CN103040830B - 一种双甲基哌嗪吡喃酮用于制备抗真菌感染药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双甲基哌嗪吡喃酮用于制备抗真菌感染药物的用途，具体而言，本发明公开了含有取代哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮或其可药用的盐及其制备方法和医药用途。通过微量液基稀释法测定该化合物体外抑制真菌生长的活性，实验结果显示，该取代吡喃酮类化合物对白色念珠菌的80%生长抑制浓度为125微克/毫升。药效学结果表明该化合物或其可药用的盐可预期作为防治真菌感染引起的疾病的药物之用途。

Description

一种双甲基哌嗪吡喃酮用于制备抗真菌感染药物的用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个具有抑制真菌生长活性的含双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮在制备抗真菌感染药物中的用途。

背景技术

随着医学科学的发展，各种新药物和新技术如广谱抗生素、激素、各种导管插管技术、化疗、移植等医疗手段的广泛使用，以及HIV感染和肿瘤，造成人类免疫系统被逐渐破坏的病例逐年增多，从而导致深部真菌病的发病率愈来愈高；而另一方面，随着人类滥用抗生素和临床抗真菌药物的广泛使用，导致传统抗生素不能有效对抗某些严重真菌感染和细菌感染、真菌的耐药现象日益严重。传统抗生素的作用已经遭遇显著瓶颈，大多数细菌、真菌对常见的抗生素产生了显著的抗药性；艾滋病患者、重症患者、烧伤患者等并发真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，寻找广谱、高效、低毒的抗真菌新药已成为药物研究的热点；对耐药菌/顽固性真菌的研究迫在眉睫。

真菌感染引起的疾病大体上可以分为以下四类：侵袭性真菌病与全身性真菌病（如曲霉病和念珠菌病等）、粘膜型真菌病（如“鹅口疮”等）、浅表型皮肤真菌病（如“香港脚”或“头皮癣”、“灰指甲”等）和过敏型真菌病（如哮喘与慢性炎症等）。在以上四类真菌病中，以第一类对人类危害最大，而后三类真菌病相应较轻一些。据来自国外的临床统计资料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌类真菌感染，大约2%的人死于全身性念珠菌感染。临床统计资料表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率高达85%，如患血液性念珠菌病则其死亡率可达40%。利用现有抗真菌药物治疗全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍无法令人满意。因此，药学界正在寻找可以抑制全身性感染的新型药物。

目前，国内外已开发上市的抗真菌药物主要有四大类，即多烯类（如两性霉素B）、三唑类（如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等）、烷基胺类（如特比萘芬）和新开发上市的棘白菌素（echinocandins）类（如卡帕芬净和米卡民等）。前三大类抗真菌药均为20世纪开发上市的老药，而棘白霉素类则是21世纪初开发上市的新药。但在上述药物中，只有少数几种能用于治疗全身性真菌感染症。三唑类抗真菌药物无论第一代还是第二代均对有丝真菌引起的全身性感染疗效不佳，而棘白霉素类抗真菌新药则对这类疾病有效。目前棘白霉素面临的最大问题是：尚无口服剂型，只限于注射（且仅限于医院使用），故病人使用颇为不便。其次，虽然棘白霉素对常见念珠菌病等真菌性感染疗效不错，但其价格昂贵，故而限制了它们在发达国家以外市场的销售量。如据报道，在我国市场上，每支卡帕芬净注射剂（剂量为50毫克）的零售价为3148元，而日本产的米卡民价格稍低一些，但每支（剂量50毫克）也要650元。我国医院临床目前最常用的全身性抗真菌药物仍为氟康唑和特比萘芬。

老品种的康唑类如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通过抑制真菌麦角甾醇生物合成中的羊毛甾醇14去甲基化酶而起效，此类老牌唑类抗真菌药物抗菌谱较窄而耐药性与日俱增。新品虽抗菌谱扩大但是代谢性质和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差；患者需要高脂饮食以利药物吸收，或服用高价的特种制剂形式方可起效；为增加水溶性而添加的环糊精等也给肾功能不全者带来较大威胁。

综上所述，尽快寻找新型结构的，异于以往药物的抗真菌先导化合物，是今后数十年药物工作者们需要抓紧研制的当务之急。为了探索这个领域，本发明人根据大量的文献调查，结合巨量的构效关系模型结合3D-SAR计算工作（Tripos数据库软件），设计出一类含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物，以期发现能有效抑制真菌生长的先导化合物，从而将其进一步开发成具有能抑制真菌生长甚或杀灭真菌的创新性药物。由此我们合成制备出设计的该类化合物，并测试了其对多种真菌菌株的生长抑制作用。结果发现：式（1）化合物3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮具有显著的抑制真菌生长活性，具有制备成抗真菌感染方面的药物用途，由此完成本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构如式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物用于制备抗真菌药物的用途：

本发明还提供了一种制备式（1）化合物的方法：

其中，OMe是指甲氧基；OEt是指乙氧基。式（1）化合物的名称为3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮。合成条件及试剂：a)碘甲烷，金属钠，乙醇；b)3,4-二甲氧基苯甲醛，氢化钠，n-丁基锂，四氢呋喃；c)硼氢化钠，甲醇；d)氢氧化锂（1摩尔/升），乙醇；e)盐酸，水；f)二环己基碳二亚胺，吡啶，二氯甲烷；g)甲磺酰氯，三乙胺，二氯甲烷；h)1,8-二氮杂环[5,4,0]十一碳-7-烯（DBU），甲苯；i)N-溴代琥珀酰亚胺（NBS），偶氮二异丁氰，四氯化碳。

本发明的又一个目的是提供式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物或其可药用盐在制备预防和治疗白色念珠菌感染疾病的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供含有式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物及其可药用的盐与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物，所制备的药物组合物还可以含有其他抗细菌和/或抗真菌药物。所述的药物可按本领域已知方法制成多种剂型，包括涂剂、膜剂、膏剂、注射剂、透皮贴剂、气雾剂、控释或缓释剂，及纳米制剂。

经本发明人详细的文献查阅，到目前为止，尚无有关该类化合物用于制备抗真菌药物的报道。该含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物对于真菌生长的强效抑制属于意想不到的发现，有着确切的原创性，据此完成本发明。

本发明有益之处在于：首次发现式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物具有抑制真菌生长、制备抗真菌感染方面的成药潜力，为开发成为治疗真菌感染创新药物提供了新的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了式（1）化合物3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮的制备方法和部分理化数据，以及该取代吡喃酮类化合物抑制真菌生长的部分药理活性数据。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1：式（1）化合物的制备

1.1仪器与试剂

熔点用显微熔点仪（北京泰克公司生产）测定，温度未校正；旋光在日本产Polax-2L型自动旋光仪上测定；红外光谱IR由Bruker Vector-22红外光谱仪测定，经KBr压片；紫外光谱用Shimadzu UV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱¹H NMR，核磁共振碳谱¹³C NMR和2D NMR由INOVA型超导核磁共振波谱仪（VARIAN INOVA-400MHz）测定（四甲基硅醚TMS为内标）；电喷雾质谱ESI-MS由Bruker Esquire 3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶（100-200，200-300和300-400目）以及薄层层析用硅胶GF254（10-40目）均为青岛海洋化工厂产品；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-90°C；薄层制备层析（PTLC）用Merck公司的铝箔硅胶板；柱色谱用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20采用瑞典AmershamPharmacia Biotech AB公司产品；薄板（TLC）测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇、磷钼酸溶液。

1.2合成与纯化制备

1.2.1关键中间体VIII的合成：由乙酰乙酸乙酯（I）为起始物，经过9步反应（a-i），最终纯化得到关键中间体化合物VIII。

a)2-甲基乙酰乙酸乙酯（化合物II）的制备：

在300毫升乙醇中，加入13.8克金属钠（600毫摩尔），完全溶解后，滴加乙酰乙酸乙酯80毫升，升温并回流1小时，滴加碘甲烷50毫升，回流两小时，冷却至室温，旋转蒸发除去乙醇，加入水用乙醚萃取（5×50毫升），合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去乙醚，减压蒸馏，收集78-80℃（13mmHg）馏分，即可得到化合物II的无色透明液体。

b)2-甲基-3-氧-5-羟基-5-(3,4-二甲氧基苯基)-戊酸乙酯（化合物III）的制备：

冰盐浴冷却条件下，向2.3克氢化钠的四氢呋喃悬浊液（140毫升）中，滴加2-甲基乙酰乙酸乙酯5.78克，然后滴加2.5M正丁基锂的正己烷溶液28毫升，十分钟后滴加3,4-二甲氧基苯甲醛5.88克的四氢呋喃溶液（10毫升），继续反应15分钟，向反应体系中加入饱和氯化铵水溶液（30毫升），用乙醚（3×50毫升）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤（3×20毫升），无水硫酸钠干燥，抽滤，硅胶柱层析（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）得到黄色油状液体，R_f(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)=0.59，即为化合物III。

c)2-甲基-3,5-二羟基-5-(3,4-二甲氧基苯基)-戊酸乙酯（化合物IV）的制备：

在冰水浴中，将3.06克化合物III溶解在四氢呋喃（67.5毫升）和甲醇（27毫升）中，缓慢加入硼氢化钠1.04克，反应30分钟。加入饱和氯化铵水溶液30毫升，乙醚萃取（3×40毫升），合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙醚，得粗品3.2克，经硅胶柱层析（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）得到黄色油状液体即为化合物IV，R_f(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)=0.35。核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ1.22(双峰,J＝7.2Hz,3H,CHCH₃),1.31(三重峰,J＝6.0Hz,3H,CH₂CH₃),1.65–1.93(多重峰,2H,H-4a,H-4b),2.53(多重峰,1H,H-2),3.82(单峰,3H,4′-OMe),3.88(单峰,6H,3′-OMe),4.17(多重峰,2H,CH₂CH₃),4.27(多重峰,1H,H-3),4.89–5.02(多重峰,1H,H-5),6.81–6.93(多重峰,3H,H-2′,H-5′,H-6′)；ESI-MS:m/z 313[M+H]⁺。

d/e)2-二甲基-3,5-二羟基-5-(3,4-二甲氧基苯基)-戊酸（化合物V）的制备：

将3.1克化合物IV溶于72毫升乙醇中，分批加入10毫升（1M）氢氧化锂溶液调节反应体系的pH值至8-9。减压除去乙醇，加入50毫升水，得到的混合物用30毫升乙酸乙酯萃取。向水层中加入15毫升（1M）盐酸，用乙酸乙酯萃取（7×30毫升），得到的有机层经无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗产物，再经硅胶柱层析（石油醚∶乙酸乙酯=1∶1）得到黄色油状液体，即为化合物V。产物结构经过¹H NMR，ESI-MS鉴定。核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ1.22(双峰,J＝7.2Hz,3H,CHCH₃),1.68–1.87(多重峰,2H,H-4a,H-4b),2.65(多重峰,1H,H-2),3.82(单峰,3H,4′-OMe),3.88(单峰,6H,3′-OMe,5′-OMe),4.30(多重峰,1H,H-3),4.91–5.02(多重峰,1H,H-5),6.57(单峰,2H,H-2′,H-6′)；ESI-MS:m/z 285[M+H]⁺。

f)3-甲基-4-羟基-6-(3,4-二甲氧基苯基)-四氢吡喃-2-酮（化合物VI）的制备：

将2.8克化合物V和1.9克二环己基碳二亚胺（DCC）溶于120毫升二氯甲烷中，加入0.74毫升吡啶，室温搅拌过夜，过滤除去生成的沉淀，滤液经减压浓缩得粗产物，再经硅胶柱层析（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）得到无色胶状物，即为化合物V，R_f(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)=0.34。产物结构经过¹H NMR，ESI-MS鉴定。核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ1.41(双峰,3H,J＝7.2Hz,H-7),2.11(多重峰,1H,H-3),2.25(多重峰,2H,H-5a,H-5b),3.88(单峰,3H,4′-OMe),3.89(单峰,6H,3′-OMe),4.28(宽单峰,1H,H-4),5.55–5.70(多重峰,1H,H-6),6.81–6.93(多重峰,3H,H-2′,H-5′,H-6′)；ESI-MS:m/z 266[M]⁺。

g/h)3-甲基-6-(3,4-二甲氧基苯基)-5,6-二氢吡喃-2-酮（化合物VII）的制备：

837毫克化合物VI溶于二氯甲烷（43.5毫升），在冰水浴条件下滴入三乙胺1.67毫升，继而缓缓滴加甲磺酰氯0.872毫升。反应30分钟。加入水洗涤（2×5毫升），饱和食盐水洗涤（2×5毫升），无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗产物。将粗产物溶于甲苯（45毫升），室温下搅拌，缓缓加入2.24克DBU（14.7毫摩尔），反应过夜。用水洗涤（2×10毫升），饱和食盐水洗涤（2×5毫升），无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析（石油醚∶乙酸乙酯=2∶1）得化合物VII的白色针状晶体，R_f(乙酸乙酯∶石油醚=1∶1)=0.51。熔点m.p.115-116℃（乙酸乙酯重结晶）。产物结构经¹H NMR和ESI-MS鉴定。核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ1.99(单峰,3H,H-7),2.49–2.71(多重峰,2H,H-5a,H-5b),3.89(单峰,3H,4′-OMe),3.91(单峰,3H,3′-OMe),5.36(双双峰,J＝12.4,3.6Hz,1H,H-6),6.67(多重峰,1H,H-4),6.84(双峰,J＝8.0Hz,1H,H-5′),6.90(双峰,J＝8.0Hz,1H,H-6′),6.97(单峰,1H,H-2′)；ESI-MS:m/z 248[M]⁺。

i)关键中间体3-溴甲基-6-(2-溴-4,5-二甲氧基苯基)-2H-吡喃-2-酮(化合物VIII）的制备：

将500毫克化合物VII、1.3克NBS、330毫克偶氮二异丁腈、100毫升四氯化碳的混合物搅拌，升温反应1.5小时后降温至室温，加入30毫升水，分液取下层，水层用50毫升氯仿洗两次，合并有机相用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析（氯仿∶石油醚:1∶1）得黄色固体，即为化合物VIII。R_f(乙酸乙酯∶石油醚=1∶3)=0.42，熔点93～95℃(氯仿重结晶)。产物结构经¹H NMR和ESI-MS鉴定。核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿)：δ3.94(单峰,3H,4′-OMe),3.96(单峰,3H,5′-OMe),4.35(单峰,2H,H-7),6.94(双峰,J＝8.4Hz,1H,H-5),7.37(单峰,1H,H-6′),7.54(双峰,J＝8.4Hz,1H,H-4),7.66(单峰,1H,H-3′)；ESI-MS:m/z 427[M+Na]⁺。

1.2.2由化合物VIII制备3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮

将40毫克化合物VIII溶于3毫升乙腈液中，冰浴搅拌下向该干燥的反应瓶中滴加反式-2,5-二甲基-哌嗪（34毫克）的乙腈溶液。搅拌120分钟，减压浓缩，加入10毫升水，以醋酸乙酯萃取三次，每次10毫升。有机层粗产品再以硅胶柱层析，石油醚-醋酸乙酯（3∶2）洗脱，纯化得到3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮：无色胶状物，R_f(氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇=20∶20∶1)=0.23；核磁共振氢谱¹H NMR(400MHz,氘代氯仿,δppm)：1.05(双峰,3H,J=6.8Hz,2″-Me),1.08(双峰,3H,J=6.8Hz,5″-Me),2.42(多重峰,1H,H-2″),2.65(三重峰,1H,J＝12.0Hz,H-6″b),2.79(双双峰,1H,J＝12.0,2.4Hz,H-6″a),2.96(多重峰,2H,H-3″b,H-5″),3.18(多重峰,1H,J＝16.8Hz,H-3″a),3.76(多重峰,1H,J＝14.8Hz,H-7b),3.84(双峰,1H,J＝14.8Hz,H-7a),3.93(单峰,3H,4′-OMe),3.94(单峰,3H,5′-OMe),6.93(双峰,1H,J＝8.8Hz,H-5),7.35(双峰,1H,J＝2.0Hz,H-6′),7.50(双双峰,1H,J＝8.8,2.0Hz,H-4),7.64(单峰,1H,H-3′)；MS(ESI)m/z 437[M+H]⁺。其中，Me是指甲基；OMe是指甲氧基；由于从关键中间体（化合物VIII）制备式（1）化合物时，采用的是反式-2,5-二甲基-哌嗪，因此得到的式（1）化合物也是反式构型。鉴定结构如下：

实施例2：式（1）化合物抑制真菌活性试验

参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）提出的标准化抗真菌敏感性试验方法，测试实施例1制备得到的式（1）化合物3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮的体外抗真菌活性。

2.1真菌标准株：

白色念珠菌ATCC10231：重庆疾病控制中心提供；

白色念珠菌ATCC76615：第二军医大学附属长征医院提供。

2.2试剂：

2.2.1沙氏琼脂培养基（sabouraud dextrose agar）：广东凯微生物科技有限公司产品。

2.2.2酵母抽提物（yeast extract）：海生工生物工程技术服务有限公司分装。

2.2.3三氮吗啡啉丙磺酸（3-N-morpholinopropanesulfonicacid，MOPS)。

2.2.4测试药物：氟康唑（Fluconazole，FCZ)，扬子江药业集团公司；式（1）化合物。将测试药物配置成不同浓度梯度的倍比稀释液待用。

2.2.5二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）及二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)：上海生工生物工程技术服务有限公司分装产品。

2.3仪器：

2.3.1电子天平JA1203N（AB204-5，METTLER TOLEDO）：上海精密科学仪器公司产品。

2.3.2SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司产品。

2.3.3隔水式恒温培养箱（GSP-9160MBE）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

2.3.4电热恒温培养箱（HZQ-F160A）：上海一恒科学仪器有限公司产品。

2.3.5美菱电冰箱（BCD-221CHC）：合肥美菱股份有限公司产品。

2.3.6微量移液器（Proline Pipette，DragonMed Pipette）：芬兰雷勃公司产品。

2.3.7细胞计数板（96 well cell culture cluster）：上海求精仪器公司产品。

2.3.8普通光学显微镜（Olympus）：日本奥林巴斯光学仪器株式会社产品。

2.3.9干烤箱（101A-2）：上海崇明实验仪器公司产品。

2.3.10立式高压蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SⅡ）：上海博讯实业有限公司产品。

2.3.11磁力加热搅拌器（ARE）：意大利VELP公司产品。

2.3.12滤膜、滤器（0.22μm，Sartorius）：德国赛多利斯公司产品。

2.3.13酸度计（PHSJ-4A）：上海精科雷磁公司产品。

2.3.14试管振荡器（MS2）：广州仪科实验室技术公司产品。

2.3.15恒温振荡培养箱（THZ-18AB）：上海一恒科学仪器公司产品。

2.3.16低温冰箱（-20°C，科龙BCD-219WAK）：广东科龙电器有限责任公司产品。

2.3.1796孔平底微量培养板：美国Corning Incorporated产品。

2.4实验方法：

2.4.1实验步骤：

2.4.1.1RPMI-1640液的配制：取10.4克RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBCO）溶于900毫升无菌水中，加入34.53克三氮吗啡啉丙磺酸（MOPS）至其终点浓度为0.165摩尔/升，室温下用磁力搅拌器混匀2-3小时，使其充分溶解，用氢氧化钠（1摩尔/升）调节pH值至7.0（25°C），用灭菌水定容至1升，滤过除菌，分装后-20°C保存备用。

2.4.1.2储备液的制备：储备液浓度应为应用液的10倍，FCZ（氟康唑）为1280微克/毫升，用电子天平称取FCZ10毫克，用1毫升二甲基甲酰胺（DMF）溶解，之后用RPMI-1640稀释至储存液浓度，分装后-70°C保存备用。

2.4.1.3应用液的制备：用RPMI-1640液将储备液作1:10稀释后再作倍比稀，FCZ为128微克/毫升-0.25微克/毫升作10个系列的浓度，均为2倍终浓度。

2.4.1.4微量药敏培养板的制备：使用一次性的96孔板，第1-10列分别加入10个浓度梯度的测试药物的应用液，从高浓度到低浓度。第11列加入RPMI-1640，每孔100微升，第12列作为空白对照，放入-20°C冰箱备用，使用时经-4°C、4°C和室温各1小时。

2.4.1.5念珠菌的激活与稀释：将待测的菌株在YPD琼脂培养基（1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖）上激活两次后，取直径大于1毫米的菌落少许于3毫升无菌生理盐水中混匀制成菌悬液，取少许，用血细胞技术板计数四个大方格中的菌细胞数，取平均值X，此时菌细胞数为X×10⁴CFU/毫升，用RPMI-1640液调整浓度为3×10⁴CFU/毫升（两倍终浓度）。

2.4.1.6加样：在上述制备好的含有测试药物的培养板上加入念珠菌悬液，每孔100微升空白对照不加，震荡混匀后放入湿盒（防止微量板中的液体挥发而影响药物的浓度）35°C孵育24-48小时后观察结果。

2.4.1.7肉眼判断结果：以生长对照空白为依据，以80%抑制（即MIC₈₀）为观察终点，菌种生长明显减少，液体轻微混浊；同时阳性生长中生长良好，空白对照清亮，无细菌生长。质控菌株之MIC值在美国临床微生物实验室标准CLSI M27-A2方案规定的范围内，显示实验结果是有效的。

2.5实验结果：见表1。

表1测试药物对白色念珠菌真菌抑制作用（MIC₈₀，单位：微克/毫升）

2.6结论：

通过采用“微量液基稀释法”研究式（1）化合物对两种真菌标准菌株的体外抗菌活性，试验研究结果表明：3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮对两种白色念珠菌菌株有明确的抗真菌活性。说明其为潜在的抑制真菌生长活性物质，具有进一步开发价值。

本发明中制备得到的式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有预防和治疗由白色念珠菌等真菌引起的感染之药物及药物组合物或保健品或者日化用品。上述各类药物组合物、保健品、或日化用品可以采用的制剂形式包括涂剂、膜剂、膏剂、注射剂、透皮贴剂、气雾剂、控释或缓释剂，及纳米制剂。

本发明的如式（1）所示的含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物还可以与现已上市的治疗真菌感染相关病症的治疗药物及其原料药，如：多烯类（如，两性霉素B）、三唑类（如，氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等）、烷基胺类（如，特比萘芬）和新开发上市的棘白菌素（echinocandins）等品种联合使用，制备得到具有治疗真菌感染相关病症功效活性的组合物或复方制剂，可预期成为治疗真菌感染疾病药品/保健品或者日化用品。上述各类药物组合物、药品/保健品或者日化用品可以采用涂剂、膜剂、膏剂、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等剂型，包括采用现已公认的药剂学常识常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。

在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。

Claims (1)

1.一种式(1)所示之含有双甲基哌嗪基团的取代吡喃酮类化合物用于制备抗真菌感染的药物用途，该化合物的名称为：3-(2,5-反式-二甲基-哌嗪-1-基甲基)-6-(2-溴-4,5-二甲氧基-苯基)-2H-吡喃-2-酮；