CN103145685B - 一类荧光化合物和其在检测钌中的应用 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
本发明公开一种荧光化合物，其具有通式Ⅰ的结构，另外涉及利用通式Ⅰ所述荧光化合物检测样品中钌金属的方法，其通过以下步骤实现1）为样品提供合适的pH体系；2）把下列检测液与样品混合，所述检测液由荧光化合物Ⅰ、一种氧化剂和助溶剂乙腈组成。3）检测混合后样品的荧光强度即可测得样品中钌金属含量。其原理是通过氧化物氧化样品中的Ru成为RuO4，然后RuO4氧化荧光团中的烯烃为羧酸，羧酸结构最终以CO2、γ-丁内酯或者δ-戊内酯的形式离去，从而使荧光增强。此方法能够检测到样品中非常低的钌含量，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一类荧光化合物，通过烯烃氧化反应机理使它们能够作为探针检测各种含钌试剂，例如Ru3+和格拉布斯二代催化剂。
背景技术
由于金属元素在生物系统中的重要性和其在活细胞中检测的困难性，使荧光技术应用于金属的检测变的尤为重要。一些荧光检测系统能够检测环境中真实样品的被测物。另外，因为荧光检测方法的快速和可再生性，使它在许多筛选应用中变的非常重要。
例如，钌金属在化学，医学和其他材料中被广泛的应用。在有机合成过程中，因为非常方便的形成碳碳双键，钌催化的烯烃复分解反应在一些活性药物制剂的制备中变的越来越重要，同时烯烃复分解反应在2005年获得了诺贝化学奖。钌金属催化剂尤其是格拉布斯二代催化剂已经被广泛的应用于关环复分解反应（RCM）、开环复分解反应（ROMP）、和交叉复分解反应（CM）。但是，尽管经过提纯和清理过程，但是对身体有危害的钌还是会出现在最终产品中。在活性药物成分中，钌残留标准在5ppm以下，尽管经过另外的纯化和分析过程，但是通过烯烃复分解反应生成的产品中经常有远高于标准的钌金属残留。
典型的钌检测分析方法包括原子吸收光谱法（AAS）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）。但是，这些方法通常需要大型分析检测仪器，复杂的样品预处理过程，而且需要经过专门训练的人员操作，使得这些检测方法成本很高，难于普及应用，荧光分子传感器正逐渐成为一种廉价和简单的方法。
钌在社会生产活动中应用范围非常广泛，对于钌的定量检测近年来引起研究人员越来越广泛的关注，因为钌的检测识别直接关系到钌残留水平的评估及钌污染问题的控制。钌可能通过饮用水或生物链被人体吸收从而对人体健康产生危害。因此，迫切需要一种方便，快捷的钌分析的荧光分子探针。
发明内容
本发明涉及一种荧光化合物，其具有通式Ⅰ的结构。还涉及一种利用此种荧光化合物检测钌含量的方法，利用高价钌的强氧化性，氧化荧光化合物的荧光团上的碳碳双键，从而引起荧光强度的变化，通过对荧光强度的测试定量的检测钌含量。本发明的技术方案如下：
一方面在于：包括一种荧光化合物，其具有以下通式Ⅰ的结构：
其中：R1和R2各自独立的选自H、C1-18烷基或苯基；
X1和X2各自独立的选自H、C1-6烷基、或卤素；
Z是O、S、Se或NR′，R′是H或C1-6烷基；
Y选自H、K、Na、Li、NH4、NH3R3、NH2(R3)2、NH(R3)3或N(R3)4；其中的R3为H或C1-6烷基；
n为0～18的整数。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，其所述的n选自0、3～8中的任一整数。最优选的情况下所述的n为0、3或4。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，其所述的苯基包括对位和邻位单取代或双取代的苯基，所述取代基选自下列取代基中的一种：H、C1-18烷基、SH或C1-6烷氧基。
本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基，例如，“C1-6烷基”包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
C1-6烷氧基中的烷基部分包括C1-4烷基、C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。
本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，其所述的R1和R2各自独立的选自H或CH3。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，其所述的X1和X2为H或Cl，Z为O或S。
对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，其所述的Y为H、K、Na、Li或NH4。
本发明的另一个方面为：一种检测样品中钌金属的荧光方法，其包括以下操作步骤：
（1）为待测样品提供pH为2～12的缓冲液体系，制得待检液；所述的缓冲液体系选自：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、邻苯二甲酸氢钾缓冲液、碳酸钠缓冲液或醋酸钠缓冲液中的一种；
（2）把检测液与步骤（1）所得待检液按照1:（12～67）的体积比混合，所述检测液由权利要求1所述荧光化合物、氧化剂和乙腈按照1:(10～30):(19200～108800)的摩尔比混合制备；其中，所述氧化剂为NaIO4、HIO4、NaClO、NaBrO3或KHSO5；
（3）检测步骤（2）所得混合物的荧光强度。
对于上文所述的检测样品中钌金属的荧光方法中，优选的情况下，步骤（1）中为待测样品提供缓冲液体系的pH为4～10，最优选的情况下pH为4。
对于上文所述的检测样品中钌金属的荧光方法中，优选的情况下，所述的检测液与步骤（1）所得待检液按照体积比1:(12-40)混合，最优选的情况下，所述的检测检测液与步骤（1）所得待检液按照体积比1:12混合。
对于上文所述的检测样品中钌金属的荧光方法中，优选的情况下，所述检测液由上文所述的荧光化合物、氧化剂和乙腈按照1:(15～25):(19200～50000)的摩尔比混合制备，最优选的情况下，所述的荧光化合物、氧化剂和乙腈按照1:20:19200的摩尔比混合制备。
对于上文所述的检测样品中钌金属的荧光方法中，优选的情况下，所述氧化剂为NaIO4或HIO4。
对于上文所述的检测样品状态为液体时，可直接参与混合，当检测样品为固体时用乙腈或水溶解后再参与混合。
本发明上述技术方案中，通式I中取代基的优选原则是：R1和R2各自独立的选自H、C1-18烷基或苯基，其目的是选用一些供电子基团，能够使化合物的荧光淬灭的更彻底；X1和X2各自独立的选自H、C1-6烷基、或卤素；其目的是能增强荧光增强的倍数：Z选自有孤对电子的元素，其目的是能增强分子的共平面效应，减少能量损失，Y选自一价的阳离子。此通式结构能够满足其在检测样品中钌金属的方法中，其通过氧化物氧化样品中的Ru成为RuO4，然后RuO4氧化荧光团中的烯烃为羧酸，羧酸结构最终以CO2、γ-丁内酯或者δ-戊内酯的形式离去，从而使荧光增强。荧光团具有氧保护基团（X=(CH2)nCH=CHR1R2,n=0～18）。另外，样品中需要加入氧化物和助溶剂。此方法能够检测到样品中非常低的钌含量，具有广泛的应用前景。检测过程如下所示：
没有荧光 有荧光
X=(CH2)nCH=CHR1R2,n=0,3,4
附图说明
图1是探针分子3的合成过程和钌催化下探针从无荧光状态3到荧光状态5的转变过程图。
图2：其中A是探针分子3在不同的pH体系下对Ru3+的检测光谱图；B是钌探针分子3在不同的商品化pH缓冲体系中对Ru3+的检测光谱图。探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图3是检测Ru3+时，探针分子3在不同浓度的高碘酸钠体系下的荧光强度图。F0是当高碘酸钠浓度为0μM时的荧光强度。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度分别为10,50,100,150,200,250,300,400μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图4是探针分子3检测Ru3+时的动力学曲线图。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图5是荧光探针分子3检测Ru3+荧光强度和Ru3+浓度的线性关系图。测试体系在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，F0和Fmax分别代表钌离子浓度为0和100nM时524nm处荧光强度，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图6A和6B是阳离子对探针分子3检测Ru3+时的选择性和干扰图。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，Ru3+浓度为0.2μM，其他阳离子浓度为2μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。金属离子分别为：RuCl3,Ca(NO3)2,Pb(NO3)2,Cr(NO3)2,Cd(NO3)2,PdCl2,Mg(NO3)2,NaNO3,Fe(NO3)3,Zn(NO3)2,KCl,AgNO3,Cu(NO3)2,Co(NO3)2andHg(NO3)2。
图7是探针分子3检测不同钌样品的光谱图。白色柱表示没有加入钌样品，竖条柱表示没有提前混合的钌样品，斜纹柱表示提前与高碘酸钠混合一小时的钌样品。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，Ru浓度为0.1μM，其他阳离子浓度为2μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图8是浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，不同乙腈含量对荧光探针3检测Ru3+的影响。乙腈含量从1.5%到10%。竖线柱：没有加Ru3+；斜线柱：加Ru3+。探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，Ru3+浓度为0.1μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图9是荧光探针3不同提前混合时间对荧光强度的影响图。格拉布斯二代催化剂分别和高碘酸钠提前混合0,10,20,35,50,60,70和85分钟。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，格拉布斯二代催化剂浓度为0.1μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图10A是在活性有机化合物存在下荧光探针3检测格拉布斯二代催化剂的光谱图。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，格拉布斯二代催化剂浓度为10nM，其他有机化合物浓度为20μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图10B是图10A中用到的有机化合物的结构图。
图11是荧光探针4检测Ru3+时，不同浓度的高碘酸钠体系下的荧光强度图。F0是当高碘酸钠浓度为0μM时的荧光强度。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子4的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度分别为10,50,100,150,200,250,300,400，500μM检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
图12是探针分子5检测Ru3+时的动力学曲线图。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子5的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
荧光团是现有技术中用以描述分子中能发出荧光的官能团部分，荧光团被广泛的应用于生物应用当中，例如免疫化学。常用的荧光团包括荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，BODIPY及其衍生物和菁类等荧光染料。可以查阅例如荧光探针手册，研究化学，分子探针等参考书籍。
本发明中，在把钌从有机配合物中解离出来和把不同氧化态的钌氧化成为四氧化钌过程中，氧化反应是一个非常关键的步骤。根据文献报道，烯烃的双键能够被催化量的RuCl3同时配合一定量的氧化剂氧化成为羧酸的形式，其中氧化剂可以选择高碘酸钠。这个反应的机理是氧化钾先将RuCl3氧化为活性物质RuO4，RuO4再氧化烯烃烃为羧酸结构。本发明将这种氧化反应能够应用到荧光检测方法中，从而能够检测RuCl3和其他氧化态的钌，例如格拉布斯二代催化剂。
在本发明中，钌荧光探针基于烯烃氧化反应引起荧光强度的变化实现对钌金属的检测。当荧光素类物质的酚羟基被烷基化后是没有荧光的，但是当这个烷基脱去后会出现非常强的绿色荧光。荧光素的这种荧光特性已被多次应用于不同的检测目的，证明了这是一种非常好的设计荧光探针的策略，同时此方法也被应用于钯探针和汞探针的研究中。
本发明使用了烯烃结构作为羟基的保护基团，因为烯烃的C=C能够被氧化为–COOH，最后通过小分子的脱去实现荧光强度的变化。本发明通过荧光探针与待检测的金属混合，检测荧光强度的变化，从而确认化合物做为金属探针的灵敏度。
为了检测样品中的金属，本发明选择带有荧光团的探针分子直接检测样品。荧光团在与金属反应后能够在紫外光或可见光下发出荧光，通过此方式，如果样品能够发出荧光（用紫外灯，镭射笔或其他设备或通过视觉观察），则能确定有金属的残留。本发明设计的带有荧光团的探针分子能够检测到样品中ppm级别的钌浓度。
将含有金属钌的待检样品加入到pH为4到11的缓冲体系（例如商品化pH缓冲液）中，同时加入浓度为15μM的荧光探针、一种浓度为300μM的氧化剂（例如NaIO4或HIO4）和助溶剂乙腈，所述乙腈为1.5～10%的体积含量，缓冲液为98.5～90%的体积含量，体积含量是根据缓冲液和乙腈混合之后的体积计算的。
本发明中的方法适合检测不同价态的钌，例如钌离子（Ⅲ）和有机配合物中的钌（Ⅱ）。用本发明中的荧光检测方法可以检测到浓度为0.3ppb浓度的钌。
因此，本发明提供了一种检测钌的荧光方法，通过使用简单的手持紫外灯或荧光笔就能观察到荧光发射。本发明中的方法可以用于很多情况下的钌的检测，例如药物制剂中的钌；环境中的含钌样品，例如水、废水、油或污泥；与人接触的或人使用的水，例如化妆品和食品添加剂等。
实施例1化合物1的合成方法
氮气保护的条件下，在干燥的100mL单口瓶中加入3g DMF(2,7-二氯荧光素)，2.6g无水碳酸钾和40mL干燥DMF，加入磁子，在50℃油浴中加热搅拌，然后在氮气保护下加入2.26mL烯丙基溴，继续搅拌12个小时后停止反应，冷却后加入250mL去离子水，再用300毫升乙酸乙酯萃取三次，收集的有机相通过水洗和饱和氯化钠溶液洗，经无水硫酸钠干燥有机相，过滤，旋蒸，产物用正己烷重结晶，最后得到2.8g橘红色化合物1的固体，产率为80%。化学方程式显示在图1中。
实施例2化合物2的合成方法
在干燥的100mL单口瓶中加入1g化合物1，0.66g氢氧化钠和40mL四氢呋喃，加入磁子在在70℃油浴中加热搅拌6个小时，冷却后用3M稀盐酸调节pH至1，然后用30mL乙酸乙酯萃取，有机相通过水洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，粗产品通过柱色谱提纯，最后得到450mg黄白色产品。化学方程式显示在图1中。1H NMR(400MHz,CDCl3,293K)δ8.12–8.01(dd,1H),7.79–7.60(m,2H),7.20–7.12(m,1H),6.97–6.89(m,1H),6.85–6.78(m,1H),6.76–6.68(m,2H),6.16–5.98(m,1H),5.50(dd,J=17.3,1.4Hz,1H),5.37(dd,J=10.6,1.3Hz,1H),4.67(d,J=5.0Hz,2H).
实施例3化合物3的合成方法
氮气保护的条件下，在100mL单口瓶中加入150mg叔丁醇钾和300mg化合物2，最后加入10mL DMSO，加入磁子在在80℃油浴中加热搅拌12个小时。待冷却后用3M稀盐酸调节pH至1，然后加入50mL去离子水，用30mL乙酸乙酯萃取，有机相通过水洗和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸，粗产品通过柱色谱提纯，最后得到45mg黄色产品。化学方程式显示在图1中。1H NMR(400MHz,CDCl3,293K)δ8.07(d,J=7.2Hz,1H),7.71(ddd,J=19.0,11.1,6.9Hz,2H),7.17(d,J=7.4Hz,1H),6.92(d,J=6.5Hz,2H),6.77(s,1H),6.72(s,1H),6.47–6.31(m,1H),5.20–5.07(m,1H),1.74(dd,J=6.9,1.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3,293K)δ169.09,154.54,153.34,152.15,150.94,150.53,139.30,135.61,130.40,128.99,127.99,126.26,125.52,123.85,118.77,116.32,112.92,112.14,111.59,104.20,103.57,81.87,9.51;HRMS(ESI-)calcd for C23H13O5Cl2439.0140found439.0148.
实施例4化合物4和5的合成方法
与化合物2的合成步骤类似，将化合物2合成过程中用到的烯丙基溴换为5-溴-1-戊烯或6-溴-1-己烯，经过烷基化和水解，得到化合物4和5。4：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(1H,s),8.02(1H,s),7.79(2H,d,J20.7),7.27(2H,d,J55.6),6.93(1H,s),6.72(2H,d,J22.9)5.82(1H,s),4.99(d,2H,J=10.2Hz),4.19(s,2H),2.27(2H,s),1.86(2H,s).
5：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.11(1H,s),8.02(1H,s),7.79(2H,d,J20.7),7.27(2H,d,J55.6),6.93(1H,s),6.72(2H,d,J22.9),5.83(1H,s),5.34–4.79(2H,m),4.16(2H,s),2.10(2H,s),1.76(2H,s),1.52(2H,s).
实施例5荧光探针化合物3检测钌离子的pH体系的研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=3,4,5,6,7,8,9的PBS磷酸缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL pH=3,4,5,6,7,8,9的PBS磷酸缓冲液和30μL高碘酸钠水溶液于小瓶中，然后向其中加入45μL探针溶液，使探针的终浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，然后再向其中加入40μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图2A中。横坐标代表不同pH，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看到，探针化合物3在pH为4时对钌离子的检测效果最佳。
由商业途径可以获得商品化的pH值为4的缓冲剂，为了简化本发明的实施方式，以下使用上述商品化的pH缓冲剂配置标准缓冲液作为探针分子的检测体系，并进行探讨。
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00（邻苯二甲酸氢钾缓冲液）,6.86（混合磷酸盐缓冲液）,9.18（四硼酸钠缓冲液）缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和30μL高碘酸钠水溶液于小瓶中，然后向其中加入45μL探针溶液，使探针的终浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，然后再向其中加入40μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图2B中。横坐标代表不同pH，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出商品化pH缓冲液（pH=4.00，邻苯二甲酸氢钾缓冲液）也能够提供比较完美的缓冲体系，并且对钌离子的检测没有什么影响。所以以后的研究中就选择邻苯二甲酸氢钾缓冲液作为本发明的检测体系。
实施例6不同浓度的高碘酸钠对荧光探针化合物3检测钌离子结果影响的研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及1.0,5.0,10,15,20,25,30,40mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL浓度分别为1.0,5.0,10,15,20,25,30,40mM的高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入40μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图3中。横坐标代表高碘酸钠的浓度，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可知使高碘酸钠比钌离子量稍高能够使检测结果更为明显。即当钌离子浓度为0.2μM而高碘酸钠浓度大于200μM时，性噪比能够达到最大，也就是检测结果最好。因此本发明中选择浓度为300μM的高碘酸钠用于本发明中。
实施例7荧光探针化合物3检测钌离子的动力学研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入20μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图4中。横坐标代表时间，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出一个小时以后荧光强度能够达到饱和。
实施例8探针化合物3检测低浓度钌离子的研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入20μL浓度分别为15,13.5,10.5,7.5,4.5,1.5,1.0μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图5中。横坐标是钌离子浓度的负对数，纵坐标是524nm处相对荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出荧光信号相对于钌离子的浓度有一个很好的线性关系，拟合相关系数R2=0.991。
表1是ICP-MS和本发明中的荧光探针3测定的不同浓度的格拉布斯二代催化剂。在浓度为50mM的pH4邻苯二甲酸氢钾缓冲体系中，探针分子3的浓度为15μM，高碘酸钠的浓度为300μM，在检测荧光强度前在室温下放置1小时，激发波长为490nm，发射波长为524nm。
表1ICP-MS和荧光探针3测定的不同浓度的格拉布斯二代催化剂结果
实施例9金属阳离子对荧光探针化合物3检测钌离子的选择性和干扰研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入40μL浓度为的15μM的钌标准溶液，其他小瓶中分别加入40μL浓度为的150μM的其他金属离子，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图6A和6B中。横坐标是不同的金属离子，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55
从图中可以看出探针分子具有很好的选择性和抗干扰能力。值得注意的是其他一些具有π电子结构的金属离子，例如银离子，镍离子，金离子，钴离子，汞离子和钯离子都没有能完成氧化反应，也就是没能使探针分子从形态3变为形态5。
实施例10荧光探针化合物3对不同钌源的检测
首先通过以下步骤制备了老化的格拉布斯催化剂：
在100mL的单口瓶中加入136mg二烯丙基丙二酸二乙酯和22.7mg格拉布斯二代催化剂，再加入20mL二氯甲烷，常温搅拌8小时。停止反应后旋蒸，用乙腈稀释到格拉布斯二代催化剂浓度也就是钌浓度为3.0μM。
竖线柱样品的制作过程：配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入100μL浓度为的3μM的钌离子水溶液以及新鲜配制的和先前制备的老化的格拉布斯二代催化剂乙腈溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。斜线柱样品的制备过程：配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。首先将1mL浓度为的3μM的钌离子水溶液以及新鲜配制的和先前制备的老化的格拉布斯二代催化剂乙腈溶液分别与300μL浓度为30mM的高碘酸钠水溶液混合1小时，然后分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后再向其中加入130μL之前混合的溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图7中。横坐标是不同的钌源，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出格拉布斯二代催化剂和钌离子有相同的钌元素浓度，但是，若把能够检测的钌离子体系算作100%的话，本发明的检测体系只能检测到新鲜配制的格拉布斯二代催化剂30%和40%的老化格拉布斯二代催化剂。可能是因为格拉布斯二代催化剂中的钌由于和有机物配合在一起，不能全部被高碘酸钠氧化为RuO4。
为了提高检测效率，本发明的进一步实验中改变了加料顺序，先把含钌样品和氧化物高碘酸钠混合一小时，然后再加入缓冲液和探针分子3，最后结果显示这样能够检测到老化格拉布斯二代催化剂中全部的钌元素，但是新鲜配制的格拉布斯二代催化剂不能全部被检测到。这可能是因为在经过烯烃交换反应后，格拉布斯二代催化剂中钌原子的配合状态有所改变。
实施例11不同乙腈含量对荧光探针化合物3检测钌离子结果的影响的研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85,2.81,2.75,2.69,2.6mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，再向其中加入40μL浓度为的15μM的钌标准溶液，然后向其中分别加入0,45,105,155,255μL乙腈，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图8中。横坐标是不同的钌源，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出当乙腈含量1.5～10%，对检测结果没有影响。
实施例12待测样品与高碘酸钠不同提前混合时间对检测效果的影响
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。首先将1mL浓度为的3μM的钌离子水溶液以及新鲜配制的和先前制备的老化的格拉布斯二代催化剂乙腈溶液分别与300μL浓度为30mM的高碘酸钠水溶液混合。然后分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后分别混合时间为0,10,20,35,50,60,70和85分钟的之前混合溶液130μL分别加入到小瓶中，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图9中。横坐标是不同的钌源，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出混合时间为1小时后，检测结果趋于稳定。
实施例13荧光探针化合物3检测存在于药物样品中的格拉布斯二代催化剂
为了证明本发明的实用性，本发明使用荧光探针化合物3检测存在于活性有机化合物中的残留格拉布斯二代催化剂。
按照如下步骤制备了含钌样品：在100mL的单口瓶中分别加入3μmol，2.55mg格拉布斯二代催化剂和6.0mol图10B中的有机化合物以及10mL二氯甲烷，常温搅拌8小时，然后旋蒸，残余物用乙腈稀释到格拉布斯二代催化剂浓度（即钌浓度）为3.0μM。
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。首先将0.1mL之前配好钌溶液分别与300μL浓度为30mM的高碘酸钠水溶液混合1小时，然后分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后再向其中加入40μL之前混合的溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图10A中。横坐标是不同样品，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
这些含钌样品都经过了8小时的老化过程，从图10A中可以看出，对于所有的样品，荧光信号恢复强度都能达到65～100%，这也说明了本发明中的探针可以检测在活性有机化合物中的残留格拉布斯二代催化剂而不受其干扰。
实施例14不同乙腈含量对荧光探针化合物3检测钌离子结果的影响的研究
配置浓度为1mM的化合物3的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85,2.81,2.75,2.69,2.6mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，再向其中加入40μL浓度为的15μM的钌标准溶液，然后向其中分别加入0,45,105,155,255μL乙腈，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图8中。横坐标是不同的钌源，纵坐标是524nm处荧光强度，所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出当乙腈含量1.5～10%，对检测结果没有影响。
实施例15不同浓度的高碘酸钠对荧光探针化合物4检测钌离子结果影响的研究
配置浓度为1mM的化合物4的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及1.0,5.0,10,15,20,25,30,40mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL浓度分别为1.0,5.0,10,15,20,25,30,40mM的高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入40μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图11中。横坐标代表高碘酸钠的浓度，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可知使高碘酸钠比钌离子量稍高能够使检测结果更为明显。即当钌离子浓度为0.2μM而高碘酸钠浓度大于200μM时，性噪比能够达到最大，也就是检测结果最好。
实施例16荧光探针化合物5检测钌离子的动力学研究
配置浓度为1mM的化合物5的乙腈溶液和50mM，pH=4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲液以及30mM的高碘酸钠水溶液。分别取2.85mL之前配置的缓冲液和45μL探针溶液于小瓶中，使探针的终浓度为15μM，然后加入30μL高碘酸钠水溶液，然后再向其中加入20μL浓度为15μM的钌标准溶液，摇晃均匀，室温下放置1h后测定各个小样的荧光。探针激发波长为490nm，探针发射波长为524nm，测试结果显示于图12中。横坐标代表时间，纵坐标为524nm处的荧光强度。所用仪器为荧光分光光度计，型号：LS55。
从图中可以看出一个小时以后荧光强度能够达到饱和。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光探针是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光探针，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种荧光化合物，其具有以下通式Ⅰ的结构：
其中：R1和R2为H或CH3；
X1和X2为Cl；
Z为O；
Y为H；
n为0、3或4。
2.一种检测样品中钌金属的荧光方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)为待测样品提供pH为2～12的缓冲液体系，制得待检液；所述的缓冲液体系选自：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、邻苯二甲酸氢钾缓冲液、碳酸钠缓冲液或醋酸钠缓冲液中的一种；
(2)把检测液与步骤(1)所得待检液按照1:(12～67)的体积比混合，所述检测液由权利要求1所述荧光化合物、氧化剂和乙腈按照1:(10～30):(19200～108800)的摩尔比混合制备；其中，所述氧化剂为NaIO4、HIO4、NaClO、NaBrO3或KHSO5；
(3)检测步骤(2)所得混合物的荧光强度。
3.根据权利要求2所述的检测样品中钌金属的荧光方法，其特征在于，所述的检测液与步骤(1)所得待检液按照1:(12-40)的体积比混合。
4.根据权利要求2所述的检测样品中钌金属的荧光方法，其特征在于，所述检测液由权利要求1所述荧光化合物、氧化剂和乙腈按照1:(15～25):(19200～50000)的摩尔比混合制备；其中，所述氧化剂为NaIO4或HIO4。
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