CN103068407A - 用于pet成像的亲脂阳离子探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含亲脂阳离子、疏水部分和PET核的成像探针。本发明还提供了产生这类成像探针的前体分子以及利用探针分析受试对象的线粒体膜电位的方法。

Description

用于PET成像的亲脂阳离子探针

发明领域

本发明涉及为了体内线粒体供能(mitochondrial energisation)的可视化，在诸如正电子发射断层成像术(PET)和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)的技术中使用的成像探针。

发明背景

线粒体功能异常会导致种种病态(pathologies)，包括癌症、糖尿病、心脏衰竭、心血管和肝脏疾病、AIDS、自身免疫紊乱、退行性疾病和衰老的病理生理学。

线粒体功能障碍引起的疾病常常与线粒体膜电位(ΔΨm)的明显变化有关。线粒体膜电位的改变是与凋亡受抑(如癌症)有关；或与凋亡增强(如AIDS和退行性疾病)有关的那些病态的一个重要特性。它还与多种由线粒体功能障碍直接导致的疾病有关，比如DNA突变和氧化应激。

因此有必要对患者体内的线粒体功能进行监测。

正电子发射断层成像术(PET)是一项广泛用于给生物组织和患者的体内代谢造影的技术。将半衰期很短的正电子发射核子(比如18F)引入探针分子并注射到患者体内。然后探针在某些组织中累积。利用PET扫描仪可以由γ射线的放射显示出探针的位置，并由断层成像中推导出探针的局部浓度。由于跨越内膜的负膜电位，诸如四苯基磷阳离子或三苯基磷

阳离子的亲脂性阳离子能够穿过细胞质和线粒体膜，有选择性地在线粒体中累积。

基于简单TPP阳离子的示踪剂已被建议用于线粒体功能障碍成像(Cheng et al(2005)J.Label.Compd.Radiopharm.48:131-137)、肿瘤成像(Madar et al(1999)J.Nucl.Med.40:1180-1185;Wang et al(2007)50:5057-5069)和冠状动脉疾病的诊断成像(Madar et al(2006)J.Nucl.Med.47:1359-1366)。

本发明涉及对已知靶向线粒体的PET探针的改进。

附图简述

图1-实施例中使用的TPP阳离子的结构。

图2-iv(静脉)注射后，[³H]MitoQ摄入小鼠组织的时程图。小鼠经iv尾静脉注射被给予100nmol[³H]MitoQ大丸药。在所示的时间点，处死小鼠并确定组织中的[³H]MitoQ含量。数据是nmol MitoQ/g湿重组织，是每个时间点两只独立小鼠的平均值±范围。A，肝和肾；B，心脏、肌肉、脑和白色脂肪组织(脂肪)；C和D，分别是注射MitoQ后头1小时的肝和肾的视图(C)以及心脏、肌肉、脑和白色脂肪组织(脂肪)的视图(D)。

图3-iv注射后[³H]TPP化合物从循环系统清除的时程图。小鼠经iv尾静脉注射被给予100nmol[³H]TPP大丸药。在所示的时间点，处死小鼠并确定血液中的[³H]TPP含量。数据是nmol TPP化合物/ml血，是每个时间点两只独立小鼠的平均值±范围。A，[³H]MitoQ；B，[³H]癸基TPP和[³H]氟代十一烷基TPP；C，[³H]TPMP。

图4-[³H]癸基TPP和[³H]氟代十一烷基TPP摄入组织的时程图。小鼠经iv尾静脉注射被给予100nmol[³H]癸基TPP或[³H]氟代十一烷基TPP大丸药。在所示的时间点，处死小鼠并确定组织中的[³H]癸基TPP或[³H]氟代十一烷基TPP含量。数据是每个时间点两只独立小鼠的平均值±范围。A，肝和肾的[³H]癸基TPP含量；B，心脏、肌肉、脑和白色脂肪组织(脂肪)的[³H]癸基TPP含量；C，所有组织的[³H]氟代十一烷基TPP含量。

图5-[³H]TPMP摄入组织的时程图。小鼠经尾静脉注射100nmol[³H]TPMP大丸药。在所示的时间点，处死小鼠并确定组织中的[³H]TPMP含量。数据是每个时间点两只独立小鼠的平均值±范围。A，肝和肾含量；B，心脏、肌肉、脑和白色脂肪组织(脂肪)含量。

图6-TPP化合物在不同时间点摄入组织的比较。小鼠经iv注射100nmol[³H]MitoQ、[³H]癸基TPP、[³H]氟代十一烷基TPP或[³H]TPMP大丸药，在15分钟(A,B)、1h(C,D)或5h(E，F)的时间点，处死小鼠并确定[³H]TPP化合物的组织含量。数据是每个时间点两只独立小鼠的平均值±范围，A、C和E中是nmol TPP化合物/g湿重组织，B,D和F是nmol TPP化合物/ml血。

图7-TPP化合物的体内线粒体摄入。A,经尾静脉给小鼠注射100nmol[³H]氟代十一烷基TPP大丸药。15分钟后，小鼠经ip注射DNP(200或300μg/kg)或载体盐水，再过15分钟后，处死小鼠并确定组织中的[³H]氟代十一烷基TPP含量。数据是每个条件下两只独立小鼠的平均值±范围。B，显示IAM-TPP被摄入细胞内的线粒体中，并在那里与巯基蛋白反应形成能够通过免疫印迹检测的硫醚加合物。C，IAM-TPP与细胞内线粒体结合的共聚焦图像。C2C12细胞与1μM IAM-TPP温育3h±10μM FCCP。然后将细胞固定，通过用抗TPP部分的抗血清标记来确定TPP部分在细胞内的位置，经免疫荧光共聚焦显微镜可视化。对照试验证实，IAM-TPP结合部位与线粒体特异性染料Mitotracker Orange有共同定位(数据未显示)。D，经尾静脉给小鼠注射500nmol IAM-TPP大丸药。1小时后，处死小鼠，制备肝和心脏线粒体。经SDS-PAGE分离线粒体(40μg蛋白质)，用抗TPP部分的抗血清经免疫印迹检测标记有IAM-TPP的蛋白。用未接触过IAM-TPP的小鼠的线粒体作为对照。在三只独立小鼠上重复试验，结果相似。

图8-靶向线粒体的PET探针18F-氟代十一烷基TPP的合成。

发明各方面的概述

本发明人惊奇地发现，如果通过例如引入疏水部分来提高成像探针的疏水性，会极大提高探针在线粒体中累积的程度，并加强探针从循环系统的清除，产生更大的组织:循环比。

这些因素一起表明本发明的靶向线粒体的疏水性成像探针比目前使用的体内线粒体供能可视成像探针灵敏20-100倍，并且有更好的组织加载和对比性能。

因此，本发明第一方面中提供了包含亲脂阳离子、疏水部分和PET核的成像探针。

所述成像探针可以用于例如正电子发射断层成像术(PET)和/或单光子发射计算机断层成像术(SPECT)中。亲脂阳离子可以是或者包含三苯基磷

(triphenylphosphonium,TPP)。

疏水部分可以是或者包含脂肪链，例如含至少5个碳原子的脂肪链。

疏水部分可以包含线性烷基链，例如线性癸基或十一烷基链。

PET核可以是例如¹⁸F。

所述疏水部分可以作为亲脂阳离子和PET核的连接分子。

本发明第二方面提供了分析受试对象中线粒体膜电位的方法，所述方法包括以下步骤:

(i)将发明第一方面所述的成像探针给予受试对象；

(ii)探针的可视化；和

(iii)推导线粒体膜电位的绝对值或相对值。

通过分析线粒体膜电位，可以例如将肿瘤可视化、研究线粒体损伤、诊断/监测涉及受试对象中线粒体供能改变的病态，或者用于考察测试化合物对线粒体电位的影响。

本发明第三方面提供了发明第一方面的成像探针，其用于

(i)分析线粒体膜电位的方法；

(ii)受试对象体内肿瘤可视化的方法；

(iii)考察受试对象中线粒体损伤的方法；

(iv)诊断和/或监测受试对象体内病理学的方法；或

(v)考察测试化合物对线粒体电位的影响的方法。

发明第四方面提供了包含亲脂阳离子和疏水部分的前体分子，所述前体分子可以与阴离子形式的PET核反应，产生发明第一方面所述的成像探针。

所述前体分子可以包含能够与PET核的阴离子形式反应的甲磺酸根基团。例如，前体分子可以是甲磺酸烷基三苯基磷

化合物，能够与¹⁸F^-反应形成¹⁸F^-氟代烷基TPP。

本发明第五方面提供了制备发明第一方面所述成像探针的方法，所述方法包括将阴离子形式的PET核与发明第四方面所述前体分子反应的步骤。

本发明还提供了制备发明第一方面所述成像探针并将其给予受试对象的方法，所述方法包括以下步骤:

(i)合成PET核的阴离子形式，比如¹⁸F^-

(ii)将所述PET核的阴离子形式引入发明第四方面所述前体分子产生成像探针;

(iii)将成像探针给予受试对象。

本发明还提供了:

(i)提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针摄入的方法，所述方法包括增加成像探针的疏水性的步骤；和(ii)提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针的组织:循环比的方法，所述方法包括增加成像探针的疏水性的步骤。

成像探针的疏水性可以通过例如引入含有至少5个碳原子的烷基链来提高。

发明详述

正电子发射断层成像术(PET)

正电子发射断层成像术(PET)是一种核医学成像技术，其产生体内功能过程的三维图像或照片。系统检测由能够发射正电子的放射性核素(示踪物)间接发射的γ射线对，其中所述放射性核素由生物活性分子引入身体。然后通过计算机分析可以重构出体内的示踪物三维空间浓度图像。在现代扫描仪中，这一重构过程常常借助在同一机器内同一操作过程中对患者进行的CTX射线扫描来实现。

葡萄糖类似物氟-18(F-18)氟去氧葡萄糖(FDG)是临床肿瘤学上给PET广泛使用的生物活性分子。这种示踪剂被利用葡萄糖的细胞摄取，并被己糖激酶磷酸化，然后成像的示踪剂浓度可以给出就局部葡萄糖摄入来说的组织代谢活性。

为了给线粒体和/或线粒体膜电位变化成像，有可能使用亲脂性阳离子，这些亲脂性阳离子由于负的内膜电位(-120到-170mV)会在线粒体中累积。这类亲脂性阳离子包括罗丹明-123(Rh123)和四苯基磷盐。

文中使用的术语“正电子发射断层成像术(PET)探针”或“成像探针”意味着适合在正电子发射断层成像术、SPECT或任何其他成像技术中使用的分子，这些分子可以通过例如注射给予患者，并在目标组织中累积。然后利用PET扫描和成像术、SPECT或另一种类型的成像技术可以推导探针的位置和局部浓度。

靶向线粒体的成像探针选择性地在线粒体中累积，可能是由于线粒体膜的高电位。探针的摄入可能是ΔΨ_m依赖性的，因此探针可以提供关于线粒体供能状态的信息。

本发明的探针所具有的体内分布特性可能一定程度上取决于线粒体的完整性。

本发明的探针可以用于给线粒体表面电位(ΔΨ_m)变动成像、给含有功能障碍的线粒体的细胞或组织成像，以及在与功能障碍线粒体有关的疾病或状况的成像或监测中使用。本发明的成像探针包含亲脂阳离子、疏水部分和PET核。单光子发射计算机断层成像术(SPECT)

单光子发射计算机断层成像术(SPECT)是一种利用γ射线的核医学断层成像技术。它与利用γ照相机的传统核医学平面显像非常类似，但能够提供真正的3D信息。该信息通常是呈现为沿患者的横断面，但根据需要可以自由地重新格式化或操作。

基本的技术需要向患者血流中注射能够发射γ射线的放射性同位素(又称为放射性核素)。这可能涉及将放射性同位素标记物附着到配体上，后者具有所希望的与某些类型的组织的化学结合特性。这种联姻使得配体和放射性同位素的组合(放射性药物)能够被携带到体内的目标部位并与之结合，然后(由于同位素发射的γ射线)可以通过γ照相机看到配体浓度。

亲脂性阳离子

本发明所述探针的亲脂性阳离子部分可以是由于线粒体膜的高电位而在线粒体中累积的任何阳离子。所述阳离子可能带有的离域正电荷促使它ΔΨ_m-依赖性地在线粒体中累积和穿过磷脂双层。

这类阳离子的例子包括罗丹明-123和磷

阳离子、三苯基和四苯基磷衍生物、砷衍生物、带有疏水基团的季铵(例如四苄基铵)，和带有离域正电荷与罗丹明相似的疏水性芳香族系统。

几种标记的磷

阳离子，比如[¹¹C]甲基三苯基磷

²²3-[¹⁸F]氟丙基和4-[¹⁸F]氟苄三芳基磷

(fluorobenzyltriarylphosphonium)曾被用做线粒体靶向剂。

亲脂性阳离子可以是三苯基磷

当它与疏水部分(见下文)连接时产生亲脂性烷基三苯基磷阳离子。

疏水部分

疏水部分与阳离子通过例如共价键相连时，会提高阳离子的整体疏水性。包含疏水部分的成像探针的辛醇/PBS分配系数是至少50、100、250、500、750或1000。甲基TPP和癸基TPP的分配系数分别是0.35和5000，其中数字越大反映出疏水性越高。氟代十一烷基的数值是740。

疏水部分可以是例如脂肪链。所述脂肪链可能包含至少2个碳原子，例如5-20、8-15或10-12个碳原子。脂肪链可能含有10或11个碳原子。

疏水部分可以包含烷基链，可以基本或者完全是线性烷基链，或者包含某些支链。链可以包含位于内部和/或末端的一或多个杂原子(例如O、S、N、P)。此外疏水部分可以含有不饱和的(烯基、炔基、芳香基、杂芳基)成分和/或可能含有插入的一或多个芳香环。

疏水部分可以与亲脂阳离子共价连接。当亲脂性阳离子是三苯基磷

(TPP)时，疏水部分可能象图1中显示的与中间的磷离子连接。

不希望被理论限制，本申请人相信与包含疏水部分的成像探针相关的增加的摄入是由于探针能更迅速地穿透细胞质膜，以及疏水部分对线粒体内膜中面向基质的表面的吸附增加。

PET核

可以在本发明的探针中使用的非放射性元素和它们的相对物包括:F-19(F-18)、C-12(C-11)、I-127(I-125、I-124、I-131和I-123)、CI-36(CI-32、CI-33、CI-34)、Br-80(Br-74、Br-75、Br-76、Br-77、Br-78)、Re-185/187(Re-186、Re-188)、Y-89(Y-90、Y-86)、Lu-177和Sm-153。

替代地，本发明的探针可以标记有一或多个放射性同位素，比如¹¹C、¹⁸F、⁷⁶Br、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、¹³N或¹⁵O。

PET扫描中使用的放射性核素一般是半衰期较短的同位素，比如碳-11(~20分钟)、氮-13(~10分钟)、氧-15(~2分钟)和氟-18(~110分钟)。

PET核可以包含¹⁸F。

术语“PET核”是指可以在PET、SPECT或其他成像过程中使用的非放射性元素或放射性核素。

PET核可以附着到，例如共价连接到亲脂性阳离子和/或疏水部分上。例如疏水部分可以作为亲脂性阳离子和PET核之间的连接物。

探针可以是¹⁸F-氟代十一烷基TPP。

使用方法

本发明还提供了分析受试对象体内线粒体膜电位的方法，所述方法包括以下步骤:

(i)将本发明所述的成像探针给予受试对象；

(ii)探针的可视化；和

(iii)推导线粒体膜电位。

用于检测和监控成像剂的成像装置包括诸如γ照相机、PET装置和SPECT装置的成像技术。

线粒体膜电位的分析可以用于例如诊断和/或监测与受试对象体内线粒体供能改变有关的病态。

线粒体膜电位的分析可以用于例如肿瘤可视化的方法或者考察受试对象体内线粒体损伤的方法。

探针可以通过本领域已知的任何合适的技术给予，比如直接注射。注射可以是静脉注射(IV)。给药可以是全身的或者在目标部位局部，比如肿瘤。

探针可以与例如能够显现特定组织或肿瘤的另一种探针联用。两种(或更多种)探针可以一起给予，独立给予或者顺序给予。

本发明的成像探针可以用于诊断、评估或监测疾病或状况的进展或治疗情况。

本发明的成像探针可以用于研究测试化合物对线粒体供能的影响。例如，可以将成像探针与测试化合物一起给药，并利用本发明的方法体内实时分析测试化合物对线粒体供能的效果。

疾病

所述疾病或状况可以以线粒体供能的改变为特征。例如，线粒体供能的改变(更高或更低的线粒体膜电位)可以是疾病的一个症状，或者是疾病的诱因或者诱因之一。

致病性线粒体供能状态在治疗后的完全或部分逆转可指示治疗效果。

线粒体的氧化损伤促成多种病态，因为线粒体是活性氧的来源而且容易受到氧化损伤。

多种疾病和状况与线粒体功能障碍有关，包括各种癌症、糖尿病、心脏衰竭、心血管和肝脏疾病、AIDS、退行性疾病、自身免疫紊乱、衰老和其他肌病。

本发明提供了能够被线粒体摄取的探针，并且所述摄取与ΔΨ_m成比例。这使得能够对功能异常的线粒体(例如活性受到抑制或者加强的线粒体)进行检测和成像。肿瘤往往有更高的线粒体膜电位，而组织损伤区域可能有较低的ΔΨ_m。

状况和/或其治疗可能通过增加或减少的细胞凋亡来表征，而细胞凋亡即可利用本发明的成像探针进行监测。线粒体膜电位的丧失是由促凋亡剂引起的细胞死亡中的一个早期事件。线粒体控制的细胞凋亡被认为是心脏衰竭中细胞损伤的内在原因。

发明的成像方法还可以用于对延缓或破坏癌症和其他恶性肿瘤中使用的化疗或放疗方案的效果进行评估。

本发明的成像方法可以用于癌症的诊断或评估，例如肺癌、乳腺癌或前列腺癌。

已有证据显示癌细胞中的线粒体跨膜电位比正常上皮细胞中的明显高。例如，CX-1结肠癌细胞系和对照绿猴上皮细胞系CV-1之间的ΔΨm差别约为60mV(在肿瘤细胞中的163mV vs.正常细胞中的104mV)。

受试对象

受试对象可以是人或动物受试对象。受试对象可以是健康受试对象，或者是患有某疾病或者有染上某疾病风险的受试对象。

具体来说，受试对象可能患有或者有染上前面章节提及的疾病或状况之一的风险。

受试对象可能正接受针对所述疾病的治疗。本发明的成像探针可以用于考察与疾病或状况的进展或缓解有关的线粒体供能的改变。

受试对象可以是实验动物，特别是以上章节提及的疾病或状况之一的动物模型。

探针合成

PET核，例如¹⁸F，可以被引入成像探针的前体形式，所述前体形式能够接受或者经调适接受PET核。

例如，可以通过本领域已知方法在回旋加速器中合成¹⁸F。合成后，¹⁸F通常处于F-形式，考虑到它110分钟的半衰期，需要迅速并入成像探针、纯化和给予受试对象。

本发明还提供了经调适能够接受PET核的前体分子。例如本发明提供了包含亲脂阳离子和疏水部分的前体分子，能够与PET核的阴离子形式反应产生本发明所述的成像探针。

前体分子可以例如包含容易发生亲核取代的离去基团。例如，前体分子可能包含能够与PET核阴离子形式反应的甲磺酸、甲苯磺酸、间硝基苯磺酸、三氟甲磺酸或碘基团。

前体可以是能够与¹⁸F^-反应形成¹⁸F^-氟代烷基TPP的甲磺酸烷基三苯基磷化合物。图8显示了甲磺酸十一烷基TPP前体与¹⁸F^-p反应形成¹⁸F-十一烷基TPP的反应。

本发明还提供了制备成像探针的方法，所述方法包括将PET核的阴离子形式与这类前体分子反应的步骤。这提供了生产成像探针的方便的一步完成法。

本发明还提供了生成发明所述成像探针并给予受试对象的方法，所述方法包括以下步骤:

(i)在例如回旋加速器中合成¹⁸F^-；

(ii)将¹⁸F^-并入前体分子产生成像探针；

(iii)任选地纯化成像探针；和

(iv)将任选纯化过的成像探针给予受试对象。

探针应当在合成后尽可能早地给予受试对象。

提高摄入和从循环系统的清除

本发明人发现在靶向线粒体的成像探针中包含一个疏水部分可以提高它被摄入组织中以及从循环系统清除的程度。摄入量相对背景循环更高导致更高的组织/循环比。这极大地增加了这些探针在检测和显现体内线粒体供能改变中的灵敏度。

本发明因此提供了提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针摄入量的方法，所述方法包括增加成像探针的疏水性的步骤。

与缺少疏水部分的相应化合物的摄入情况相比，摄入的速率和/或含量可以提高5-50、10-40或者20-30倍。

特别是某些组织，比如肾、肌肉、心脏和脂肪中的摄入会提高。

摄入的差别可以在例如给药后1小时到5小时后测量。

本发明还提供了提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针的组织:循环比的方法，所述方法包括增加成像探针的疏水性的步骤。

组织:循环比可以通过将组织(例如肾、肝、肌肉或心脏)中的化合物浓度和循环系统(例如血液)中的化合物浓度进行比较来获得。

成像探针从循环系统的清除与缺少疏水部分的相应成像探针比较提高了5-50、10-40或20-30倍。与缺少疏水部分的相应化合物相比，组织/循环比要高至少50-、80-或100-倍。

含有疏水部分的成像探针的例子是¹⁸F-氟代十一烷基TPP，相应的缺少疏水部分的成像探针是¹⁸F-TPP或¹⁸F-TPMP。由于PET核不可能影响探针的摄入或清除，PET可以与缺少疏水部分和PET核(例如TPP或TPMP)的相应分子比较。

因此，通过引入三苯基磷

亲脂阳离子或者增加其烷基侧链的长度(比如具有至少5个，例如8-15个碳原子)可以提高疏水性。疏水性还可以通过给三苯基磷

部分上的烷基基团添加侧链、在链中加入芳香基团以及给苯环添加侧基来提高。

以下通过实施例对发明做进一步描述，所述实施例是为了协助本领域普通技术人员实施发明，并非限制发明的范围。

实施例

实施例1–考察iv(静脉内)注射后，靶向线粒体的烷基TPP化合物的器 官分布动力学

为了确定烷基TPP化合物在体内分布的速度有多快，iv注射后首先评估靶向线粒体的抗氧化剂MitoQ的摄入(图2)。为此，将100nmol[³H]MitoQ大丸药经尾静脉注射给予小鼠，并测量接下来的48小时内各个器官中的[³H]MitoQ的量(图2)。注射1小时后测量到肝和肾有大量MitoQ摄入(图2A)。此时，心脏的摄入没有如此大量，肌肉和脂肪组织摄入更低，脑只有非常少的摄入(图2B)。MitoQ的这种迅速被器官摄取的情况通过它很快从血液中消失可以反映出来(图3A)。然后组织中累积的[³H]MitoQ逐渐消失，对于肝脏半衰期为~2小时，肾~4小时，心脏~15小时。48小时内被给予的放射性就几乎完全从这些组织中清除，这与其他研究中发现的iv注射后24小时~80%MitoQ被清除的情况一致。为了评估[³H]MitoQ到组织的最初摄入情况，重点研究了注射后第一个小时内它的组织分布(图2C和D)。这显示了MitoQ非常迅速地被摄入组织，在注射后能够测量到的最早时间(5分钟)达到最大值。这些数据共同显示MitoQ被迅速从血液中摄入多数器官，但不同器官摄取的程度有显著差异。

为了了解MitoQ从循环系统迅速摄入器官是否是所有烷基TPP阳离子的一般特性，还是MitoQ所特有的，接下来评估了三种烷基TPP阳离子,即[³H]癸基TPP、[³H]氟代十一烷基TPP和[³H]TPMP，在iv注射后的器官分布。这些化合物的疏水性涵盖从比较亲水的[³H]TPMP(辛醇/PBS分配系数0.35)到疏水的[³H]癸基TPP和[³H]氟代十一烷基TPP(辛醇/PBS分配系数分别为5000和740±100)。48小时内[³H]癸基TPP的组织分布如图4A和B所示，[³H]氟代十一烷基TPP在5小时内的如图4C所示。它们的摄入特性与MitoQ类似，两种化合物都是迅速被摄入肝、肾和心脏，然后从肝和肾中消失，半衰期~3小时。与MitoQ一样，从心脏的消失稍慢，对[³H]癸基TPP和[³H]氟代十一烷基TPP的半衰期分别为~15小时和~21小时。[³H]癸基TPP和[³H]氟代十一烷基TPP从血液的清除(图3B)与[³H]MitoQ(图3A)在性质上类似，但它们的血液浓度更低。测量了iv注射后5小时内[³H]TPMP的器官分布(图5A、B)。[³H]TPMP的分布与MitoQ、癸基TPP和氟代十一烷基TPP的在性质上类似，迅速被摄入肝、心脏、肾和脂肪。但TPMP摄入的程度比MitoQ、癸基TPP和氟代十一烷基TPP普遍要低，除了脑。[³H]TPMP从肝和肾清除的半衰期分别是~3小时和~2小时，与其他TPP化合物类似。但是，TPMP从心脏清除的半衰期是~2h，比其他烷基TPP化合物的显著更短。[³H]TPMP从血液的清除与更疏水的烷基TPP化合物性质类似，但血液中剩余的[³H]TPMP浓度更高一些(图3C)。比较[³H]TPMP和其他烷基TPP化合物从其余组织的清除半衰期从技术上很困难，因为被摄取的化合物的量低，但对于脂肪和肌肉，TPMP的清除半衰期估计在~1-2小时，而癸基TPP和氟代十一烷基TPP的是显著更长的~7-12小时。这些试验一起展示了所有烷基TPP化合物被广泛迅速地从血液中摄入器官。

实施例2-烷基TPP化合物随时间摄入器官程度的比较

图2、4和5中的数据显示，接受评估的四种TPP化合物的器官分布性质类似。但是，化合物摄入不同器官的程度存在显著的量的差别。为了评估这些差别，我们制作了iv注射后15分钟、1小时和5小时四种TPP化合物的组织含量(图6A、C、E)。因为被摄入肌肉、脂肪和脑的量比其他器官的低，这些数据在每个小图中呈现为放大的插入项。这项分析显示对于肾、心脏和肌肉，摄入程度的顺序是癸基TPP、氟代十一烷基TPP>MitoQ>TPMP，并且差别在注射后1-5小时最明显。这些差别的幅度很大，例如注射后1小时癸基TPP、MitoQ和TPMP摄入心脏的比率是17:6:1，到5小时，该比率是32:10:1。MitoQ、癸基TPP和氟代十一烷基TPP的器官分布与摄入有类似顺序：肾>肝>心脏>肌肉,脂肪>脑。TPMP的器官分布与其他三种更疏水的化合物的器官分布大体类似，不同的是，该化合物的肝摄入比肾摄入更高，而且更多地被摄入脑。

烷基TPP化合物由于细胞质和线粒体膜电位而累积到组织中，如Nernst等式所述。因此，化合物在组织的线粒体中的浓度由线粒体和细胞质膜电位以及循环系统中化合物的浓度决定。因为对于本文报道的所有试验这些膜电位都是类似的，化合物摄入组织的程度的主要决定因素是它在血液中的浓度。为了修正这个因素造成的器官摄入的偏差，我们还测定了化合物在器官中的浓度与它在循环系统中的浓度的比率，这些数据显示的是在iv注射后15分钟、1小时和5小时当时的情况(图6B、D和F)。这些数据验证了图6A、C和E的发现，证实摄入程度的顺序是癸基TPP、氟代十一烷基TPP>MitoQ>TPMP。例如，对于癸基TPP、MitoQ和TPMP，注射后1小时的心/血比率是109:11:1，到5小时该比率是248:26:1。一个例外是虽然MitoQ和TPMP的肝/血比率类似，但癸基TPP和氟代十一烷基TPP的明显更高。此外，所有四种化合物的脑/血比率差别很小，说明图6A、C和E中看到的TPMP的明显更高的摄入可能是由于它存在于被截留的血液中，而不是在脑本身中。图6中的数据共同表明所有四种化合物的器官分布性质上类似。癸基TPP和氟代十一烷基TPP的摄取程度显著高于MitoQ，而MitoQ的摄入又比TPMP保持大得多的程度。

实施例3-烷基TPP化合物的体内线粒体摄入

实施例1和2的结果显示烷基TPP化合物在体内被迅速摄入器官。TPP化合物被摄取到线粒体和细胞中经证实是由于线粒体和细胞质膜电位所致，其中累积的化合物多数位于线粒体内。因此有可能烷基TPP化合物一旦在组织中累积，受膜电位驱使，它们会主要定位在线粒体内。为了验证试验中确实是这种情况，接下来确定通过降低线粒体膜电位是否能减少烷基TPP化合物的体内摄取。为了这个目的，将[³H]氟代十一烷基TPP经iv注射给小鼠，15分钟后再给小鼠注射不同剂量的线粒体解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)或者载体盐水(saline carrier)，再过15分钟测量器官累积[³H]氟代十一烷基TPP的程度(图7A)。所用的DNP的量被证实能够导致体内线粒体的部分解偶联而没有毒性。我们的试验显示，DNP以剂量依赖的方式将器官对[³H]氟代十一烷基TPP的摄入降低最多达40%(图7A)。这些发现与体内器官中烷基TPP化合物的摄取程度由线粒体膜电位决定是一致的。

要直接展示烷基TPP化合物在体内线粒体中的定位在技术上有困难，因为线粒体分离所需的组织匀浆会使它们迅速地重新分布。以前为了克服这个问题，曾使用修饰过的烷基TPP化合物4-碘丁基TPP(IBTP)和10-碘癸基TPP(IDTP)。这些化合物和其他烷基TPP化合物以相同的方式累积在线粒体中，但一旦进入线粒体基质，碘部分即被线粒体巯基蛋白代替形成稳定的硫醚加合物，后者可以利用抗TPP部分的抗体来显现。因为IBTP和IDTP与蛋白巯基的反应速率较低，将该法延伸到制备与更具巯基活性的碘代乙酰胺(IAM)部分附着的TPP化合物(IAM-TPP;图7B)。其意图是，该分子应当被线粒体累积，并在这里标记线粒体巯基蛋白，有了IAM部分的增强的巯基活性，有利于IAM-TPP在被从器官清除前，在体内与线粒体蛋白巯基进行反应(图7B)。在与分离的线粒体温育时，IAM-TPP迅速与蛋白巯基反应，可以利用抗TPP抗体检测，如先前针对IBTP所示(数据未显示)。IAM-TPP与细胞的温育及随后通过免疫细胞化学进行的分析显示解偶联剂敏感型IAM-TPP定位在线粒体内(图7C)，证实IAM-TPP使线粒体蛋白被标记。然后经iv注射给予小鼠大剂量IAM-TPP，并在1小时后从心脏和肝分离线粒体。利用针对TPP部分的选择性抗血清对这些线粒体组分进行的Western印迹显示了IAM-TPP对心脏和肝线粒体蛋白的标记(图7D)。这些数据综合表明，iv注射后，烷基TPP化合物受到线粒体膜电位的驱使迅速被组织内的线粒体摄取。

因此，烷基TPP化合物已被证实在iv给药后5分钟内被体内多种器官积累，从而给组织提供治疗有效量的化合物。这种组织摄取是由于化合物以膜电位依赖性方式累积到线粒体中。

该项研究中的有趣发现是，癸基TPP和氟代十一烷基TPP化合物相比于TPMP而言被摄入组织的量大得多。这是由于线粒体内膜的面向基质表面对更长链的烷基TPP阳离子有更大的吸收。重要的是，通过改变侧链可以大大地(10-30倍)加强TPP阳离子的摄入程度。

除了提高烷基TPP化合物在器官内的绝对水平，将烷基侧链修饰为氟代十一烷基或癸基部分能大大提高烷基TPP化合物的器官/血液浓度比率，比TPMP提高100倍以上。这一特性对于为了评估与癌症和细胞死亡相关的线粒体极性变化而设计更有效的用于评估线粒体体内功能的PET探针是有用的。这里给出的数据表明，与TPMP类似，基于长链、疏水性烷基TPP阳离子的PET探针比目前开发作为PET探针的烷基TPP阳离子有明显更好的组织加载和反差特性(contrast properties)。这方面来说，由氟代十一烷基TPP获得的数据特别有趣，因为¹⁹F原子可以容易地被PET-活性¹⁸F替代，且氟代十一烷基TPP的摄入对体内线粒体极化的不同程度产生应答。

实施例4–用18F-十一烷基TPP在动物模型中显现肿瘤和线粒体损伤

使用了其中移植有各种大小肿瘤的免疫缺陷型小鼠模型。然后将18F-十一烷基TPP给予小鼠，利用PET显现肿瘤。

还使用了心脏或肾缺血再灌注模型来显示，18F-十一烷基TPP可以用于显现组织内有可视的损伤的线粒体。

最后，利用血脑屏障损伤模型研究了本发明的探针在所述损伤后是否被脑摄取，从而指示血脑屏障是否受到损害。

材料与方法

化学合成

碘化[³H]TPMP(60Ci/mmol)来自American Radiolabeled Chemicals。合成[³H]MitoQ和[³H]癸基TPP制品并HPLC纯化至>97%放射性纯度。为了合成甲磺酸11-氟十一烷基三苯基磷

(氟代十一烷基TPP)，将11-溴十一醇(752.1mg，2.99mmol)、氟化四丁基铵(2.34g 7.21mmol)和H₂O(162μL)的混合物置于Kimax管(15mm x 150mm)中。氩气吹洗下用螺旋盖密封，80°C搅拌1小时。允许反应稍微冷却，萃取至戊烷(25mL)中。有机层用H₂O(30mL)洗三次，用MgSO₄干燥，过滤并在真空中浓缩，产生浅棕色油状的含有~7%由-CH₂F(4.5)vs=CH₂(4.9-5)共振态的¹H NMR积分(integration)的11-氟十一-1-烯(fluoroundec-1-ene)的11-氟-1-十一醇(416mg，2.19mmol，73%)。¹HNMR 4.46(2H,d,t J=47.3,6.2Hz,-CH₂F),3.66(2H,t,J=6.2Hz,-CH₂OH),1.2-1.8(18H,m)ppm。¹⁹F NMR-218.5(t,t J=47.5,24.6Hz)ppm。将粗制11-氟-1-十一醇(333mg,1.75mmol)、三乙胺(351mg,3.47mmol,484μL,2equiv.)溶于无水CH₂Cl₂(10mL)的溶液于~10°C搅拌10分钟。然后在保持温度<10°C情况下，加入溶于无水CH₂Cl₂(1mL)中的甲基磺酰氯(230mg,2.02mmol,156μL)溶液。加毕后，允许反应物暖至RT并搅拌2小时。通过用CH₂Cl₂(25mL)稀释来逐渐完成反应，用H₂O(12.5mL)、1%NaHCO₃水溶液(12.5mL)、饱和NaCl水溶液(12.5mL)洗涤有机层，用MgSO₄干燥，过滤并真空中浓缩产生浅棕色油状物(444mg)。粗产物经柱层析纯化，柱子是用5%醚/石油醚在硅胶60A 40-63μm (20g)上制备。用20%醚/石油醚洗脱纯产品，真空浓缩得到透明油状11-氟十一烷基甲磺酸酯(279.5mg 59%)。¹HNMR 4.43(2H,d,t J=47.4,6.2Hz,-CH₂F)、4.22(2H,t,J=6.6Hz,-CH₂O)、3.00(3H,s,CH₃SO₂)、1.6-1.8(4H,m)、1.2-1.4(14H,m)ppm。¹⁹F NMR-218.4(t,tJ=47.4,24.9Hz)ppm。质谱发现:291.1406。C₁₂H₂₅FO₃S₂Na需要:291.1401。将纯化的11-氟十一烷基甲磺酸酯(279.5mg,1.041mmol)和三苯基膦(582mg,2.21mmol)合并到带有磁力搅拌条的10mm x 100mm Kimax管中，氩气吹洗并用螺旋盖密封。给反应加热，并于90°C搅拌4天。然后将反应产物溶解在最小量的CH₂Cl₂中，真空中浓缩产生粗油(0.842g)。粗产品再次溶于最小量的CH₂Cl₂(~1mL)中，用醚(~50mL)沉淀之。冰浴中静置沉淀物，弃去透明液体。重复该溶解/沉淀过程，产生微浊粘性油状的11-氟十一烷基三苯基磷

甲磺酸(407.1mg 74%)。¹H NMR:7.69-7.81(15H,m),4.41(2H,d,tJ=47.4,6.2Hz,-CH₂F),3.6(2H,m,-CH₂P),2.73(3H,s,CH₃SO₂),1.5-1.8(6H,m),1.2-1.4(12H,m)ppm。³¹P NMR:24.78ppm。¹⁹F NMR:-218.4(t,t J=47.4,24.9Hz)ppm。MS发现:435.2627,C₂₉H₃₇FP⁺需要:435.261。

为了合成甲磺酸[³H]氟代十一烷基TPP（[³H]FluoroUndecylTPPmesylate），将11-氟十一烷基甲磺酸盐(6.8mg,25.3μmol)和[³H]三苯基膦(3.2mg,12.2μmol,372μCi)合并到带有磁力搅拌条的500μL微量反应管中，氩气吹洗并用螺旋盖密封。将反应加热并于90°C搅拌4天。然后将反应产物溶解在CH₂Cl₂(40μL)中，并加至带盖离心管内的二乙醚(2mL)中。悬浮物以~160×g离心10分钟，弃去溶剂。将残留物溶于加至乙醚(2mL)的CH₂Cl₂(40μL)中，进行如上所述离心。弃去溶剂得到油状产物(196μCi)。在1:9甲醇/CH₂Cl₂中的硅胶上进行的TLC显示99%的放射活性位于R_f 0.2-0.5之间。

为了合成甲磺酸[5-(2-碘-乙酰氨基-戊基]-三苯基磷(IAM-TPP)，将0°C的溴化5-氨基戊基三苯基磷

（5-aminopentyltriphenylphosphoniumbromide hydrogen bromide）(0.050g,0.098mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液加入三乙胺(15mL,0.108mmol)，溶液搅拌5分钟。将溶液冷却至-78°C(丙酮/干冰)，一次加入固体碘乙酸p-硝基苯酯(0.030g,0.098mmol)。将溶液搅拌20分钟，在-78°C真空除去溶剂。将残余物溶于丙酮(3mL)，然后加入碘化钠(100mg)，室温下搅拌溶液2小时。然后真空下除去溶剂，所得固体物重新溶解在CH₂Cl₂(5mL)中，用蒸馏水和10%甲磺酸钠水溶液顺序洗涤。真空下将有机组分的体积减小(1mL)并加到二乙醚(20mL)中使之沉淀。将该溶解/沉淀过程重复两次，以除去所有残余的p-硝基苯酚。将最终的固体物溶解在水中，冻干产生黄色大体积固体0.0465g(78%)。质谱(高分辨率+ve)–发现516.0938,C₂₅H₂₈INOP⁺需要516.0948。¹H NMR(CD₃OD)1.5-1.8(m,6H),2.69(s,3H),3.16(m,2H),3.39-3.50(m,2H),3.67(s,2H),7.70-7.95(m,15H)ppm。¹³C NMR(CD₃OD)-1.8,22.7(d,J=49Hz),23.1(d,J=2Hz),28.5(d,J=17Hz),29.2,39.5,40.1,119.9(d,J=87Hz),131.5(d,J=13Hz),134.8(d,J=10Hz),136.3(d,J=3Hz),171.4ppm。³¹P NMR(CD₃OD)–24.8ppm。

已发表的辛-1-醇的分配系数是:TPMP,0.35；MitoQ,2760；癸基TPP,5000。本项研究中确认氟代十一烷基TPP(740±100)和IAM-TPP(19±1)的辛-1-醇分配系数与前述相同。

将化合物给予小鼠

雌性C57/BL6小鼠(20-25g)培养在12小时的光/暗周期下，可随意摄取标准实验室食物和水。至8-10周龄时，将小鼠置于约束管中，经尾静脉iv注射溶于补充有10%DMSO的100μL无菌磷酸缓冲液(PBS)中的100nmol[³H]化合物(~400-500nCi)。保留一份注射用的[³H]化合物溶液样品以便计算比活，然后用于确定化合物的组织含量。在注射后的指定时间点，通过颈椎脱位处死小鼠，经心脏穿刺获得~100-200μL血样。然后取出器官，除净血液，转移到冰上预冷过的Eppendorf管中，称量并保存在-80°C待处理。采集的组织是：心脏、肾、肝、脑、骨骼肌(腓肠肌)和白色脂肪组织(皮下的)。注射这种用量的MitoQ和其他TPP阳离子在以前显示是无毒的，在这里也是。注射后对小鼠进行监测以保证无发病或痛苦，所有程序按照University ofOtago动物伦理学委员会的批准进行。

从组织提取[ ³ H]化合物

将组织在室温下解冻，转移到50mL Falcon管中。向组织中加入冰冷甲醇(~4°C;1mL/100mg组织湿重)，用Ultraturrax匀浆仪将组织匀浆(冰上2x30秒)。将组织匀浆按每批1ml的量转移到1.5mL Eppendorf管中，离心(4°C，10,000x g，8分钟)。将甲醇提取物倒入20ml玻璃闪烁管(Wheaton)，使甲醇在N₂流环境中挥发。向组织匀浆沉淀物中再加入冰冷的甲醇(1mL/100mg)，涡旋1分钟，如上所述离心，甲醇提取物倒入新鲜20mL玻璃闪烁管并挥发。将该过程再重复3次得到每个组织样品的5份提取物。第五份提取物中的放射性往往可以忽略不计。每个管中加入闪烁体(OptiPhase HiSafe II;10mL)，在闪烁计数仪(LKB Wallac 1217Rackbeta)中使用合适的淬灭校正测量³H DPM含量，并计算每个样品的放射性总量。然后利用注射的[³H]化合物的比活将组织摄取含量计算为mol化合物/g湿重组织。由[³H]化合物从器官消失的一级速率常数(测量为iv注射后前5小时，ln[TPP化合物]对时间的斜率)确定化合物在器官中的半衰期。对于肝、肾和心脏，因为累积了大量放射性，该过程很稳定。但其他器官累积的较少量放射性使得评估变化性更大，因此对于那些器官只能提供一个估计。

IAM-TPP线粒体摄取的分析

为了评估体内线粒体对IAM-TPP的摄取，小鼠如上所述经尾静脉iv注射溶于100μL无菌PBS的500nmol IAM-TPP。1小时后，经颈椎脱位处死小鼠，通过匀浆和随后的分级离心制备肝和心脏线粒体，用牛血清清蛋白作为标准品经二辛可宁酸法确定蛋白含量。通过在12.5%丙烯酰胺胶上进行还原性SDS-聚丙烯酰胺电泳，将线粒体蛋白(40μg)分开，转移到硝酸纤维素膜，用抗TPP部分的兔抗血清来检测TPP结合蛋白，随后用偶联了马辣根过氧化物酶的抗兔IgG的第二抗体通过增强的化学发光进行监测。为了评估细胞内的线粒体对IAM-TPP的摄取情况，在补充了10%(v/v)胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM中，将C2C12小鼠成肌细胞系(European Collection of Animal Cell Cultures)在6孔培养板中的22mm玻璃盖玻片上生长至半铺满。然后将这些细胞与不含FCS/X%FCS的DMEM，以及1μM IAM-TPP±10μM FCCP一起温育3小时。在一些温育中，于温育的最后30分钟加入100nM MitoTracker Orange(Molecular Probes)。温育结束时，用甲醛固定细胞，处理后，进行免疫细胞化学和共聚焦显微镜研究。用抗TPP部分的兔抗血清联合偶联了Oregon Green的二抗抗兔IgG(Molecular Probes)使细胞内的TPP显现。用共聚焦显微镜获取图像。

以上说明书提及的所有出版物均通过引用并入本文。发明中描述过的方法和系统的各种改动和变化对本领域技术人员是显而易见的，不需脱离发明的范围和精神。虽然是结合具体优选实施方案对发明进行的描述，可以理解不应将要求保护的发明局限于这些具体实施方案。的确，对线粒体生物学、放射学或相关领域的技术人员来说显而易见的发明实施模式的各种改动也包含在以下权利要求的范围内。

Claims (21)

1.成像探针，其包含亲脂阳离子、疏水部分和PET核。

2.权利要求1的成像探针，其中所述亲脂阳离子是或者包含三苯基磷

(TPP)。

3.权利要求1或2的成像探针，其中所述疏水部分包含含有至少5个碳原子的脂肪链。

4.权利要求3的成像探针，其中所述疏水部分包含含有8-15个碳原子的脂肪链。

5.权利要求4的成像探针，其中所述疏水部分包含线性烷基链。

6.前述权利要求任一项的成像探针，其中所述疏水部分作为亲脂阳离子和PET核之间的连接物。

7.前述权利要求任一项的成像探针，其中所述PET核选自下组:¹¹C、¹⁸F、⁷⁶Br、¹²³I、¹²⁴I、¹³¹I、¹³N或¹⁵O。

8.分析受试对象中的线粒体膜电位的方法，包括以下步骤:

(i)将前述权利要求任一项的成像探针给予受试对象；

(ii)探针的可视化；和

(iii)推导线粒体膜电位。

9.使受试对象体内肿瘤可视化的方法，包括用权利要求8的方法分析线粒体膜电位的步骤。

10.考察受试对象中线粒体损伤的方法，包括用权利要求8的方法分析线粒体膜电位的步骤。

11.诊断和/或监测与线粒体供能改变有关的病态的方法，包括用权利要求8的方法分析线粒体膜电位的步骤。

12.研究测试化合物对线粒体电位的影响的方法，包括将测试化合物给予受试对象和用权利要求8的方法分析线粒体膜电位的变化的步骤。

13.权利要求1-7中任一项的成像探针，其用于

(i)权利要求8所述的分析线粒体膜电位的方法；

(ii)权利要求9所述的使肿瘤可视化的方法；

(iii)权利要求10所述的考察受试对象中线粒体损伤的方法；

(iv)权利要求11所述的诊断和/或检测与线粒体供能改变有关的病态的方法；或者

(v)权利要求12所述的研究测试化合物对线粒体电位的影响的方法。

14.前体分子，其包含亲脂阳离子和疏水部分，该前体分子能够与PET核的阴离子形式反应生成权利要求1-7中任一项的成像探针。

15.权利要求14的前体分子，其包含与PET核的阴离子形式反应的甲磺酸根。

16.权利要求14的前体分子，其是甲磺酸烷基三苯基磷

化合物，能够与¹⁸F^-形成¹⁸F^-氟代烷基TPP。

17.制备权利要求1-7中任一项的成像探针的方法，包括将PET核的阴离子形式与权利要求14-16中任一项的前体分子反应的步骤。

18.制备和给予权利要求1-7任一项的成像探针的方法，包括以下步骤:

(i)合成¹⁸F^-

(ii)将¹⁸F^-引入权利要求14-16任一项的前体分子以产生成像探针；

(ii)将所述成像探针给予受试对象。

19.提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针的摄入的方法，包括增加成像探针的疏水性的步骤。

20.提高包含三苯基磷

(TPP)阳离子的成像探针的组织:循环比的方法，包括增加成像探针的疏水性的步骤。

21.权利要求13或14的方法，其中通过引入具有至少5个碳原子的烷基链来增加成像探针的疏水性。

Images