CN103115879A

CN103115879A - 一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法

Info

Publication number: CN103115879A
Application number: CN2013100181290A
Authority: CN
Inventors: 刘燕; 高健洲; 高荣孚; 彭金根; 郑国明
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN103115879B

Abstract

本发明是一种分别测定活体植物叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的方法。基本原理是用光纤光谱仪测定从400纳米到700纳米的叶片吸收光谱，对吸收光谱进行四阶导数处理，从而分离不同组分的吸收峰，用以确定叶绿素a和叶绿素b的最大吸收峰位置，用900纳米处的光谱校正叶片结构差异带来的误差，从而准确测定三种色素的含量。本方法原理简单、适用范围广，多种植物能用此方法建立数学模型，而且不受叶片颜色和表面反光特性的影响，双波长测定叶绿素a和叶绿素b有较好的区分度和准确性。

Description

一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法

技术领域

本发明涉及一种植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法。

背景技术

在生物圈中产生氧的过程以及光能转化为储存的化学能过程中，叶绿素a和叶绿素b起着非常关键的作用。在植物进行光合作用的过程中，叶绿体中的天线色素吸收光能并传递到反应中心色素，反应中心色素释放电子才能启动后续的光化学反应过程。天线色素包括绝大部分的叶绿素a和全部的叶绿素b，这两种色素在叶片中的含量是重要的生理参数。从应用的角度来说，了解叶绿素的含量对于农业生产管理和生理生态学研究来说也很重要。原因如下：(1)叶片吸收光能的多少与叶片光合色素含量多少有直接关系，叶片中叶绿素的浓度决定了其光合能力的潜力，也因此决定了农作物的产量。(2)叶片的氮素水平与叶绿素含量也是相关的，测量叶绿素含量能够间接了解植物的营养状态。(3)色素含量还与植物受到胁迫时的生理反应有密切关系。例如在植物衰老的过程中叶片中的叶绿素含量会降低而类胡萝卜素的含量会升高。(4)叶片的色素含量还受一些非生物因素的影响(例如叶片接收到的光照强度等)，所以色素含量还可以反映植物与周围环境的关系。

目前最常用的测定叶绿素含量的方法是，将叶片研磨成碎片用化学提取液提取出叶绿素，然后用分光光度计测定萃取液的吸收光谱来计算叶绿素的含量。这种方法是根据叶绿素a和叶绿素b混合液在红光区的最大吸收峰分别为663纳米和645纳米，由于吸光度具有加和性，通过两种色素的吸光系数即可求得对应的色素含量。这种方法的主要缺点是需要破坏植物叶片才能完成测定，由此带来诸多不便：(1)无法做到对同一个叶片进行连续观测。同一个植株的不同叶片叶绿素含量存在差异，要想较准确掌握植物生长的动态变化就需要扩大取样范围和增加取样次数，需要大量的实验材料才能完成。(2)叶绿素在叶片内是以蛋白复合物相结合的形式而发挥相应捕获光线的功能，在化学浸提液中这种结合被破坏，且提取后叶绿素容易分解。显然，直接测定活体叶片中的叶绿素含量更能反应植株的生理状态。(3)浸提叶绿素的过程需要消耗大量时间、药品和人力，不方便在田间直接测定。

近年来根据反射光或者吸收光来测定活体植物叶片叶绿素含量的方法得到了较大的发展。光学方法测定的最大优势是无损伤、原位测定，测量过程迅速简便，并且如果有成品化的仪器在大田里就能完成测定。目前光学法测定主要有两种方式，一是测定被叶片吸收最多的红色区域特定波长光线的吸收率，依此来计算叶绿素含量。现在市面上主要的商用快速叶绿素测定仪就是采用这种方法。例如美能达公司的SPAD-502就是测定660纳米处的吸收率，并结合红外区域的940nm处光谱修正由叶片结构导致的误差，进而测定叶绿素含量。这种方法的缺点是只使用一个单一波长进行测定，而叶绿素a和叶绿素b的最大吸收峰不同，只挑选一个波长就要放弃最大的吸收峰而选择能够兼顾两者的波长来测定。这就带了也应用上的不便：(1)不能区分叶绿素a和叶绿素b的含量，只能测定总的叶绿素含量。(2)仪器的读数是“叶绿素指数”，是叶绿素相对含量，而非绝对含量，不方便进行跨度较大(时间、植物种类等方面)的比较。(3)不同种类的植物叶片内含的吸光物质种类和数量不同，即便是在吸收量最大的红色区域，其吸收特性也会存在差异，单一波长决定了这种方法只能适应少数几种植物。前文提到的SPAD-502主要针对水稻和玉米开发的，应用到其他植物上测量偏差较大。另一种光学方法是测定被叶片反射的光谱，波长覆盖紫外光、可见光和近红外区域，用数理统计的方法建立反射光谱和叶绿素含量的数学模型，从而计算叶绿素含量。这种方法的主要缺点是：(1)分析难度大，建立数学模型比较困难。反射光是不被叶片吸收的部分，光谱成分很复杂，要想成功地建立数学模型的关键是从复杂的光谱信息中找到合适的参数，目前主要依靠数理统计的方法来完成。并不是每一种植物都能成功建立这样的模型，而且从已有的文献来看即便报道成功的模型也并不稳定，只能适应特定的植物样本。(2)受植物叶片反光特性影响大，不适用于非绿色叶片或反光较为强烈的植物。(3)不能区分叶绿素a和叶绿素b。这种方法主要应用在卫星遥感监测农作物、森林的动态变化，适用于大面积的测量，而在单个叶片尺度下这种方法并不适用。

根据检索的结果，目前用光学方法测定活体植物叶片叶绿素含量方法的相关专利有六个。其中有一种方法通过获取激光后散射图像计算叶绿素含量。激光器的成本和技术难度都较高，不适合广泛推广使用。一种方法通过检测植物叶绿素荧光信号来计算叶绿素。叶绿素荧光信号的强弱在不同生理状态下变化迅速而且变化幅度大，多用来评估叶片的瞬时生理状态。用来估计叶绿素含量也可以，但需要明确测定时叶片的生理状态才能使用。其它四种方法都是应用叶片的反射光谱来计算叶绿素含量，但获取反射光的设备不同，包括光谱仪、CCD照相系统或是扫描仪等，这四种方法都存在前面提到的用反射光测定叶绿素含量的不便之处。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种原理简单、适用范围广，多种植物能用此方法建立数学模型，而且不受叶片颜色和表面反光特性的影响，利用吸收光谱，双波长测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，对不同色素的含量测定有较好的区分度。

本发明是一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，包含以下步骤：

(1)测量光线透过叶片后的光谱，通过如下公式计算吸收光谱：

A_{n} = - \log (\frac{S_{n} - D_{n}}{R_{n} - D_{n}}),

其中，A_n为波长n下的吸收率，D_n为光谱仪在波长n下关闭电源时的计数值，R_n为光谱仪在波长n下测量标准白板的计数值，S_n为光谱仪在波长n下测量透过叶片光线的计数值，完成后保存测量和计算结果；

(2)以波长900纳米处的计数值作为基线进行调零，消除叶片厚度带来的误差；

(3)对吸收光谱进行平滑预处理，消除过多的噪声；

(4)对平滑后的吸收光谱取4阶导数后再次进行平滑处理；

(5)在波长640到690之间选择最大和次大的两个吸收峰用于测定叶绿素a和叶绿素b，较小那个波长对应的吸收值记作R₁，较大的那个波长对应的吸收值记作R₂，在波长420到450之间选择一个最大的吸收峰用于测定类胡萝卜素，对应的吸收值记作B；

(6)用线性回归方程建立步骤(5)所挑选特定波长的吸收值与化学浸提法测定的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的数学模型；

(7)用其它叶片测定步骤(5)所挑选的波长处吸收值，用步骤(6)所建立的数学模型计算叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量。

所述步骤(3)中，采用Savitzky-Golay算法对吸收光谱进行平滑预处理，窗函数所包含的数据点个数为10，多项式回归次数为2。

所述步骤(4)中，用Savitzky-Golay算法对导数光谱再次进行平滑处理，窗函数所包含的数据点个数为20，多项式回归次数为4。

在步骤(5)和步骤(6)之间，将用于光谱测量的那部分叶片分离出来，用化学浸提法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。

本发明的有益技术效果在于：

1.测定结果是叶绿素的绝对含量，单位为mg/g；

2.能够分别测定叶绿素a和叶绿素b的含量，比单纯测定总叶绿素含量能反映更多叶片的生理状态；

3.通过本方法能够找到叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素在不同植物叶片中的吸收峰位置，因此多数植物都能通过此方法建立吸收率与色素含量的数学模型；

4.本方法受叶片色彩和叶片结构的影响较小，应用本方法已经成功建立了8种植物的叶绿素计算模型，8种植物中有彩色叶片、高反光叶片和比较厚的叶片，本方法适应性较强。

5.已测定植物的叶绿素a含量范围从0.02mg/g至3.08mg/g，叶绿素b含量范围从0.01mg/g至0.88mg/g，类胡萝卜素含量范围0.02mg/g至0.66mg/g，测定结果与经典的化学浸提测定方法相关性高，R²在0.85以上，相对误差在10％以内。结果准确可用。

附图说明

图1：芍药叶片吸收光谱和四阶导数处理后的光谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明是一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，包含以下步骤：首先根据需要选取完整无损的植物叶片，清洁表面后等待测定，然后进行下述步骤：

(1)用光纤将光源、积分球和光谱仪连接好，打开光源并调整光源的强度以及光谱仪积分时间，使光谱仪能接收到足够强的信号，关闭光源，测量无光照条件下的仪器读数，用于消除仪器暗电流带来的误差，打开光源，测量标准白板的光谱，放入待测叶片，测量光线透过叶片后的光谱，通过如下公式计算吸收光谱：

A_{n} = - \log (\frac{S_{n} - D_{n}}{R_{n} - D_{n}}),

其中，A_n为波长n下的吸收率，D_n为光谱仪在波长n下关闭电源时的计数值，R_n为光谱仪在波长n下测量标准白板的计数值，S_n为光谱仪在波长n下测量透过叶片光线的计数值，完成后保存测量和计算结果。

(2)以波长900纳米处的计数值作为基线进行调零，消除叶片厚度带来的误差。

(3)对吸收光谱进行平滑预处理，消除过多的噪声。采用Savitzky-Golay算法对吸收光谱进行平滑预处理，窗函数所包含的数据点个数为10，多项式回归次数为2。

(4)对平滑后的吸收光谱取4阶导数，进行平滑处理。采用Savitzky-Golay算法对导数光谱再次进行平滑处理，窗函数所包含的数据点个数为20，多项式回归次数为4。

(5)在波长640到690之间选择最大和次大的两个吸收峰用于测定叶绿素a和叶绿素b，较小那个波长对应的吸收值记作R₁，较大的那个波长对应的吸收值记作R₂，在波长420到450之间选择一个最大的吸收峰用于测定类胡萝卜素，对应的吸收值记作B。

如图1所示，本实例为芍药叶片吸收光谱和四阶导数处理后的光谱，图中粗实线为芍药叶片的吸收光谱，细实线为取四阶导数后的光谱。芍药吸收光谱中有两个明显的大吸收峰，它们是由叶片中不同成分物质吸收峰叠加在一起形成的，通过取四阶导数能够将重叠的吸收峰分离。本例中红光区域挑选的两个波长分别是648纳米和681纳米，蓝光区域挑选的波长为427纳米。

(6)用线性回归方程建立步骤(5)所挑选特定波长的吸收值与化学浸提法测定的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的数学模型。

本实施实例中芍药叶片中三种色素含量的数学模型分别是：

叶绿素a：C_a＝0.49R₁+0.9R₂-0.45

叶绿素b：C_b＝-0.05R₁+0.47R₂-0.09

类胡萝卜素：C_x＝0.45C_a-0.64C_b-0.085B+0.077

为了检验本方法的准确性，将同一样品用本方法测得的叶绿素含量与化学浸提法测得的叶绿素含量做相关分析验证模型的准确性，本实例中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素这三种色素模型的R²分别是，0.85、0.86和0.99，且相对误差都在10％以内。说明此法可用。

与现有技术相比，本发明主要不同之处在于：扫描400纳米到700纳米之间植物叶片的吸收光谱，利用四阶导数把叶片中不同组分相互重叠的吸收峰分离开，从而确定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸收峰及位置。用两个红色区域的波长建立吸收率与叶绿素a、叶绿素b含量的数学模型，用一个蓝色区域的波长建立吸收率与类胡萝卜素含量的数学模型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，其特征在于包含以下步骤：

A_{n} = - \log (\frac{S_{n} - D_{n}}{R_{n} - D_{n}}),

(3)对吸收光谱进行平滑预处理，消除过多的噪声；

(4)对平滑后的吸收光谱取4阶导数后再次进行平滑处理；

2.根据权利要求1所述的一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用Savitzky-Golay算法对吸收光谱进行平滑预处理，窗函数所包含的数据点个数为10，多项式回归次数为2。

3.根据权利要求1所述的一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，用Savitzky-Golay算法对导数光谱再次进行平滑处理，窗函数所包含的数据点个数为20，多项式回归次数为4。

4.根据权利要求1所述的一种利用吸收光谱测定植物活体叶片中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量的方法，其特征在于，在步骤(5)和步骤(6)之间，将用于光谱测量的那部分叶片分离出来，用化学浸提法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。