CN103074340A - 一种核酸及其应用和药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸，该核酸为siRNA或者插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒。本发明还提供了上述核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸和药学上可接受的载体。本发明提供的核酸和药物组合物能够在体内达到30％以上抑制率的干扰HBV的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及一种核酸、该核酸的应用和一种药物组合物。
背景技术
乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎(乙肝)，是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病。乙型肝炎主要通过血液和体液传播，临床表现多样化，包括急性、慢性、淤胆型和重症型肝炎，并且容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例亦可转变为原发性肝细胞癌。
目前HBV感染呈世界性流行，主要侵犯儿童及青壮年。据世界卫生组织报道，全球约有4亿人为慢性HBV携带者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。中国是世界范围内感染HBV人数最多的国家，全国现有慢性乙肝病人2000万，每年乙肝新发病人数约50万。由此可见，乙肝已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最为严重的一种传染病。
防治乙型肝炎的药物中，核酸干扰药物具有良好的应用前景，但是，目前的核酸干扰药物的体内干扰HBV的效果较差。
发明内容
本发明的目的是克服目前的核酸干扰药物的体内干扰HBV的效果较差的缺陷，提供一种体内干扰HBV的效果较好的核酸干扰药物。
本发明的发明人发现，针对同一已知基因或基因组，即使根据已知的siRNA作用机制和序列规律设计出来的siRNA，并不一定能在体内具有较好的核酸干扰效果，即不经过实验验证，无法确定siRNA的体内效果。本发明的发明人经过创造性劳动，发现并验证了若干在体内具有较好的核酸干扰效果的siRNA，由此得到本发明。
为了实现上述目的，本发明提供了一种核酸，该核酸含有正义链序列为SEQ ID NO：1且反义链序列为SEQ ID NO：2的siRNA-8、正义链序列为SEQ ID NO：3且反义链序列为SEQ ID NO：4的siRNA-23、正义链序列为SEQ ID NO：5且反义链序列为SEQ ID NO：6的siRNA-27、正义链序列为SEQ ID NO：7且反义链序列为SEQ ID NO：8的siRNA-30、正义链序列为SEQ ID NO：9且反义链序列为SEQ ID NO：10的siRNA-32、正义链序列为SEQ ID NO：11且反义链序列为SEQ ID NO：12的siRNA-34、正义链序列为SEQ ID NO：34且反义链序列为SEQ ID NO：35的siRNA-4、正义链序列为SEQ ID NO：36且反义链序列为SEQ ID NO：37的siRNA-9、正义链序列为SEQ ID NO：38且反义链序列为SEQ ID NO：39的siRNA-17、正义链序列为SEQ ID NO：40且反义链序列为SEQ ID NO：41的siRNA-22、正义链序列为SEQ ID NO：42且反义链序列为SEQ ID NO：43的siRNA-26、正义链序列为SEQ ID NO：44且反义链序列为SEQ ID NO：45的siRNA-35、正义链序列为SEQ ID NO：46且反义链序列为SEQ ID NO：47的siRNA-36、正义链序列为SEQ ID NO：48且反义链序列为SEQ ID NO：49的siRNA-37、正义链序列为SEQ ID NO：50且反义链序列为SEQ ID NO：51的siRNA-38、正义链序列为SEQ ID NO：52且反义链序列为SEQ ID NO：53的siRNA-40和正义链序列为SEQ ID NO：54且反义链序列为SEQ ID NO：55的siRNA-45中的至少一种。
本发明还提供了另外一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环片段组成；所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77。
本发明还提供了上述核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸和药学上可接受的载体。
通过上述技术方案，本发明提供的核酸和药物组合物能够在体内达到30％以上抑制率的干扰HBV的效果。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，使用的术语siRNA是指小干扰核糖核酸，使用的术语shRNA是指短发夹核糖核酸。
本发明提供了一种核酸，该核酸含有正义链序列为SEQ ID NO：1且反义链序列为SEQ ID NO：2的siRNA-8、正义链序列为SEQ ID NO：3且反义链序列为SEQ ID NO：4的siRNA-23、正义链序列为SEQ ID NO：5且反义链序列为SEQ ID NO：6的siRNA-27、正义链序列为SEQ ID NO：7且反义链序列为SEQ ID NO：8的siRNA-30、正义链序列为SEQ ID NO：9且反义链序列为SEQ ID NO：10的siRNA-32、正义链序列为SEQ ID NO：11且反义链序列为SEQ ID NO：12的siRNA-34、正义链序列为SEQ ID NO：34且反义链序列为SEQ ID NO：35的siRNA-4、正义链序列为SEQ ID NO：36且反义链序列为SEQ ID NO：37的siRNA-9、正义链序列为SEQ ID NO：38且反义链序列为SEQ ID NO：39的siRNA-17、正义链序列为SEQ ID NO：40且反义链序列为SEQ ID NO：41的siRNA-22、正义链序列为SEQ ID NO：42且反义链序列为SEQ ID NO：43的siRNA-26、正义链序列为SEQ ID NO：44且反义链序列为SEQ ID NO：45的siRNA-35、正义链序列为SEQ ID NO：46且反义链序列为SEQ ID NO：47的siRNA-36、正义链序列为SEQ ID NO：48且反义链序列为SEQ ID NO：49的siRNA-37、正义链序列为SEQ ID NO：50且反义链序列为SEQ ID NO：51的siRNA-38、正义链序列为SEQ ID NO：52且反义链序列为SEQ ID NO：53的siRNA-40和正义链序列为SEQ ID NO：54且反义链序列为SEQ ID NO：55的siRNA-45中的至少一种。
根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，该核酸为所述siRNA-8、所述siRNA-23、所述siRNA-27、所述siRNA-30、所述siRNA-32和所述siRNA-34中的一种；进一步优选为所述siRNA-23、所述siRNA-27或所述siRNA-30。该优选情况下，所述核酸能够在较低的施用量下具有较高的抑制效果。
根据本发明所述的核酸，其中，所述核酸含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，优选情况下，所述核酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。所述修饰的核苷酸基团不会导致所述核酸干扰HBV的功能的丧失。
根据本发明所述的核酸，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。
例如，磷酸基团的修饰是指对磷酸基团中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰(Phosphorthioate)和硼烷化磷酸盐修饰(Boranophosphate)。如下式所示分别用硫和硼烷置换磷酸基团中的氧。两种修饰都能稳定核酸的结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
硫代磷酸修饰 硼烷化磷酸盐修饰
核糖基团的修饰是指对核糖基团中2′-羟基(2′-OH)的修饰。在核糖基团的2′-羟基位置引入某些取代基如甲氧基或氟后，使血清中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加了核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。对核苷酸戊糖中2′-羟基的修饰包括2′-氟修饰(2′-fluromodification)、2′-氧甲基修饰(2′-OME)、2′-甲氧乙基修饰(2′-MOE)、2′-2，4-二硝基苯酚修饰(2′-DNP modification)、锁核酸修饰(LNA modification)、2′-氨基修饰(2′-Amino modification)、2′-脱氧修饰(2′-Deoxy modification)等。
2′-氟修饰 2′-氧甲基修饰
2′-甲氧乙基修饰 2′-2，4-二硝基苯酚修饰
锁核酸修饰 2′-氨基修饰 2′-脱氧修饰
碱基的修饰是指对核苷酸基团中的碱基进行修饰，如在尿嘧啶的5’位点引入溴或碘的5′-溴尿嘧啶(5′-bromo-uracil)和5′-碘尿嘧啶(5′-iodo-uracil)修饰是常使用的碱基修饰方法，其他还有N3-甲基脲嘧啶(N3-methyl-uracil)修饰、2，6-二氨基嘌呤(2，6-diaminopurine)修饰等。
5′-溴尿嘧啶 5′-碘尿嘧啶
N3-甲基脲嘧啶 2，6-二氨基嘌呤
根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’-OH被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
本发明的发明人发现，对于同一条siRNA而言，对某几个特定的核苷酸基团进行2’-OH的甲氧基或氟取代的修饰，能够显著提高该siRNA的抗降解能力和抑制效果，由此得到本发明特别优选的一种实施方式。
根据本发明特别优选的一种实施方式，该核酸含有正义链序列为SEQID NO：78且反义链序列为SEQ ID NO：79的siRNA(m)-8、正义链序列为SEQ ID NO：80且反义链序列为SEQ ID NO：81的siRNA(m)-23、正义链序列为SEQ ID NO：82且反义链序列为SEQ ID NO：83的siRNA(m)-27、正义链序列为SEQ ID NO：84且反义链序列为SEQ ID NO：85的siRNA(m)-30、正义链序列为SEQ ID NO：86且反义链序列为SEQ ID NO：87的siRNA(m)-32和正义链序列为SEQ ID NO：88且反义链序列为SEQ IDNO：89的siRNA(m)-34中的至少一种。
根据本发明所述的核酸，其中，包括所述siRNA-8、所述siRNA-23、所述siRNA-27、所述siRNA-30、所述siRNA-32和所述siRNA-34的siRNA可以通过本领域常规的方法获得，例如通过固相合成和液相合成得到，所述固相合成已经有商业的订制服务提供，因此可以通过商购获得。所述修饰的核苷酸基团可以通过具有相应修饰的核苷酸单体引入。
基于如上合成的siRNA，本发明进一步提供了与上述siRNA具有相同或相似功能的shRNA表达质粒，具体如下：
本发明还提供了一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环(loop)片段组成；所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77。
根据本发明所述的核酸，其中，优选情况下，所述质粒中，所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。该优选情况下，所述核酸能够在较低的施用量下具有较高的抑制效果。
其中，对于同一个shRNA中的所述两个短反向重复片段，其中一个为对应于siRNA正义链的正义短反向重复片段，其中另一个为对应于siRNA反义链的反义短反向重复片段。
其中，所述质粒的序列可以包括用于表达shRNA的空载体序列和所述shRNA的序列，还可以进一步包括其它辅助序列。在明确所需表达的shRNA的序列的情况下，本领域技术人员可以通过常规的方法选择、设计、合成和/或使用所述质粒，以表达所述shRNA。例如，用于表达shRNA的空载体可以为购自武汉晶赛公司的pGenesil系列的空载体(编号为1-8的载体均可使用)产品。
其中，所述环片段用于和所述两个短反向重复片段一起形成shRNA的短发夹结构，但不破坏shRNA的功能，所述环片段可以为构建shRNA中常规的选择，例如文献(Wang L，Mu F Y.A Web based design center for vectorbased siRNA and siRNA cassette.Bioinformatics，2004，20(11)：1818-1820)中所提及的环片段，又例如，可以为SEQ ID NO：25(即，5’-TCAAGAGA-3’)。
其中，所述质粒的序列还可以包括shRNA序列上游的转录启动子序列(例如RNA聚合酶III启动子序列，如H1启动子或U6启动子)和shRNA序列下游的转录终止子序列(例如5-6个连续的T)。所述质粒的序列还可以进一步包括限制性酶切位点，以方便进行针对所述质粒的分子生物学操作，如酶切克隆和/或酶切鉴定等。
本发明还提供了如上所述的核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。在所述用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物中，如上所述的核酸主要通过RNA干扰的机制发挥作用。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有如上所述的核酸和药学上可接受的载体。所述核酸和所述药学上可接受的载体可以通过常规的方法制备得到所述药物组合物。例如所述药物组合物可以为注射液。所述注射液可以用于皮下、肌肉或静脉的注射。
根据本发明所述的药物组合物，其中，相对于1重量份的所述核酸，所述药学上可接受的载体的含量为1-100000重量份。
根据本发明所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述pH值缓冲液可以为pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇和蔗糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以确定所述渗透压调节剂的含量。
本发明所述药物组合物的使用剂量可以为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重和病症的严重程度来确定。例如，对于雄性，7-8周龄，体重20-25g的C57BL/6J-TgN(AlblHBV)44Bri乙型肝炎病毒基因小鼠，以所述药物组合物中的所述核酸的量计，所述药物组合物的用量可以为0.001-10μmol/kg体重，优选为0.01-1μmol/kg体重。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品、本发明所用的核酸电泳等操作均按常规方案进行。
制备实施例1
委托上海吉玛(GenePharma)公司化学合成表1中所列的siRNA。
表1
经过序列比对，上述siRNA的序列与人或小鼠的基因组序列不存在16个碱基长度以上的同源序列。并且，上述siRNA是等摩尔的正义链和反义链退火后形成的。
制备实施例2
委托上海吉玛(GenePharma)公司制备表2中所列的表达shRNA的质粒。表达shRNA的质粒记为shRNA(p)，分别为shRNA(p)-8、shRNA(p)-23、shRNA(p)-27、shRNA(p)-30、shRNA(p)-32、shRNA(p)-34、shRNA(p)-4、shRNA(p)-9、shRNA(p)-17、shRNA(p)-22、shRNA(p)-26、shRNA(p)-35、shRNA(p)-36、shRNA(p)-37、shRNA(p)-38、shRNA(p)-40和shRNA(p)-45。其中，所有表达shRNA的质粒均为在购自武汉晶赛公司的编号为pGenesil-1的空载体(该空载体的序列如其说明书所示)中插入由一个对应于siRNA正义链的正义短反向重复片段、一个环片段(SEQ ID NO：25，即5’-TCAAGAGA-3’)和一个对应于siRNA反义链的反义短反向重复片段串联而成的编码shRNA的核酸片段。
表2
制备实施例3
委托苏州瑞博公司化学合成表3中所列的修饰的siRNA。修饰的siRNA记为siRNA(m)，分别为siRNA(m)-8、siRNA(m)-23、siRNA(m)-27、siRNA(m)-30、siRNA(m)-32和siRNA(m)-34，其碱基序列分别对应于制备实施例1中的siRNA-8、siRNA-23、siRNA-27、siRNA-30、siRNA-32和siRNA-34。
其中，(OM)代表它左边的核苷酸基团的2’羟基被甲氧基修饰，(F)代表它左边的核苷酸基团的2’羟基被氟修饰。
化学修饰方案如表3：
表3
上述修饰的siRNA是等摩尔的正义链和反义链退火后形成的。
制备实施例4
将0.09μmol的上述各种siRNA、shRNA(p)和siRNA(m)分别溶解于8ml无RNA酶的无菌生理盐水中，得到药物组合物(即核酸浓度为0.01125μmol/ml)。
测试实施例1
本测试实施例测试制备实施例3得到的siRNA(m)-8、siRNA(m)-23、siRNA(m)-27、siRNA(m)-30、siRNA(m)-32和siRNA(m)-34，和制备实施例1得到的siRNA-8、siRNA-23、siRNA-27、siRNA-30、siRNA-32和siRNA-34在血清环境中的稳定性。
将20μmol的上述修饰或不修饰的siRNA分别与50μl的胎牛血清(FBS，购自HyClone，货号GTB0060)和40μl的PBS混合后，在37℃下温育48小时后，得到处理样品。以新鲜的修饰或不修饰的siRNA为对照样品。对处理样品和对照样品同时进行电泳检测。以处理样品的电泳条带的光强度值与对照样品的电泳条带的光强度值的比值计算降解率。结果如表4所示。
表4
| 修饰的siRNA | 降解率(％) | 不修饰的siRNA | 降解率(％) |
| siRNA(m)-8 | 5.13±0.71 | siRNA-8 | 41.56±0.87 |
| siRNA(m)-23 | 16.55±0.89 | siRNA-23 | 86.64±5.21 |
| siRNA(m)-27 | 12.64±1.56 | siRNA-27 | 36.97±4.33 |
| siRNA(m)-30 | 14.98±0.95 | siRNA-30 | 65.67±1.87 |
| siRNA(m)-32 | 21.64±0.84 | siRNA-32 | 90.33±5.21 |
| siRNA(m)-34 | 8.97±0.94 | siRNA-34 | 42.77±3.64 |
本表数据均以平均值±标准误的方式表示。
通过表4可以看出，在血清中，修饰的siRNA相比不修饰的siRNA具有更高的稳定性。
测试实施例2
本测试实施例用于说明本发明提供的核酸在体内抑制HBV的效果。
采用C57BL/6J-Tg(AlblHBV)44Bri乙型肝炎病毒转基因小鼠为实验动物模型，以进行体内实验。如文献(Chisari FV et al.Molecular pathogenesis ofhepatocellular carcinoma in hepatitis B virus transgenic mice.Cell.1989.59(6)：1145-56.)所详细描述，该乙型肝炎病毒转基因小鼠的产生方式已为本领域公知。
具体地，选用雄性、7-8周龄且体重为20-25g范围内的小鼠。所用小鼠均购自北京大学医学部实验动物科学部；动物合格证号：SCXK(京)2006-0008；饲养条件按照SPF级动物标准执行。
为尽可能消除小鼠个体间差异，筛选出血清乙肝表面抗原(HBsAg)呈强阳性且HBV基因组DNA呈阳性的转基因小鼠，进行随机分组，每组6只。
分别使用制备实施例4得到的药物组合物通过常规的尾静脉注射对上述小鼠进行1次注射，作为处理组，注射的体积为20ml的注射液/kg体重(即，0.225μmol核酸/kg体重)。对照组按处理组同样的方法进行，所不同的是，所用的核酸为购自武汉晶赛公司的针对小鼠的阴性对照siRNA和阴性对照shRNA质粒。
血清HBsAg检测
注射后第14天，将小鼠进行眼球取血，常规离心分离得到血清，使用ELISA试剂盒对血清中HBsAg的含量进行检测。该试剂盒购自法国生物梅里埃有限公司，操作按说明书进行。结果以P/N值(P/N值＝样品孔的光吸收值/空白孔光吸收值)表示，并按下列公式计算siRNA对两者的抑制率。光吸收值为每孔在450nm处的吸光值减去样品在630nm处的吸光值所得的差值。样品孔所加的样品为待测血清，空白孔所加的空白为去离子水。
抑制率(％)＝(对照组的P/N值-处理组的P/N值)/(对照组的P/N值)×100％，结果如表5所示。
表5
肝组织HBV-mRNA的检测
注射后第14天，将小鼠处死并取出肝脏组织，使用Trizol(GIBCOL公司)试剂，按其说明书进行肝组织总RNA的提取，并将提取的总RNA经DNase酶消化去除DNA后，逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR法检测siRNA对乙型肝炎病毒mRNA表达的抑制作用。
荧光定量PCR法中，以小鼠GAPDH基因作为内参基因，并且使用针对C基因、X基因、S和P基因的引物各进行一轮检测，具体序列如表6：
表6
| 基因 | 上游引物 | 下游引物 |
| C基因 | 5’-ctgggtgggtgttaatttgg-3’(SEQ ID NO：26) | 5’-taagctggaggagtgcgaat-3’(SEQ ID NO：27) |
| X基因 | 5’-actctctcgtccccttctcc-3’(SEQ ID NO：28) | 5’-ggtcgttgacattgcagaga-3’(SEQ ID NO：29) |
| S和P基因 | 5’-ttcctaggaccccttctcgt-3’(SEQ ID NO：30) | 5’-agcagcaggatgaagaggaa-3’(SEQ ID NO：31) |
| GAPDH | 5’-ctctgctcctcctgttcgac-3’(SEQ ID NO：32) | 5’-acgaccaaatccgttgactc-3’(SEQ ID NO：33) |
荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性按如下等式计算：
siRNA抑制活性＝[1-(给药组乙肝病毒基因的拷贝数/给药组GAPDH的拷贝数)/(空白对照组乙肝病毒基因的拷贝数/空白对照组GAPDH的拷贝数)]×100％。
对于同一药物组合物处理的样本使用的三对检测引物中，以抑制率最高的引物为待比较的结果。结果如表7所示。
表7
测试实施例3
采用测试实施例2的方法测试各药物组合物在体内对HBV的抑制效果，不同的是，分别使用制备实施例4得到的药物组合物与9倍体积生理盐水混合后，通过常规的尾静脉注射对所用小鼠进行1次注射，注射的体积为20ml的注射液/kg体重(即，0.0225μmol核酸/kg体重)，以注射相同体积的生理盐水的小鼠为空白对照组。
本测试实例的结果如表8和表9所示。
表8
表9
通过表5、表7、表8和表9的数据可以看出，本发明提供的所述核酸能够在体内对HBV具有明显的抑制效果。
并且，siRNA(m)-8、siRNA(m)-23、siRNA(m)-27、siRNA(m)-30、siRNA(m)-32和siRNA(m)-34具有比siRNA-8、siRNA-23、siRNA-27、siRNA-30、siRNA-32和siRNA-34更高的抑制效率。
并且，siRNA-8、siRNA-23、siRNA-27、siRNA-30、siRNA-32和siRNA-34具有比siRNA-9、siRNA-17、siRNA-22、siRNA-26、siRNA-35、siRNA-36、siRNA-37、siRNA-38、siRNA-40和siRNA-45更高的抑制效率。
并且，shRNA(p)-8、shRNA(p)-23、shRNA(p)-27、shRNA(p)-30、shRNA(p)-32、shRNA(p)-34和shRNA(p)-4具有比shRNA(p)-9、shRNA(p)-17、shRNA(p)-22、shRNA(p)-26、shRNA(p)-35、shRNA(p)-36、shRNA(p)-37、shRNA(p)-38、shRNA(p)-40和shRNA(p)-45更高的抑制效率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种核酸，该核酸含有正义链序列为SEQ ID NO：1且反义链序列为SEQ ID NO：2的siRNA-8、正义链序列为SEQ ID NO：3且反义链序列为SEQ ID NO：4的siRNA-23、正义链序列为SEQ ID NO：5且反义链序列为SEQ ID NO：6的siRNA-27、正义链序列为SEQ ID NO：7且反义链序列为SEQ ID NO：8的siRNA-30、正义链序列为SEQ ID NO：9且反义链序列为SEQ ID NO：10的siRNA-32、正义链序列为SEQ ID NO：11且反义链序列为SEQ ID NO：12的siRNA-34、正义链序列为SEQ ID NO：34且反义链序列为SEQ ID NO：35的siRNA-4、正义链序列为SEQ ID NO：36且反义链序列为SEQ ID NO：37的siRNA-9、正义链序列为SEQ ID NO：38且反义链序列为SEQ ID NO：39的siRNA-17、正义链序列为SEQ ID NO：40且反义链序列为SEQ ID NO：41的siRNA-22、正义链序列为SEQ ID NO：42且反义链序列为SEQ ID NO：43的siRNA-26、正义链序列为SEQ ID NO：44且反义链序列为SEQ ID NO：45的siRNA-35、正义链序列为SEQ ID NO：46且反义链序列为SEQ ID NO：47的siRNA-36、正义链序列为SEQ ID NO：48且反义链序列为SEQ ID NO：49的siRNA-37、正义链序列为SEQ ID NO：50且反义链序列为SEQ ID NO：51的siRNA-38、正义链序列为SEQ ID NO：52且反义链序列为SEQ ID NO：53的siRNA-40和正义链序列为SEQ ID NO：54且反义链序列为SEQ ID NO：55的siRNA-45中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中，该核酸为所述siRNA-8、所述siRNA-23、所述siRNA-27、所述siRNA-30、所述siRNA-32或所述siRNA-34；优选为所述siRNA-23、所述siRNA-27或所述siRNA-30。
3.根据权利要求1或2所述的核酸，其中，所述核酸含有至少一个修饰的核苷酸基团。
4.根据权利要求3所述的核酸，其中，所述修饰的核苷酸基团为磷酸基团、核糖基团和碱基中的至少一种被修饰的核苷酸基团。
5.根据权利要求4所述的核酸，其中，所述核糖基团被修饰的核苷酸基团为核糖基团的2’-OH被甲氧基或氟取代的核苷酸基团。
6.根据权利要求5所述的核酸，其中，该核酸含有正义链序列为SEQ IDNO：78且反义链序列为SEQ ID NO：79的siRNA(m)-8、正义链序列为SEQID NO：80且反义链序列为SEQ ID NO：81的siRNA(m)-23、正义链序列为SEQ ID NO：82且反义链序列为SEQ ID NO：83的siRNA(m)-27、正义链序列为SEQ ID NO：84且反义链序列为SEQ ID NO：85的siRNA(m)-30、正义链序列为SEQ ID NO：86且反义链序列为SEQ ID NO：87的siRNA(m)-32和正义链序列为SEQ ID NO：88且反义链序列为SEQ ID NO：89的siRNA(m)-34中的至少一种。
7.一种核酸，该核酸为插入有编码短发夹核糖核酸的核酸片段的质粒，所述质粒表达所述短发夹核糖核酸，所述编码短发夹核糖核酸的核酸片段由两个短反向重复片段和位于所述两个短反向重复片段之间的环片段组成；
所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：67，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：73，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：76和SEQ ID NO：77。
8.根据权利要求7所述的核酸，其中，所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，或所述两个短反向重复片段的序列分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。
9.权利要求1-8中任意一项所述的核酸在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的药物组合物中的应用。
10.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1-8中任意一项所述的核酸和药学上可接受的载体。
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