CN103090824A - 液相色谱填料孔径的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种液相色谱填料孔径的测定方法，包括以下步骤：提供至少两种不同孔径的已知填料、至少两种不同分子量的已知高分子标准品、缓冲溶液及待测填料；以缓冲溶液为流动相，已知填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到多条与不同孔径相对应的标准曲线；以缓冲溶液为流动相，待测填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到与待测填料相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定待测填料的孔径范围。上述液相色谱填料孔径的测定方法，采用凝胶渗透色谱法，通过待测曲线与多条标准曲线对比，从而得到待测填料的孔径，测得的填料孔径较准确。
Description
技术领域
本发明涉及液相色谱填料孔径领域，特别是涉及一种液相色谱填料孔径的测定方法。
背景技术
目前测定液相色谱填料孔径的方法主要有氮气吸附法和压汞法两种。氮气吸附法是通过测定氮气在材料表面的吸附和脱附等温线，并通过数学模型计算出材料的孔径。压汞法则是通过测定不同压力下进入孔中汞的量来计算孔体积，并计算出孔径。
但是，液相色谱填料的工作环境是水溶液或有机溶剂，而氮气吸附法是在真空状态下进行测量孔径的，压汞法是在高压状态下的汞环境中进行测定孔径的，均无法反映出工作环境下填料孔径的实际状态。
同时，氮气吸附法通常适合于测定50纳米以下的微孔和介孔结构，对于液相色谱50纳米以上的填料的孔径数据测定会存在较大偏差。压汞法通常适合于测定50纳米以上的大孔结构，对于液相色谱50纳米以下的填料的孔径数据测定会存在较大偏差。
发明内容
基于此，有必要提供一种适用范围较广、反映实际工作状态下填料孔径的液相色谱填料孔径的测定方法。
一种液相色谱填料孔径的测定方法，包括以下步骤：
提供多种不同孔径的已知填料、多种不同分子量的已知高分子标准品、缓冲溶液及待测填料；
采用液相色谱仪，以所述缓冲溶液为流动相，所述已知填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的所述已知高分子标准品在每种孔径的所述已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个所述第一保留时间及所述分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线；及
采用液相色谱仪，以所述缓冲溶液为流动相，所述待测填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的所述已知高分子标准品在所述待测填料中的第二保留时间，拟合多个所述第二保留时间及所述分子量，得到与所述待测填料相对应的待测曲线，将所述待测曲线与多条所述标准曲线对比，根据分别位于所述待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定所述待测填料的孔径范围。
在其中一个实施例中，所述凝胶渗透色谱法测试中，所述流动相的流速为1~2ml/min。
在其中一个实施例中，所述缓冲溶液为pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液。
在其中一个实施例中，所述已知高分子标准品为葡聚糖、聚乙二醇或普鲁兰。
在其中一个实施例中，所述多种已知填料为四种；所述多种已知高分子标准品为八种。
在其中一个实施例中，所述四种已知填料的孔径分别为15nm、30nm、50nm及100nm。
在其中一个实施例中，所述八种已知高分子标准品的分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD及670kD。
在其中一个实施例中，所述待测填料为硅胶填料、聚苯乙烯改性填料或聚甲基丙烯酸酯填料。
上述液相色谱填料孔径的测定方法，采用凝胶渗透色谱法，测试已知高分子标准品在待测填料中的保留时间，得到待测曲线，通过待测曲线与多条标准曲线对比，从而得到待测填料的孔径，反映了填料在实际工作状态下的孔径大小，测得的填料孔径较准确，适用范围较广，能够适用于1~100nm孔径的填料。
附图说明
图1为一实施方式的液相色谱填料孔径的测定方法的流程图；
图2为一实施方式的多条标准曲线图；
图3为实施例1的填料孔径测定曲线图；
图4为实施例2的填料孔径测定曲线图；
图5为实施例3的填料孔径测定曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
请参阅图1，一实施方式的液相色谱填料孔径的测定方法，包括以下步骤：
步骤S100、提供多种不同孔径的已知填料、多种不同分子量的已知高分子标准品、缓冲溶液及待测填料。
请参阅图2，本实施方式中，已知填料的种类为四种，这四种已知填料的孔径分别为15nm、30nm、50nm及100nm。
已知高分子标准品可为葡聚糖、聚乙二醇或普鲁兰。本实施方式中，已知高分子标准品为葡聚糖，葡聚糖的种类为八种。八种葡聚糖的分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD及670kD。
缓冲溶液可为pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液。
待测填料为硅胶填料、聚苯乙烯改性填料（PST）或聚甲基丙烯酸酯填料（PMA）。待测填料的孔径在所有已知填料的孔径范围之内。本实施方式中，待测填料的孔径范围为15~100nm。
步骤S200、采用液相色谱仪，以缓冲溶液为流动相，已知填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的已知高分子标准品在每种孔径的已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个第一保留时间及分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线。
请参阅图2，采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以pH=7、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1~2ml/min，分别以孔径为15nm、30nm、50nm、100nm的已知填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，其中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在每种孔径的已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个第一保留时间及分子量进行拟合处理，得到多条不同孔径对应的标准曲线。
其中，色谱柱的规格为7.8*300mm。
步骤S300、采用液相色谱仪，以缓冲溶液为流动相，待测填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的已知高分子标准品在待测填料中的第二保留时间，拟合多个第二保留时间及分子量，得到与待测填料相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定待测填料的孔径范围。
待测填料可为1~100nm的硅胶填料、聚苯乙烯改性填料或聚甲基丙烯酸酯。本实施方式中，待测填料为硅胶填料。
请参阅图3，采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以pH=7、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1~2ml/min，以硅胶填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在硅胶填料中的第二保留时间，拟合多个第二保留时间及分子量，得到与硅胶填料相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定硅胶填料的孔径范围。
其中，色谱柱的规格为7.8*300mm。
上述液相色谱填料孔径的测定方法，采用凝胶渗透色谱法，测试已知高分子标准品在待测填料中的保留时间，得到待测曲线，通过待测曲线与多条标准曲线对比，从而得到待测填料的孔径，反映了填料在实际工作状态下的孔径大小，测得的填料孔径较准确，适用范围较广，能够适用于1~100nm孔径的填料。
下面结合具体实施例，对本发明作进一步的阐述。
实施例1
提供孔径分别为15nm、30nm、50nm、100nm的已知填料，分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD、670kD的葡聚糖，pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液，及5μm粒径的硅胶填料。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以已知填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在每种孔径的已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个第一保留时间及分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以硅胶填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在硅胶填料中的第二保留时间，拟合多个第二保留时间及分子量，得到与硅胶填料相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定硅胶填料的孔径范围。
其中，色谱柱的规格为7.8*300mm。
请参阅图3，图3为硅胶填料的填料孔径测定曲线图。由图3可知，硅胶填料的孔径为15~30nm。
实施例2
提供孔径分别为15nm、30nm、50nm、100nm的已知填料，分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD、670kD的葡聚糖，pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液，及3μm粒径的聚苯乙烯改性填料（PST）。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以已知填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在每种孔径的已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个第一保留时间及分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以PST为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在PST中的第二保留时间，拟合多个第二保留时间及分子量，得到与PST相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定PST的孔径范围。
其中，色谱柱的规格为7.8*300mm。
请参阅图4，图4为PST的填料孔径测定曲线图。由图4可知，PST的孔径为30~50nm。
实施例3
提供孔径分别为15nm、30nm、50nm、100nm的已知填料，分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD、670kD的葡聚糖，pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液，及10μm粒径的聚甲基丙烯酸酯填料（PMA）。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以已知填料为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在每种孔径的已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个第一保留时间及分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线。
采用Agilent 1260高效液相色谱仪，以磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1ml/min，以PMA为固定相，将每种葡聚糖溶于磷酸缓冲溶液中，葡聚糖的浓度为10mg/mL，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种葡聚糖在PMA中的第二保留时间，拟合多个第二保留时间及分子量，得到与PMA相对应的待测曲线，将待测曲线与多条标准曲线对比，根据分别位于待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定PMA的孔径范围。
其中，色谱柱的规格为7.8*300mm。
请参阅图5，图5为PMA的填料孔径测定曲线图。由图5可知，PMA的孔径为15~30nm。
上述液相色谱填料孔径的测定方法，采用凝胶渗透色谱法，测试已知高分子标准品在待测填料中的保留时间，得到待测曲线，通过待测曲线与多条标准曲线对比，从而得到待测填料的孔径，反映了填料在实际工作状态下的孔径大小，测得的填料孔径较准确，适用范围较广，能够适用于1~100nm孔径的填料。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供多种不同孔径的已知填料、多种不同分子量的已知高分子标准品、缓冲溶液及待测填料；
采用液相色谱仪，以所述缓冲溶液为流动相，所述已知填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的所述已知高分子标准品在每种孔径的所述已知填料中的第一保留时间，然后以保留时间为横轴，分子量为纵轴，对多个所述第一保留时间及所述分子量进行拟合处理，得到多条与不同孔径相对应的标准曲线；及
采用液相色谱仪，以所述缓冲溶液为流动相，所述待测填料为固定相，通过凝胶渗透色谱法测试得到每种分子量的所述已知高分子标准品在所述待测填料中的第二保留时间，拟合多个所述第二保留时间及所述分子量，得到与所述待测填料相对应的待测曲线，将所述待测曲线与多条所述标准曲线对比，根据分别位于所述待测曲线两侧且最相邻的两条标准曲线对应的孔径确定所述待测填料的孔径范围。
2.根据权利要求1所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述凝胶渗透色谱法测试中，所述流动相的流速为1~2ml/min。
3.根据权利要求1所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH=7.0、浓度为150mmol/L的磷酸缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述已知高分子标准品为葡聚糖、聚乙二醇或普鲁兰。
5.根据权利要求1所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述多种已知填料为四种；所述多种已知高分子标准品为八种。
6.根据权利要求5所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述四种已知填料的孔径分别为15nm、30nm、50nm及100nm。
7.根据权利要求5所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述八种已知高分子标准品的分子量分别为12kD、25kD、50kD、80kD、150kD、270kD、410kD及670kD。
8.根据权利要求1所述的液相色谱填料孔径的测定方法，其特征在于，所述待测填料为硅胶填料、聚苯乙烯改性填料或聚甲基丙烯酸酯填料。
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