CN103074359A - 使用细胞内同步表达法在t4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其步骤如下：带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建；将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞；分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白。本发明方法无需进行外源重组蛋白的过表达，避免了体外展示法中需要外源重组蛋白大量过表达的技术瓶颈；无需进行外源重组蛋白的分离纯化，避免了耗时且昂贵的蛋白分离纯化过程。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法。
背景技术
T4噬菌体的衣壳表面有两种修饰蛋白，分别为Hoc蛋白和Soc蛋白。此二蛋白为非必要蛋白，即删除或改造此二蛋白不会对T4噬菌体的复制和扩增造成影响。基于此二蛋白分子的这一特点，并通过分子生物学手段，可将外源蛋白（即非T4噬菌体自身的蛋白）与Hoc或Soc蛋白重组，并展示在T4噬菌体表面。通过分子生物学手段在T4噬菌体表面展示外源重组蛋白的技术，已在疫苗开发方面显示出巨大的潜在应用价值。
现有的T4噬菌体表面展示技术为体外展示技术。该方案以分子克隆的手段构建Hoc或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒，在表达菌体内大量过表达外源重组蛋白。然后以色谱法分离纯化过表达的外源重组蛋白，并与Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体在缓冲液中结合。之后通过差速离心法将未结合的外源重组蛋白与T4噬菌体颗粒分离，从而得到衣壳上展示了外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒。现有的T4噬菌体表面展示技术以体外展示为主要手段。这一技术涉及外源重组蛋白的过表达和分离纯化，然后再以Hoc蛋白或Soc蛋白缺失的T4噬菌体与之结合。这个过程会面临：1）外源重组蛋白过表达的表达量问题；2）重组蛋白的溶液可溶性及分离纯化效率问题；3）已纯化的外源重组蛋白与T4噬菌体表面在缓冲液体系中的结合效率问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法设计合理、可操作性强的使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其特点是，其步骤如下：
（一）带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建：
（1）将Hoc蛋白或Soc蛋白的基因编码区与所需展示的外源蛋白的基因编码区融合，并在序列上游加入T4噬菌体控制Hoc蛋白或Soc蛋白表达的天然调控区域；外源蛋白选自任意蛋白；融合后形成带有调控序列的编码Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因序列；含有此序列的质粒在大肠杆菌细胞内会在T4噬菌体感染装配的过程中同步表达外源重组蛋白；
（2）制备包含质粒复制所需区域和抗生素抗性基因的基因片段；依据所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并通过PCR的方法扩增所选择的质粒载体的抗性基因和质粒复制所需区域；PCR的方法为：根据所选择的质粒载体的序列，在质粒复制所需区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物；PCR引物的设计基于PCR反应所设计的一对引物覆盖整个质粒复制所需区域和抗性基因；然后使用质粒载体的DNA为模板，使用标准的Taq酶并按照Taq酶设定的标准PCR循环进行PCR操作；
（3）以DNA连接酶按照商业公司提供的标准方法将从以上步骤获得的抗生素抗性基因和质粒复制所需区域以及Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞内；培养细胞，进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒；
（二）将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以传统的生物化学方法制作大肠杆菌细胞的感受态细胞，并将外源重组蛋白的表达质粒以标准的化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞内；
（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞：将含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养至细菌细胞密度1.5-6×108/毫升LB培养基，然后以MOI感染复数= 0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体感染细胞，并在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养3-4个小时；个过程中，T4噬菌体不断装配扩增，与T4噬菌体装配同步表达的外源重组蛋白已经展示在T4噬菌体衣壳上；
（四）分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒：以差速离心法将以上感染产物的培养基上清与展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒、尚未破裂的大肠杆菌细胞以及感染所产生的细胞残骸分离开来，离心力34,500g；丢弃上清，并以PI-Mg缓冲液重悬离心所得的沉降物；加入DNaseI至10微克/毫升的终浓度，并在37摄氏度培养30分钟以消化DNA；之后再以差速离心法去除细胞及残骸，离心力4,300g，丢弃离心沉降物并保留上清；上清中含有较纯的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；以高速离心的方法将噬菌体颗粒沉降下来，离心力34,500g，去除上清，再以PI-Mg缓冲液重悬噬菌体颗粒，从而获得具有较高浓度的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液，在4摄氏度长期稳定保存；
（五）检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白：对于T4噬菌体颗粒衣壳上所展示的外源重组蛋白，检测方法的选择基于外源蛋白本身的性质。
本发明方法中，外源重组蛋白序列的构建采用的是基于PCR方法的重叠扩增剪接法（PCR-directed splicing by overlap extension）。重叠扩增剪接法是在分子克隆技术中广泛应用的一种基本的PCR方法，其目的是将两段DNA序列拼接成一条完整的DNA片段。本方案中涉及的Hoc蛋白或Soc蛋白的外源重组蛋白序列的构建，即为将Hoc蛋白或Soc蛋白的编码区基因片段与外源蛋白的基因片段拼接成一条完整的DNA片段。根据外源蛋白的基因序列以及外源蛋白和Hoc蛋白或Soc蛋白的上下游顺序，并依据重叠扩增剪接法的基本原理，设计出PCR引物和PCR循环方案，以重叠扩增剪接法获得Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段。Hoc蛋白或Soc蛋白的启动子区域序列可以作为上游引物的一部分放在基因编码区的上游。或者，假如外源重组蛋白中Hoc蛋白或Soc蛋白在上游，可在PCR时直接将启动子区域序列包括进扩增的DNA片段。由于本方案中外源蛋白可以是任意蛋白，故重叠扩增剪接法中PCR引物和PCR循环方案的设计需要依据所要展示的外源蛋白的序列，以及外源蛋白序列排练在Hoc蛋白或Soc蛋白序列的上游还是下游来确定。PCR引物和PCR循环方案的设计基于PCR反应的基本常识以及重叠扩增剪接法的基本原理。
除了含有用于表达外源重组蛋白的序列以外，所构建的质粒还需要含有质粒复制所需的区域，以及一个抗生素的抗性基因，用来保持所构建的质粒在大肠杆菌细胞中的 稳定存在。这一部分的基因片段可以从商业可获得的质粒载体中以PCR手段扩增获得。依据具体实验所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并根据所选择的质粒载体的序列在质粒复制所需的区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物以及PCR循环方案。PCR引物和PCR循环方案的设计基于PCR反应的基本常识。
与现有技术相比，本发明技术方案带来的有益效果如下：
（1）本发明方法无需进行外源重组蛋白的过表达，避免了体外展示法中需要外源重组蛋白大量过表达的技术瓶颈。
（2）本发明方法无需进行外源重组蛋白的分离纯化，避免了耗时且昂贵的蛋白分离纯化过程。
（3）本发明方法中，外源重组蛋白一旦表达即与T4噬菌体衣壳结合，从而成为稳定的T4噬菌体衣壳的一部分，对于一些可溶性低，折叠不稳定的外源重组蛋白，这一点十分重要。
（4）本发明方法体外展示法在缓冲液体系中将纯化后的外源重组蛋白与T4噬菌体结合，这一过程需要加入大大过量的纯化后的外源重组蛋白才能达到有效结合。而本方案采用体内同步表达，外源重组蛋白一旦表达即与T4噬菌体衣壳结合，无需大量表达、纯化外源重组蛋白，从而有效的节约了人力、物力及材料资源。
附图说明
图1为以SDS-PAGE确定外源重组蛋白的成功展示图；
图2 为以酶学实验确定所展示的gal蛋白的活性图；
图3为通过ELISA实验检测所展示的GG蛋白图。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其步骤如下：
（一）带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建：
（1）将Hoc蛋白或Soc蛋白的基因编码区与所需展示的外源蛋白的基因编码区融合，并在序列上游加入T4噬菌体控制Hoc蛋白或Soc蛋白表达的天然调控区域；外源蛋白选自任意蛋白；融合后形成带有调控序列的编码Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因序列；含有此序列的质粒在大肠杆菌细胞内会在T4噬菌体感染装配的过程中同步表达外源重组蛋白；
（2）制备包含质粒复制所需区域和抗生素抗性基因的基因片段；依据所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并通过PCR的方法扩增所选择的质粒载体的抗性基因和质粒复制所需区域；PCR的方法为：根据所选择的质粒载体的序列，在质粒复制所需区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物；PCR引物的设计基于PCR反应所设计的一对引物覆盖整个质粒复制所需区域和抗性基因；然后使用质粒载体的DNA为模板，使用标准的Taq酶并按照Taq酶设定的标准PCR循环进行PCR操作；
（3）以DNA连接酶按照商业公司提供的标准方法将从以上步骤获得的抗生素抗性基因和质粒复制所需区域以及Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞内；培养细胞，进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒；
（二）将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以传统的生物化学方法制作大肠杆菌细胞的感受态细胞，并将外源重组蛋白的表达质粒以标准的化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞内；
（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞：将含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养至细菌细胞密度1.5-6×108/毫升LB培养基，然后以MOI感染复数= 0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体感染细胞，并在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养3-4个小时；个过程中，T4噬菌体不断装配扩增，与T4噬菌体装配同步表达的外源重组蛋白已经展示在T4噬菌体衣壳上；
（四）分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒：以差速离心法将以上感染产物的培养基上清与展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒、尚未破裂的大肠杆菌细胞以及感染所产生的细胞残骸分离开来，离心力34,500g；丢弃上清，并以PI-Mg缓冲液重悬离心所得的沉降物；加入DNaseI至10微克/毫升的终浓度，并在37摄氏度培养30分钟以消化DNA；之后再以差速离心法去除细胞及残骸，离心力4,300g，丢弃离心沉降物并保留上清；上清中含有较纯的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；以高速离心的方法将噬菌体颗粒沉降下来，离心力34,500g，去除上清，再以PI-Mg缓冲液重悬噬菌体颗粒，从而获得具有较高浓度的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液，在4摄氏度长期稳定保存；
（五）检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白：对于T4噬菌体颗粒衣壳上所展示的外源重组蛋白，检测方法的选择基于外源蛋白本身的性质。
实验例，以下通过两个实例阐明本发明的技术方案。
将天然折叠、功能完整的两种外源蛋白：GG蛋白和gal蛋白，分别与Soc蛋白和Hoc蛋白融合，形成重组蛋白，并以细胞内同步表达法展示在T4噬菌体的衣壳上。
（一）构建Soc蛋白与gal蛋白融合的重组蛋白的表达质粒：
（1）通过PCR的方法扩增Soc蛋白的基因序列，包括其启动子区域（Soc蛋白启动子区域的基因序列为：tataaataatcatgtaatttaaataaaggagaattac）。引物1为Soc蛋白启动子区域的基因序列的前18个碱基。引物2为以下序列的反向互补序列：Soc蛋白基因编码区的最后21个碱基除去终止密码子，加上gal蛋白基因编码区的前18个碱基。PCR的方法为：使用T4噬菌体DNA为模板，引物1和引物2为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（2）通过PCR的方法扩增gal蛋白的基因序列。引物1为Soc蛋白基因编码区的最后21个碱基除去终止密码子，加上gal蛋白基因编码区的前18个碱基。引物2为以下序列的反向互补序列：gal蛋白基因序列的最后18个碱基，包含终止密码子。PCR的方法为：使用半乳糖苷酶的编码基因DNA为模板，引物1和引物2为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（3）得到Soc蛋白和gal蛋白融合的重组蛋白的基因序列。以上两个步骤中产生的PCR扩增产物经过商业可获得的PCR产物纯化试剂盒的纯化后，以水稀释20倍，并按1：1混合后作为PCR模板。以4.2.6.1.1步骤中的引物1和4.2.6.1.2步骤中的引物2作为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（4）通过PCR的方法扩增pUC18质粒载体的氨苄抗性基因和质粒复制所需区域。引物1为pUC18的氨苄抗性基因的上游序列中的18个碱基，引物2为以下序列的反向互补序列：pUC18的质粒复制所需区域的下游序列中的18个碱基。PCR的方法为：使用pUC18的DNA为模板，引物1和引物2为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（5） 以DNA连接酶按照标准方法将上述得到的pUC18的氨苄抗性基因和质粒复制所需区域和Soc和gal蛋白融合的重组蛋白的基因序列连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞（商业可获得）内，并进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Soc蛋白和外源蛋白gal蛋白融合的重组蛋白的表达质粒。
（二）构建Hoc蛋白与GG蛋白融合的重组蛋白的表达质粒：
（1） 通过PCR的方法扩增Hoc蛋白的基因序列，并在基因编码区上游加入Soc蛋白的启动子区域（专业共识认为Hoc蛋白与Soc蛋白在T4噬菌体的装配过程中是几乎同步表达的，故使用Soc蛋白的启动子区域几乎不会改变Hoc重组蛋白在T4噬菌体感染和装配过程中的起始表达时间）。引物1为Hoc蛋白编码区基因序列的前18个碱基，并在引物序列中的上游加入Soc蛋白启动子区域的基因序列。引物2为以下序列的反向互补序列：Hoc蛋白基因编码区的最后21个碱基除去终止密码子，加上GG蛋白基因编码区的前18个碱基。PCR的方法为：使用T4噬菌体DNA为模板，引物1和引物2为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（2）通过PCR的方法扩增GG蛋白的基因序列。引物1为Hoc蛋白基因编码区的最后21个碱基除去终止密码子，加上GG蛋白基因编码区的前18个碱基。引物2为以下序列的反向互补序列：GG蛋白基因序列的最后18个碱基，包含终止密码子。PCR的方法为：使用G蛋白（G protein）的编码基因DNA为模板，引物1和引物2为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（3）得到Hoc蛋白和GG蛋白融合的重组蛋白的基因序列。以上两个步骤中产生的PCR扩增产物经过商业可获得的PCR产物纯化试剂盒的纯化后，以水稀释20倍，并按1：1混合后作为PCR模板。以4.2.6.2.1步骤中的引物1和4.2.6.2.2步骤中的引物2作为引物，使用标准的Taq酶（商业可获得）并按照商业公司为Taq酶专门设定的标准PCR循环进行PCR操作。
（4） 通过PCR的方法扩增pUC18的氨苄抗性基因和质粒复制所需区域。方法同（一）中的步骤（4）。
（5） 以DNA连接酶按照标准方法将上述的pUC18的氨苄抗性基因和质粒复制所需区域和的Hoc蛋白和GG蛋白融合的重组蛋白的基因序列连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞（商业可获得）内，并进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白和外源蛋白GG蛋白融合的重组蛋白的表达质粒。
（三）将上述外源重组蛋白的表达质粒分别转化进入大肠杆菌细胞内。方法参见实施例1中方法。
（四）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株分别感染含有上述外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞。方法参见实施例1中方法。
（五）分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒。方法参见实施例1中方法。
（六）检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白：
（1）以SDS-PAGE确定外源重组蛋白的成功展示。所得的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒的SDS-PAGE带型内含有所展示的外源重组蛋白的条带，可确定外源重组蛋白在T4噬菌体颗粒上的展示。见附图1。图1中：泳道2-4为展示Hoc-GG重组蛋白的噬菌体样品，其展示的Hoc-GG重组蛋白的条带位置以黑色箭头标出。泳道5-7为展示Soc-gal重组蛋白的噬菌体样品，其展示的Soc-gal重组蛋白的条带位置以黑色箭头标出。
（2）以酶学实验确定所展示的gal蛋白的活性。gal蛋白具有半乳糖苷酶活性，可将无色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal）转化产生蓝色的5-溴-4-氯-3-吲哚。利用这一性质，可检测T4噬菌体颗粒上所展示的Soc-gal重组蛋白是否保有其天然功能。见附图2。图2中，在20微升的PI-Mg缓冲液反应体系中，加入1微克的反应底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷（X-gal，无色）。1号反应管中加入作为对照的噬菌体病毒颗粒：109个Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体。2号反应管中加入109个展示Soc-gal重组蛋白的T4噬菌体病毒颗粒。经过在37摄氏度30分钟的反应，2号反应管中的底物经过T4噬菌体表面展示的Soc-gal重组蛋白的催化作用，产生蓝色的5-溴-4-氯-3-吲哚（黑色箭头标出，此图为黑白图）。而1号反应管中的反应底物仍然为无色。
（3） 以针对蛋白GG的抗体通过ELISA实验确定所展示的GG蛋白的正确折叠。GG蛋白是G蛋白抗体结合结构域，正确折叠的GG蛋白可与G蛋白抗体有效结合，故通过ELISA实验使用G蛋白抗体可检测所展示的Hoc-GG重组蛋白的正确折叠。见附图3。在ELISA实验中对照组使用的是109个Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体颗粒，检测组加入的是109个展示了Soc-gal重组蛋白的T4噬菌体病毒颗粒。反应中G蛋白抗体的稀释度和反应强度（表现为第二抗体在650纳米的吸光值）如图所示。
从以上所举的实例可以看出，本发明方法通过使用细胞内同步表达法，成功的实现了在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子。并且，所展示的外源蛋白折叠正确、功能完整。
Claims (1)
1.一种使用细胞内同步表达法在T4噬菌体表面展示外源蛋白大分子的方法，其特征在于，其步骤如下：
（一）带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒的构建：
（1）将Hoc蛋白或Soc蛋白的基因编码区与所需展示的外源蛋白的基因编码区融合，并在序列上游加入T4噬菌体控制Hoc蛋白或Soc蛋白表达的天然调控区域；外源蛋白选自任意蛋白；融合后形成带有调控序列的编码Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因序列；含有此序列的质粒在大肠杆菌细胞内会在T4噬菌体感染装配的过程中同步表达外源重组蛋白；
（2）制备包含质粒复制所需区域和抗生素抗性基因的基因片段；依据所需要的抗性基因和质粒复制区序列，选择合适的商业可获得的质粒载体，并通过PCR的方法扩增所选择的质粒载体的抗性基因和质粒复制所需区域；PCR的方法为：根据所选择的质粒载体的序列，在质粒复制所需区域和抗性基因的上下游选择合适区段设计PCR引物；PCR引物的设计基于PCR反应所设计的一对引物覆盖整个质粒复制所需区域和抗性基因；然后使用质粒载体的DNA为模板，使用标准的Taq酶并按照Taq酶设定的标准PCR循环进行PCR操作；
（3）以DNA连接酶按照商业公司提供的标准方法将从以上步骤获得的抗生素抗性基因和质粒复制所需区域以及Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的基因片段连接起来，并通过标准的化学转化法将其转化进入XL10-Gold感受态细胞内；培养细胞，进行质粒扩增，即得到带有T4噬菌体天然调控区的Hoc蛋白或Soc蛋白与外源蛋白融合的重组蛋白的表达质粒；
（二）将外源重组蛋白的表达质粒转化进入大肠杆菌细胞内：以传统的生物化学方法制作大肠杆菌细胞的感受态细胞，并将外源重组蛋白的表达质粒以标准的化学转化方法转化进入大肠杆菌感受态细胞内；
（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体病毒株感染含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞：将含有外源重组蛋白表达质粒的大肠杆菌细胞在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养至细菌细胞密度1.5-6×108/毫升LB培养基，然后以MOI感染复数= 0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌体感染细胞，并在37摄氏度摇床中以180-270转/分钟的摇速培养3-4个小时；个过程中，T4噬菌体不断装配扩增，与T4噬菌体装配同步表达的外源重组蛋白已经展示在T4噬菌体衣壳上；
（四）分离从以上的感染步骤中产生的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒：以差速离心法将以上感染产物的培养基上清与展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒、尚未破裂的大肠杆菌细胞以及感染所产生的细胞残骸分离开来，离心力34,500g；丢弃上清，并以PI-Mg缓冲液重悬离心所得的沉降物；加入DNaseI至10微克/毫升的终浓度，并在37摄氏度培养30分钟以消化DNA；之后再以差速离心法去除细胞及残骸，离心力4,300g，丢弃离心沉降物并保留上清；上清中含有较纯的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒；以高速离心的方法将噬菌体颗粒沉降下来，离心力34,500g，去除上清，再以PI-Mg缓冲液重悬噬菌体颗粒，从而获得具有较高浓度的展示有外源重组蛋白的T4噬菌体颗粒悬浮液，在4摄氏度长期稳定保存；
（五）检测所获得的T4噬菌体颗粒的衣壳上所展示的外源重组蛋白：对于T4噬菌体颗粒衣壳上所展示的外源重组蛋白，检测方法的选择基于外源蛋白本身的性质。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
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| CN111954683A (zh) * | 2018-04-05 | 2020-11-17 | 生物辐射Abd瑟罗泰克有限公司 | 感兴趣的蛋白质的展示系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1602962A (zh) * | 2004-08-04 | 2005-04-06 | 任兆钧 | 口蹄疫全病毒基因工程疫苗及其制备方法 |
| US20060068379A1 (en) * | 1997-04-11 | 2006-03-30 | Steven Alasdair C | Phage display of intact domains at high copy number |
| CN1972710A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-05-30 | 美国天主教大学 | 包含噬菌体纳米颗粒的方法和组合物 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060068379A1 (en) * | 1997-04-11 | 2006-03-30 | Steven Alasdair C | Phage display of intact domains at high copy number |
| CN1972710A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-05-30 | 美国天主教大学 | 包含噬菌体纳米颗粒的方法和组合物 |
| CN1602962A (zh) * | 2004-08-04 | 2005-04-06 | 任兆钧 | 口蹄疫全病毒基因工程疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 孟繁梅 等: "噬菌体展示技术系统发展进展", 《遗传》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111954683A (zh) * | 2018-04-05 | 2020-11-17 | 生物辐射Abd瑟罗泰克有限公司 | 感兴趣的蛋白质的展示系统 |
| CN110878320A (zh) * | 2018-09-05 | 2020-03-13 | 湖北微生元生物科技有限公司 | 使用t4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法 |
| CN110885847A (zh) * | 2018-09-05 | 2020-03-17 | 湖北微生元生物科技有限公司 | 使用t4噬菌体展示技术高效表达超敏蛋白的方法 |
| CN109652432A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-19 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种高纯度隐地蛋白的制备方法 |
| CN109666686A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-23 | 华中科技大学鄂州工业技术研究院 | 一种高纯度隐地蛋白的制备方法 |
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