。如图9所示，左侧为模型鼠，箭头处为凋亡肝脏显像，右侧为正常对照鼠，在左侧模型鼠的前位静态平面显像图中可观察到肝脏部位有明显的放射性浓聚。

显像结束后，大鼠处死，立即取出肝脏，一部分用福尔马林液固定，另一部分用γ计数仪测定放射性计数，并称重，计算每克脏器百分注射剂量率（%ID/g），模型鼠肝脏摄取的放射性（ID%/g）是对照组的2.83倍。

实施例7

大鼠凋亡肝脏的原位末端标记法（TUNEL）检测

TUNEL法用于单细胞水平凋亡免疫组化检验和量化分析，其原理为标记DNA断裂位，详细步骤如下：（1）大鼠肝脏样本经福尔马林液固定24h后，石蜡包埋，切片，每片厚度4-5μm；（2）二甲苯脱蜡30min，梯度乙醇水化后PBS冲洗，每次1min，（3）滴加蛋白酶K，37℃孵育30min后，PBS洗涤3次，（4）滴加TUNEL检测液（购自碧云天生物技术研究所），37℃避光孵育1h，PBS洗涤3次，（5）用抗荧光淬灭封片液封片后，100倍荧光显微镜下观察。如图10所示，左侧为模型鼠，右侧为对照组，图中箭头所指为发荧光的凋亡小体，模型鼠的肝脏可见较多的发荧光的凋亡小体，而对照组的肝脏中发荧光的凋亡小体就很少。这个结果与^99mTc-Cys-Annexin V的大鼠肝脏凋亡显像的结果相一致，说明^99mTc-Cys-Annexin V标记化合物作为显像剂能够显示大鼠肝脏的凋亡情况。

实施例8

按照实施例1中所述的方法进行标记处理，其区别仅在于取乙二胺四乙酸钾进行反应，并且其浓度改为25mg/mL,而其他操作不变，以实施例1中步骤（3）中所述的检测条件进行HPLC检测，标记率为95.3%。同时，实验证明乙二胺四乙酸盐的浓度在5-25mg/mL范围内时，均能保证^99mTc-Cys-Annexin V的标记率大于95%。

实施例9

按照实施例1中所述的方法进行标记处理，其区别仅在于取溴化亚锡进行标记反应，且其浓度改为5mg/mL,而其他操作不变，以实施例1中步骤（3）中所述的检测条件进行HPLC检测，标记率为96.1%。同时，实验证明亚锡盐的浓度在1-5mg/mL范围内时，均能保证^99mTc-Cys-Annexin V的标记率大于95%。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (11)

1.一种^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取含有乙二胺四乙酸盐的磷酸缓冲液，并依次加入Cys-Annexin V、以及亚锡盐稀盐酸溶液反应；

（2）向步骤（1）的反应液中加入新淋洗的Na^99mTcO₄溶液，混匀后置35-37℃水浴反应，得到标记产物^99mTc-Cys-Annexin V。

2.根据权利要求1所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述乙二胺四乙酸盐的浓度为5-25mg/ml。

3.根据权利要求2所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述乙二胺四乙酸盐为乙二胺四乙酸钠或乙二胺四乙酸钾。

4.根据权利要求3所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述含有乙二胺四乙酸盐的磷酸缓冲液的浓度为0.1M、pH7.4。

5.根据权利要求1-4任一所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述亚锡盐的浓度为1-5mg/ml。

6.根据权利要求5所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述亚锡盐为氯化亚锡、氟化亚锡、酒石酸亚锡、溴化亚锡或柠檬酸亚锡中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求6所述的^99mTc标记Cys-Annexin V的方法，其特征在于：所述氯化亚锡稀盐酸溶液中稀盐酸的浓度为1%。

8.一种标记蛋白^99mTc-Cys-Annexin V，其特征在于为权利要求1-7任一所述的方法标记得到的标记产物^99mTc-Cys-Annexin V。

9.一种显像剂，其特征在于，为权利要求8所述的标记蛋白^99mTc-Cys-Annexin V。

10.一种权利要求8所述的标记蛋白在检测细胞凋亡中的应用。

11.一种检测细胞凋亡的技术，其特征在于，以权利要求9所述的显像剂进行放射性核素显像。

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