CN103121033A - 利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，该方法首先通过逐次增加营养肉汤培养基中的砷含量，分离出一种耐高浓度砷环境能产生较多尿素分解酶的耐砷细菌；然后将耐砷细菌置于含有尿素酶和CaCl2的营养汤培养基中，富集得到具有钙化作用耐砷细菌菌液；再将富集得到钙化作用耐砷细菌CR5菌液与含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养，钙化作用耐砷细菌通过诱导固化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修复。该方法操作简便、易于控制，成本低，可广泛用于重金属土壤污染的修复。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，属于生物环境污染修复技术领域。
背景技术
砷是一种剧毒元素，自从1250年发现以来，已经发生了很多严重的砷中毒事件。全球至少有5000多万人正面临着地方性砷中毒的威胁，其中，亚洲的砷污染最为严重，主要集中在孟加拉国、印度和中国。土壤及水环境的砷污染已经成为一个受全世界广泛关注的环境问题。砷通常是以As3+和As5+的形式出现在土壤中。砷化合物的毒性极强，砷对人的中毒剂量为0.01-0.052克，致死量为0.06-0.2克，已有研究发现高浓度的砷会增加患皮肤癌及膀胱、肾脏、肝脏和肺部肿瘤的风险。三价砷甚至能造成胎儿畸形和死亡。
由于使用砷化合物的企业（如玻璃、颜料、农药等）、采矿业及重金属冶炼等工业的迅速发展，已造成了我国土壤环境的严重砷污染。现已在我国的多个矿区周围的土壤中检测到了高浓度的砷，如我国贵州、郴州、西安和新疆地区均已发现了砷浓度范围高达11-1217mg Kg-1的大面积土壤。我国于1983年在新疆的奎屯开垦区发现了高砷污染地区，是我国大陆最早发现地方性砷中毒的省区，此地土壤中砷浓度高达7.27-75.38mg Kg-1。据不完全统计，我国现生活在砷污染地区的人口数已经超过了两百万。由于土壤的盐碱化加速砷从矿物及岩石等中溶出和迁移，并会在一定程度上阻碍污染物的生物可利用性，所以要去除像新疆这种干旱区盐碱地土壤中的砷是更加困难的。新疆矿产资源非常丰富，随着西部大开发政策的实施，对新疆矿产资源的开发力度也越来越大，种种开发活动已经引起了严重的土壤砷污染。不同来源的砷会在矿渣或土壤中长期积累，然后含砷污染物会慢慢迁移进入到其他地区或是水体中，就会使污染区域不断扩大。因此，我们迫切需要一种方法对含砷尾矿及高砷土壤进行治理和修复，至少要先找到一种能够阻止砷溶出、迁移进入地表及地下水体的高效的、经济实用的、环境友好型的技术方法。无疑，生物修复方法，特别是广泛存在、易培养的细菌就成了最具潜力的方法。目前，国际上公认的最有前途的砷污染土壤的处理方法就是生物修复技术。
利用生物技术修复砷污染环境现已有很多应用实例，但是修复效果大都不理想。如大家熟知的超积累植物蜈蚣草，已在很多土壤砷污染地区得以实际应用。但是植物修复有一定的局限性，很多植物都不能在像中国西北部这样的干旱恶劣的环境中生存。而且植物修复周期太长、效率较低。除此之外，还有包括硫还原菌在内的各种细菌修复方法也被应用于砷污染环境的修复之中。但是由于吸附了砷的菌体无法分离出来，依然存在于环境中，然后由于各种原因，已经被细菌吸收了的砷又会重新释放到环境中。另外，大部分微生物对氧化还原条件和有毒金属价态改变的敏感性等问题，都导致了生物修复技术在实际中的应用还是有一定困难的。另外，某些高盐度土壤更加大了生物修复的难度。因此，这些不足就使我们迫切需要找到一种实用、经济、高效的土壤原位修复技术。
发明内容
本发明的目的是，提供一种利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，该方法首先通过逐次增加营养肉汤培养基中的砷含量，分离出一种耐高浓度砷环境能产生较多尿素分解酶的耐砷细菌；然后将耐砷细菌置于尿素酶和CaCl2的营养汤培养基中，富集得到具有钙化作用耐砷细菌菌液；再将富集得到钙化作用耐砷细菌CR5菌液与含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养，钙化作用耐砷细菌通过诱导固化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修复。该方法操作简便、易于控制，成本低，可广泛用于重金属土壤污染的修复。
本发明所述的一种利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、选用砷污染严重地区土壤置于带盖的灭菌瓶中，将土壤样品置于营养肉汤锥形瓶中，营养肉汤pH为8-8.5，砷含量为100mg L-1,然后将锥形瓶置于转速为130rpm min-1，温度为30℃的条件下培养48h，得到菌液；
b、将培养得到的菌液分别依次接入砷含量为100mg L-1、250mgL-1、500mg L-1的营养肉汤培养基中，按常规方法分离得到耐砷细菌，该耐砷细菌在基因库的代码为CR5，编号为HQ331532；
c、然后将耐砷细菌CR5置于质量含量为2%的尿素酶、20-60mML-1CaCl2和砷含量为100-500mg L-1的营养汤培养基中，将混合液置于转速为130rpm min-1，温度为30℃的条件下培养5-7天，富集得到钙化作用耐砷细菌CR5菌液，所得到的菌液pH为8-9；
d、将富集得到具有钙化作用耐砷细菌CR5菌液100-300ml与50-100g含砷量为200-600mg Kg-1的污染土壤进行混合，形成混合溶液，混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养7-15天后终止实验，钙化作用耐砷细菌CR5通过钙化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修复，阻止其向周围土壤及地表或地下水中迁移。
步骤b和步骤c中选用的营养肉汤培养基为蛋白胨10g L-1、牛肉膏1.5g L-1、酵母粉1.5g L-1和氯化钠5g L-1。
步骤a中选用的污染土壤为高盐环境下的砷污染土壤，砷污染环境为其土壤中重金属为可交换状态，且与碳酸盐相互结合，包括砷污染土壤、铯污染土壤、铜污染土壤、铅污染土壤。
步骤d中形成混合溶液中的菌液菌密度为107CFU/ml。
本发明所述的利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，具体工艺步骤是：
耐砷细菌的分离：选用砷污染严重地区土壤置于带盖的灭菌瓶中，称取1-2g土壤样品置于含50ml 营养肉汤的锥形瓶中，其营养肉汤pH为8-8.5，三价砷离子含量为100mg L-1,然后将锥形瓶置于转速为130rpm min-1，温度为30℃的条件下培养48h，将培养得到的菌液分别依次接入三价砷离子含量为100mg L-1、250mg L-1、500mg L-1的营养肉汤培养基中，其他培养条件不变分离得到耐砷细菌；
诱导固化作用耐砷细菌驯化富集：将分离得到的耐砷细菌置于质量含量为2%的尿素酶、20-60mM L-1CaCl2和三价砷离子含量为100-500mg L-1的营养汤培养基中，将混合液置于转速为130rpm min-1，温度为30℃的条件下培养5天-7天富集得到钙化作用耐砷细菌菌液，所得到的菌液pH为8-9；
诱导固化作用细菌修复砷污染土壤：将富集得到具有诱导固化作用耐砷细菌菌液100-300 ml与含三价砷离子200-600mg Kg-1的50-100g的污染土壤中混合形成混合溶液，其中菌液菌密度为107CFU/ml ，混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养7-15天后终止实验，钙化作用耐砷细菌通过钙化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修复，阻止其向周围土壤及地表或地下水中迁移。
本发明所述的利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，该方法中分离的耐砷细菌在基因库的代码为CR5，编号为HQ331532；
| Name of bacterial species | Accession number |
| Sporosarcina ginsengisoli CR5 | HQ331532 |
本发明所述的利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，该方法中所选用的营养肉汤培养基为蛋白胨10g L-1、牛肉膏1.5g L-1、酵母粉1.5g L-1、氯化钠5g L-1；所选用的污染土壤为含氯化钠盐在5-15%环境下的砷污染土壤；所分离选用得到的细菌为具有诱导固化作用的细菌CR5能适应含高盐重金属污染的土壤环境。
本发明所述的利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，该方法的主要优点：①利用耐砷细菌修复砷污染土壤，避免产生二次污染，且成本低；②分离菌种选用高盐砷污染环境土壤，属于特殊环境土壤修复；③采用具有钙化细菌修复砷污染土壤，其作用过程为碱性环境下可与碳酸盐结合形成稳定的不再呈现污染二次转移的土壤，其修复技术稳定且环保；④对重金属污染环境的修复应用广，操作简单，且无需使用会产生二次污染的药剂。
具体实施方式
实施例
a、选用砷污染严重地区土壤为高盐环境下的砷污染土壤，砷污染环境为其土壤中重金属为可交换状态，且与碳酸盐相互结合，包括砷污染土壤、铯污染土壤、铜污染土壤、铅污染土壤，置于带盖的灭菌瓶中，将土壤样品1-2g置于含50ml营养肉汤锥形瓶中，营养肉汤pH为8-8.5，砷含量为100mg L-1,然后将锥形瓶置于转速为130rpmmin-1，温度为30℃的条件下培养48h，得到菌液；
b、将培养得到的菌液分别依次接入砷含量为100mg L-1、250mgL-1、500mg L-1的营养肉汤培养基为蛋白胨10g L-1、牛肉膏1.5g L-1、酵母粉1.5g L-1和氯化钠5g L-1中，按常规方法分离得到耐砷细菌，该耐砷细菌在基因库的代码为CR5，编号为HQ331532；
c、然后将耐砷细菌CR5置于质量含量为2%的尿素酶、20-60 mML-1CaCl2和砷含量为100-500mg L-1的营养汤培养基为蛋白胨10g L-1、牛肉膏1.5g L-1、酵母粉1.5g L-1和氯化钠5g L-1中，将混合液置于转速为130rpm min-1，温度为30℃的条件下培养5-7天，富集得到钙化作用耐砷细菌CR5菌液，所得到的菌液pH为8-9；
d、将富集得到具有钙化作用耐砷细菌CR5菌液100-300ml与50-100g含砷量为200-600mg Kg-1的污染土壤进行混合，形成混合溶液，混合溶液中的菌液菌密度为107CFU/ml，混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养7-15天后终止实验，钙化作用耐砷细菌CR5通过钙化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修复，阻止其向周围土壤及地表或地下水中迁移，具体实施例采用表的形式表述：
通过本发明所述方法，采用钙化作用耐砷细菌通过诱导固化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修复。该方法操作简便、易于控制，成本低，可广泛用于重金属土壤污染的修复。
Claims (4)
1.一种利用诱导固化作用的耐砷细菌原位修复砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、选用砷污染严重地区土壤置于带盖的灭菌瓶中，将土壤样品置于营养肉汤锥形瓶中，营养肉汤pH为8-8.5，砷含量为100 mg L-1,然后将锥形瓶置于转速为130 rpm min-1 ，温度为30℃的条件下培养48 h，得到菌液；
b、将培养得到的菌液分别依次接入砷含量为100 mg L-1、250 mg L-1和500mg L-1的营养肉汤培养基中，按常规方法分离得到耐砷细菌，该耐砷细菌在基因库的代码为CR5，编号为HQ331532；
c、然后将耐砷细菌CR5置于质量含量为2%的尿素酶、20- 60 mM L-1 CaCl2和砷含量为100- 500 mg L-1的营养汤培养基中，将混合液置于转速为130rpm min-1 ，温度为30℃的条件下培养5-7天，富集得到钙化作用耐砷细菌CR5菌液，所得到的菌液pH为8-9；
d、将富集得到具有钙化作用耐砷细菌CR5菌液100-300 ml与50-100g含砷量为200-600 mg Kg-1的污染土壤进行混合，形成混合溶液，混合液pH呈现微弱碱环境至pH为8-9，将混合溶液置于湿润环境下培养7-15天后终止实验，钙化作用耐砷细菌CR5通过钙化作用将富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修复，阻止其向周围土壤及地表或地下水中迁移。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b和步骤c中选用的营养肉汤培养基为蛋白胨10g L-1、牛肉膏1.5g L-1、酵母粉1.5g L-1和氯化钠5g L-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a中选用的污染土壤为高盐环境下的砷污染土壤，砷污染环境为其土壤中重金属为可交换状态，且与碳酸盐相互结合，包括砷污染土壤、铯污染土壤、铜污染土壤、铅污染土壤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中形成混合溶液中的菌液菌密度为107-108CFU/ml。
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