CN103122365A

CN103122365A - 抗结核抑制剂筛选的靶标基因Rv3290c及应用

Info

Publication number: CN103122365A
Application number: CN2011103738201A
Authority: CN
Inventors: 何正国; 曾菊梅; 崔涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明属于药物分子学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Rv3290c在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如SEQ.ID NO：2所示。利用虚拟筛选的方法，针对Rv3290c的天然底物活性中心，通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv3290c天然底物结合位点具有高亲和力的20个小分子化合物，从中得到1个抑菌化合物(苯并噻吩类化合物14#)，该化合物的名称为乙基2-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苄基)氨基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-3-羧酸。对该化合物在结核分枝杆菌的抑菌效应进行了评价。

Description

抗结核抑制剂筛选的靶标基因Rv3290c及应用

技术领域

本发明属于药物分子学技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌基因Rv3290c在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用。

背景技术

结核分枝杆菌是一种严重危害人类健康的病原菌，据世界卫生组织统计，全世界每年大约有三百万人死于结核病，并且全球约有三分之一的人口感染处于潜伏状态的结核分枝杆菌(WHO，2009)。目前，结核病化学疗法有一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要6～9个月，导致了严重的毒性和抗药性。从引进抗结核药物时便不断出现抗药性结核分枝杆菌菌株。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此外，遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(Gandhi et al，2010)。近年来出现的药物抗性菌株以及与HIV的共感染问题，使得这一形式更加严峻。因此，寻找新的药物靶标并研发新的抗结核药物和诊断工具已经迫在眉睫(Ginsberg and Spigelman，2007)。特别地，需要具有新作用机制的对抗药性菌株具有活性的新药物。相应地，还存在鉴定新药物靶标的迫切要求。

在研发新的抗结核药物中，常规的筛选方法是使用化合物库进行批量筛选，在Bryk R及其同事的相关工作中，抑菌试验一共使用了15,000个化合物(Bryk R et al，2008)，工作量大，费钱费力，结核分枝杆菌是一种病原菌，无法常规操作，需要寻找特异性好，命中率高的抑制剂。目前在结核分枝杆菌中基于结构的药物设计是研发新的抗结核药物的有效手段，但是相关的研究只进行到筛选出潜在的药物小分子，没有进行抑菌试验(Cui T at al，2009；Dube Det al，2008)，导致无法评估所筛选到的小分子是否具有潜在的应用价值。

结核分枝杆菌中的L-赖氨酸氨基转移酶(由Rv3290c编码，EC：2.6.1.36)，它参与催化整个反应，将L-赖氨酸的ε-氨基转移到α-酮戊二酸产生L-谷氨酸和α-氨基己二酸-δ-半醛(Mani Tripathi and Ramachandran，2006)。在营养缺乏的结核杆菌感染模式下，Rv3290c基因的上调倍数达40多倍(Betts et al，2002)。另一项研究显示结核分枝杆菌适应外界环境进入稳定期和潜伏感染的时候，Rv3290c基因依然是上调表达的(Voskuil et al，2004)。然而当结核分枝杆菌进入长期的潜伏感染时，Rv3290c基因的表达水平会降低(Voskuil，2004)。这说明Rv3290c基因的表达是与细菌的感染动态相关的，它是潜在的作为药物靶标的理想选择。然而，到目前为止，尚未有人报道具有抗结核效应的Rv3290c的抑制剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分子设计方法，获得一种新的结核病治疗药物的靶标。本发明的另一个目的是针对Rv3290c天然底物结合位点筛选的小分子化合物体外抑菌试验中确实能起到抑菌作用。确定结核分枝杆菌中的Rv3290c是一种合适的抗结核抑制剂筛选的靶标。

本发明是这样实现的：首先通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv3290c天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物。本发明获取结核分枝杆菌Rv3290c的蛋白质序列(编码该蛋白质的序列可以从Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList万维服务器；Rv3290c基因坐标：从3670445到3671794获得)，其全长包含449个氨基酸残基。将Rv3290c蛋白质上结合磷酸吡哆醛和α-酮戊二酸的活性口袋选定作为对接化合物的活性位点(Mani Tripathi and Ramachandran，2006)(PDB ID：2CJH)。利用所获得的三维结构信息和活性位点信息，在计算机上构建了一个针对结核分枝杆菌Rv3290c的计算机辅助药物筛选系统，然后运用该系统从小分子化合物数据库中筛选与之活性位点有高亲和力的化合物分子。

其次，本发明测定了小分子抑制剂对结核分枝杆菌的抑菌作用。为了确定哪些抑制剂分子具有体外抑菌活性，将50μg/ml的候选抑制剂添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中。将添加了抑制剂的细菌培养物于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照进行比较来判断细菌生长是否受到抑制。其中对照1是不用抑制剂的处理，对照2是使用利福平处理，实验过程中的数据是与两个对照比较来评价利用所述候选抑制剂得到的抑制效果，

最后，本发明确定了候选抑制剂的最小抑制浓度(MIC)。在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。候选抑制剂的使用量或浓度取决于若干因素，包括该抑制剂的分子量，其溶解度等。优选两种及两种以上的浓度梯度，以便计算候选抑制剂的MIC(最低抑制浓度)。然后按照实验设计将抑制剂按不同浓度梯度稀释(见实施例)后，添加到7H9商用培养基的分枝杆菌培养物中。将添加了抑制剂的分枝杆菌培养物于37℃培养7～8天，通过读取各OD值来判断细菌生长是否受到抑制。

本发明的优点

本发明针对Rv3290c的活性位点进行计算机辅助的药物设计，高通量筛选小分子化合物数据库。设计的小分子抑制剂，命中率高，工作量小，省时省钱省力，筛选到的化合物确实能有效抑制细菌的生长。由于是针对细胞靶点设计的药物，而细胞靶点突变速率相对较慢，因此不易形成耐药性。显而易见，本发明筛选的与结核分枝杆菌Rv3290c活性位点的结合的化合物可在抗结核药物开发中应用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明涉及的结核分枝杆菌Rv3290c的蛋白质的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明涉及的结核分枝杆菌Rv3290c的蛋白质的序列。

图1.本发明技术流程图。

图2.通过体外对接筛选到的小分子化合物与Rv3290c蛋白质结合的相对构象。

图3.候选抑制剂在结核分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图4.候选抑制剂在牛型分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图5.候选抑制剂在耻垢分枝杆菌菌株中进行抑菌筛选结果。

图6.结核分枝杆菌靶标Rv3290c基因与牛型分枝杆菌菌株和耻垢分枝杆菌菌株中的同源基因蛋白质序列一致性的比较。

图7.14#小分子化合物的结构式。

图8.最小抑菌浓度测定实验中结核分枝杆菌菌株在各抑制剂浓度下的生长情况。从左到右苯并噻吩类化合物即抑制剂14#的浓度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

具体实施方式

本发明可以通过下述实施例来说明，但本实施例不是限制本发明的保护范围。

实施例1.建立针对结核分枝杆菌Rv3290c的计算机药物筛选系统

本实施例中构建针对结核分枝杆菌Rv3290c的计算机药物筛选系统所用的操作系统为Linux操作系统，发行版本为Fedora Core 7-i386版本。chimera软件从网络(http://www.cgl.ccsf.edu/chimera/)免费下载，下载后直接安装运行。Dms源代码包从网络(http://www.cgl.ucsf.edu/Overview/softwarc.htm]#dms)免费下载，在本机linux计算机上编译得到可运行的二进制程序，然后安装。通过与美国加利福利亚大学Kuntz实验室签署使用协议，获得DOCK软件使用许可。通过网络(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK_6/index.htm)获得DOCK软件包的源代码(版本为6.1)，在本地linux计算机上对源代码进行编译，得到可运行的二进制程序然后安装。后续实施例中所用到的sphgen、sphere_selector、showbox、grid、dock6程序以及相关的一些化学参数文件均来自DOCK软件包。

实施例2.运用步骤1的计算机药物筛选系统从ZINC数据库中筛选与结核分枝杆菌Rv3290c活性位点有高亲和力的化合物

本实施例中小分子化合物数据库来自ZINC数据库。ZINC是一个可以免费使用的用于虚拟筛选的化合物数据库，由美国加利福利亚大学药物化学系的Shoichet研究小组建立并维护。ZINC数据库中的数据可以以SMILES，mol2，3D SDF等多种文件格式免费下载，特别适用于以分子对接为主的虚拟筛选策略，其中mol2格式可直接用于DOCK程序的输入文件。ZINC是一个不断更新的数据库，本实施例中使用数据为ZINC7(http://blaster docking.org/zinc7/)。ZINC数据库包含的数据量十分巨大，但其提供了多种方式可使用户根据自己的需要获取相应的子数据集。

基于分子对接的虚拟筛选这一步骤是通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选与Rv3290c天然底物结合位点(Rv3290c蛋白质上结合磷酸吡哆醛和α-酮戊二酸的活性口袋)具有高亲和力的小分子化合物。本发明获取结核分枝杆菌Rv3290c的蛋白质序列(编码该蛋白质的序列可以从Http://genolist.pasteur.fr/TubercuList(TubercuList万维服务器；Rv3290c基因坐标：从3670445到3671794获得)，其核苷酸序列和对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示，它包含449个氨基酸残基。将Rv3290c蛋白质上结合磷酸吡哆醛和α-酮戊二酸的活性口袋被选定作为对接化合物的活性位点(PDB ID：2CJH)。在本实施例中，针对Rv3290c的活性中心对Specs(网址：http://www.specs.net)的小分子化合物数据库的10,756种化合物进行筛选，得到20个与Rv3290c天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物。同时得到了小分子化合物与受体结合的相对构像(如图2所示)。筛选完所有的化合物库以后，通过综合亲和力打分以及人工观察小分子与靶蛋白质Rv3290c天然底物结合位点的空间互补情况，最终确定候选的抑制剂(即小分子化合物)，结果见表1。

表1.通过运行分子对接程序来从小分子化合物数据库中筛选到与Rv3290c天然底物结合位点具有高亲和力的小分子化合物

实施例3菌株的培养和液体抑制剂的配制

供试菌株的准备：

本实施例的试验材料涉及耻垢分枝杆菌菌株(耻垢分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93202。网址：http://www.cmccb.org.cn/)，牛型分枝杆菌菌株(牛型分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93006。网址：http://www.cmccb.org.cn/)，结核分枝杆菌菌株(结核分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93004。网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

液体筛选培养基的组分及制备：在100ml的液体筛选培养基中加入90ml商购的7H9液体培养基(该7H9液体培养基购自美国BD公司，货号：271310)和10ml OADC营养液(5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，140mmol/l NaCl，该商品OADC营养液购自美国BD公司，货号：211886)，该液体培养基是针对分枝杆菌菌株的典型液体培养基。

候选抑制剂的准备：

本实施例的候选抑制剂见表1所述。优选的候选抑制剂的剂型以溶液或混悬液使用。采用二甲基亚砜(DMSO)溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体方法：先配制成原始浓度为50mg/ml(0.1M)的抑制剂浓缩液，在测定抑制剂的最低抑制浓度(MIC)时，利用原始浓度的抑制剂浓缩液进行浓度梯度实验，其浓度梯度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

接种及培养方法：

将上述分枝杆菌分别接种于上述筛选培养基中，于37℃培养3～21天(其中：耻垢分枝杆菌菌株培养3天，牛型分枝杆菌菌株，结核分枝杆菌菌株均培养21天)至分枝杆菌密度为1×10⁸～2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1。然后将每一个分枝杆菌菌液进行稀释(终浓度为1～2×10⁴)并分装到96孔板中。

整个操作在常用的生物安全柜的无菌程序下进行。

实施例4抑制剂的体外抑菌活性试验

按照实施例3的无菌操作程序，将实施例3的结核分枝杆菌菌液(菌株编号为：93004)接种到添加有候选抑制剂的筛选培养基中来确定候选抑制剂的体外抑菌活性。为了确定哪些候选抑制剂分子具有体外抑菌活性，将50μg/ml的候选抑制剂(见表1)添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照(含对照1和对照2)进行比较来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制。对照1为不添加候选抑制剂，对照2为添加利福平50μg/ml(利福平为一线抗结核药物)实验过程中的数据是与两个对照比较来评价候选抑制剂对结核分枝杆菌抑制效果。结果如图3所示。牛型分枝杆菌菌株(菌株编号为：93006)的体外抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图4所示。耻垢分枝杆菌菌株(菌株编号为：93202)的体外抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图5所示。从图中可以明显看出候选抑制剂苯并噻吩类化合物即抑制剂14#能有效抑制结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌的生长，而对耻垢分枝杆菌不产生抑制效果。因此确定苯并噻吩类化合物即抑制剂14#14#为本发明后续试验的结核分枝杆菌的特异性抑制剂。

通过NCBI Blast搜索发现，结核分枝杆菌中Rv3290c蛋白质与牛型分枝杆菌的是100％同源的，但是与耻垢分枝杆菌只有79％的同源性，如图6所示。因此即抑制剂14#14#小分子化合物(购自荷兰Specs公司)是特异针对结核分枝杆菌的抑制剂。

本实施例的抑制剂14#的化学名称为乙基2-[(3，5-二溴-2，4-二羟基苄基)氨基]-4，5，6，7-四氢-1-苯并噻吩-3-羧酸(ethyl 2-[(3，5-dibromo-2，4-dihydroxybenzylidene)amino]-4，5，6，7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxylate(ZINC ID 690246；其分子式为C₁₈H₁₇Br₂NO₄S；分子量为503.21)。其结构式见图7。

实施例5.确定候选抑制剂的最低抑制浓度(MIC)

在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。按照实施例3的设计方案，将不同浓度的抑制剂14#进行梯度稀释(其浓度梯度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml)，添加到培养有结核分枝杆菌的液体筛选培养基中，37℃培养7～8天，通过读取各OD值来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制，结果见图8所示。耻垢分枝杆菌菌株，牛型分枝杆菌菌株的接种与培养条件同结核分枝杆菌，其MIC测定结果如表2所示。

表2.抑制剂14#对各分枝杆菌属的最小抑菌浓度

参考文献：

1.World Health Organization.Global Tuberculosis Control 2009：Epidemiology，Strategy，Financing.Nonserial Publication.WHO，2009.

2.Gandhi NR，Nunn P，Dheda K，Schaaf HS，Zignol M，van Soolingen D，Jensen P，Bayona J.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis：a threat to global control oftuberculosis.Lancet.2010 May 22；375(9728)：1830-43.

3.Ginsberg AM，Spigelman M.Challenges in tuberculosis drug research and development.NatMed.2007 Mar；13(3)：290-4.

4.Bryk R，Gold B，Venugopal A，Singh J，Samy R，Pupek K，Cao H，Popescu C，Gurney M，HothaS，Cherian J，Rhee K，Ly L，Converse PJ，Ehrt S，Vandal O，Jiang X，Schneider J，Lin G，Nathan C.Selective killing of nonreplicating mycobacteria.Cell Host Microbe.2008 Mar 13；3(3)：137-45.

5.Cui T，Zhang L，Wang X，He ZG.Uncovering new signaling proteins and potential drug targetsthrough the interactome analysis of Mycobacterium tuberculosis.BMC Genomics.2009 Mar19；10：118.

6.Dube D，Mani Tripathi S，Ramachandran R.Identification of in vitro inhibitors ofMycobacterium tuberculosis Lysine ε-aminotransferase by pharmacophore mapping andthree-dimensional flexible searches.Med Chem Res.2008.17：182-188.

7.Mani Tripathi S，Ramachandran R.Direct evidence for a glutamate switch necessary for substraterecognition：crystal structures of lysine epsilon-aminotransferase(Rv3290c)from Mycobacteriumtuberculosis H37Rv.J Mol Biol.2006 Oct 6；362(5)：877-86.

8.Betts JC，Lukey PT，Robb LC，McAdam RA，Duncan K.Evaluation of a nutrient starvationmodel of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling.MolMicrobiol.2002 Feb；43(3)：717-31.

9.Voskuil MI，Visconti KC，Schoolnik GK.Mycobacterium tuberculosis gene expression duringadaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy.Tuberculosis(Edinb).2004；84(3-4)：218-27.

10.Voskuil MI.Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditionsassociated with latency.Tuberculosis(Edinb).2004；84(3-4)：138-43.

Claims

1.结核分枝杆菌基因Rv3290c在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ.ID NO：1所示。

2.结核分枝杆菌基因Rv3290c在筛选抗结核抑制剂靶标中的应用，其特征在于，该基因编码的蛋白质的序列如序列表SEQ.ID NO：2所示。

3.如权利要求1或2所述的一种结核分枝杆菌Rv3290c基因作为药物靶标的应用，其特征在于包含以下步骤：

(1)从PBD蛋白质数据库获得结核分枝杆菌Rv3290c蛋白质结构，以蛋白质上结合磷酸吡哆醛和α-酮戊二酸的天然底物结合位点为其活性位点；

(2)建立针对结核分枝杆菌Rv3290c的计算机药物筛选系统；

(3)运用步骤(2)的计算机药物筛选系统针对结核分枝杆菌Rv3290c蛋白质活性位点，从ZINC数据库中筛选出20个与结核分枝杆菌Rv3290c活性位点有高亲和力的化合物；

(4)利用小分子化合物进行抑菌试验，测定有抑菌活性的小分子的最小抑菌浓度；

其中：

步骤(1)中的结核分枝杆菌Rv3290c蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

步骤(3)的20个与结核分枝杆菌Rv3290c活性位点有高亲和力的化合物如下所述，且具有以下特征：

化合物1#

英文名称：N-[(4，4-dimethyl-2，6-dioxocyclohexylidene)methyl](methyl)homocysteine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19338987；

化合物2#

英文名称：N-[(2，6-dioxocyclohexylidene)methyl]aspartic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19639046；

化合物3#

英文名称：2-({2-[(2-methyl-2-phenylcyclopropyl)carbonyl]hydrazino}carbonyl)benzoic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00333535；

化合物4#

英文名称：

1-(4-chlorophenyl)-5-[(1H-tetraazol-5-ylamino)methylene]-2，4，6(1H，3H，5H)-pyrimidinetrione

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19805480；

化合物5#

英文名称：N-[(2，2-dimethyl-4，6-dioxo-1，3-dioxan-5-ylidene)methyl]glutamic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02026613；

化合物6#

英文名称：5-chloro-2-{[(1，3-dioxo-1，3-dihydro-2H-inden-2-ylidene)methyl]amino}benzoic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19908460；

化合物7#

英文名称：2-[(5-bromo-2-furoyl)amino]-3-(2-furyl)acrylic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00306269；

化合物8#

英文名称：N～2～-[(2，2-dimethyl-4，6-dioxo-1，3-dioxan-5-ylidene)methyl]glutamine

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02028991；

化合物9#

英文名称：(5-formyl-4-hydroxy-6-oxo-3-phenylpyridazin-1(6H)-yl)acetic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19938668；

化合物10#

英文名称：2-(butoxycarbonyl)terephthalic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02024019；

化合物11#

英文名称：7-hydroxy-2，4-dioxo-1，2，3，4-tetrahydro-6-pteridinecarboxylic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC19800880；

化合物12#

英文名称：3-methyl-1-phenyl-4-(quinolin-5-yldiazenyl)-1H-pyrazol-5-ol

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC06269027；

化合物13#

英文名称：

4-(acetyloxy)-2-[(acetyloxy)methyl]-5-(6-amino-7，8-dihydro-9H-purin-9-yl)tetrahydro-3-furanylacetate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02105819；

化合物14#

英文名称：

ethyl 2-[(3，5-dibromo-2，4-dihydroxybenzylidene)amino]-4，5，6，7-tetrahydro-1-benzothiophene-3-carboxylate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00690246；

化合物15#

英文名称：

2-(1，3-dioxo-1，3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)-3-{[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy}acrylic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC02023396；

化合物16#

英文名称：2-[2-(1-cyano-2-hydrazino-2-oxoethylidene)hydrazino]benzoic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00333102；

化合物17#

英文名称：4-({10-[(3-carboxyacryloyl)oxy]decyl}oxy)-4-oxobut-2-enoic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC04100227；

化合物18#

英文名称：diethyl 2，6-dihydroxypyridine-3，5-dicarboxylate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC17111072；

化合物19#

英文名称：3-[5-(4-fluorobenzylidene)-4-oxo-2-thioxo-1，3-thiazolidin-3-yl]benzoic acid

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC00966733；

化合物20#

英文名称：

ethyl 4-[(3-{[4-(ethoxycarbonyl)phenyl]imino}-3，4-dihydroquinoxalin-2(1H)-ylidene)amino]benzoate

结构式：

化合物在ZINC数据库中的编号：ZINC09783046；

其中

步骤(4)测定有抑菌活性的小分子化合物即抑制剂14#的最小抑菌浓度分别如下：

结核分枝杆菌 2μg/ml；

牛结核分枝杆菌 2-4μg/ml。