CN103059236A

CN103059236A - 阳离子型刷形嵌段共聚物、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN103059236A
Application number: CN2013100188567A
Authority: CN
Inventors: 倪沛红; 郝莹; 何金林; 张明祖; 刘坚; 张洋
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN103059236B

Abstract

本发明公开了一种阳离子型刷形共聚物、其制备方法及应用。本发明首次结合原子转移自由基聚合（ATRP）和开环聚合（ROP），制备了侧链含生物可降解聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物，首先利用小分子ATRP引发剂，对甲基丙烯酸羟乙酯进行ATRP聚合反应，获得末端带有溴或氯取代基的大分子；利用其作为大分子ATRP引发剂，与pH敏感的单体进行ATRP聚合反应，获得pH响应的两嵌段共聚物；再利用两嵌段共聚物侧基上的羟基，对环状磷酸酯单体进行开环接枝共聚，得到侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物。本发明开发的新型的侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物具有良好生物相容性、生物可降解性以及低毒性，可以作为基因载体，在生物医学中具有良好的应用前景。

Description

阳离子型刷形嵌段共聚物、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种阳离子型刷形嵌段共聚物、其制备方法以及其作为基因载体的应用。

背景技术

现如今，基因组学在先天性和获得性疾病的治疗等方面取得突破性进展，基因治疗已成为最活跃的研究领域之一。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。构建一个生物相容性好、可生物降解、安全性高、转染效率高和表达水平高的载体，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、可控、高效、稳定的表达是基因治疗研究的一个重要方向。

目前用于基因输送的基因载体主要分为病毒类和非病毒类。病毒载体包载能力小，易引起免疫反应，在临床上暴露出一系列安全问题；非病毒型阳离子基因载体具有较高的转运能力和转染效率、不受DNA体积大小和数目的限制、制备方便、不存在引入病毒基因的危险性等方面的优势，因而备受关注。阳离子聚合物基因载体的种类很多，有多肽类：聚赖氨酸、聚谷氨酸及其衍生物；多聚胺类：聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺树状物；聚甲基丙烯酸类；聚酰胺-胺型树状物；以及一些天然高分子如壳聚糖、明胶等。近年来生物可降解的阳离子型聚合物，例如：聚β-氨基酸酯、聚赖氨酸、胺类衍生物以及含氨基的嵌段聚合物等，在基因治疗领域得到广泛的应用，其中以含氮的嵌段共聚物作为非病毒基因载体的研究尤为广泛。但是，阳离子载体与DNA之间的静电作用限制了基因进入细胞核之后与载体解离释放出来，过多的正电荷会增加载体的毒性。

为了克服阳离子聚合物的缺陷，研究人员设计合成在阳离子载体外层连接一段亲水性嵌段聚合物，用于屏蔽正电荷。具有高密度侧链基团的刷形嵌段共聚物能够改变聚阳离子主链周围的微环境，可以降低主链周围的介电常数，增强聚阳离子主链与DNA之间离子和氢键的相互作用，并且能屏蔽电荷，降低复合物的自聚集，减少与组织细胞的作用，降低载体毒性，延长载体在体内的循环时间，且具有抗非特异吸附性能。由于刷形嵌段共聚物的众多优点，使之在生物医学领域具有潜在的应用前景。

在现有技术中，已有一些关于刷形嵌段共聚物用作药物、基因载体的报道。但是，作为基因载体，应当具有良好的生物可降解性，在生物体内降解过程中不会影响生物体内局部的pH值，从而不会对生物体产生一系列副作用。并且，作为基因治疗的载体，还应当具有下列特征：具有良好的生物相容性以及低的毒性，同时亲水性侧链在体内可以屏蔽电荷，降低载体的毒性，延长载体在体内的循环时间。

因此，需要寻求更多的阳离子型刷形嵌段共聚物。

发明内容

本发明的目的是，提供一种阳离子型刷形嵌段共聚物，该共聚物应具有良好的生物可降解性和相容性，可用作基因载体；本发明的另一个目的是提供该阳离子型刷形嵌段共聚物的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明的总体构思是：结合原子转移自由基聚合（ATRP）和开环聚合（ROP）法，制备刷形嵌段共聚物。首先在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，利用小分子ATRP引发剂，对单体甲基丙烯酸羟乙酯进行ATRP聚合反应，获得末端带有溴或氯取代基的聚甲基丙烯酸羟乙酯，利用其作为大分子ATRP引发剂，与pH敏感性单体进行ATRP聚合反应，获得侧基含羟基和具有pH响应性的两嵌段共聚物；再利用两嵌段共聚物侧链上的羟基为反应点，对环状磷酸酯单体进行开环聚合，得到侧链含聚磷酸酯的刷形嵌段共聚物。

本发明具体的技术方案为：一种阳离子型刷形嵌段共聚物，由下列化学结构式表达：

Figure 2013100188567100002DEST_PATH_IMAGE001

；

式中，R₁选自、

Figure 2013100188567100002DEST_PATH_IMAGE003

、

或

Figure 2013100188567100002DEST_PATH_IMAGE005

中的一种；R2选自乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种，其中单甲基封端的聚环氧乙烷的结构式为：-(CH₂CH₂O)_iCH₃，式中i为3～11；X为溴或氯；k为20～50，n为1～4，m为30～80。

上述阳离子型刷形嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：

(1)在原子转移自由基聚合（ATRP）催化剂和催化剂配体的存在下，利用ATRP小分子引发剂与单体甲基丙烯酸羟乙酯进行溶液ATRP反应，获得末端含溴或氯的聚甲基丙烯酸羟乙酯；

其中，ATRP引发剂为α-溴代丙酸甲酯（MBP）或2-溴代异丁酸乙酯（EBiB）；单体与ATRP引发剂的摩尔比为20∶1～50：1；ATRP催化剂与催化剂配体的摩尔比为1∶1～1∶4；溶剂选择甲醇、甲醇/水混合溶剂或丙酮中的一种。

(2)在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，用步骤(1)获得的末端含溴或氯的聚甲基丙烯酸羟乙酯作为大分子引发剂，与pH敏感的单体进行溶液ATRP反应，获得侧基含羟基的两嵌段共聚物，其化学结构式如下所示：

；式中，k为20～50，m为30～80，X为溴或氯；

其中，pH敏感的单体与大分子引发剂的摩尔比为30∶1～80∶1；ATRP催化剂与催化剂配体的摩尔比为1∶1～1∶4；大分子引发剂与ATRP催化剂的摩尔比为1∶0.5～1∶2；所述pH敏感的单体选自甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（二乙氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（二异丙基氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（N-叔丁基氨基）乙酯中的一种；

(3)用步骤(2)获得的侧基含羟基的两嵌段共聚物，对环状磷酸酯单体进行开环聚合，得到接枝共聚物，即所述阳离子型刷形嵌段共聚物；

所述环状磷酸酯单体为：

Figure 2013100188567100002DEST_PATH_IMAGE007

，式中R2选自乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种，其中单甲基封端的聚环氧乙烷的结构式为：-(CH₂CH₂O)_iCH₃，式中i为3～11。

上述技术方案中，步骤(1)中，ATRP 催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；步骤(2)中，ATRP 催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

进一步的技术方案，在步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

(i) ATRP大分子引发剂提纯处理：在反应结束后，加入溶剂将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止，待溶液变绿色后，使其通过装有中性Al₂O₃的柱子，再旋转蒸发使溶液浓缩，将浓缩液滴入体积比为1∶5～1∶10的正己烷中，沉淀，最后将所得到的沉淀物在真空烘箱中25 ℃条件下干燥，得到淡黄色的固体产物；

(ii)两嵌段共聚物的提纯处理：在反应结束后，加入溶剂将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止，待溶液变绿色后，使其通过装有中性Al₂O₃的柱子，再旋转蒸发使溶液浓缩，将浓缩液滴入体积比为1∶5～1∶10的正己烷中，沉淀，最后将所得到的沉淀物在真空烘箱中25 ℃条件下干燥，得到淡黄色的固体产物；

(iii)阳离子型刷形嵌段共聚物的提纯处理：在反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，将浓缩液滴入体积比为1∶5～1∶10的冰无水乙醚溶剂中，沉淀，除去未反应的单体，将得到的固体产物置于真空烘箱中25 ℃条件下干燥，获得乳白色固体产物。

本发明同时请求保护上述阳离子型刷形嵌段共聚物作为基因载体的应用。

其中，侧链的聚磷酸酯链段是一类由磷酸酯键连接主链的结构单元组成，与生物大分子核酸的结构相似，具有较低的毒性、良好的生物相容性、生物可降解性和亲水性，降解后生成磷酸盐和小分子醇，不产生酸性小分子和二氧化碳，因此不会对生物体产生副作用。聚磷酸酯作为刷形嵌段共聚物的刷形部分，使载体具有抗蛋白吸附和延长血液循环时间的功能，并且刷形嵌段共聚物的结构中含有pH敏感的阳离子型嵌段，在一定pH条件下可发生质子化，带正电荷，与带负电的DNA通过静电相互作用，从而压缩DNA，可以用作基因载体。

由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明采用了生物降解性和生物相容性良好的聚磷酸酯作为亲水性侧链，与生物相容性良好的pH敏感性聚合物链段相结合，首次结合原子转移自由基聚合和开环聚合方法，制备了具有良好生物相容性和生物可降解性的pH响应的刷形嵌段共聚物。

2、本发明采用了具有高密度接枝亲水性聚磷酸酯作为刷形嵌段共聚物的刷，与DNA复合后，外层的亲水性刷，在体内可屏蔽电荷，降低复合物的自聚集，减少与组织细胞的作用，降低载体的毒性，改善载体在体内的分布，延长载体在体内的循环时间，具有抗蛋白质非特异吸附性能。

3、本发明中获得的侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物在水中可自组装形成带有正电荷的聚集体，可以与带负电荷的DNA通过静电相互作用，起到压缩DNA的作用，可用作基因载体。因此，本发明公开的阳离子型刷形嵌段共聚物可以同时包载DNA，在基因治疗方面，具有良好的应用价值。

附图说明

图1为核磁共振氢谱图（¹H NMR）。（A）实施例一中末端含氯的聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA₃₃-Cl）；（B）实施例二中侧基含羟基的两嵌段共聚物（PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆）；（C）实施例四中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆。溶剂为氘代二甲亚砜（DMSO-d ₆）。

图2为实施例四中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆的核磁共振磷谱图（³¹P NMR），溶剂为氘代二甲亚砜（DMSO-d ₆）。

图3为红外光谱图。（A）实施例一中末端含氯的聚甲基丙烯酸羟乙酯PHEMA₃₃-Cl；（B）实施例三中侧基含羟基的两嵌段共聚物PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆：（C）实施例四中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆。

图4为实施例四中刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆和实施例五中(PHEMA₃₃-g-PEEP₅₀)-b-PDMAEMA₅₀在水相中的临界聚集浓度（cac）测试结果。

图5为实施例六中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆缩合DNA，在不同N/P比条件下的凝胶阻滞电泳测试结果，1～14泳道中共聚物与DNA的N/P比分别为0、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、9、10、15。

图6为实施例七中在不同N/P比条件下，(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA复合粒子的表面zeta电位结果。

图7为透射电镜照片。（A）实施例七中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆在水溶液中自组装形态；（B）裸质粒DNA（Plasmid pUC 18 DNA）；（C）(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA复合粒子，N/P比为20。

图8为不同聚合物对HeLa细胞（子宫颈癌细胞）的毒性测试结果。（A）实施例七中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆；（B）用于对照试验的支化聚乙烯亚胺（branched PEI）。

图9为实施例七中侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物与DNA复合物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA对HeLa细胞的转染结果。(A)、(B) 、(C)中阳离子聚合物与DNA的N/P比分别为10、15、20。

具体实施方法

下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：

实施例一：ATRP大分子引发剂聚甲基丙烯酸羟乙酯PHEMA₃₃-Cl的合成

将支管圆底烧瓶放入120 ℃ 烘箱中干燥后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷直至达到室温，氩气充放气三次后充满氩气。单体甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）（4.1 g, 31.50 mmol）溶于甲醇（10 mL）后加入支管瓶中，将小分子引发剂α-溴代丙酸甲酯（119 μL, 1.05 mmol），配体2，2′-联吡啶（328.0 mg, 2.1 mmol），纯度为99.99%的氯化亚铜（104.0 mg, 1.05 mmol）加入到上述混合体系中，通入氩气保护。升温至30 ℃，并保持此温度，磁力搅拌，反应10~12小时。

加入甲醇将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变绿色后，使之通过装有中性Al₂O₃的柱子以除去溶液中的铜盐；旋转蒸发使溶液浓缩，再将浓缩液滴入正己烷中，经沉淀除去未反应的原料。最后将所得淡黄色沉淀物在真空烘箱干燥，得到淡黄色的固体物质，即PHEMA₃₃-Cl大分子引发剂，测得产率为52 %，其数均分子量（

）为4410 g mol^-1；

产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，聚合物的核磁共振谱图见图1(A)，红外光谱谱图见图3(A)，这些测试结果证明成功合成了PHMEA₃₃-Cl。

实施例二：侧基含羟基的两嵌段共聚物PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆的合成

将支管圆底烧瓶放入120 ℃ 烘箱中干燥后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷直至达到室温，充放氩气三次后继续将玻璃瓶充满氩气。将实施例一制备的大分子引发剂PHEMA₃₃-Cl（2.2 g, 0.5 mmol）溶于甲醇（15 mL）加入支管瓶中，将配体2，2′-联吡啶（156.2 mg, 1.0 mmol），单体甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯（DMAEMA）（4.6 g, 30 mmol），纯度为99.99%的氯化亚铜（49.5 mg, 0.5 mmol）加入到上述混合体系中，通入氩气保护。升温至35 ℃，并保持此温度，磁力搅拌，反应24~28小时。

加入甲醇将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变绿色后，使之通过装有中性Al₂O₃的柱子以除去溶液中的铜盐；旋转蒸发使溶液浓缩，再将浓缩液滴入正己烷中，沉淀除去未反应的原料；最后将所得沉淀物在真空烘箱干燥，得到淡黄色的固状物质，即PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆，测得产率为46 %，其数均分子量（

）为14710 g mol^-1。

产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，核磁共振谱图见图1(B)，红外光谱谱图见图3(B)。这些结果表明已成功合成了PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆。

实施例三：侧基含羟基的两嵌段共聚物PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₅₀的合成

将支管圆底烧瓶放入120 ℃ 烘箱中干燥后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷直至达到室温，充放氩气三次后继续将玻璃瓶充满氩气。将实施例一制备的大分子引发剂PHEMA₃₃-Cl（2.2 g, 0.5 mmol）溶于甲醇（15 mL）加入支管瓶中，将配体2，2′-联吡啶（156.2 mg, 1.0 mmol），单体甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯（DMAEMA）（3.8 g, 25 mmol），纯度为99.99%的氯化亚铜（CuCl，49.5 mg, 0.5 mmol）加入到上述混合体系中，通入氩气保护。升温至35 ℃，并保持此温度，磁力搅拌，反应24~28小时。

加入甲醇将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止。待溶液变绿色后，使之通过装有中性Al₂O₃的柱子以除去溶液中的铜盐；旋转蒸发使溶液浓缩，再将浓缩液滴入正己烷中，沉淀除去未反应的原料；最后将所得沉淀物在真空烘箱干燥，得到淡黄色的固状物质，即PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₅₀，其数均分子量（

）为12210 g mol^-1。

产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，核磁共振谱图与图1(B)相似，红外光谱谱图与图3(B)相似。

实施例四：侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆的合成

将支管圆底烧瓶放入120 ℃ 烘箱中干燥后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷直至达到室温，充放氩气三次后继续将玻璃瓶充满氩气，迅速称取并加入实施例二制备的PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆（0.5 g, 0.034 mmol）和辛酸亚锡（8.8 mg），用干燥的注射器将30 mL经回流除水干燥后的无水四氢呋喃（THF）注射到支管瓶中至PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆溶解，随后用干燥的注射器打入一定量的单体2-乙氧基-2-氧-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（EEP）（165 mg, 1.09mmol）（EEP: Sn(Oct)₂ = 1:0.02，摩尔比），支管瓶充满氩气后移至40 ℃油浴中搅拌反应5小时。

反应完毕，旋转蒸发除去四氢呋喃溶剂，将反应产物用150 mL冰的无水乙醚沉淀，除去未反应的原料，得到的产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到乳白色固体产物，即(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆。数均分子量（

）为37550 g mol^-1。

产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振磷谱（³¹P NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，聚合物的核磁共振氢谱见图1(C)，核磁共振磷谱见图2，红外光谱谱图见图3(C)，从图1(C)、图(2)和图3(C)可以看出，成功合成了(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆。

通过荧光探针法表征上述侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆在水溶液中的自组装性质。图4(A)为共聚物的临界聚集浓度（cac）测试结果，共聚物的临界聚集浓度（cac）约为0.05 g L^-1。

实施例五：侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₅₀)-b-PDMAEMA₅₅的合成

将支管圆底烧瓶放入120 ℃ 烘箱中干燥后塞上磨口玻璃塞，用泵抽冷直至达到室温，充放氩气三次后继续将玻璃瓶充满氩气，迅速称取并加入实施例三制备的PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₅₀（0.42 g, 0.034 mmol）和辛酸亚锡（8.8 mg），用干燥的注射器将30 mL经回流除水干燥后的无水四氢呋喃（THF）注射到支管瓶中至PHEMA₃₃-b-PDMAEMA₆₆溶解，随后用干燥的注射器打入一定量的单体2-乙氧基-2-氧-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（EEP）（165 mg, 1.09mmol）（EEP: Sn(Oct)₂ = 1:0.02，摩尔比），支管瓶充满氩气后移至40 ℃油浴中搅拌反应5小时。

反应完毕，旋转蒸发除去四氢呋喃溶剂，将反应产物用150 mL冰的无水乙醚沉淀，除去未反应的原料，得到的产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到乳白色固体产物，即(PHEMA₃₃-g-PEEP₅₀)-b-PDMAEMA₅₀。数均分子量（

）为19730 g mol^-1。

产物经核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振磷谱（³¹P NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证其聚合物结构、分子量和分子量分布，聚合物的核磁共振氢谱与图1(C)相似，核磁共振磷谱见与图2相似，红外光谱谱图与图3(C)相似。

通过荧光探针法表征的上述侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₅₀)-b-PDMAEMA₅₅在水溶液中的自组装性质，图4(B)为共聚物的临界聚集浓度（cac）测试结果，如所示，共聚物的临界聚集浓度（cac）为0.018 g L^-1。

实施例六：利用琼脂糖凝胶阻滞电泳研究侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆对DNA的压缩能力

将聚合物样品(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆与DNA分别溶解在0.5×TBE（Tris-硼酸缓冲液）中，超声并搅拌使其完全溶解，所述聚合物溶液和DNA溶液的浓度均为1 mg mL^-1。

根据不同的N/P比值，于一定量的DNA溶液中加入聚合物溶液，漩涡震荡使完全混合均匀，通过静电作用压缩DNA，形成聚合物与DNA的复合物。将复合物溶液 (8 μL) 与2 μL的上样缓冲溶液 (85%丙三醇和15%溴酚蓝)混合，点样加入含有0.5 μg mL^-1溴乙锭的0.8% 的琼脂糖凝胶中。电泳电压为70 V，时间为30分钟，缓冲溶液为0.5×TBE。

上述N/P比为聚合物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆中氮原子与DNA中磷原子的摩尔比。

图5为琼脂糖凝胶阻滞电泳测试结果，1～14泳道中共聚物与DNA的N/P比分别为0、0.1、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5、3、5、7、9、10、15。从图5可以看出当N/P 比大于7时，聚合物可以完全固定DNA，阻滞DNA的迁移。

实施例七：载体(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA的构建

（1）配制聚合物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆溶液和DNA溶液：将聚合物和DNA分别溶解在pH值为7.4的缓冲溶液中，搅拌使完全溶解，溶液浓度为1 mg mL^-1；

（2）构建基因载体：按照阳离子型刷形共聚物与DNA不同的N/P比例，分别在1、3、5、7、10、15、20时，取相应量的聚合物和DNA溶液混合，漩涡震荡使完全混合均匀，通过静电作用阳离子型聚合物压缩DNA，形成(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA复合物。

图6为在不同N/P比条件下，(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA复合粒子表面的zeta电位结果。从图6可以看出，通过上述方法获得的复合物载体在不同N/P比下，显示出不同的zeta电位，随着N/P比的增大，zeta电位值由负变正，逐渐增大。

通过透射电子显微镜分析，可以比较裸质粒DNA（Plasmid pUC 18 DNA）粒子、阳离子型刷形聚合物聚集体、聚阳离子缩合DNA后形成的复合纳米粒子的形态，结果参见图7。

图8为通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）测试的侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆和用于对照试验的支化的聚乙烯亚胺（branched PEI）对HeLa细胞（子宫颈癌细胞）的毒性测试结果。结果表明，共聚物具有低毒性，细胞存活率高于文献中常用的支化型聚乙烯亚胺（branched PEI）阳离子载体。

图9为侧链含聚磷酸酯的阳离子型刷形嵌段共聚物与DNA复合物(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA对HeLa细胞的转染结果。

如图9所示，细胞内为GFP（绿色荧光蛋白）标记的DNA，说明本发明的(PHEMA₃₃-g-PEEP₁₁₂)-b-PDMAEMA₆₆/DNA复合基因载体能有效地转染到HeLa细胞内， (A)、(B) 、(C)中阳离子聚合物链段与DNA的N/P比分别为10, 15, 20，在不同N/P比的条件下，均能获得明显的转染效果。

Claims

1.一种阳离子型刷形嵌段共聚物，其特征在于：由下列化学结构式表达：

；

式中，R₁选自

、

、

或

中的一种；R₂选自乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种，其中单甲基封端的聚环氧乙烷的结构式为：-(CH₂CH₂O)_iCH₃，式中i为3～11；X为溴或氯；k为20～50，n为1～4，m为30～80。

2.权利要求1所述阳离子型刷形嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

其中，ATRP引发剂为α-溴代丙酸甲酯或2-溴代异丁酸乙酯；单体与ATRP引发剂的摩尔比为20∶1～50∶1；ATRP催化剂与催化剂配体的摩尔比为1∶1～1∶4；溶剂选择甲醇、甲醇/水混合溶剂或丙酮中的一种；

(2)在ATRP催化剂和催化剂配体的存在下，用步骤(1)获得的末端含溴或氯的聚甲基丙烯酸羟乙酯作为大分子引发剂，与pH敏感的单体进行ATRP反应，获得侧基含羟基的两嵌段共聚物；

其中，单体与大分子引发剂的摩尔比为30∶1～80∶1；ATRP催化剂与催化剂配体的摩尔比为1∶1～1∶4；大分子引发剂与ATRP催化剂的摩尔比为1∶0.5～1∶2；所述pH敏感的单体选自甲基丙烯酸-2-（二甲氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（二乙氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（二异丙基氨基）乙酯、甲基丙烯酸-2-（N-叔丁基氨基）乙酯中的一种；

所述环状磷酸酯单体为：，式中R2选自乙基、异丙基、丁基或单甲基封端的聚环氧乙烷基中的一种，其中单甲基封端的聚环氧乙烷的结构式为：-(CH₂CH₂O)_iCH₃，式中i为3～11。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，ATRP 催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种；步骤(2)中，ATRP 催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

(i) ATRP大分子引发剂提纯处理：在反应结束后，加入溶剂将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止，待溶液变绿色后，使其通过装有中性Al₂O₃的柱子，再旋转蒸发使溶液浓缩，将浓缩液滴入正己烷溶液中,体积比为1∶5～1∶10，沉淀，最后将所得到的沉淀物在真空烘箱中室温干燥，得到淡黄色的固体产物；

(ii)两嵌段共聚物的提纯处理：在反应结束后，加入溶剂将反应产物稀释，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止，待溶液变绿色后，使其通过装有中性Al₂O₃的柱子，再旋转蒸发使溶液浓缩，将浓缩液滴入正己烷中，体积比为1∶5～1∶10；产物沉淀，最后将所得到的沉淀物在真空烘箱中25 ℃条件下干燥，得到淡黄色的固体产物；

(iii)阳离子型刷形嵌段共聚物的提纯处理：在反应结束后，旋转蒸发除去溶剂，将浓缩液滴入冰的无水乙醚溶剂中，体积比为1∶5～1∶10；产物沉淀，除去未反应的单体，将得到的固体产物置于真空烘箱中25 ℃条件下干燥，获得乳白色固体产物。

5.权利要求1所述阳离子型刷形嵌段共聚物作为基因载体的应用。