CN103111093B - 旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效、特异富集旗肽标签蛋白D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱及其制备方法和用途，本发明所提供的免疫亲和纯化富集柱包含偶联有免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体的活化琼脂糖填料和装载该免疫亲和填料的塑料柱。所述的免疫亲和填料偶联的D-tag特异性多克隆抗体是用免疫亲和法提取得到的，所述的免疫亲和纯化富集柱是将免疫亲和填料装载入特制的塑料柱得到的，该免疫亲和纯化富集柱富集D-tag标签重组蛋白效率高、特异性强，洗脱条件温和，可重复利用，是目前分离提纯、富集D-tag标签重组蛋白理想的材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物分离、纯化富集装置，尤其是一种高效分离纯化、富集旗肽D-tag标签重组蛋白的免疫亲和纯化富集柱的制备方法及其应用。
背景技术
分子生物学及蛋白质组学是生命科学研究领域的热门学科，重组蛋白质的使用在近年来大大增加。为方便基因重组蛋白的标记、追踪、鉴定和纯化，在目标蛋白表达中会人为引进一段标签多肽形成重组蛋白。因此分离纯化、富集重组蛋白的技术越来越显示其重要性。从成份复杂的表达体系中分离纯化、富集目标蛋白是一项艰巨而繁重的任务，而亲和层析法是目前最广泛的分离纯化、富集重组蛋白的方法。
由于目前用于分离纯化、富集D-tag重组蛋白的亲和层析柱主要有金属螯合亲和柱以及利用酶的底物、反应性燃料为配基的亲和柱，这些亲和柱存在非特异性吸附、洗脱条件剧烈、提纯效果不佳等显著缺点，而且金属螯合亲和柱还存在金属离子脱落到洗脱液中的缺陷，这些都将限制分离提纯出来的目标蛋白后续的应用、检测。D-tag作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。因此现D-tag标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效、特异性分离纯化、富集D-tag标签重组蛋白的免疫亲和纯化富集柱制备方法及其应用。
为达上述目的，本发明2次采用抗原抗体的特异性反应和可离解的特性Ag + Ab (固相) Ag-Ab （固相）原理，具体如下：
首先利用这一原理将D-tag短肽半抗原偶联于Agarose上制得D-tag- Agarose亲和柱，用于提取D-tag特异性多克隆抗体。
再利用这一原理将提取所得的抗D-tag特异性抗体Anti-D-tag偶联到Agarose上制得Anti-D-tag- Agarose免疫亲和柱，用于分离纯化、富集细胞裂解液中的D-tag标签重组蛋白。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案：
一种旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备，其特征在于：
1）将免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体采用流式过柱的化学偶联反应偶联到过碘酸钠氧化的琼脂糖Agarose上，用硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液PBS清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，得到D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料；
2）将D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料装入塑料柱中，按需要的体积装柱，即得所述的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱。
所述方法制备的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱，包含偶联有免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该免疫亲和填料的塑料柱。
所述免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体，是用D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得免疫原免疫动物，得到含抗体血清，将含抗体血清上到偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，清洗未结合的杂质，用弱酸洗脱下D-tag特异性多克隆抗体，脱盐、冻干备用。
所述的 D-tag肽是由8个氨基酸即天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸组成的短肽，采用这8个氨基酸残基分成2组以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的D-tag短肽，其序列为：1）半胱氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸即C-DDDK,2) 天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸即DYKD-C。见序列表。
所述的D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸钠SDS变性血蓝蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酰-羟基琥珀酰亚胺酯即碘乙酰-NHS反应生成碘乙酰化 KLH或OVA ；通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉过量的碘乙酸后，将巯基化D-tag短肽与碘乙酰化的KLH或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。
所述偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，是将2种方向相反巯基化的D-tag短肽半抗原与碘乙酰化的Agarose反应，形成化学共价键复合体填料D-tag-Agarose,将D-tag-Agarose装柱即得偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱。
所述的旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的应用，其特征在于：所述免疫亲和纯化富集柱与用辣根过氧化物酶HRP标记免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体联用。
本发明的优点：
本发明所制得的免疫亲和纯化富集柱，具有以下显著优势：
（1）作为配基的D-tag特异性多克隆抗体采用的是只有4个氨基酸的D-tag短肽为免疫原刺激动物产生的，抗体对表达体系中的D-tag标签蛋白识别能力更强；并且抗体采用免疫亲和层析法提纯，提纯所得抗体特异性高，使得抗体和琼脂糖珠偶联密度大，偶联率高，用这种高特异性的抗体所制得的免疫亲和填料识别表达体系的D-tag标签重组蛋白效率明显提高。
（2）采用过碘酸钠活化的Agarose，使抗体和Agarose形成稳定的化学键，偶联于填料上的抗体不容易脱落，能更准确分离、富集D-tag标签重组蛋白。
（3）将所得的免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体标记上HRP得到Anti-D-tag HRP，直接标记一抗用来检测免疫亲和纯化富集柱的富集效果更准确；同时此免疫亲和纯化富集柱洗脱条件温和，能反复使用，降低成本。是目前分离提纯、富集D-tag标签重组蛋白理想的材料。
附图说明
图1为用免疫沉淀法检测D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱吸附目标蛋白图。图中： 1为分子量标记；
2为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清5倍稀释液 10μL；
3为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清5倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集后的滤液 10μL；
4为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清5倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液 15μL；
5为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清5倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱柱富集后的洗脱液 10μL；
6为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清5倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱柱富集后的洗脱液 5μL。
附图1图示说明D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱能识别重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液中的D-tag标签蛋白，并能将D-tag标签蛋白吸附，吸附在填料上的D-tag标签蛋白能用弱酸洗脱。
附图2为用免疫沉淀法检测D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集效果图。
图中：
1为分子量标记；
2为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清50倍稀释液 10μL；
3为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清50倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集D-tag后的滤液 10μL；
4为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清50倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液 10μL。
其中左边4道未加D-tag多肽抑制，右边4道加入D-tag多肽抑制。
附图2图示说明D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱能从含重组D-tag标签蛋白很低的细菌裂解液中富集D-tag标签蛋白。用D-tag多肽能完全抑制，说明所获得的免疫印记信号是D-tag特异性信号。
附图3为用D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱与Anti-D-tag-HRP联用效果图，图中：
NZHUS术。1为分子量标记；
2为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清10倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液5μL；
3为重组D-tag标签蛋白的细菌裂解原液上清10倍稀释液经D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱富集后的洗脱液15μL；
注：附图1、附图2、附图3 实验所用到的重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液来自同一管，购自武汉三鹰生物技术有限公司。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例1 免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体的制备
1.1 D-tag短肽半抗原设计
采用由8个氨基酸残基即天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸组成的短肽，用这8个氨基酸残基分成2种以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的D-tag短肽。
1.2 D-tag短肽免疫原制备
取5 mg/mL KLH 10 mL,加入100 μL饱和Na2CO3，再加入1 mL 10%的SDS混匀后煮沸5分钟变性，再与碘乙酰-NHS反应生成碘乙酰化 KLH，通过G25 Sephadex去掉过量的碘乙酸后，加入55 mg的D-tag短肽半抗原，调pH=8.5，室温反应60分钟后, 得到D-tag -KLH共价键复合体，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫抗原。改用OVA为载体蛋白用同样方法制备检测用包被抗原D-tag-OVA。
1.3 多克隆抗血清制备：用新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度为1mg/mL,首次免疫用0.5mL疫苗加1mL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫每次每兔用0.25mL疫苗加0.75mLPBS加1mL不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35-40天采集血清检测滴度，血清滴度达到1：6400后进行生产性血清制备。
1.4 D-tag短肽-Agarose亲和柱制备。
1.4.1 取2 g赖氨酸溶于10 mL 0.1 mol/L Na2CO3,充分溶解后加入到20 mL已用过碘酸钠活化的Agarose中混匀， 60℃反应5分钟，摇匀再次反应10 分钟，转4℃静置20 分钟，然后加入硼氢化钠 100 mg混匀，室温摇床上摇动过夜，得到氨基-agarose 20 ml。
1.4.2 将20 ml的氨基- agarose转移到50 ml洁净的空柱子，用500 ml蒸馏水分5次清洗。排干水备用。
1.4.3 用冷丙酮清洗氨基- agarose，再用含有0.5ml三乙胺的25ml 丙酮溶液清洗，当溶液还剩1/3在填料上层时，反复震荡重悬氨基- agarose。
1.4.4 用1 ml富马酸二甲脂DMF溶解75 mg NHS活化的碘乙酸，彻底溶解后，1000转/分离心1分钟，取上清边振荡边逐滴加入1.4.3重悬好的氨基- agarose，盖紧，室温避光反应60分钟。
1.4.5将氨基- agarose装柱，滴干，清洗掉过量的碘乙酸，滴干后移至50 ml的干净试管中。
1.4.6用1 ml含有10 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠EDTA的0.1 mol/L Na2CO3溶液溶解10 mg D-tag短肽，加入到1.4.5清洗后的氨基- Agarose室温中速摇床上反应60分钟,得到D-tag-Agarose，将此D-tag-Agarose装柱，用含0.05%吐温的磷酸盐缓冲液PBSt充分清洗后，再用PBS中和至PH=7。
1.5 D-tag特异性多克隆抗体提纯：将500 mL的免疫血清流过步骤1.4.6所制的免疫亲和层析柱。清洗未结合的杂质，柱上的D-tag特异性多克隆抗体用1.6%乙酸洗脱。洗脱的抗体用透析袋透析去掉乙酸， 冻干备用。
经间接ELISA检测，结果表明本发明所制的免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体效价很高，特异性很高。
实施例2 高密度D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱制备。
2.1取经过碘酸钠活化的 Agarose 3 mL转入柱子中，用100 mL蒸馏水洗，滴干，再过Agarose的2倍体积的0.1 mol/L Na2CO3，滴干备用；
2.2 将300 mg经免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体用0.1 mol/L Na2CO3溶解使浓度达20 mg/mL，完全溶解后离心取上清；
2.3上清加入步骤2.1的亲和柱中，收集流出液再次过柱，反复3-5次；
2.4用20 mL蒸馏水把未结合的抗体洗出来，收集在一起；
2.5用蒸馏水配制浓度为10 mg/mL的硼氢化钠溶液1.2 mL，加入柱子中，振荡混匀，4℃反应30分钟；
2.6用10倍填料体积的PBS洗填料，滴干PBS，将填料移入干净的试管中，加入与填料体积相等的甘油，即得D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料。
2.7在特制塑料柱内下端装上过滤膜，将D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料按需要量装入柱中，填料上层盖上过滤膜，即得所述的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱。
该免疫亲和纯化富集亲和柱保存条件为：-20℃。
实施例3 D-tag特异性抗体标记辣根过氧化物酶
3.1称5 mg免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体，溶解于100 μL 0.1 mol/L Na2CO3，反应10分钟，按抗体量：辣根过氧化物酶=1：1加入5 mg 已经活化的辣根过氧化物酶，混匀；
3.2加入1 mg硼氢化钠，混匀后排气，于-20℃放置1分钟后移至4℃静置2小时；
3.3经G25 Sephadex脱盐柱脱盐；
3.4加入BSA使BSA终浓度为1mg/mL，再加50%甘油，用 ELISA法检测所标记抗体的使用滴度。
实施例4用免疫沉淀法检测D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱吸附目标蛋白
4.1 取D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集填料100 μL装柱，用500 μL 0.05 mol/L HCl洗柱子，PBS洗至中性；
4.2 重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液离心取上清2ml，用蒸馏水将上清液稀释5倍后过D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱；
4.3 用3 mL PBSt洗柱子，再用3 mL蒸馏水洗柱子，用300 μL 0.05 mol/L HCl的 PBSt溶液洗脱，收集300 μL洗脱液，加10 μL饱和碳酸钠中和使PH=7；
4.4 取重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清5倍稀释液、滤过液及洗脱液各300 μL分别等量加入5乘的上样缓冲液5*loading buffer，煮沸5分钟，离心，取上清点样跑电泳，做免疫印迹实验。实验结果如图1。
实施例5 用免疫沉淀法检测D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的富集效果
5.1 取D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集填料100 μL装柱，用500 μL 0.05 mol/L HCl洗柱子，PBS洗至中性；
5.2 重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液离心取上清0.2ml，用蒸馏水将上清稀释50倍后过D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱；
5.3 用3 mL PBSt洗柱子，再用3 mL蒸馏水洗柱子，用300 μL 0.05 mol/L HCl的 PBSt溶液洗脱，收集300 μL洗脱液，加10 μL饱和碳酸钠中和使PH=7；
5.4 取重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液上清50倍稀释液、滤过液及洗脱液各300 μL分别等量加入5*loading buffer，煮沸5分钟，离心，取上清点样跑电泳，做免疫印迹实验。，做2个重复，做免疫印迹转膜后，一个重复不加D-tag多肽抑制，另一个重复加D-tag多肽抑制，实验结果如图2。
实施例6 D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱与用辣根过氧化物 酶标记的免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体联用
6.1 取D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集填料50 μL装柱，用250 μL 0.05 mol/L HCl洗柱子，PBS洗至中性；
6.2 取重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液原液离心取上清1ml，用蒸馏水将上清液稀释10倍后过D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱；
6.3 用1.5 mL PBSt洗柱子，再用1.5 mL蒸馏水洗柱子，用150 μL 0.05 mol/L HCl的 PBSt溶液洗脱，收集150 μL洗脱液，加10 μL饱和碳酸钠中和使PH=7；
6.4 取洗脱液150μL加入等量5*loading buffer，煮沸5分钟，离心，取上清点样跑电泳，做免疫印迹实验。
6.5做免疫印迹上抗体的时候，直接上Anti-HA-HRP，实验结果如图3。
注：实施例4、实施例5、实施例6实验所用到的重组D-tag标签蛋白的细菌裂解液来自同一管，购自武汉三鹰生物技术有限公司。
南宁市蓝光生物技术有限公司
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<140> 2012
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (3)
1.一种旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：
1）将免疫亲和纯化的旗肽D-tag特异性多克隆抗体采用流式过柱的化学偶联反应偶联到过碘酸钠氧化的琼脂糖 Agarose上，用硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液PBS清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，即得D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料;
2）将D-tag标签重组蛋白免疫亲和填料装入塑料柱中，按需要的体积装柱，即得所述的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱；
所述的免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体是用D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得免疫原免疫动物，得到含抗体血清，将含抗体血清上到偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，清洗未结合的杂质，用弱酸洗脱下D-tag特异性多克隆抗体，脱盐、冻干备用；
所述的D-tag短肽是由8个氨基酸即天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸组成的短肽，采用这8个氨基酸残基分成2组以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的D-tag短肽，其序列为：1）半胱氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酸即C-DDDK,2) 天冬氨酰-酪氨酰-赖氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸即DYKD-C；
所述偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱，将2种方向相反巯基化的D-tag短肽半抗原与碘乙酰化的Agarose反应，形成化学共价键复合体填料D-tag-Agarose，将D-tag-Agarose装柱即得偶联有D-tag短肽的免疫亲和层析柱。
2. 根据权利要求1所述的旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所制的D-tag标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱包含偶联有免疫亲和纯化的D-tag特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该免疫亲和填料的塑料柱。
3. 根据权利要求1所述的旗肽标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所述的D-tag短肽偶联活化的载体蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸钠、变性血蓝蛋白KLH或卵清蛋白OVA载体蛋白，再与碘乙酰-羟基琥珀酰亚胺酯即碘乙酰-NHS反应生成碘乙酰化 KLH或OVA ，通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉过量的碘乙酸后，将巯基化D-tag短肽与碘乙酰化的KLH或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。
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