CN103045730A - 老年性痴呆病变前期CD33基因mRNA水平原位杂交筛查试剂盒及筛查方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与老年性痴呆（Alzheimer’sDisease-AD）前期病理演变有密切相关的CD33基因mRNA的方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可以在，mRNA水平上检测CD33基因的表达功能，比现有的临床生化检测指标和影像医学检查更早期，能实现真正的老年性痴呆（AD）病变前期mRNA水平的筛查，做到预防性诊治的目的。同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于医院推广应用。

Description

老年性痴呆病变前期CD33基因mRNA水平原位杂交筛查试剂盒及筛查方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与老年性痴呆（AD）病变前期mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。   

背景技术

阿尔茨海默病(  Alzheimer’s disease-,AD)是最常见的痴呆类型，占所有痴呆的60%~80%，也是致残率高和负担大的疾病之一。到2006年，人类第一杀手心脏病死亡率比2000年下降了11.5%，第二杀手卒中死亡率下降了18.1%，但阿尔茨海默病的死亡率却上升了47.1%，成为老年人的第5位致死原因。随着全球性人口规模和预期寿命的增加，阿尔茨海默病已成为世界卫生问题，根据未来的预测，痴呆患病率每二十年增加近一倍，至2030年将达到6570万，到2050年将达到1亿1540万。各国阿尔茨海默病患者数增加不是均衡的。发达国家的痴呆人数预测以100%的比例增长，而中国/印度及其南亚和西太平洋邻国等发展中国家将以超过300%的比例增长，中国的AD人数则将以336%的比例增长。中国是世界上人口老化基数最大国家，截止2008年底，我国60岁以上老年人口已接近1.69亿，占总人口的12%。根据2005年北京协和医院领导的一项跨省市（北京/上海/成都/西安）流行病学调查结果估计，65岁以上老年人AD患病率为4.8%，且随着年龄增长而增加。因此，中国绝不是一个AD低发国家，恰恰相反，而是世界上AD人数最多且增长速度最快的国家。因此迅猛增加的疾病负担必将对我国的社会经济发展和家庭生活产生重要影响。 

    AD是世界上致残率高且负担重的疾病。按照2003年度世界卫生组织报导的关于全球疾病负担的估计，60岁以上老年人中痴呆导致残疾的占11.2%，远高于卒中（9.5%）、骨骼肌障碍（8.9%）、心血管病（5%）及各种类型的癌症（2.4%）。据美国一个跨学科专家组的共识估计，除脊髓损伤和晚期癌症以外，AD致残加权显著高于任何其他健康状况。在美国，AD人口已超过500万，AD的花费已超过1000亿美元，估计到2050年AD患者人数将以几何级数方式增长到1300万人,经过核算，每年将花费1400亿美元。 AD已成为重大的公共卫生问题，并确定为未来几年公共卫生问题的研究重点。 

AD是一种常见的神经系统退行性疾病, 临床表现为进行性认知功能减退，典型病理改变为老年斑( sen ile plaque, SP)、神经原纤维缠结( neurona l fibrillary tang les, NFT) 及神经元丢失, 另外伴有颗粒空泡变性( granulov acuolar degeneration,GD),平野小体和脑血管的改变。经过数十年有关AD的病因和发病机制的研究后，虽然对AD的病因还有许多不了解，但是对其病理和生理机制有了肯定和全面的认识，并从中发现了一些重要的疾病标志。现代分子遗传学在帮助人类认识AD的发病机制方面意义非凡，发现常染色体突变能导致Aβ42肽的表达增多，参与的基因包括CD33 基因。CD33基因是最近发现四个新基因与老年性痴呆发病有关其中之一。AD的生物标志物能很好地帮助临床诊断，与病理发现有良好的一致性。2010年美国国立老化研究院和阿尔茨海默病联合会推荐新的诊断定义与标准，强调将记忆损害与生物标志物结合。AD是疾病的整个临床过程，包括了AD痴呆前期和痴呆期AD。AD的临床前驱期则指出现早期病理生理学改变至出现最早的认知症状之间漫长的阶段。当前，临床使用的AD治疗药物不少，但均缺乏有临床意义的疗效。痴呆是严重的认知功能损害，呈进展性和不可逆性，要通过药物干预实现病情稳定或缓解是极其困难的。因此，对痴呆实施预防应该是一个重要的临床研究方向。最新AD研究报告表明，作为“婴儿”这一代，到2050年在美国将有1千3百50万人成为AD痴呆患者。如果，假设有一种干预可以是AD痴呆的发病延迟5-10年或提早5-10预测和筛查，那么AD痴呆患者人数将减少80%，用于AD的预计医疗费用将会大大减少。中国现有AD患者以超过800多万，而且，发病人数每年在上升。因此，寻找有效AD筛查工具，对临床前期AD患者及未发生AD高危人群的早期筛查，在人群中尽早开展干预治疗，减少AD的最终发生率有重要的临床和时代意义。尽早开发出应用于AD病变前期mRNA水平筛查试剂盒，这将改变目前临床上的AD发生后的诊治模式，将AD的诊治提高、提前到病变前期，做到预防性（治未病）的早期介入和治疗，并进一步做到mRNA水平的调控及基因早期治疗，将AD消灭在萌芽状态。 

本发明人在长期研究中发现，导致老年性痴呆治疗效果不佳的主要原因是不能做到真正的早期诊断和早期治疗。本课题拟采用核酸原位杂交技术，寻找与AD发病密切相关的CD33基因一级转录功能产物-mRNA，观察其在AD病人、高危人群、正常对照人群表达变化，统计分析其临床应用意义和价值，并培养、开发出可应用于临床的早期筛查试剂盒，用于临床前期AD患者及高危人群的早期筛查，做到预防性诊治，尽早开展干预治疗，减少AD的最终发生率。 

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的筛查和治疗老年性痴呆、以及预防老年性痴呆，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在老年性痴呆症的基因生理病理学演变前期,就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本（老年性痴呆患者、高危人群、正常对照），对CD33基因与老年性痴呆症的早期预警进行检测分析。 

CD33基因的mRNA作为早期筛查老年性痴呆病变前期有非常重要的临床诊断意义。CD33基因的mRNA在老年性痴呆症前期及病变过程中表达过度。它作于老年性痴呆病变前期筛查、及老年性痴呆症早期预防的检测指标及治疗后的复发预警也有非常重要的临床意义。 

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了大胆创新。特别是筛选临床标本（正常人群、高危人群、疾病患者），突破了正常组织与疾病组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发病变期前mRNA水平，与疾病早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上疾病形成后诊治模式变成疾病的预防性诊治，争取了疾病诊治的时间和空间，达到预防重大疾病。 

根据现有的文献资料CD33基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。 

本发明人在对（老年性痴呆患者、高危人群、正常对照人）例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上老年性痴呆症CD33基因都过度表达，高危人群有不同程度表达15-25%,正常人都是零表达。表明CD33基因是老年性痴呆病变前期筛查的重要标志物。 

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。 

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。 

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA）和检测的靶mRNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过450bp以上，而对于较长的碱基序列，超过1000bp以上，我们会选择该基因的CDS来做探针，如果CDS的碱基序列长度也超过1000bp以上，我们会选择其中一段碱基序列来合成探针，但要经过Blast分析机体中是否有相同碱基序列片段存在）。 

本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到老年性痴呆病理演变前期mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供老年性痴呆前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的老年性痴呆病理演变前期mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床老年性痴呆症的早期预防和治疗争取时间和空间。 

综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。 

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与老年性痴呆病理演变前期的CD33基因的原位杂交检测方法。 

发明内容

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针序列为序列表SEQ ID NO.1所示序列，是CD33基因CDS中（41…1135bp）,从121…540bp的一段,探针长420bp，与体内的靶片段进行反向互补杂交）。CD33基因为序列表SEQ ID NO.2所示序列，全长1466bp，位于染色体19q13.3上”。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。 

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。 

本发明的老年性痴呆病理演变前期基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，及早对老年性痴呆病理演变前期的筛查及老年性痴呆症经治疗后疗效的评判。CD33基因是一种老年性早衰基因，它的表达变化表明老年性痴呆症前期病理演变的可能，提示临床医生及早介入预防和治疗。 

本发明还提供一种CD33基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。 

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞、或脑脊液标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自老年性痴呆患者、高危人群，正常人群。 

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的高危人群、老年性痴呆症好发家族、经治疗后老年性痴呆症病人。 

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以CD33基因为检测对象，合成探针是CD33基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞及脑脊液的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供CD33基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人CD33基因表达低或不表达，即不显色，CD33基因在老年性痴呆病人和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高，高度显色。 

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以CD33基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。 

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的CD33基因表达量，用来确定老年性痴呆病理演变是否已发生，因为CD33基因在正常人中低表达或不表达，如果CD33基因表达高度，说明老年性痴呆发生风险非常高，以及治疗后病人治疗效果评判，从而获得老年性痴呆前期的筛查和诊断信息，帮助临床医生及早介入。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。 

如上所述，当检测到CD33基因的表达高于正常对照时，则可预测受试者老年性痴呆病理演变已发生。 

本发明具有如下有益效果： 

本发明的临床意义是更早期跟踪检测老年性痴呆病变发生和病理演变过程中老年性痴呆症的发生、发展趋势。本发明可以在基因水平上检测CD33基因异常表达，亦未形成老年性痴呆之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床老年性痴呆病理演变前期高风险人群，一个真正的早期筛查以及治疗后疗效判定。这样才有可能实施老年性痴呆的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治老年性痴呆这一恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。 

附图说明

图1是本发明CD33基因原位杂交实施流程图。 

图2是本发明实施例老年性痴呆病人CD33过量表达图片。 

图3是本发明实施例中正常人CD33表达图片。 

图4是本发明实施例中高危人群CD33表达图片。 

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。 

实施例1 

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以CD33基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成： 

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL, 加水至100mL既可)。

实施例2 

应用核酸原位杂交检测方法对老年性痴呆患者CD33基因表达的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min, 再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液 

, 99ml即为使用浓度)洗10min, 三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内, 加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片,弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内,用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片, 盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片,弃去盖玻片, 将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次,每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s,取出玻片,自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内,加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片, 盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片,用1×缓冲液Ⅲ洗30s,自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片,盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次, 每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中,混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。 

老年性痴呆病人20名，55岁以上人群20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有老年性痴呆患者CD33基因有过度表达，细胞染色深；高危人群（55岁以上）有一定量表达（20%左右）；正常对照人零表达，涂片细胞不染色。结果见图2、图3和图4。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>   芮屈生物技术（上海）有限公司

 

<120>  老年性痴呆病变前期CD33基因mRNA水平原位杂交筛查试剂盒及筛查方法和应

       用

 

<130>  。

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  420

<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

<400>  1

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<212>  DNA

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Claims (10)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种CD33基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞和脑脊液细胞标本。

9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的标本是老年性痴呆患者、55岁以上高危人群、正常对照人群，包括临床上的高危人群病变前期病理演变，以及老年性痴呆患者治疗后的复发病理演变过程中CD33基因mRNA表达变化。

10.CD33基因在制备检测老年性痴呆原位杂交试剂盒中的应用。

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