CN103063500B - 悬浮细胞染色装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种悬浮细胞染色装置，该装置由套管(1)、推杆(2)、柱塞密封垫(3)、截留膜(4)组成，柱塞密封垫(3)位于套管(1)腔内中上部，截留膜(4)位于套管(1)腔内下部，套管(1)的管壁上设置有膜上开口(5)和膜下开口(6)。本装置用于对悬浮细胞染色，可以有效克服现有细胞染色方法失败率高，准确性和重复性差、耗时长等不足，具有成功率高、准确性和重复性好、耗时短等优点。

Description

悬浮细胞染色装置

技术领域

本发明属于免疫学技术和生物学技术领域，涉及细胞染色技术，具体涉及悬浮细胞染色装置。

背景技术

细胞学检测为细胞生物学最常用技术。悬浮细胞免疫学染色检测方法一直使用离心技术洗涤细胞。其步骤为：获得单个悬浮细胞；固定细胞或不固定细胞；加入抗体(或其它可与细胞标志物结合的物质)；离心方式洗去未结合的抗体；加入显色物质；离心方式洗去显色物质；检测染色情况。根据加入的抗体或者抗抗体等等各种检测方式方法，基本为重复上述操作步骤，完成细胞免疫染色，最终检测细胞标志物。

常规方法检测细胞对于细胞膜标志物的检测尚勉强可实施，但是，检测细胞浆，细胞核等细胞内标志物时候非常困难。因为检测需要打开细胞膜。细胞膜被打通后，细胞渗透压改变，导致细胞难以通过离心方式回收。细胞染色后洗涤未结合的抗体时，由于细胞渗透压改变，离心后细胞不能被紧密的压缩在试管底部，移去上清时候细胞同时被移去。大多数情况是完成细胞染色步骤后大部分细胞丢失，实验结果不准确或者难以完成实验。因此，以往基于离心方式的悬浮细胞免疫染色操作非常困难。费时费力且结果难以保障。细胞标志检测越来越广泛地进入应用。细胞染色方法的操作困难严重阻碍了流式细胞仪等细胞检测设备的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种悬浮细胞染色装置，以克服当前细胞学检测免疫反应使用离心方式洗涤细胞方法的缺陷，使得悬浮细胞免疫反应能够快速操作完成，该装置使悬浮细胞免疫反应可以实施并具有检测准确性高、重复性好、客观性强、操作方便快速特点。

实现本发明的具体方案是：

本发明提供的这种悬浮细胞染色装置，由套管1、推杆2、柱塞密封垫3、截留膜4组成，套管1为中空圆管状结构，柱塞密封垫3为圆形片状结构，其位于套管1腔内中上部，柱塞密封垫3的外周与套管1的管腔内壁呈可滑动的密封配合，推杆2为长杆状结构，其前端与柱塞密封垫3的上部相连接，与柱塞密封垫3成为一体，截留膜4位于套管1腔内下部，将套管1的内腔分为膜上腔和膜下腔两部分，在截留膜4上方的套管1的管壁上靠近截留膜4处设置有供注入和排出溶液用的膜上开口5，在截留膜4下方的套管1的管壁上设置有供注入和排出溶液用的膜下开口6。

膜下开口6可以设置在截留膜4下方的套管1的侧面管壁上，也可以设置在截留膜4下方的套管1的底部管壁上；膜上开口5和膜下开口6上可以设置有阀门8、9，所设置的阀门可以是单通阀门，也可以是多通阀门；推杆2的后端可设置一个便于操作者把握的推杆手柄7；截留膜4可以由尼龙膜构成，也可以由陶瓷膜构成，用以截留细胞或亚细胞结构等相对较大物质，允许抗体等相对较小物质穿过，截留膜4的穿过孔径为0.1μm至50μm，优选0.45μm；套管1、推杆2和推杆手柄7可由塑料或不锈钢制成，柱塞密封垫(3)可由橡胶制成。

本发明提供的悬浮细胞染色装置可以多个组合使用，形成组合式悬浮细胞染色装置，以便同时对较多细胞进行染色。本发明提供的这种组合式悬浮细胞染色装置由并行排列的两个或两个以上的上述的悬浮细胞染色装置和一个由中空管状结构构成的连通管10组成，每个悬浮细胞染色装置的膜下开口6与连通管10相连通，连通管10的两端设置有供注入和排出溶液用的连通管开口11，在连通管10的两端的连通管开口11上可设置有阀门，在连通管10一端的连通管开口与设置在该连通管开口上的阀门之间可以设置有分流接头12。

本发明装置用于对悬浮细胞染色，细胞洗涤过程采用压力将需要分离的抗体和液体穿流过截留膜4，细胞或亚细胞结构被截留膜4截留，完成细胞与各类染色物质的洗涤分离过程。截留膜4可截留细胞、亚细胞结构等相对较大物质，允许抗体等相对较小物质穿过。

推杆2和柱塞密封垫3为一体结构，可由手动或机械电动控制，在套管1中进行活塞运动。柱塞密封垫3与套管1形成密封配合，推杆2和柱塞密封垫3向膜方向运动时，将能将截留膜4上的液体通过截留膜4压出，细胞、亚细胞结构等相对较大物质不能通过膜而被截留。

套管1上设置有二个注入和排出溶液的开口，即膜上开口5和膜下开口6，膜上开口5和膜下开口6可连接阀门或与液体分流接头连接后再连接阀门，以便于不同溶液的注入或排出，阀门可选不同形式，如多通道或电动，可实现自动化，阀门上可连接不同形式的泵。

本发明提供的悬浮细胞染色装置使用时可按以下方法操作：

1.加入细胞：经膜上开口5向套管1中的截留膜4上部的腔体中注入固定于70％乙醇中的待染色的悬浮细胞，注入方式可用压力泵，如蠕动泵、柱塞泵或用注射器等方式注入，注入完后将膜上开口5关闭；

2.洗涤细胞：

a.将推杆(2)向下推压使柱塞密封垫(3)向截留膜4方向加压移动，使截留膜4上部腔体中的乙醇通过截留膜4后经膜下开口6排出，排出后将膜下开口6关闭，此时待染色的细胞被截留在截留膜4的上面；

b.用蠕动泵将洗涤溶液由膜下开口6注入，同时使推杆2及柱塞密封垫3向远离截留膜4的方向移动，此时洗涤溶液通过截留膜4被注入套管1的截留膜4上部的腔体中。不同染色方法洗涤溶液各不相同，同一染色方法也可使用不同的洗涤溶液，如免疫荧光染色实验常用无Ca+Mg+Hanks液或PBS溶液，酶免疫染色使用PBST溶液；

c.使推杆2及柱塞密封垫3向截留膜4方向加压移动，使截留膜4上部腔体中的洗涤溶液通过截留膜4后经膜下开口6排出，此时经洗涤的细胞被截留在截留膜4的上面；

重复上述步骤2中的分步骤c，重复7-8次。

3.加入染色物质：将染色物质如标记抗体、抗抗体、酶、酶底物、生物染料、化学染料等经膜上开口5向套管1中的截留膜4上部的腔体中注入，可利用压力泵将染色物质经膜上开口5加入，注入完后将膜上开口5关闭，放置适当时间以便免疫反应或染色。

4.洗涤细胞：操作同上述步骤2中的分步骤c，重复操作上述步骤2中的分步骤c4-6次，以洗涤未结合的抗体或染色物质。

5.收集染色后的细胞：打开膜上开口5，用蠕动泵将洗涤溶液由膜下开口6注入，同时从膜上开口5收集含有被染色细胞的流出液，此时即完成细胞染色。

本发明适用于医学和生物技术领域。细胞是医学和生物技术领域最重要的研究和应用对象。细胞染色，特别免疫染色(如免疫荧光染色、酶免疫染色)是细胞分析常用手段。而采用现有技术对悬浮细胞进行染色因操作困难而导致实验或检测失败率高的问题一直未能解决。本发明悬浮细胞染色装置克服了上述困难。本发明装置可有效保障悬浮细胞染色的成功，而传统离心方法染色常常因发生细胞丢失而以失败告终。本发明装置细胞效染色的准确性高、重复性好和客观强，不受人为因素干扰，并使所需的染色时间大为缩短：传统离心方法操作时间较长，一个标准的细胞抗体、抗抗体染色程序需要3小时至4小时，而本发明装置只需要1.5小时。

本发明具有的有益效果：(1)保障细胞免疫染色的成功：细胞固定后，由于细胞膜被打通，传统离心方式操作时细胞不能被离心力紧密地压缩到离心管底部，造成移除上清废液时候细胞同时被移除，反复多次的细胞洗涤导致大量细胞丢失，实验以失败告终。(2)提高免疫反应染色或其它染色的准确性、重复性和客观性：本发明可以实现自动化操作，克服因不同人员操作产生的实验误差。使得悬浮细胞染色实现自动化、标准化、快捷化。(3)节省时间与设备：传统离心方式免疫染色时候，由于细胞难以被离心力紧密地压缩到离心管底部，需要高转速、长时间离心，整个免疫反应耗时较长。而本装置大大节省时间和实验对离心机的要求。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的。以下实例不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1本发明悬浮细胞染色装置的一个实施例的结构图，图1中数字标识所示部分为：

1：套管；

2：推杆

3：柱塞密封垫

4：截留膜

5：膜上开口

6：膜下开口

7：推杆手柄

8：膜下开口阀门

9：膜上开口阀门

图2为实施例2组合式悬浮细胞染色装置的结构图，图2中数字标识所示部分为：

5：膜上开口

6：膜下开口

9：膜上开口阀门

10：连通管

11：连通管开口

12：分流接头

13、14：阀门

15：悬浮细胞染色装置

图3实施例3中的显微镜观察细胞荧光染色结果。

图4实施例3中流式细胞测定仪测定被染色细胞荧光结果。

具体实施方式

实施例1

图1所示为本发明悬浮细胞染色装置的一个具体实施例的结构，该悬浮细胞染色装置由套管1、推杆2、柱塞密封垫3、截留膜4组成，套管1由塑料或不锈钢制成，套管1为中空圆管状结构，柱塞密封垫3为圆形片状结构，其位于套管1腔内中上部，柱塞密封垫3的外周与套管1的管腔内壁呈可滑动的密封配合，推杆2为长杆状结构，其前端与柱塞密封垫3的上部相连接，与柱塞密封垫3成为一体，推杆2的后端设置有一个便于操作者把握的推杆手柄7，截留膜4位于套管1腔内下部，在截留膜4上方的套管1的侧壁上靠近截留膜4处设置有一个供注入和排出溶液用的膜上开口5，截留膜4下方设置有一个供注入和排出溶液用的膜下开口6，膜上开口5上设置有阀门9，膜下开口6上设置有阀门8，阀门8由一个三通阀构成；截留膜4是尼龙膜或陶瓷膜，该膜可截留细胞或亚细胞结构等相对较大物质，允许抗体等相对较小物质穿过，截留膜4使用的是pirce公司出产的穿过孔径0.45μm的尼龙膜。阀门8使用的是鲁尔阀，具体是集优塑件科技开发有限公司出产的医用三通阀。阀门9使用BD公司16G大号留置针作为三通阀使用。套管(1)由不锈钢或塑料制成，套管1的高度为10厘米，内径1厘米，套管1的管壁的厚度为0.2厘米。推杆2由不锈钢或塑料制成，柱塞密封垫3由橡胶制成。

实施例2

组合式悬浮细胞染色装置，即悬浮细胞染色装置的组合使用。

本发明提供的悬浮细胞染色装置可以组合使用，可以将两个或两个以上的悬浮细胞染色装置组合使用，这样可以同时处理较多的细胞，即同时对较多的细胞进行染色。

图2为4个悬浮细胞染色装置组合使用的实施例，具体组合方式是：在并行排列的4个悬浮细胞染色装置的下面设置一个连通管10，将4个悬浮细胞染色装置外套管1上的溶液注入和排出通道膜下开口6与连通管10相连通，连通管10的两端设置有连通管开口11，其中一端的开口上设置有分流接头12，在该分流接头12的分流口上设置有阀门14，在另一端的开口上设置有阀门13。连通管10为中空管状结构，可由橡胶、不锈钢、有机玻璃等材料制成。

使用时，待染色细胞和染色物质由膜上开口5注入；细胞洗涤时，洗涤溶液利用压力泵由膜上开口5或由连通管10的一端的开口注入，本实施例中由接有分流接头12的连通管开口注入，洗涤溶液注入连通管10内腔后，经各个悬浮细胞染色装置的膜下开口6流入各个悬浮细胞染色装置的腔体内。在由接有分流接头12的连通管开口注入洗涤溶液的同时，可配合将推杆2和柱塞密封垫3向远离截留膜4的方向移动，使注入的洗涤溶液穿过截留膜4流入套管1的截留膜4上部的腔体内；洗涤溶液注入完毕后，关闭接有分流接头12的连通管开口，本实施例中是通过控制接在分流接头12上的阀门14实现的。洗涤溶液由连通管10的另一端的开口排出。收集被染色细胞时，将推杆2和柱塞密封垫3向截留膜4的方向移动，使柱塞密封垫3停留在接近截留膜4的位置，开启膜上开口5，利用压力泵将溶液由连通管10的一端的开口注入，此时，连通管10的另一端的开口处于关闭状态，收集由膜上开口5流出的溶液，该流出溶液中含有被染色细胞，即由膜上开口5收集被染色细胞。

实施例3

使用实施例1制备的悬浮细胞染色装置进行细胞免疫荧光染色实验

实验步骤：见图1

1.加入细胞：打开阀门9，向套管1中的截留膜4上部的腔体中注入固定于70％乙醇中的待染色的悬浮细胞，注入完后关闭阀门9；

2.洗涤细胞：

a.打开阀门8，使推杆密封垫向截留膜4方向加压移动，使截留膜4上部腔体中的乙醇通过截留膜4后经溶液注入和排出通道套管膜下开口6由构成阀门8的三通阀的其中一个通道排出，排出后关闭此阀门通道。此时待染色的细胞被截留在截留膜4的上面。

b.用蠕动泵将洗涤溶液由构成阀门8的三通阀的另一个通道注入，同时使推杆密封垫向远离截留膜4的方向移动，此时洗涤溶液通过截留膜4被注入套管1的截留膜4上部的腔体中，关闭构成阀门8的三通阀的该洗涤溶液注入通道，开启构成阀门8的三通阀的另一通道。

c.使推杆密封垫向截留膜4方向加压移动，使截留膜4上部腔体中的洗涤溶液通过截留膜4后经溶液注入和排出通道套管膜下开口6由构成阀门8的三通阀的其中的开启的通道排出。此时经洗涤的细胞被截留在截留膜4的上面。

重复上述步骤2中的分步骤c，重复8次。

3.加入FITC标记抗体：打开阀门9，向套管1中的截留膜4上部的腔体中注入200ul FITC标记抗体溶液，注入完后关闭阀门9，室温放置30分钟。

4.洗涤细胞：同上述步骤2中的分步骤c，重复5次。

5.收集染色后的细胞：打开阀门9，

用蠕动泵将洗涤溶液由构成阀门8的三通阀的一个通道注入，同时从阀门9收集含有被染色细胞的流出液，此时即完成细胞染色。

实施例4

免疫荧光染色实验

一.实验材料

1.PNC-1细胞系细胞：培养的PNC-1细胞系细胞胰酶消化后用洗涤液洗涤3次。加入无水乙醇至70％浓度。室温放置20分钟；

2.FITC标记兔抗人GAPDH抗体、无关抗体：FITC标记兔抗鼠IgG抗体、FITC标记羊抗兔IgG抗体：均为武汉市晶赛生物工程技术有限公司产品，稀释滴度1∶200。

3.无水乙醇：上海国药集团。

4.洗涤溶液：0.15Mol PBS溶液，按照常规配方配制。

二.实验方法：

按实施例3所述的方法进行细胞染色后，得到染色细胞。

三.实验结果：

将得到的染色细胞用流式细胞测定仪和荧光显微镜测定细胞荧光染色结果，二种方式测定结果均说明染色成功。荧光显微镜观察的染色结果见图3。流式细胞测定仪检测细胞被荧光染色的结果见表1图4。

表1：流式细胞测定仪测定细胞荧光结果

样品	FACS阳性率
		阴性对照：FITC标记兔抗鼠IgG抗体第1次	2.02
阴性对照：FITC标记兔抗鼠IgG抗体第2次	1.73

阴性对照FITC标记羊抗兔IgG抗体第1次	1.74
		FITC标记抗GAPDH第1次	99.36
FITC标记抗GAPDH第2次	99.93
		阴性对照FITC标记羊抗兔IgG抗体第2次	2.13

本次染色样本全部成功。

实验结论：

固定后的悬浮细胞经过悬浮细胞染色装置染色操作，可将FITC标记抗GAPDH抗体染色到PNC-1细胞。FITC标记对照抗体未染色。染色过程方便快捷，染色结果细胞荧光非特异性本底低，阳性率高。

Claims (8)

1.一种悬浮细胞染色装置，其特征在于，由套管(1)、推杆(2)、柱塞密封垫(3)、截留膜(4)组成，套管(1)为中空圆管状结构，柱塞密封垫(3)为圆形片状结构，其位于套管(1)腔内中上部，柱塞密封垫(3)的外周与套管(1)的管腔内壁呈可滑动的密封配合，推杆(2)为长杆状结构，其前端与柱塞密封垫(3)的上部相连接，与柱塞密封垫(3)成为一体，截留膜(4)位于套管(1)腔内下部，将套管(1)的内腔分为膜上腔和膜下腔两部分，在截留膜(4)上方的套管(1)的管壁上靠近截留膜(4)处设置有供注入和排出溶液用的膜上开口(5)，在截留膜(4)下方的套管(1)的管壁上设置有供注入和排出溶液用的膜下开口(6)；膜下开口(6)上设置有阀门(8)，所述的阀门是多通阀门；膜下开口(6)设置在截留膜(4)下方的套管(1)的侧面管壁上或设置在截留膜(4)下方的套管(1)的底部管壁上；截留膜(4)由尼龙膜或陶瓷膜构成；截留膜(4)的穿过孔径为0.1μm至50μm。

2.根据权利要求1所述的悬浮细胞染色装置，其特征在于，截留膜(4)的穿过孔径为0.45μm。

3.根据权利要求1所述的悬浮细胞染色装置，其特征在于，在截留膜(4)上方的套管(1)的管壁上靠近截留膜(4)处设置有供注入和排出溶液用的膜上开口(5)，膜上开口(5)上设置有阀门(9)。

4.根据权利要求1所述的悬浮细胞染色装置，其特征在于，推杆(2)的后端设置有一个便于操作者把握的推杆手柄(7)。

5.根据权利要求4所述的悬浮细胞染色装置，其特征在于，套管(1)可由塑料或不锈钢制成；推杆(2)和推杆手柄(7)可由塑料或不锈钢制成；柱塞密封垫(3)可由橡胶制成。

6.一种组合式悬浮细胞染色装置，其特征在于，它由并行排列的两个或两个以上的权利要求1至5中任一项所述的悬浮细胞染色装置和一个由中空管状结构构成的连通管(10)组成，每个悬浮细胞染色装置的膜下开口(6)与连通管(10)相连通，连通管(10)的两端设置有供注入和排出溶液用的连通管开口(11)。

7.根据权利要求6所述的组合式悬浮细胞染色装置，其特征在于，在连通管(10)的两端的连通管开口(11)上设置有阀门。

8.根据权利要求6所述的组合式悬浮细胞染色装置，其特征在于，在连通管(10)的一端的开口上设置有分流接头(12)，在该分流接头(12)的分流口上设置有阀门(14)，在连通管(10)的另一端的开口上设置有阀门(13)。