CN103123672A

CN103123672A - 抗结核抑制剂筛选的靶标基因Rv0233及应用

Info

Publication number: CN103123672A
Application number: CN2011103738235A
Authority: CN
Inventors: 何正国; 崔涛; 曾菊梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明属于药物分子学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Rv0233在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如SEQ.ID NO：2所示。利用虚拟筛选的方法，针对Rv0233的天然底物活性中心，通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv0233天然底物结合位点具有高亲和力的18个小分子化合物，从中得到1个抑菌化合物(吡唑类化合物51#)，该化合物的名称为2-({[1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-4-yl]甲基}氨基)乙醇，本发明对该化合物在结核分枝杆菌的抑菌效应进行了评价。

Description

抗结核抑制剂筛选的靶标基因Rv0233及应用

技术领域

本发明属于药物分子学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Rv0233在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用。

背景技术

结核分枝杆菌是一种严重危害人类健康的病原菌，据世界卫生组织统计，全世界每年大约有三百万人死于结核病，并且全球约有三分之一的人口感染处于潜伏状态的结核分枝杆菌(WHO，2009)。目前，结核病化学疗法有一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要6～9个月，导致了严重的毒性和抗药性。从引进抗结核药物时便不断出现抗药性结核分枝杆菌菌株。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此外，遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(Gandhi et al，2010)。近年来出现的药物抗性菌株以及与HIV的共感染问题，使得这一形式更加严峻。因此，寻找新的药物靶标并研发新的抗结核药物和诊断工具已经迫在眉睫(Ginsberg and Spigelman，2007)。特别地，需要具有新作用机制的对抗药性菌株具有活性的新药物。相应地，还存在鉴定新药物靶标的迫切要求。

在研发新的抗结核药物中，常规的筛选方法是使用化合物库进行批量筛选，在Bryk R及其同事的相关工作中，抑菌试验一共使用了15,000个化合物(Bryk R et al，2008)，工作量大，费钱费力，结核分枝杆菌是一种病原菌，无法常规操作，需要寻找特异性好，命中率高的抑制剂。目前在结核分枝杆菌中基于结构的药物设计是研发新的抗结核药物的有效手段，但是相关的研究只进行到筛选出潜在的药物小分子，没有进行抑菌试验(Cui T at al，2009；Dube D et al，2008)，导致无法评估所筛选到的小分子是否具有潜在的应用价值。

结核分枝杆菌Rv0233基因编码核苷酸还原酶(NrdB；EC：1.17.4.1)，催化由核糖核酸形成脱氧核糖核酸的反应(Mowa MB et al，2009)。目前已经获得Rv0233蛋白质与肉豆蔻酸共结晶的晶体结构(PDB ID：3EE4)(Mowa MB et al，2009).在本发明中，Rv0233蛋白质结合肉豆蔻酸的活性空腔被选作对接化合物的活性位点。将有致病性的结核分枝杆菌H37Rv菌株与无致病性的BCG卡介苗相比，结核分枝杆菌Rv0233蛋白是差异表达的基因中上调最高的，上调倍数达7倍之多(Schmidt F et al，2004)。这说明Rv0233基因的表达可能与结核分枝杆菌的致病性密切相关，它是潜在的作为药物靶标的理想选择。然而，到目前为止，尚未有人报道具有抗结核效应的Rv0233的抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分子设计方法，获得一种新的结核病治疗药物的靶标。本发明的另一个目的是针对Rv0233天然底物结合位点筛选的小分子化合物抑菌试验中确实能起到抑菌作用。确定结核分枝杆菌中的Rv0233是一种合适的抗结核抑制剂筛选的靶标。

本发明是这样实现的：首先通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv0233天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物。本发明获取结核分枝杆菌Rv0233的蛋白质序列(编码该蛋白质的序列可以从Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList万维服务器；Rv0233基因坐标：从278585到279529获得)，其全长包含314个氨基酸残基。目前已经获得Rv0233与肉豆蔻酸共结晶的晶体结构(PDB ID：3EE4)(Mowa MB et al，2009).在本发明中，Rv0233结合肉豆蔻酸的活性空腔被选作对接化合物的活性位点。利用所获得的三维结构信息和活性位点信息，在计算机上构建了一个针对结核分枝杆菌Rv0233的计算机辅助药物筛选系统，然后运用该系统从小分子化合物数据库中筛选与之活性位点有高亲和力的化合物分子。

其次，本发明测定了小分子抑制剂对结核分枝杆菌的抑菌作用。为了确定哪些抑制剂分子具有抑菌活性，将50μg/ml的候选抑制剂添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中。将添加了抑制剂的细菌培养物于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照进行比较来判断细菌生长是否受到抑制。其中对照1是不用抑制剂的处理，对照2是使用利福平处理，实验过程中的数据是与两个对照比较来评价利用所述候选抑制剂得到的抑制效果，

最后，本发明确定了候选抑制剂的最小抑制浓度(MIC)。在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。候选抑制剂的使用量或浓度取决于若干因素，包括该抑制剂的分子量，其溶解度等。优选两种及两种以上的浓度梯度，以便计算候选抑制剂的MIC(最低抑制浓度)。然后按照实验设计将抑制剂按不同浓度梯度稀释(见实施例)后，添加到7H9商用培养基的分枝杆菌培养物中。将添加了候选抑制剂的分枝杆菌培养物于37℃培养7～8天，通过读取各OD值来判断细菌生长是否受到抑制。

本发明的优点

本发明针对Rv0233的活性位点进行计算机辅助的药物设计，高通量筛选小分子化合物数据库。设计的小分子抑制剂，命中率高，工作量小，省时省钱省力，筛选到的化合物确实能有效抑制细菌的生长。由于是针对细胞靶点设计的药物，而细胞靶点突变速率相对较慢，因此不易形成耐药性。显而易见，本发明筛选的与结核分枝杆菌Rv0233活性位点的结合的化合物可在抗结核药物开发中应用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明涉及的结核分枝杆菌Rv0233的蛋白质的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明涉及的结核分枝杆菌Rv0233的蛋白质的序列。

图1.本发明技术流程图。

图2.通过体外对接筛选到的小分子化合物与Rv0233蛋白质结合的相对构象。

图3.候选抑制剂在结核分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图4.候选抑制剂在牛型分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图5.候选抑制剂在耻垢分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图6.本发明筛选出的抑制剂51#小分子化合物的结构式。

图7.最小抑菌浓度测定实验中结核分枝杆菌菌株在各抑制剂浓度下的生长情况。从左到右为吡唑类化合物即51#抑制剂的浓度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

具体实施方式

本发明可以通过下述实施例来说明，但本实施例不是限制本发明的保护范围。

实施例1.建立针对结核分枝杆菌Rv0233的计算机药物筛选系统

本实施例中构建针对结核分枝杆菌Rv0233的计算机药物筛选系统所用的操作系统为Linux操作系统，发行版本为Fedora Core 7-i386版本。chimera软件从网络(http://www.cgl.ccsf.edu/chimera/)免费下载，下载后直接安装运行。Dms源代码包从网络(http://www.cgl.ucsf.edu/Overview/softwarc.htm]#dms)免费下载，在本机linux计算机上编译得到可运行的二进制程序，然后安装。通过与美国加利福利亚大学Kuntz实验室签署使用协议，获得DOCK软件使用许可。通过网络(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK_6/index.htm)获得DOCK软件包的源代码(版本为6.1)，在本地linux计算机上对源代码进行编译，得到可运行的二进制程序然后安装。后续实施例中所用到的sphgen、sphere_selector、showbox、grid、dock6程序以及相关的一些化学参数文件均来自DOCK软件包。

实施例2.运用步骤1的计算机药物筛选系统从ZINC数据库中筛选与结核分枝杆菌Rv0233活性位点有高亲和力的化合物

本实施例中小分子化合物数据库来自ZINC数据库。ZINC是一个可以免费使用的用于虚拟筛选的化合物数据库，由美国加利福利亚大学药物化学系的Shoichet研究小组建立并维护。ZINC数据库中的数据可以以SMILES，mol2，3D SDF等多种文件格式免费下载，特别适用于以分子对接为主的虚拟筛选策略，其中mol2格式可直接用于DOCK程序的输入文件。ZINC是一个不断更新的数据库，本实施例中使用数据为ZINC7(http://blaster docking.org/zinc7/)。ZINC数据库包含的数据量十分巨大，但其提供了多种方式可使用户根据自己的需要获取相应的子数据集。

基于分子对接的虚拟筛选这一步骤是通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv0233天然底物结合位点(Rv0233蛋白质上结合肉豆蔻酸的活性空腔被选作对接化合物的活性位点)具有高亲和力的小分子化合物。本发明获取结核分枝杆菌Rv0233的蛋白质序列(编码该蛋白质的序列可以从Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList万维服务器；Rv0233基因坐标：从278585到279529获得)。其核苷酸序列和对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示，它包含 314个氨基酸残基。目前已经获得Rv0233与肉豆蔻酸共结晶的晶体结构(PDB ID：3EE4)(Mowa MB et al，2009).在本发明中，Rv0233结合肉豆蔻酸的活性空腔被选作对接化合物的活性位点。在本实施例中，针对Rv0233的活性中心对Specs(网址：http://www.specs.net)的小分子化合物数据库的10,756种化合物进行筛选，得到18个与Rv0233天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物。同时得到了小分子化合物与受体结合的相对构像(如图2所示)。筛选完所有的化合物库以后，通过综合亲和力打分以及人工观察小分子与靶蛋白质Rv0233天然底物结合位点的空间互补情况，最终确定候选的抑制剂(即小分子化合物)，结果见表1。

表1.通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选到与Rv0233天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物

实施例3菌株的培养和液体抑制剂的配制

供试菌株的准备：

本实施例的试验材料涉及耻垢分枝杆菌菌株(耻垢分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93202。网址：http://www.cmccb.org.cn/)，牛型分枝杆菌菌株(牛型分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93006。网址：http://www.cmccb.org.cn/)，结核分枝杆菌菌株(结核分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93004。网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

液体筛选培养基的组分及制备：

在100ml的液体筛选培养基中加入90ml商购的7H9液体培养基(该7H9液体培养基购自美国BD公司，货号：271310)和10ml OADC营养液(5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，140mmol/l NaCl，该商品OADC营养液购自美国BD公司，货号：211886)，该液体培养基是针对分枝杆菌菌株的典型液体培养基。

候选抑制剂的准备：

本实施例的候选抑制剂见表1所述。优选的候选抑制剂的剂型以溶液或混悬液使用。采用二甲基亚砜(DMSO)溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体方法：先配制成原始浓度为50mg/ml(0.1M)的抑制剂浓缩液，在测定抑制剂的最低抑制浓度(MIC)时，利用原始浓度的抑制剂浓缩液进行浓度梯度稀释试验，其浓度梯度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

接种及培养方法：

将上述分枝杆菌分别接种于上述筛选培养基中，于37℃培养3～21天(其中：耻垢分枝杆菌菌株培养3天，牛型分枝杆菌菌株，结核分枝杆菌菌株均培养21天)至分枝杆菌密度为1×10⁸～2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1。然后将每一个分枝杆菌菌液进行稀释(终浓度为1～2×10⁴)并分装到96孔板中。

整个操作在常用生物安全柜的无菌程序下进行。

实施例4抑制剂的抑菌活性试验

按照实施例3的无菌操作程序，将实施例3的结核分枝杆菌菌液(菌株编号为：93004)接种到添加有候选抑制剂的筛选培养基中来确定候选抑制剂的抑菌活性。为了确定哪些候选抑制剂分子具有抑菌活性，将50μg/ml的候选抑制剂(见表1)添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照(含对照1和对照2)进行比较来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制。对照1为不添加候选抑制剂组，对照2为添加利福平50μg/ml组(利福平为一线抗结核药物)实验过程中的数据是与两个对照比较来评价候选抑制剂对结核分枝杆菌抑制效果。结果如图3所示。牛型分枝杆菌菌株(菌株编号为：93006)的抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图4所示。耻垢分枝杆菌菌株(菌株编号为：93202) 的抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图5所示。从图中可以明显看出候选抑制剂吡唑类化合物即抑制剂51#能有效抑制结核分枝杆菌的生长，而对耻垢分枝杆菌和牛型分枝杆菌不产生抑制效果。因此确定吡唑类化合物51#为本发明后续试验的结核分枝杆菌的特异性抑制剂。

本实施例筛选的抑制剂51#化学名称为2-({[1-(4-甲基苯基)-1H-吡唑-4-yl]甲基}氨基)乙醇(2-({[1-(4-methylphenyl)-1H-pyrazol-4-yl]methyl}amino)ethanol(ZINC ID 02025622；其分子式为C₁₃H₁₇N₃O；分子量为231.3))。其结构式见图6。

实施例5.确定候选抑制剂的最低抑制浓度(MIC)

在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。按照实施例3的设计方案，将不同浓度的吡唑类化合物51#进行梯度稀释(其浓度梯度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml)，添加到培养有结核分枝杆菌的液体筛选培养基中，37℃培养7～8天，通过读取各OD值来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制，结果见图7。耻垢分枝杆菌菌株，牛型分枝杆菌菌株的接种与培养条件同结核分枝杆菌，其MIC测定结果如表2所示。

表2.抑制剂51#对各分枝杆菌属的最小抑菌浓度

参考文献：

1.World Health Organization.Global Tuberculosis Control 2009：Epidemiology，Strategy，Financing.Nonserial Publication.WHO，2009.

2.Gandhi NR，Nunn P，Dheda K，Schaaf HS，Zignol M，van Soolingen D，Jensen P，Bayona J.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis：a threat to global control of tuberculosis.Lancet.2010 May 22；375(9728)：1830-43.

3.Ginsberg AM，Spigelman M.Challenges in tuberculosis drug research and development.Nat Med.2007 Mar；13(3)：290-4.

4.Bryk R，Gold B，Venugopal A，Singh J，Samy R，Pupek K，Cao H，Popescu C，Gurney M，Hotha S，Cherian J，Rhee K，Ly L，Converse PJ，Ehrt S，Vandal O，Jiang X，Schneider J，Lin G，Nathan C.Selective killing of nonreplicating mycobacteria.Cell Host Microbe.2008 Mar 13；3(3)：137-45.

5.Cui T，Zhang L，Wang X，He ZG.Uncovering new signaling proteins and potential drug targets through the interactome analysis of Mycobacterium tuberculosis.BMC Genomics.2009 Mar19；10：118.

6.Dube D，Mani Tripathi S，Ramachandran R.Identification of in vitro inhibitors of Mycobacterium tuberculosis Lysine ε-aminotransferase by pharmacophore mapping and three-dimensional flexible searches.Med Chem Res.2008.17：182-188.

7.Mowa MB，Warner DF，Kaplan G，Kana BD，Mizrahi V.Function and regulation of class I ribonucleotide reductase-encoding genes in mycobacteria.J Bacteriol.2009 Feb；191(3)：985-95.

8.Schmidt F，Donahoe S，Hagens K，Mattow J，Schaible UE，Kaufmann SH，Aebersold R，Jungblut P R.Complementary analysis of the Mycobacterium tuberculosis proteome by two-dimensional electrophoresis and isotope-coded affinity tag technology.Mol Cell Proteomics.2004Jan；3(1)：24-42.Epub 2003 Oct 13.

Claims

1.结核分枝杆菌基因Rv0233在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌基因Rv0233基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.结核分枝杆菌基因Rv0233在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质的序列如序列表SEQ.ID NO：2所示。

3.如权利要求1或2所述的一种结核分枝杆菌Rv0233基因作为药物靶标的应用，其特征在于包含以下步骤：

(1)从PBD蛋白质数据库获得结核分枝杆菌Rv0233蛋白质结构，Rv0233结合肉豆蔻酸的活性空腔被选作对接化合物的活性位点；

(2)建立针对结核分枝杆菌Rv0233的计算机药物筛选系统；

(3)运用步骤(2)的计算机药物筛选系统针对结核分枝杆菌Rv0233蛋白质活性位点，从ZINC数据库中筛选出18个与结核分枝杆菌Rv0233活性位点有高亲和力的化合物；

(4)利用小分子化合物进行抑菌试验，测定有抑菌活性的小分子的最小抑菌浓度；

其中：

步骤(1)中的结核分枝杆菌Rv0233蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

步骤(3)的18个与结核分枝杆菌Rv0233活性位点有高亲和力的化合物如下所述，且具有以下特征：

化合物36#

英文名称：N～1～-(4-ethylphenyl)-N～2～-(3-hydroxypropyl)ethanediamide

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02025188；

化合物37#

英文名称：N′-[2-(4-chlorophenoxy)acetyl]-2-furohydrazide

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00323962；

化合物38#

英文名称：N-(2-chloroethyl)-5-ethoxy-1H-benzimidazol-2-amine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02026089；

化合物39#

英文名称：4-[(hexylsulfonyl)methyl]benzaldehyde

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02028789；

化合物40#

英文名称：N-[3-(1H-imidazol-4-yl)propyl]-N′-methylthiourea

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC05833911；

化合物41#

英文名称：2-(4-methyl-1-piperazinyl)acetohydrazide

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19802145；

化合物42#

英文名称：N-benzyl-N-{6-[(2-chloroethyl)amino]hexyl}amine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02029196；

化合物43#

英文名称：6-(3，4-dihydro-2(1H)-isoquinolinyl)hexylamine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02029199；

化合物44#

英文名称：6-(1-piperidinyl)hexylamine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02029173；

化合物45#

英文名称：2-{[6-(benzylamino)hexyl]amino}ethanol

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02029182；

化合物46#

英文名称：2-(4-imidazo[1，2-a]pyridin-2-ylbenzylidene)hydrazinecarboximidamide

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00337551；

化合物47#

英文名称：6-(4-{2-[amino(imino)methyl]carbohydrazonoyl}phenyl)-7-methylimidazo[2，1-b][1，3]thiazol-7-ium

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00337555；

化合物48#

英文名称：1-methyl-3-[3-(1-methyl-1H-imidazol-3-ium-3-yl)propyl]-1H-imidazol-3-ium

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19873028；

化合物49#

英文名称：3-(dimethylamino)propyl imidothiocarbamate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19802119；

化合物50#

英文名称：

S，S-bis[2-(acetylamino)ethyl]dithiocarbonate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02027654；

化合物51#

英文名称：2-({[1-(4-methylphenyl)-1H-pyrazol-4-yl]methyl}amino)ethanol

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02025622；

化合物52#

英文名称：2-({[1-(4-chlorophenyl)-1H-pyrazol-4-yl]methyl}amino)ethanol

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02025602；

化合物53#

英文名称：N-[4-(6-chloroimidazo[1，2-a]pyridin-2-yl)phenyl]acetamide

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00333142；

其中

步骤(4)测定有抑菌活性的小分子化合物即抑制剂51#对结核分枝杆菌的最小抑菌浓度为8μg/ml。