CN103037683A - 用于增加植物生物量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有通过两个半胱氨酸之间的二硫键产生的六元环的肽在增加光合生物体的生物量中的应用，其应用于木材工业、从可再生资源获得能量、以及农业中。

Description

用于增加植物生物量的方法
技术领域
本发明包含于生物技术领域中，具体地，包含于植物生物量的产生。因此本发明涉及含有通过两个半胱氨酸之间的二硫键产生的六元环的肽在增加植物生物量中的应用，其具有在木材工业、从可再生资源获得能量、以及农业中的应用。
背景技术
植物和动物中的细胞生长均通过一系列已知为激素或生长因子的细胞外信号调控（Galiha et al.2009,Semi Cell Dev Biol.20:1149-1156），它们通过特定的膜受体起作用（Santnerand Estelle2009,Nature459:1071-1078;De，I et al.2009,Nat Cell Biol11:1166-1173）。这些激素可以在植物内合成或它们可以来源于外界生物体，由根瘤菌产生的可以促进其共生植物生长的因子就是这样（Lugtenberg and Kamilova2009,Annu Rev Microbiol63:541-556）。
已确定了植物中的五组生长因子：生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和其衍生物、以及乙烯。事实上，这些物质广泛分布并且可以在所有高等植物中发现。它们的功能特异，在非常低的浓度下表现其活性，调控细胞生长、细胞分裂和分化，以及器官形成、衰老和潜在态（潜伏状态，latency state）。尽管不完全未知，生长因子的结构保守以所述生长因子在植物和动物中均起作用的方式发生是较低频率的。典型的实例是已知为颗粒体蛋白的糖蛋白，该颗粒体蛋白具有从真菌到哺乳动物的代表，并且表现的功能可变，在植物中调节植物生长，或在动物中调控癌症（Bateman andBennett2009,Bioessays31:1245-1254）。
为了调节植物发育和增加植物生物量，已进行了大量依靠使用化合物（如，例如，专利申请EP0934951A1中描述的）或化肥对其生长进行调控的尝试。专利申请US2010/0016166A1描述了用于增加植物种子和花朵数量的方法，其包括在谷氨酸盐（酯）存在下培养植物。国际专利申请WO2010/001184A1描述了一种组合物，其包含（i）微粒化的天然方解石矿物；（ii）微粒化的沸石；以及（iii）一种或多种用于刺激植物生长和增加作物产量的添加剂。然而，矿物施肥对农业生产具有负面影响，因为高浓度的肥料可能破坏土壤，并且在作物产量方面没有一直获得期望的结果。
近年来，由于基因操作的进展，已开发了用于增加植物生物量的新策略，包括调控控制植物细胞代谢的已确定基因的表达。在该意义下，美国专利申请US2009/0094716A1描述了用于增加植物生物量的方法，包括操作编码具有WD40结构域的6个拷贝的蛋白（FVE）的fve基因的表达。FVE的表达抑制向植物提供了改良的农业性质，具体地，对比对照植物，由该植物产生的生物量产量增加。此外，国际专利申请WO2007/027866描述了将重组DNA用于在控制植物形态、生理和生长中有用的蛋白的表达。所述重组DNA包含植物中的功能性启动子，其共价结合至编码具有Pfam家族蛋白的至少一个结构域的蛋白的核苷酸序列。专利申请WO2009/003429A2描述了用于调控植物中生物量产生的方法，包括改变ckil基因或其直系同源物（orthologs）或同源物的表达。美国专利申请US2010/0037351A1描述了生物量的增加，以及在高渗压力下通过在植物中过表达编码磷脂酶Dε（PLDε）基因的植物产量。然而，包括植物基因操作的方法通常较昂贵并且不容易被社会接受。
国际专利申请WO2004/035798披露了在过表达E2Fa/DPa的转基因植物中上调的或下调的基因的确定，以及其改变植物性状（特性，characteristic）的应用；特别地，披露了SEQ ID:1848蛋白，尽管没有示出其最终用作植物生长因子。
此外，国际专利申请WO2004/035798披露了通常用于产生与相应野生型植物相比具有增加的产量的植物的方法，包括至少增加包括SEQ ID:4659和SEQ ID:4660的蛋白质的组的活性，尽管没有披露所述蛋白质增加植物生物量的能力。
因此，本领域的技术需要对已存在的用于增加生物量以及作物产量的方法开发可替换的没有前述缺点的方法。
目前已发现了对植物和藻类给予肾上腺髓质素增加了它们的生物量。肾上腺髓质素（AM）和原肾上腺髓质素（proadrenomedullin，PAMP）N端区的20个氨基酸的肽，来自于由adm基因编码的相同蛋白，前原肾上腺髓质素（preproadrenomedullin）的翻译后处理。尽管没有任何结构相似性，但是这两种肽产生相似的以及大量生理应答。其中包括它们的血管扩张效应、支气管扩张效应、细胞活动性和生长调控效应、对其它激素分泌的调节效应、以及肠内吸收调节效应（López,J and Martínez,A.2002.IntRev Cytol221:1-92）。在癌症细胞的环境中，AM的作用类似于生长因子，促进细胞活动性，减少凋亡以及引起血管形成（Martínez et al,2002,J NatlCancer Inst94:1226-1237）。
发明内容
本发明的作者已发现，出人意料地，向植物和藻类（包括微藻），即通常的“光合生物体（光合作用生物体，photosynthetic organisms）”给予肾上腺髓质素，在所述生物体生长中产生了其生物量的增加，从而发现了所述蛋白质作为植物和藻类的生长因子的新应用。
如实施例1所示，在增加的浓度的肾上腺髓质素存在下放置胡萝卜和烟草愈伤组织，观察到，与对照样品相比，愈伤组织产生了按照剂量依赖响应的生长增加（图1）。此外，实施例2显示，用肾上腺髓质素处理的微藻（小球藻（Chlorella））比未经处理的微藻生长较快。
因此，基于这些发现，本发明使得能够在不必使用激素（赤霉素、生长素、细胞分裂素，等）或农用化学品的情况下，植物或藻类的植物生物量增加。此外，考虑到其对于光合生物体是外源因子（即，其不是由植物或藻类天然产生的），其对植物生理（树液（sap）流动、气孔打开、紧张度（膨胀度，turgidity）、与共生真菌的关系等）或藻类生理将没有副作用，并且将仅影响植物或藻类生长，已检测到该影响。另外，其不是在植物或藻类中天然产生的事实有利于环境控制以及控制基因改变的物质的扩散。
另一方面，已知肾上腺髓质素在其氨基酸序列中具有与受体识别相关的特征基序（motif）（或识别特征），其由通过两个半胱氨酸之间的二硫桥产生的6个氨基酸的环[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]组成。因此，在不受任何理论限制的情况下，认为任何在其氨基酸序列中具有所述基序的蛋白都将识别受体并且引发致使所述光合生物体（例如，植物或藻类）生物量增加的过程，进行其作为生长因子的功能。
因此，基于肾上腺髓质素对光合生物体（例如，植物或藻类）的新影响，并且考虑到在其氨基酸序列中存在的基序，已开发了以下发明方面：
-用于增加光合生物体，例如，植物或藻类的生物量的方法，其包括在包含以下各项的肽存在下培养所述光合生物体：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
-基因构建体，包含：
（a）编码包含以下各项的肽的核酸：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，以及
（b）用于调节其在光合生物中表达的调控元件。
-载体、宿主细胞、转基因光合生物体细胞、以及转基因光合生物体，例如植物或藻类，包含如上文定义的基因构建体，或编码包含以下各项的肽的核酸：（i）氨基酸序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]，其中，Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
将在以下本发明的详细描述中详细解释这些发明方面以及其不同的特定实施方式。
附图说明
图1是示出依赖于存在于培养基中肾上腺髓质素的摩尔浓度的植物生物量相对生长的柱状图。各柱都表示8次独立重复的统计学平均值和标准偏差。
图2是示出肾上腺髓质素对微藻（小球藻）的影响的图；用肾上腺髓质素处理的微藻比未经处理的微藻生长较快。
具体实施方式
本发明的方法
在一方面中，本发明涉及用于增加光合生物体生物量的方法（在下文中称为本发明的方法），其包括在包含以下各项的肽（在下文中将称为本发明的生长因子）存在下培养所述光合生物体：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
氨基酸Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4可以是相同的或彼此不同的。在特定的实施方式中，Xaa1、Xaa2、Xaa3、和/或Xaa4是与Cys不同的氨基酸。
如在本文中使用的，术语“光合生物体”包括任意能够进行光合作用的生物，光合作用即为使用来自日光的能量将二氧化碳转化为有机化合物，特别是糖类的过程。光合作用发生在植物、藻类、以及多种细菌，例如藻青菌等中，但不发生在古生菌中。光合生物体也称为光合自养生物，因为它们可以生产它们自身的食物。
如在本文中使用的，术语“植物”包括属于植物界的有生命的生物体，例如，树木、花朵、草本植物（herb）、灌木、草类、藤类、蕨类、苔藓、绿藻，等。目前，植物可以分成三组，即：（i）陆生植物或有胚植物（embryophyte），更正式地为胚生植物（Embryophyta）或后生植物（Metaphyta），其构成最常见的植物组，并且包括非维管陆生植物或苔藓、维管植物或导管植物，其包括种子植物（seed plant）或种子植物类（spermatophyte）；（ii）绿色植物-也称为植物界（Viridiplantae）、绿色植物界（Viridiphyta）或绿叶植物界（Chlorobiont）；及（iii）原始色素体生物（Archaeplastida）、泛植物（Plastida）、或原始色素体植物（Primoplantae）。
如在本文中使用的，术语“藻类”包括大量以及多种简单的、典型的自养生物，范围从单细胞到多细胞形式。在特定的实施方式中，藻类是微藻，即微小的藻类，典型地发现在淡水和海水系统中。
术语“藻青菌”，通常称为蓝绿藻，如在本文中使用的，尽管常规地在较老的教科书中包含在藻类中，但是许多现代资料认为其已过时，目前认为其是细菌。
在本发明的内容中，“光合生物体的生物量”应理解为以下两项的量：构成光合生物体的生物物质或有机物质，以及在自发的或非自发的（即，激发的）生物过程中产生的生物物质或有机物质。在一个实施方式中，生物量作为能源是有用的，例如木材、废料、（氢）气体、醇类燃料，等。
在一个实施方式中，其中光合生物体是维管植物，所述植物的生物量包括存在于该植物中的生物物质或有机物质的量，即，构成植物的气生部分（即，茎、树干、叶、枝条、果实、头状花序，等）（气生生物量）以及其地下部分（即，根、愈伤组织、块茎，等）（地下生物量）的生物物质或有机物质。“植物生物量”通常以植物的干质量或干重（或适用时使用“鲜重”）衡量。
在本发明中，表述“增加光合生物体的生物量”应理解为影响光合生物 体以获得大于1的生长速率，其中生长速率（GR）通过下列公式定义：
GR=最终重量/初始重量
另一种用于测量光合生物体生物量增加的方法基于计算相对生长速率（RGR）或每单位生物量和时间的生物量增益（biomass gain），通过下列公式定义：
RGR=（LnW2-LnW1）/（t1-t2）
其中，W1和W2是植物在时间2和1（分别为t2和t1）的重量[Valladares,F.2004,Ecologia del bosque mediterráneo en un mundo cambiante,pp.191-227.Ministerio de Medio Ambiente(Ministry of the Environment),EGRAF,S.A.,Madrid]。
如本领域技术人员将理解的，在维管植物的情况下，在本领域的现有技术中有直接或间接与GR相关的其他参数，可以用于确定所述植物的植物生物量的增长。所述参数的示例性非限制实例包括：
-叶片面积比率（LAR）或叶片面积与植物总重量的比率。表示为m2（叶片）kg-1（植物）。可以通过多种方法测量叶片面积。存在设置有摄像机、数字卡片、和计算机图像分析软件的使得能够相当快地测定多个叶片面积（除了其它尺寸：宽度、长度，等）的自动叶片面积测量设备。另一种系统是影印或扫描叶片以及依靠估算表面的图像分析软件。另一种简单的可替换方法是将影印的叶片轮廓剪下并将其称重，使用剪下的具有已知面积的相同纸张校正重量/面积比。测定叶片面积后，将叶片存放在带有其标记（标识）的纸质信封中，在烤箱中干燥从而获得其“干重”；
-比叶片面积（SLA）或叶片面积与叶片重量的比率。表示为m2（叶片）kg-1（植物）；
-叶片平均分数（LMF）或叶片生物量与植物总生物量的比率。表示为kg（叶片）kg-1（植物）；或
-净同化率（net assimilation rate，NAR）或单位叶片面积植物重量增加速率。表示为kg（植物）m-2（叶片）天-1。相对生长速率等于LAR乘NAR的结果。
其他生长分析参数包括：
-茎质量分数（SMF）或茎生物量与植物总生物量的比率。表示为kg（茎）kg-1（植物）；
-根质量分数（RMF）或根生物量与植物总生物量的比率。表示为kg（根）kg-1（植物）；
-干物质（DM）或植物干重与植物鲜重的比率。表示为kg（干重）kg-1（鲜重）。
本发明的方法可以应用于任何类型的光合生物体，例如，植物、藻类，等。因此，根据本发明，当实际地使任何光合生物体接触本发明的生长因子时，获得了所述光合生物体增加的生物量。
如在本说明书的开始表明的，本发明的生长因子是包含基序[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]的肽。然而，在特定实施方式中，本发明的生长因子是包含基序[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]的肽，前提是所述肽不是SEQ ID NO:4的肽或SEQ ID NO:6的肽。
如本领域技术人员将理解的，所述基序，可选地，将与其它氨基酸序列侧接形成确定为本发明的生长因子的肽的部分。
因此，在特定实施方式中，所述肽（本发明的生长因子）包括氨基酸序列
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2
其中：
-X1表示该肽氨基末端的氨基酸序列，以及
-X2表示该肽羧基末端的氨基酸序列。
如在本文中使用的，术语“肽”指的是氨基酸通过肽键的方式结合形成的分子，为了简单化，其包括肽、多肽和蛋白质，尽管通常认为术语“蛋 白质”应用于具有稳定构象的完整生物分子而术语“肽”通常保留通常缺少稳定的三维结构的短链氨基酸低聚物；同样地，术语“多肽”通常保留氨基酸的任意侧链，不考虑它们的长度（通常），其通常缺乏确定的构象。
尽管肽氨基末端的氨基酸序列（X1）的长度可以在较大范围内变化，在特定的实施方式中，X1具有包括在1至250个氨基酸的长度，或甚至更典型的1至175个氨基酸，通常1至100个氨基酸，更通常1至50个氨基酸，甚至更通常2至40个氨基酸，还甚至更通常5至35个氨基酸。
同样地，尽管肽C末端（或羧基末端）的氨基酸序列（X2）的长度可以在较大范围内变化，在特定的实施方式中，X2具有包括在1至250个氨基酸的长度，或甚至更典型的1至175个氨基酸，通常1至100个氨基酸，更通常1至50个氨基酸，甚至更通常2至40个氨基酸。
在特定的实施方式中，肽C末端的氨基酸序列（X2）包括氨基酸序列GRRRR（SEQ ID NO:7），其在进一步的特定实施方式中，位于与序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys的最后一个Cys相距10至50个氨基酸处，即，所述序列的最后一个氨基酸（Cys）与序列GRRRR（SEQ ID NO:7）的第一个氨基酸（G）之间有10至50个氨基酸。
在特定的实施方式中，X2的C末端是酰胺化的。
包含所述基序[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]的肽的示例性实例包括，但不限于，肾上腺髓质素；其氨基酸序列在序列SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、和SEQ ID NO:6中示出的拟南芥（Arabidopsis）蛋白；其氨基酸序列在序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和SEQ ID NO:10中示出的水稻（Oryza sativa）蛋白；以及其氨基酸序列在序列SEQ ID NO:11中示出的假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）蛋白。
因此，在本发明的方法的特定实施方式中，本发明的生长因子选自由以下各项组成的组：肾上腺髓质素；其氨基酸序列在SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中示出的肽、以及它们的组合，其将在下文详细描述。
肾上腺髓质素
肾上腺髓质素（AM）是最初在人类嗜铬细胞瘤中发现的由52个氨基酸构成的降血压肽，其具有分子内二硫桥[Cys-Cys]并且与降血钙素基因相关肽具有高度同一性。前体蛋白，前原肾上腺髓质素（SEQ ID NO:2）的长度为185个氨基酸（GenBank登记号AAC60642.1），其被细胞内处理后，将产生具有52个氨基酸的成熟蛋白，其将是肾上腺髓质素。在本发明的方法的特定实施方式中，AM是由SEQ ID NO:3定义的人类肾上腺髓质素。不希望受限于任何理论，认为人类AM呈现对植物组织活性的事实是由于在植物中或在与它们相关的微生物中存在类似的因子。
SEQ ID NO:2（前体原肾上腺髓质素）：
MKLVSVALMY LGSLAFLGAD TARLDVASEF RKKWNKWALS PGKRELRMSSSYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAART RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY
Figure BDA00002771334900091
Figure BDA00002771334900092
RSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
[肾上腺髓质素的氨基酸序列以下划线示出，基序GRRRR的氨基酸序列以双下划线和粗体示出]
SEQ ID NO:3（人类肾上腺髓质素）：
YRQSMNNFQGLRSFG
Figure BDA00002771334900093
RFGT
Figure BDA00002771334900094
TVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-NH2[肾上腺髓质素的特征基序（Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys）以粗体示出，其中形成二硫桥的两个半胱氨酸以下划线示出]
如本领域技术人员将理解的，本发明也包括具有增加光合生物体生物量能力的SEQ ID NO:3的任何变体。
如在本文中使用的，术语“SEQ ID NO:3的变体”指的是其氨基酸序列可以是通过改变保守氨基酸以及通过测定前述任意参数来检测得到的变体具有增加光合生物体生物量的能力而从SEQ ID NO:3获得的任何肽。保守氨基酸替换指的是具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组包括丝氨酸和苏氨酸；具有含氨基侧链的氨基酸组包括天门冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组包括苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组包括赖氨酸、精氨酸、和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组包括半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天门冬酰胺-谷氨酰胺。
肾上腺髓质素的功能性等价变体包括基本同一于天然肾上腺髓质素[SEQ ID NO:3]的多肽。如在本文中使用的，表述“基本同一（同源）”指的是与SEQ ID NO:3中示出氨基酸序列具有至少50%的同一性程度的氨基酸序列，有利的至少60%，优选至少70%，更优选至少85%，甚至更优选至少95%。两种肽之间的同一性程度可以使用本领域技术人员广泛已知的计算机算法和方法确定。两种肽的两种氨基酸序列的同一性（相同性）优选使用BLASTP算法（BLAST Manual,Altschul,S.et al,NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894,Altschul,S.,et al,J.,1990,Mol.Biol.215:403-410）确定。
另一方面，肾上腺髓质素在其氨基酸序列中具有特征基序（或识别特征），其与肾上腺髓质素受体识别相关，由通过两个半胱氨酸之间的二硫键产生的6个氨基酸的环[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]组成。另外，肾上腺髓质素在相距基序约20-40个氨基酸处具有酰胺化的羧基末端（CONH2）。在其氨基酸序列中具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys基序的任意肾上腺髓质素变体将识别肾上腺髓质素受体并且引发致使光合生物体生物量增加的过程。因此，本发明也预期（设想）那些具有增加光合生物体生物量能力的肾上腺髓质体变体，包含由两个半胱氨酸之间的二硫键产生的所述6个氨基酸的环。另外，SEQ ID NO:3变体可以具有酰胺化的羧基末端。
最后，本发明也包括肾上腺髓质素或如之前定义的其变体的片段，条件是它们保留了增加光合生物体生物量的能力。所述能力可以通过前述段落中提及的参数确定。
拟南芥蛋白
本发明的生长因子的其他特定实施方式包括在SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、和SEQ ID NO:6中描述的拟南芥蛋白。
确定在序列SEQ ID NO:4下的蛋白质[MLDTLIGGIVGGIAGAIIGTVDGFARGIGICPDSYQS
Figure BDA00002771334900101
EEHKKKLPTNLSRNGGAAAVKAKEN
Figure BDA00002771334900102
QKDRE-NH2]是具有GenBank登记号NP_564910的未知名称的蛋白质。
确定在序列SEQ ID NO:5下的蛋白质[MDPKSCENSSDVKGQTSDSVSKKVLIEEEEDVKKPQQGKENDSRMAKDVVSCSSNISAHVVHEEVADNVTAVSCNEAESDISKAKAKEFHTIDLSGVGERICRICHFGSDQSPEASGDDKSVSPELIEIGCKCKNELGLAHFHCAEAWFKLRGNSVTAKNVTVRLMEDWSGERDNTLD
Figure BDA00002771334900112
GRGQSCCIFMVFLLTILLLHWFFKKISGYYQNT-NH2]是具有GenBank登记号NP_180967的锌指蛋白家族（C3HC4型环指）的蛋白质。
确定在SEQ ID NO:6下的蛋白质[MGDVILFIDDTKSKVRITRCRICHEEEEESFFEVPCACSGTVKFAHRN
Figure BDA00002771334900114
NEKGNTTCEICLQVYKDGYTAVLKQSKLIEQEVTIRVN
Figure BDA00002771334900115
Figure BDA00002771334900116
RSRRLVSIAESDISQCNSVADRGASFCRSLTFTLSVFLLMKHTFDVIYGTEEYPFSVFTVLTLKAIGILLPMFIIIRTISTIQKTLRRRHQYPESEEEDRLSSDDDDDLEEEDEEQQQHLA-NH2]是GenBank登记号NP_567222的称为potchoun1（PIT1）的蛋白。
[在所有情况下，本发明的生长因子的特征基序（Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys）以粗体表示，形成二硫桥的两个半胱氨酸以下划线示出，基序GRRRR的氨基酸序列以双下划线和粗体示出]。
如本领域的技术人员将理解的，本发明的内容也包括所述蛋白的变体（variant）和片段，条件是它们保留了本发明的生长因子的特征基序以及当将它们给予光合生物体时它们增加其生物量。光合生物体生物量的增加可通过前述的任意参数确定，例如，通过如在实施例1中描述的植物生物量增加测定，或通过如在实施例2中描述的藻类生物量增加测定。术语变体以及其在本发明的内容中的意义已在之前的段落定义。
水稻蛋白
在没有限制的情况下，包含基序[Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys]的肽包括其氨基酸序列在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和SEQ ID NO:10中示出的水稻（大米）的蛋白质。
SEQ ID NO:8：
MEAAPRDDKPARMNSEDDDGHRRWGSDGGEAMPRTTSPVRRCDAGGGGGVADSAWEEEGPTGEIPARRMERPARHGGVPAKYGRRLDGEDDGVLVPGEVVATSASAQETRQRRPEAEQWRQRH
Figure BDA00002771334900117
TSGGVRGKRRAGRGRGGDYDAGGGDGTAGRRADAAAGVAGF
Figure BDA00002771334900118
RERRSATVWLGRSGRGKTEGEVD*
SEQ ID NO:9（蛋白受体样蛋白激酶2前体，推定的（putative），表达的）：MHAACSCRPRCAARRPRRARRRRCSRGRTPCRARRRRRPASSGR
Figure BDA000027713349001110
RSSRTRTPRRGARGAAWRRRVGRRGGRRRGGAGVAGTLDALDLSSLPGLAALNLSLNSLTGSFPSNVSSPLLSLRSIDLSSNNLSGPIPAALPALMPNLEHLNLSSNQFSGEIPASLAKLTKLQSVVLGSNLLHGGVPPVIGNISGLRTLELSGNPLGGAIPTTLGKLRSLEHINVSLAGLESTIPDELSLCANLTVIGLAGNKLTGKLPVALARLTRVREFNVSKNMLSGEVLPDYFTAWTNLEVFQADGNRFTGEIPTAITMASRLEFLSLATNNLSGAIPPVIGTLANLKLLDLAENKLAGAIPRTIGNLTSLETLRLYTNKLTGRLPDELGDMAALQRLSVSSNMLEGELPAGLARLPRLVGLVAFDNLLSGAIPPEFGRNGQLSIVSMANNRFSGELPRGVCASAPRLRWLGLDDNQFSGTVPACYRNLTNLVRLRMARNKLAGDVSEILASHPDLYYLDLSGNSFDGELPEHWAQFKSLSFLHLSGNKIAGAIPASYGAMSLQDLDLSSNRLAGEIPPELGSLPLTKLNLRRNALSGRVPATLGNAARMEMLDLSGNALDGGVPVELTKLAEMWYLNLSSNNLSGEVPPLLGKMRSLTTLDLSGNPGLCGHDIAGLNSCSSNTTTGDGHSGKTRLVLAVTLSVAAALLVSMVAVVCAVSRKARRAAVVVEKAETSASGGGGSSTAAAVQASIWSKDTTFSFGDILAATEHFNDAYCIGKGSFGTVYRADLGGGRAVAVKRLDASETGDACWGVSERSFENEVRALTRVRHRNIVKLHGFCAMGGYMYLVYELAERGSLGAVLYGGGGGGGCRFDWPARMRAIRGVAHALAYLHHDCSPPMIHRDVSVNNVLLDPDYEPRVSDFGTARFLVPGRSTCDSIAGSYGYMAPELAYMRVTTKCDVYSFGVVAMEMLMGKYPGGLISSLQHSPQSLSAEGHDGSGGGGGEEASASASRRLLLKDVVDQRLDAPAGKLAGQVVFAFVVALSCVRTSPDARPTMRAVAQELAARRRPILDRPFEMIKIGDLTNSHR*
SEQ ID NO:10：
MSRRGTRRQRDGNGDRGAASSSSPSTSPSHGPAGGWASQIR
Figure BDA00002771334900121
GGRTSVAVMLGDGAPVLL
Figure BDA00002771334900122
RRPPSSLLLMLFFFFFFHVQNACMPCSLAC*
[在所有情况下，本发明的生长因子的特征基序（Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys）以粗体表示，形成二硫桥的两个半胱氨酸以下划线示出，基序GRRRR的氨基酸序列以双下划线和粗体示出]。
假微型海链藻（硅藻）蛋白：
SEQ ID NO:11：
MAPALCGDLISTRRSFLALAWTLTTLLSFFSFVVAVFLAGRINQQYISMTSGDYAEWYTHEYGNDFYDRLLEEGSGECCRYLEGGEEGGGGEQQREGEDHDRQEGGSNDRNQLDAEFFQSLANANSRSLEFAGVYTTVLGIALSLYGSTVVVGFMSLKGEYIPPCFSFRSMSMIEEEGEVGVEDADTGPRNLWGEKIHRGVFLGCLVIFANLLLLCAVIFGELEVHDNYNNYDQQNNDNIFSYREKISSVFAIT
Figure BDA00002771334900123
VYVLFAVIYLSCGGMLDDDNDTVQHNTGNWMDHSHSQFELSPRGN
Figure BDA00002771334900124
RGRRDMPDKAEPLVSAVGGGITEIGCATRSDERAYVLDEGCIDETT*
[本发明的生长因子的特征基序（Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys）以粗体示出，形成二硫桥的两个半胱氨酸以下划线示出，基序GRRRR的氨基酸序列以双下划线和粗体表示]。
为了使本发明的生长因子具有期望的效果，即，增加光合生物体的生物量，必须使所述生长因子与所述光合生物体接触。本领域的现有技术中有多种方法使得能够将活性成分（在本发明中为本发明的生长因子）给予光合生物体，特别是植物。同样地，活性成分将以适宜于要使用的给予方法的方式配制。
通常，对于将本发明的生长因子给予光合生物体，它将是可以以固体形式或液体形式使用的组合物的部分，例如，以可润湿粉末的形式或并入常规稀释剂的可乳化浓缩物的形式。所述组合物可以以常规方式获得，例如，通过将本发明的生长因子与稀释剂以及可选地与其它成分或组分混合。在特定的实施方式中，光合生物体是植物，然后包含本发明的生长因子的组合物可以通过常规方法，通过将本发明的生长因子与稀释剂以及可选地与其它成分或组分混合而获得，这些成分或组分通常用于农用组合物并且是本领域技术人员已知的，如但不限于：溶剂、活性剂（active agent）或pH调节剂、肥料，等。在特定的实施方式中，作为添加剂给予本发明的生长因子以补充供给至溶液培养体系中植物的营养溶液，在另一个特定的实施方式中，给予至所述植物的灌溉水。
在组合物中的本发明的生长因子的浓度可以在较宽的范围内变化，典型地至少10-2至10-16M，通常至少10-4至10-12M，更通常至少10-6至10-11M，还更通常从10-8至10-10M。所述组合物另外的技术特征为，例如，可以使用农业用载体，可以并入另外的组分，其呈现形式，获得其的方法，等。
在本说明书所使用的意义中，术语“农业用载体（农业可接受的载体， agriculturally acceptable carrier）”包括可以在农业部门中使用的任何物质或物质的组合，并且其包括可以加入和/或与本发明的生长因子混合的任何农业用液体或固体物质，以便使其成为较简单或改进的应用形式，或具有适用的或期望的活化强度。
在本文中描述的组合物可以进一步包含，如果期望，其它通常用于农业组合物的成分或组分，如，但不限于：溶剂、活性剂或pH调节剂、肥料，等，条件是它们全都允许或不危害或损害本发明的生长因子增加植物生物量的能力。本领域技术人员通常已知用于农业组合物中的所述成分或组分。
本发明提供的组合物可以通过通常基于组合物的不同组分以适宜量混合的常规方法获得。
如上所述，本发明的方法可以用于任何光合生物体。在特定的实施方式中，本发明的方法将适用于特别需要增加生物量的那些光合生物体，如，例如，可以工业用于任何种类的工业的植物和藻类。因此，在特定的实施方式中，光合生物体是植物，例如，用于产生能量如可再生能量，用于人类或动物营养的植物、材种、观赏植物等。
其生物量用于产生燃料或可再生能量的植物的实例包括，但不限于：
（i）用于产生电能的植物：主要从快速生长的木材能量作物（woodenergy crop）中获得，如杨树、柳树、桉树、洋槐、松树、刺槐、香蕉树，等，以及草本植物，如蓟、芒草（miscanthus）、巨型芦苇（giant reed）、大戟、刺梨仙人掌（prickly pear cacti）等；以及
（ii）用于产生生物燃料的植物：产生从以下各项中获得的生物醇类：甜菜、玉米、甜高粱、甜藤、马铃薯、菊芋等，以及从油菜籽、向日葵、大豆等中获得的生物油类。
如本领域技术人员将理解的，将植物生物量用于获得热能以及产生燃料气体也是可能的。然而，由于这些过程的特性（热能包括应用直接燃烧系统以获得热量，以及燃料气体的产生包括在消化器（digester）中降解生物量以获得气体），用于产生所述能量的生物量可以来自于任何植物。
木材植物的实例包括，但不限于：松树、桉树、栓皮栎、雪松、橡树、圣栎，等。
关注的观赏植物的示例性非限制实例包括属于以下各项的植物：胭脂花（Aeschynathus）；美人蕉（Canna）；金鱼花（Columnea）；银莲花（Anemone）；杜鹃花（Azalea）；秋海棠（Begonia）；蒲包草（Calceolaria）；亚麻荠（Camelia）；石竹（Dianthus）；小苍兰（Freesia）；大丁草（Gerbera）；木槿（Hibiscus）；六角英（Hypoestes）；高凉菜（Kalanchoe）；花烟草（Nicotiana）；天竺葵（Pelargonium）；矮牵牛（Petunia）；樱草（Primula）；毛茛（Ranunculus）；假昙花（Rhipsalidopsis）；玫瑰（Rosa）；非洲堇（Saintpaulia）；大岩桐（Sinningia-gloxinia）；海豚花（Streptocarpus）；粗根鸢尾（Tigridia）；马鞭草（Verbena）；或百日草（Zinnia）属。其他观赏植物包括兰（兰（Orchidaceae）科）以及观赏灌木，其包括湾月桂（Laurusnobilis）、忍冬（Lonicera fragrantissima)、星木兰(Magnolia stellata)、八仙花(Hydrangea macrophylla)、金链花(Laburnum x watereri)、日本玫瑰或棣棠（Kerria japonica)，等。
用于人类或动物营养的植物的示例性非限制实例包括果树，其包括，但不限于，樱桃树、李子树、桃树、杏树（apricot tree）、橄榄树、芒果树、梨树、苹果树、枇杷树、温柏树、橘树、柠檬树、无花果树、木瓜树、栗子树、橡树、圣栎树、胭脂树、榛实树、杏树（almond tree）、胡桃树，等；草料植物，其包括，但不限于，豆类（例如，苜蓿、紫花苜蓿、蝶豆、落花生、含羞草、风铃草，等），草类（例如，黑麦草、牛毛草、野茅、蓝牧草、盖氏虎尾草、纤毛蒺藜草、须芒草、臂形草、被认为是牧草的百慕达草、以及象草、紫狼尾草、甜藤、台湾草、以及为收获草的玉米草，等），谷类（例如高粱、小麦、黑麦、大麦，等）；用于人类消耗的植物（莴苣、卷心菜、菠菜、瑞士甜菜、青豆、西红柿植物，等），等。
在另一个特定的实施方式中，光合生物体为藻类，例如，微藻如来自小球藻（Chlorella）、布朗葡萄藻（Botryococcus）、微拟球藻（Nannochloropsis）、雨生红球藻（Haematococcus）、富油新绿藻（Neochloris）、或融合微藻（Tetraselmis）的微藻；此外，包含于本发明的内容中藻类的示例性非限制实例包括肠浒苔（Aonori（Enteromorphaintestinalis）（单细胞绿藻中的多种）（日本））、爱森藻（Arame（Eiseniabicyclis））、翅菜（Badderlocks）、翅藻（jap.Sarumen（Alaria esculenta））、斑纹美叶藻（（Carola）（Callophyllis variegata）（南美））、角叉菜藓（Mastocarpus stellarus）、小球藻（Chlorella）、糖昆布（Laminariasaccharina）、褐藻（Durvillea antarctica）、掌状红皮藻（Palmaria palmata）、麒麟菜（Euchema cottonii）、海葡萄（Caulerpa lentillifera）、古拉曼江蓠（Gulaman）、古拉曼-达加江蓠（Gulaman-Dagat（Agardhiella tenera））、鹿尾菜（Hijiki o Hiziki（Sargassum fusiforme））、无肋马尾菜（Hondawara（Sargassum enerve））、箭尾鹿角菜（Chondrus crispus）、裂缘紫菜（Porphyralaciniata/Porphyra umbilicallis）、石莼（Ulva lactuca）、刺褐藻（Sargassumechinocarpum）、海带（Saccharina japonica）、鹿角藻（Miru（Codium sp.））、冈村枝管藻（Mozuku（Cladosiphon okamuranus））、紫菜（Nori（红藻紫菜中的多种））、掌状海带（Laminaria digitata）、龙须菜（Ogonori（红藻江蓠中的多种））、墨角藻（Fucus vesiculosus）、海囊藻（Seatron（Nereocystisluetkeana））、紫菜（Slack（Porphyra purpurea）、流苏紫菜（syn.Porphyralaciniata））、钝顶节旋藻（Arthrospira platensis）、极大节旋藻（Arthrospiramaxima）、伸长海条藻（Thongweed（Himanthalia elongata））、角叉菜（Tsunomato（红藻角叉菜中的多种））、裙带菜（Wakame（Undariapinnatifida），等。
本发明的基因构建体
本发明预期了实现本发明的生长因子增加光合生物体生物量的另一种可能性，包括向所述光合生物体的基因组中插入编码所述生长因子的核苷酸序列，以便当所述核苷酸序列表达时，其在光合生物体中具有期望的效果。
因此，本发明的另一方面涉及基因构建体，在下文中，本发明的基因构建体包含
（a）编码包含以下各项的肽的核酸序列：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中
-Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，以及
（b）用于调节其在光合生物体中表达的调控元件。
在特定的实施方式中，所述调控元件适宜于在藻类中调控编码所述肽的核酸序列的表达；本领域技术人员已知所述元件。
在另一个特定的实施方式中，所述调控元件适宜于在植物中调控编码所述肽的核酸序列的表达；本领域技术人员已知所述元件。
在特定的实施方式中，适宜于调控编码所述肽的核酸序列表达的调控元件不同于所述核酸序列，即，在所述核酸序列编码拟南芥蛋白（例如，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:6）的事件中，所述核酸序列在用于调控其在植物中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述拟南芥蛋白在所述植物中表达的调控元件不同，或在所述核酸序列编码水稻蛋白（例如，SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、或SEQ ID NO:10）的事件中，所述核酸序列在用于调控其在植物中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述水稻蛋白在所述植物中表达的调控元件不同，或在所述核酸序列编码假微型海链藻蛋白（例如，SEQ ID NO:11）的事件中，所述核酸序列在调控其在藻类中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述假微型海链藻蛋白在所述藻类中的表达的调控元件不同。
氨基酸Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4可以是相同的或彼此不同的。在特定的实施方式中，Xaa1、Xaa2、Xaa3、和/或Xaa4是与Cys不同的氨基酸。
因此，在特定的实施方式中，本发明的所述基因构建体包含
（a）编码包含以下各项的肽的核酸序列：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中
-Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，以及
（b）用于调控其在光合生物体中表达的调控元件。
前提是当所述核酸序列（a）编码选自由其氨基酸序列在SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中示出的蛋白质所组成的组中的蛋白质时，所述核酸序列（a）在调控其在植物中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述蛋白在拟南芥中表达的调控元件不同；
前提是当所述核酸序列（a）编码选自由其氨基酸序列在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中示出的蛋白质所组成的组中的蛋白质时，所述核酸序列（a）在调控其在植物中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述蛋白在水稻（oryza sativa sp）中表达的调控元件不同；以及
前提是当所述核酸序列（a）编码其氨基酸序列在SEQ ID NO:11中示出的蛋白质时，所述核酸序列（a）在调控其在藻类中表达的调控元件的控制下，该调控元件与天然调节所述蛋白在假微型海链藻（硅藻）中表达的调控元件不同。
在本发明的基因构建体的特定实施方式中，所述肽包含氨基酸序列
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2
其中：
-X1表示肽的氨基末端的氨基酸序列，以及
-X2表示肽的羧基末端的氨基酸序列。
尽管肽氨基末端的氨基酸序列（X1）的长度可以在较大范围内变化，但是在特定的实施方式中，X1具有包括1至250个氨基酸的长度，或甚至更典型的1至175个氨基酸，通常1至100个氨基酸，更通常1至50个氨基酸，甚至更通常2至40个氨基酸，还甚至更通常5至35个氨基酸。
同样地，尽管肽C末端的氨基酸序列（X2）的长度可以在较大范围内变化，但是在特定的实施方式中，X2具有包括1至250个氨基酸的长度，或甚至更典型的1至175个氨基酸，通常1至100个氨基酸，更通常1至50个氨基酸，甚至更通常2至40个氨基酸。
在特定的实施方式中，肽的C末端的氨基酸序列（X2）包括氨基酸序列GRRRR（SEQ ID NO:7），其在进一步特定的实施方式中位于与序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys的最后一个Cys相距10至50个氨基酸处。
在特定的实施方式中，X2的C末端是酰胺化的。
在另一个特定实施方式中，所述肽选自由以下各项组成的组：肾上腺髓质素和其氨基酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中示出的蛋白质，以及它们的功能性等价变体和片段。
本发明的基因构建体可以通过使用本领域的现有技术中已知的技术获得[Sambrock et al.,2001.″Molecular cloning:a Laboratory Manual",3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.,Vol.1-3]。本发明的所述基因构建体并入了，操作性结合至其中，用于调节其在光合生物体中表达的调控元件。如在本说明书中使用的，表述“操作性结合”意味着编码本发明的生长因子[即，包含氨基酸序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys的肽]的核酸序列在控制调控元件或表达调控序列的控制下在正确的读码框中表达。控制调控元件是控制和调控转录以及，在适当时，蛋白质的翻译的序列，其包括启动子序列、转录调控子的编码序列、核糖体结合序列（RBS）、和/或转录终止序列。
本发明的基因构建体可以通过任何适宜的方法插入光合生物体细胞，例如，植物细胞或组织，或藻类细胞的基因组中以获得转化的光合生物体。所述方法可以包括，例如，使用脂质体、电穿孔、扩散、粒子轰击、微注射、基因枪、增加自由DNA吸收的化合物，例如，与磷酸钙共沉淀、病毒载体，等。
因此，另一方面，本发明涉及包含本发明的基因构建体的载体。
在特定的实施方式中，所述载体是适宜转化藻类的载体；本领域技术人员已知所述载体（例如，WO2009149470披露了用于载体转化的藻类细胞的方法和组合物，其中，载体包含驱动耐抗生素基因在藻类细胞中表达的Vcp启动子）。
在另一个特定实施方式中，所述载体是适宜转化植物的载体；本领域技术人员也已知所述载体。在更特定的实施方式中，适宜转化植物的载体包括来源于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒的那些，如在EP120516中描述的那些。除了来源于土壤杆菌Ti或Ri质粒的转化载体，可替换的方法可以用于将基因构建体插入植物细胞和组织中，如，例如，但不限于，通过真空渗透方案。
另一方面，编码包含以下各项的肽的核酸：（i）氨基酸序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基之间形成二硫桥，[在下文中，核酸（a）]，以及本发明的基因构建体两者都可以并入包含原核复制子（即，当将其引入原核宿主细胞，如细菌时，能够引导自我复制以及使重组DNA分子保持在染色体外的DNA序列）的载体中。本领域已知所述复制子。此外，含有原核复制子的载体通常包含用于插入基因构建体的限制位点。本领域的现有技术已知这些载体，如，例如，在专利US6,268,552中描述的。
同样地，载体也可以包含用于在已转化的光合生物体，例如植物细胞和/或组织，或藻类细胞中检测异源DNA存在的标记物。使得能够在所述光合生物体，例如植物细胞中选择异源DNA的基因标记物，包括赋予耐抗生素，例如，氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、庆大霉素等的基因。新霉素磷酸转移酶基因具有在真核和原核细胞中表达的优点。标记物使得能够选择符合要求的经转化的光合生物体，例如，由于它们并入了适当的耐性基因，因而在含有相应抗生素的培养基中生长的植物。
引入所述核酸（a）以及引入所述基因构建体以转化光合生物体，例如，植物细胞或组织，或藻类细胞，以及产生转基因的光合生物体，例如，转基因植物或转基因藻类，如上所述，可以通过本领域已知的任何方法进行，包括，但不限于，由根癌土壤杆菌，优选用无突的（unarmed）T-DNA载体介导的DNA转化、电穿孔、直接DNA转化、粒子轰击，等。（对于这些主题的改变，参见，例如，Marta Izquierdo Rojo in“Ingeniería Genéticay Transferencia Génica”,1999,Ediciones Pirámide,S.A,Madrid）。
另一方面，本发明涉及包含所述核酸（a）、根据本发明的基因构建体、或如上所述的载体的宿主细胞。用于包含根据本发明的基因构建体或如上所述的载体的适宜宿主细胞包括，但不限于，原核细胞、酵母、或真核细胞，如，例如昆虫细胞。如本领域技术人员将理解的，取决于要转化的宿主细胞，本发明的基因构建体或包含其的载体可以含有表达控制序列，其可以在原核细胞和生物体，例如细菌等中起作用，或在真核细胞和生物体，例如，昆虫细胞、哺乳动物细胞等中起作用。
另一方面，本发明涉及转基因植物细胞或藻类，包含整合在其基因组中的本发明的所述核酸序列（a）或所述基因构建体。本领域的现有技术已知用于培养经转化的植物细胞和组织，或藻类以及再生转基因植物或藻类的技术，所述植物或藻类的培养和生长条件也是如此（参见，例如，上文引用的Marta Izquierdo（1999））。
因此，从用本发明的基因构建体转化的植物细胞，或用本发明的基因构建体转化的藻类获得的转基因植物，构成了本发明另外的发明方面。
本发明的生长因子的应用
取决于光合生物体，本发明的生长因子增加光合生物体生物量的能力具有在不同产业中的应用。因此，如在前述发明方面中表明的，本发明的生长因子可以用于增加将要用于产生能量、获得木材、人类或动物营养、或作为改善观赏植物外观的方式的花艺的藻类或植物的生物量。
以下实施例示出了本发明且绝不能认为限制其范围。
实施例1：在胡萝卜和烟草植物中增加植物生物量
材料及方法
胡萝卜（Daucus carota）和烟草（Nicotiana tabacum）愈伤组织由Carolina Biological Supply Company（Burlinton,NC,USA）提供，在无菌条件下保存在分别针对胡萝卜和烟草的固体愈伤组织诱导培养基中（也获自Carolina Biological）。其具体组分可在该公司的目录中获得。
将单个愈伤组织分成小部分，将这些小部分在无菌条件下称重，然后接种在含有不同浓度的合成肽人类肾上腺髓质素（AM）（PhoenixPharmaceuticals,Burlingame,CA,USA）的新鲜培养基（固体愈伤组织诱导培养基获自Carolina Biologicals）上。暗生长30天后，再次称取愈伤组织的重量并且将生长速率计算为最终重量除以初始重量的商。
各样品的干重通过使愈伤组织经受在250℃下的烘箱干燥过程12小时计算。
结果
在胡萝卜和烟草中都观测到了按照剂量依赖响应的愈伤组织的生长增加（图1）。刺激细胞生长的AM最有效的浓度为10-10M。在较低或较高浓度下都发生了较缓慢的生长增加。在AM的最佳剂量下，与对照相比获得了生物量60%的增加。
为了证实质量的增加不是由于组织水合增加，测量了组织的干重，并且发现保持了该差异，表明生物量的增加相当于涉及的组织的净生长。
在愈伤组织细胞中观测到的包括愈伤组织细胞生长（细胞增殖）增加的效果，完全转移至整个植物。有时细胞增殖的增加将影响植物的感官或物理性质。然而，植物中将产生生物量的增加，如在愈伤组织细胞中产生的那样。
实施例2：在小球藻（Chlorella）属的微藻中藻类生物量的增加
材料及方法
在两个单独的玻璃烧瓶中制备在Guillard F/2培养基中的小球藻的两份相同的培养物（各250ml）[Guillard,R.R.L.1975.Culture of phytoplanktonfor feeding marine invertebrates,pp26-60.In Smith W.L.and Chanley M.H（Eds.）Culture of Marine Invertebrate Animals,Plenum Press,New York,USA；Guillard,R.R.L.and Ryther,J.H.1962.Studies of marine planktonicdiatoms.I.Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve.Can.J.Microbiol.8:229-239]。然后向烧瓶中加入100μl的所述Guillard F/2培养基，向另一个烧瓶中加入含有足以达到10-8M的最终浓度的量的合成肽人类肾上腺髓质素（AM）（Phoenix Pharmaceuticals,Burlingame,CA,USA）的100μl所述Guillard F/2培养基。
向培养物中持续鼓入含有5%的CO2的空气。使用12小时光照/12小时黑暗的光周期照射烧瓶。
周期性收集来自培养基中的等份以分析微藻的生长。使用PerlinElmer Lambda35紫外/可见光光度计测量在680nm下的吸光度。
结果
与未经处理的微藻相比，经AM处理的微藻生长较快且更快地达到稳定生长期（stationary phase）。
Figure IDA00002771335600011
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Figure IDA00002771335600121

Claims (21)

1.一种用于增加光合生物体的生物量的方法，其包括在肽存在下培养所述光合生物体，所述肽包括：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的所述氨基酸序列的半胱氨酸残基在其之间形成二硫桥。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽包括
氨基酸序列
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2
其中：
X1表示所述肽的氨基末端的氨基酸序列，以及
X2表示所述肽的羧基末端的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中X2的氨基酸序列包含序列GRRRR（SEQ ID NO:7）。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述氨基酸序列GRRRR（SEQ IDNO:7）位于与序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys的最后一个Cys相距10至50个氨基酸处。
5.根据权利要求1所述的方法，其中X2的C末端是酰胺化的。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中X1具有1至250个氨基酸的长度和/或X2具有1至250个氨基酸的长度。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽为肾上腺髓质素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述肽选自由其氨基酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11中示出的肽、和它们的组合所组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述光合生物体为植物或藻类。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述光合生物体为植物，且所述肽作为添加剂而给予，以补充在溶液培养体系中供给所述植物的营养溶液，或将其给予至所述植物的灌溉水。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物选自用于产生可再生能量的植物、用于人类或动物营养的植物、材种、和观赏植物。
12.一种基因构建体，包括：
（a）编码肽的核酸，所述肽包括：
（i）氨基酸序列
Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]
其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及
（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基在其之间形成二硫桥，以及
（b）用于调节其在光合生物体中表达的调控元件，
前提是，当所述核酸序列（a）编码选自由其氨基酸序列在SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中示出的蛋白质所组成的组中的蛋白质时，所述核酸序列（a）在用于调控其在植物中表达的调控元件的控制下，所述调控元件与天然调节所述蛋白质在拟南芥（Arabidopsis sp.）中表达的调控元件不同；
前提是，当所述核酸序列（a）编码选自由其氨基酸序列在SEQID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中示出的蛋白质所组成的组中的蛋白质时，所述核酸序列（a）在用于调控其在植物中表达的调控元件的控制下，所述调控元件与天然调节所述蛋白质在水稻（Oryza sativa sp.）中表达的调控元件不同；以及
前提是，当所述核酸序列（a）编码其氨基酸序列在SEQ ID NO:11中示出的蛋白质时，所述核酸序列（a）在用于调控其在藻类中表达的调控元件的控制下，所述调控元件与天然调节所述蛋白在假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）中表达的调控元件不同。
13.根据权利要求12所述的基因构建体，其中所述肽包含氨基酸序列
X1-Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys-X2
其中：
X1表示所述肽的氨基末端的氨基酸序列，以及
X2表示所述肽的羧基末端的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的基因构建体，其中X2的氨基酸序列包含序列GRRRR（SEQ ID NO:7）。
15.根据权利要求12所述的基因构建体，其中所述氨基酸序列GRRRR（SEQ ID NO:7）位于与序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys的最后一个Cys相距10至50个氨基酸处。
16.根据权利要求12所述的基因构建体，其中所述肽是肾上腺髓质素。
17.根据权利要求12所述的基因构建体，其中所述肽选自由其氨基酸序列在SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11中示出的肽所组成的组。
18.一种载体，包含根据权利要求12至17中任一项所述的基因构建体。
19.一种宿主细胞，包含编码肽的核酸、或根据权利要求13至18中任一项所述的基因构建体、或根据权利要求19所述的载体，所述肽包括：（i）氨基酸序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基在其之间形成二硫桥。
20.一种转基因光合生物体细胞，包含整合在其基因组中的编码肽的核酸、或根据权利要求12至17中任一项所述的基因构建体，所述肽包括：（i）氨基酸序列Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys[SEQ ID NO:1]，其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、和Xaa4独立地表示氨基酸，以及（ii）在（i）中示出的氨基酸序列的半胱氨酸残基在其之间形成二硫桥。
21.一种转基因光合生物体，包含至少一个根据权利要求20所述的转基因光合生物体细胞。
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