CN103031374A - 一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用。所述基因芯片包括针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。本发明芯片通过一次实时、同步、高通量检测神经－免疫－内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价畜禽在运输应激后上述指标的典型变化，对于评价运输过程中畜禽的机体状况及生产性能具有指导意义。本发明芯片不仅将在新药研究中体现节省样品、节省时间，同时节省资金，具有重大实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于评价运输应激模型的基因芯片及其应用。
背景技术
运输应激(transport stress)是指在运输途中的禁食/限饲、环境变化(混群、密度、温度、湿度)、颠簸、心理压力等应激原的综合作用下，动物机体产生本能的适应性和防御性反映，是影响动物生产的重要因素之一。运输应激条件下，动物往往表现为呼吸、心跳加速，恐惧不安、性情急躁，体内的营养、水分大量消耗，并最终影响动物的生产性能、免疫水平及畜产品品质。
运输应激的机理为动物受到应激原的作用后，下丘脑兴奋，分泌促肾上腺皮质释放激素，通过垂体门脉系统进入垂体前叶，使垂体前叶分泌肾上腺皮质激素（ACTH）增多，ACTH通过血液循环到达肾上腺，促使糖皮质激素的释放。应激初期分泌的肾上腺，也可刺激垂体前叶释放ACTH，ACTH分泌的增多，阻碍某些营养物质的吸收，加强分解代谢，抑制炎症和免疫反应，致使机体抵抗力下降。应激原的强度大，作用持久时，肾上腺皮质分泌功能衰竭，可造成动物发病和死亡。
目前对于运输应激模型的评价并没有一个确定的标准，大多时候用皮质醇、儿茶酚胺等激素水平的变化来衡量应激的发生，但导致激素变化的影响因素太多，且其自身的代谢速度快，不能稳定和确切的指示机体实际的应激状态，所以我们引入基因芯片这一新技术。基因芯片技术作为基因诊断、相关基因确定、疾病分子机理分析、药物筛选等重要工具，具有高通量、并行性及样品消耗量少的优势，在中药研究尤其是新药的设计筛选开发独具魅力，能够进行大规模筛选，在药物与基因间架起一座桥梁，通过基因表达谱芯片实验可以同时观察成千上万个基因在不同个体、不同组织、不同发育阶段的表达状况，从疾病及药物两个角度对生物体的多个参数同时进行研究，发掘药物靶点并同时获取作用机制的相关信息，改变了传统的一次实验仅对单个或几个基因表达差异进行观察，为多环节药物作用机制的研究提供了有力工具。
因此，我们希望通过基因表达谱分析找到能够评价动物运输应激模型的基因芯片。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于评价运输应激模型的基因芯片。
本发明另一目的是提供一种包括上述基因芯片的试剂盒。
本发明又一目的是提供一种利用上述基因芯片或试剂盒评价运输应激模型的方法。
本发明提供的评价运输应激模型的基因芯片，其主要针对以下基因产生的RNA、CRNA或CDNA进行检测：
1、细胞死亡相关基因：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。
2、免疫相关基因：RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、B4galt1、Gpx2、Ptprc、Ctnnb1、Apob、S100a9、Itga6、Tgfbr1、Hmox1。
3、氧化应激相关基因：Scd1、Gpx2、Akr1c21、Hmox1、Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Aldh1a1、Fmo1、Cyp2j10。
4、应激应答相关基因：Fgb、B4galt1、Sphk1、Il24、Nrep、Adm、Fga、Acvr1、Aqp2、Ptprc、Gpx2、Bcl2l1、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、Ppp1r15b、Tgfbr1、Hmox1、Gdnf、Casc3、Nox1、Cyp1a1、Aldh1a1、Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax。
一种优选的组合应当具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax、RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scd1、Gpx2、Akr1c21、Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Fmo1、Cyp2j10、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp1r15b、Casc3、Hspa8、Tfrc。
利用上述基因芯片对目的基因进行检测后，通过以下运输应激综合症评价标准进行检验：
1、细胞死亡相关基因：上调Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Gdnf、Lifr；下调Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。T检验P<0.01。
2、免疫相关基因：上调Ptms、B4galt1、Gpx2、Ptprc、Ctnnb1、Apob、S100a9、Itga6、Tgfbr1、Hmox1；下调RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3。T检验P<0.01。
3、氧化应激相关基因：上调Scd1、Gpx2、Akr1c21、Hmox1；下调Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Aldh1a1、Fmo1、Cyp2j10。T检验P<0.01。
4、应激应答相关基因：上调Fgb、B4galt1、Sphk1、Il24、Nrep、Adm、Fga、Acvr1、Aqp2、Ptprc、Gpx2、Bcl2l1、Rela、Tnrc6a、Pdcd6ip、Ppp1r15b、Tgfbr1、Hmox1、Gdnf、Casc3；下调Nox1、Cyp1a1、Aldh1a1、Hspa8、Tfrc、Tlr9、Bax。T检验P<0.01。
本发明中所述的探针可以是上述相应基因的核酸序列、其互补序列，或者它们的片段，它们被固定在适于检测反应的固相载体上，制成基因芯片。本发明中所述固相载体可选用本领域中众所周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果。优选的，本发明所述固相载体为玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片等。
本发明所述基因芯片可包含在一个试剂盒中，其中还可以包括用于评价反应的相应试剂、缓冲液以及说明书等。其包括对上述基因产生的RNA或表达产物测定的全部或部分试剂，典型地，测定RNA的试剂包括荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及其原位RT-PCR，Northern检测试剂盒等，测定蛋白表达产物的试剂盒，包括ELISA试剂盒、抗体芯片等。
在本发明的实施方案中，所述固相载体为玻璃片，玻璃片用多聚赖氨酸进行处理，向其上固定具有本发明所选的基因特征性片段，利用机械手点印芯片，并将芯片重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性，得到评价用基因芯片。同时以荧光素标记待测样品，和芯片进行杂交。
在本发明中，待测样品核酸的抽提可采用异硫氰酸胍稳定法，用分光光度计对RNA定量。
本发明所述评价用基因芯片采用了下述严格交反应条件。依据本发明所选择的条件，可实现使大量杂交反应中的大多数反应物处于最佳状况中，从而使尽可能多的配对物都不遗漏，即减少假阳性的可能，将错配降到最低。
（1）预杂交芯片：
I.取出芯片，平衡至室温；
II.加入1×杂交Buffer；
III.45℃，60rpm，预杂交10min。
（2）杂交液的配制：
表1杂交液的配制
| 配方 | 300μl | 终浓度 |
| 1 | 片段化cRNA(0.5mg/ml) | 30μl | 0.05μg/μl |
| 2 | Oligo B2对照(3nM) | 5μl | 50pM |
| 3 | 20×Hybridizition control | 15μl | 1× |
| 4 | 鱼精DNA(9.3mg/ml) | 3.3μl | 0.1mg/ml |
| 5 | 乙酰化BSA(20mg/ml) | 7.5μl | 0.5mg/ml |
| 6 | 2×杂交Buffer | 150μl | 1× |
| 7 | DMSO | 30μl | |
| 8 | RNase-Free Water | 59.2μl |
I.杂交液混匀，离心片刻；
II.99℃，温浴5min；
III.将杂交液转至45℃，温浴5min；
IV.离心机最大转速离心5min。
（3）杂交芯片
I.吸出芯片中的1×杂交Buffer；
II.将杂交液加入到芯片中；
III.45℃，60rpm，杂交16h。
本发明中所用试剂均为常规试剂，包括用于标记的试剂：MessageAmpTM II-Biotin（Ambion公司，＃1791）、1 Poly-A RNAControl Kit(Affymetrix公司，P/N 900433)、1 Hybridization Control Kit(Affymetrix公司，P/N 900454)；用于清洗和染色的试剂：分子生物学级用水（BioWhittaker Molecular Applications/Cambrex,P/N51200）、蒸馏水（Invitrogen Life Technologies,P/N 15230-147）、牛血清白蛋白(BSA、50mg/mL)（Invitrogen Life Technologies,P/N15561-020)、R-Phycoerythrin Streptavidin（分子探针，P/N S-866）、5M NaCl（无RNA酶、无DNA酶）（Ambion,P/N 9760G）、20×SSPE(3M NaCl,0.2M NaH2PO4,0.02M EDTA)（BioWhittaker MolecularApplications/Cambrex，P/N 51214）、羊IgG（Sigma-Aldrich,P/N I5256）、Anti-streptavidin抗体(羊)（生物素化Vector Laboratories,P/NBA-0500）、10%Surfact-Amps 20(Tween-20)（Pierce Chemical,P/N28320）等。
基于以上技术方案，本发明具有以下优点和效果：
（1）本发明首次将上述差异表达明显的基因聚类后采用生物芯片技术应用于对运输应激模型的评价，并通过一次实时、同步、高通量检测神经－免疫－内分泌指标的变化多层次、多靶点全面评价畜禽在运输应激后上述指标的典型变化。
（2）本发明首次将细胞凋亡、氧化应激和免疫相相关基因结合起来作为运输应激综合症的评价指标，上述指标对于评价运输过程中畜禽的机体状况及生产性能具有指导意义。
（3）本发明芯片不仅将在新药研究中体现节省样品、节省时间，同时节省资金，具有重大实际意义。
附图说明
图1为应激前后大鼠体重、体温变化。
图2为应激前后大鼠血清生化指标变化，应激前为对照组。
图3为应激前后大鼠空肠组织解剖学观察，应激前为对照组。
图4为应激前后大鼠空肠组织光镜下观察，应激前为对照组。
图5为应激前后大鼠空肠组织电镜下观察，应激前为对照组。
图6为应激前后大鼠空肠TUNEL染色，应激前为对照组。
图7为变化5倍以上基因聚类分析，a为cell death相关基因聚类分析；b为氧化还原相关基因聚类分析；c为应激应答相关基因聚类分析。
图8为应激前后大鼠部分变化基因PCR验证，应激前为对照组。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基因芯片的制备
关于本发明所述基因芯片的制备，可采用如下详述的通用策略。
1、载玻片处理
首先充分清洗载玻片，用25×NaOH溶液200mL加300mL 95％乙醇配成500mL碱性清洗液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清水冲洗5遍并将载玻片泡在水中。接下来就是用多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mL多聚-L-赖氨酸浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，1h后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般将涂好的载玻片用锡箔纸包好，室温放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。
2、基因芯片的点印
点印DNA用机械手。将一组处理好的载玻片固定在一个平台上，将DNA样品（溶在50%DMSO中，0.25-0.75μg/μl）装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上约1μl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上．每个载玻片上大约点0.5μl的DNA溶液。点样的质量要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性，矩阵24×24，每个样品重复4次，每张芯片上下两个矩阵。
3、基因芯片的后加工处理
当基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性后备用。
3.1重新水合化：通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点中都分布均匀。需要对之进行重新水和化并进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时，点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件，本芯片采用的是相对湿度70%环境水合2h，室温干燥0.5h。
3.2UV交联：当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量．在UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为65MJ/cm。
3.3封闭：封闭主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么，将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑．而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结合．这一过程一般在15min内结束。
3.4变性处理：当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将整个载玻片立即浸入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3～5次，停留2min，然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。
实施例2本发明所述基因芯片检测待测样品的通用策略
1、待测样品的标记
依照所检测对象的不同，选择具体的待测样本，依照如下方法提取核酸样品，并对所得待测样品核酸进行生物素标记。
RNA的提取方法：（参见分子克隆：实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等著黄培堂等译518-522页）；对待测样品的核酸进行提取。
生物素标记：以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增，RNA/T7-Oligo（dT）作为引物合成双联cDNA，再以cDNA为模板合成cRNA，并用生物素-NTP进行标记。
2、基因芯片与待测样品的杂交
取出芯片平衡芯片至室温，参见下表配制杂交液
表2杂交液的配制
| 配方 | 300μl | 终浓度 | |
| 1 | 片段化cRNA(0.5mg/ml) | 30μl | 0.05μg/μl |
| 2 | Oligo B2对照(3nM) | 5μl | 50pM |
| 3 | 20×Hybridizition control | 15μl | 1× |
| 4 | 鱼精DNA(9.3mg/ml) | 3.3μl | 0.1mg/ml |
| 5 | 乙酰化BSA(20mg/ml) | 7.5μl | 0.5mg/ml |
| 6 | 2×杂交Buffer | 150μl | 1× |
| 7 | DMSO | 30μl | |
| 8 | RNase-Free Water | 59.2μl |
根据芯片类型确定需要配制的体积，这已将杂交过程中会损失部分（10-20μL）杂交液考虑在内。将杂交液置于加热块上，99℃温育5min。其间，用一次性吸头通过一个septa（芯片上septa位置）注入相应体积1×杂交缓冲液将芯片置于杂交炉中，45℃温育10min，60rpm旋转。将99℃已温育5min的杂交液转移到另一加热块上，45℃温育5min。从加热块上取出杂交液，微型离心机最大转速离心5min，以除去杂交混合液中的不溶性物质。从杂交炉中取出芯片，吸出1×杂交缓冲液，将杂交液加入到芯片中，将芯片平衡放置于杂交炉中，45℃，60rpm旋转杂交16h。
3.杂交结果的检测
将杂交完毕的芯片用
Scanner 3000（Affymetrix，USA）激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。
实施例3运输应激模型评价芯片实例
本例用35℃、60n/min的条件模拟运输应激2小时，连续3天，研究应激后大鼠临床症状、肠道组织形态学变化，细胞凋亡及基因变化，并通过本发明芯片来进行检测和验证。
一、材料和方法
1.1动物分组和饲养
20只体重为250±20g雄性SD（sprague-Dawley）大鼠（购自北京维通利华试验动物技术有限公司）。供试大鼠在温度25℃，湿度45%环境下适应性饲养3天（每天上午定时给料，自由饮水）。随机分为对照组和应激组，每组10只。饲喂商品鼠粮（每天定量200g）。
1.2试验处理
应激组大鼠于摇床中35℃、60n/min，每天上午9:00-11:00处理连续3天，对照组于室温下正常饲养。
1.3样品和指标数据采集
在第3天处理完大鼠后立即眼球采血用于血清生化检测，短颈处死取空场（距离幽门口20cm）组织用灭菌生理盐水冲洗干净分为4部分①10%甲醛固定②基因芯片检测③④液氮冻透后-80℃保存。
1.4动物临床表现
每天在应激前即9:00记录大鼠体重、体温，11：00即应激后记录大鼠体重、体温。观察应激前后大鼠的精神状态，生理行为变化，并拍照片。
1.5血清皮质醇及血糖检测
血样，37℃放置60min，4℃下3000r/min离心10min，取上清200ul分装，冷藏送于中国农业大学动物医院检测皮质醇和血糖的含量。
1.6空肠组织形态学检测
1.6.1空肠组织眼观及光镜下形态学变化
大鼠处死后，打开腹腔，拍照记录腹腔脏器眼观变化。
用中性甲醛固定空场组织24h，然后经脱水、透明、浸蜡、包埋处理制成石蜡切片，石蜡切片再经二甲苯：无水酒精(1:1)、无水酒精及95％酒精-80％酒精-70％酒精-50％酒精等梯度酒精脱蜡脱水(各2min)，用Ehrlieh苏木精溶液染色约10-15min，用蒸馏水洗去多余染料后，入0.5％盐酸酒精溶液分色(10～15s钟)，以镜检为准，用自来水蓝化15～30min，经蒸馏水洗后，梯度酒精上行至95％酒精(各l～2min)，入0.5％伊红酒精液染30s至1min，再依次入95％酒精和无水酒精脱水(各1～3min)，经二甲苯：无水酒精(1:1)，二甲苯透明，中性树胶封片。日本Olympus BH2生物显微镜下（10*20/10*40）观察组织变化。
1.6.2空肠组织电镜变化
用锋利刀片取1mm3的空肠组织，入戊二醛固定液中，固定24h(4℃)，0.1M磷酸缓冲液清洗3次（每次3～5min），用1%锇酸固定标本2h(4℃)，再经30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇(可过夜保存)、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮梯度脱水（10min）；100%丙酮(用干燥剂处理过)脱水2次，每次10min，然后将标本移入环氧树脂与丙酮1:1的混合液中，浸润标本，放于抽湿机上2h，再将标本放入点有环氧树脂的标本盒内，置于35℃烘箱内2h；后将标本滤纸上吸干，再放入点有环氧树脂的标本盒内，70℃温箱过夜聚合。制作超薄切片(60～80nm)，柠檬酸铅染色10min。双蒸水清洗数分钟，滤纸吸干，JEM-1230透射电镜(日本JEOL公司)观察空肠黏膜上皮细胞结构。
1.7基因芯片扫描
取对照组和应激组空肠组织每组6个样匀浆，提取RNA，用大鼠全基因寡聚DNA芯片进行分析，方法同实施例2。该芯片选自Agilent大鼠寡聚DNA芯片（4×44K)，Agilent G4131F（上海生物芯片有限公司），该芯片含有针对上述基因的寡核苷酸探针，所述探针的探针号、基因名、基因号如表3所示。
表3检测探针
| 探针号 | 基因名 | 基因号 |
| A_44_P524566 | Actc1 | NM_019183 |
| A_44_P454202 | Acvr1 | NM_024486 |
| A_43_P11527 | Adm | NM_012715 |
| A_44_P323773 | Akr1c21 | NM_001013057 |
| A_44_P365286 | Aldh1a1 | NM_022407 |
| A_44_P402346 | Apob | NM_019287 |
| A_42_P763077 | Aqp2 | NM_012909 |
| A_44_P879764 | B4galt1 | NM_053287 |
| A_43_P11800 | Bax | NM_017059 |
| A_44_P548065 | Bcl2l1 | NM_031535 |
| A_44_P489244 | Casc3 | NM_147144 |
| A_44_P540570 | Cox7c | NM_001134705 |
| A_44_P409339 | Ctnnb1 | NM_053357 |
| A_44_P321009 | Cyp1a1 | NM_012540 |
| A_44_P448154 | Cyp2j10 | NM_001134980 |
| A_44_P332328 | Fga | NM_001008724 |
| A_43_P10037 | Fgb | NM_020071 |
| A_44_P283508 | Fmo1 | NM_012792 |
| A_44_P365470 | Gdnf | NM_019139 |
| A_44_P500056 | Gpx2 | BQ196649 |
| A_44_P298331 | Gsdma1 | NM_001108297 |
| A_43_P11472 | Hmox1 | NM_012580 |
| A_44_P396546 | Hspa8 | NM_024351 |
| A_43_P15489 | Il24 | NM_133311 |
| A_44_P187056 | Itga6 | XM_002729169 |
| A_44_P263355 | Lifr | NM_031048 |
| A_44_P330692 | Naip2 | AJ271303 |
| A_44_P356344 | Ndufc2 | NM_001009290 |
| A_44_P421322 | Nox1 | NM_053683 |
| A_44_P635239 | Nrep | AY724475 |
| A_44_P520840 | Pdcd6ip | NM_001029910 |
| A_44_P351211 | Phlda1 | NM_017180 |
| A_44_P1035051 | Ppp1r15b | NM_001107175 |
| A_43_P10391 | Ppp3r1 | NM_017309 |
| A_43_P12707 | Ptms | NM_031975 |
| A_44_P135213 | Ptprc | NM_001109890 |
| A_44_P184726 | Rela | NM_199267 |
| A_44_P1052504 | Rhot2 | NM_181823 |
| A_44_P86724 | RT1-CE16 | NM_001008839 |
| A_44_P274061 | RT1-CE3 | NM_001008841 |
| A_44_P172850 | RT1-CE5 | NM_001008843 |
| A_44_P353618 | S100a9 | NM_053587 |
| A_44_P550145 | Scd1 | NM_139192 |
| A_44_P445572 | Sort1 | NM_031767 |
| A_44_P381917 | Sphk1 | NM_133386 |
| A_43_P15662 | Tfrc | NM_022712 |
| A_44_P703479 | Tgfbr1 | NM_012775 |
| A_44_P294706 | Tlr9 | NM_198131 |
| A_44_P161343 | Tnrc6a | NM_001107549 |
| A_44_P39879 | Tpt1 | NM_053867 |
1.8荧光定量PCR验证芯片数据。
1.8.1RNA提取
称取90～100mg空肠组织于盛有液氮的研钵中，研磨成粉状后加入1mL TRIzol试剂，继续充分研磨，转入1.5mL的Eppendof管中，室温放置5min。加入200μL氯仿，振荡混匀，2～8℃12000rpm，离心15min，移上清（水相）于一新Eppendof管中，加入500μL异丙醇混匀，室温放置15min，2～8℃，12000rpm离心10min，弃上清。加1mL 75%乙醇，洗涤1次（适度震荡混匀），4℃小于7500rpm离心5min，弃乙醇。（不要回流液体，应缓慢倾斜移除废液），室温稍微晾干，RNA略显透明，加入0.1%DEPC水20～40μL，缓慢用枪头吹吸5～8次，溶解混匀并置于-20'C或-80℃保存备用。
用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40μg/mL。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0（比值最好在1.9～2.1之间）。
1.8.2RI-PCR
依次取2.0μL oligo-dT18（10mmol/L）与2.0μL dNTPs（10mmol/L加入到有2.0μL RNA（1μg/μL）的1.5mL Eppendof管中，75℃变性5min，立即置冰上冷却。然后每管中加入2.0μL M-MLV反转录酶（200U/μL）.8.0μL 5×反转录酶反应缓冲液（10mmol/L），0.8μL RNA酶抑制剂（50U/μL），用灭菌的0.1%DEPC处理水补足总体积至40μL 37℃反应2h，95℃灭活反转录酶5min，立即使用或-20℃保存。
1.8.3荧光PCR的引物、反应体系和程序
根据GenBank发表的大鼠的Bax、Bcl-212、GPX2等基因序列，使用Primer premier 5.0和DNAMAN生物软件分别在相对保守的区域设计PCR特异引物，由上海生物工程公司合成。引物序列见表1。将冻干粉状态的引物用灭菌超纯水，配制成20pmol/L溶液，-20℃保存。
表4PCR引物
PCR反应体系：1.0μL cDNA，1.0μL引物，10μL Briliant SYBRGreen QPCR master Mix，0.3μL ROX，补水至20μL。
反应条件：94℃预变性5min。94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s，40个循环。溶解曲线条件为：95℃1min；55℃30s；95℃30s。
二、结果
2.1动物临床表现
与对照组相比，用摇床35℃、60n/min、2h/d，连续3天处理后大鼠被毛湿透、精神萎靡，排泄增加，并有洗脸行为。
2.2大鼠体重体温变化
如图1所示，与对照组相比，应激后大鼠体重显著下降（p<0.05），体温均显著升高（p<0.05），平均达到39.5℃。
2.3大鼠血清生化指标变化
如图2所示，与对照组相比，应激组大鼠皮质醇及血糖均显著升高(p<0.05)。应激后，动物机体通过升高血糖来应对外界环境变化带来的刺激；同时机体快速启动下丘脑-肾上腺-皮质轴，使血清中皮质醇水平迅速升高。
2.4空肠组织形态学变化
2.4.1大鼠空肠组织解剖学变化
如图3所示，与对照组相比，应激组大鼠肠道充血、出血，肠道鼓气严重。
2.4.2大鼠空肠组织光镜观察
如图4所示，对照组大鼠空场绒毛结构比较完整，应激组的肠道绒毛损伤,顶端脱落至肠腔,固有层裸露,肠道结构完整性破坏。
2.4.3大鼠空肠组织电镜观察
如图5所示，对照组空肠上皮细胞微绒毛排列整齐，细胞器如线粒体结构相对清晰，运输应激大鼠小肠黏膜上皮微绒毛变短、排列稀疏不整；线粒体、转运小泡及次级溶酶体数量增加。细胞间连
2.4.4大鼠空肠组织凋亡检测
如图6所示，应激组空肠凋亡细胞明显多于对照组。
2.5芯片差异数据
2.5.1上调5倍以上基因数据
表5上调5倍以上基因数据
2.5.2下调5倍以上基因数据
表6下调5倍以上基因数据
2.5.3变化5倍以上基因聚类分析
如图7所示，3列control_1、control_2、control_3为对照组，3列stress_1、stress_2、stress_3为应激组，最右边为基因名缩写。红色表示基因表达上调，黑色表示基因表达没变化，绿色表示基因表达下调。7a为cell death相关基因聚类分析；7b为氧化还原相关基因聚类分析；7c为应激应答相关基因聚类分析。
2.5.4部分变化基因PCR验证
如图8所示，挑选部分基因进行RT-PCR对基因芯片进行验证，其与基因芯片中数据变化趋势一致。
2.6差异基因GO（Gene Ontology）分析
表7中所列数据表明显著变化基因的功能分类，即这些基因的变化影响了机体哪一方面功能反应。如显著变化的基因中有21个与机体的外源性刺激应答有关，这21个基因占了该功能相关基因总数867中的2.42%，p<0.01(GO:0009605)。
表7变化5倍以上差异基因GO分析
2.7差异基因Pathway分析
表8所列数据展示了基因芯片检测到的显著变化基因参与机体活动所涉及的信号通路，如检测到8个显著变化基因是与凋亡通路相关，其占凋亡通路总基因（99）数的8.08%，p<0.01。
表8变化5倍以上差异基因Pathway分析
结论：通过对大鼠临床表现、血清生化指标、组织形态学检测、凋亡检测以及部分基因的RT-PCR验证试验，结果表明本基因芯片评价体系的准确率可达80%以上。
运输应激对于动物而言是一种强烈应激，是造成动物应激反应的重要原因之一。动物运输过程中的驱赶、装卸、震动、摩擦、碰撞、高温、饥渴等因素将会引起应激综合征，导致动物发生行为、生理变化并最终导致组织损伤。随着大鼠、小鼠、兔、狗、猪等动物基因组测序的完成，研制实用的基因组芯片，利用基因芯片技术从整体、器官、细胞等水平筛选有关基因的差异表达，获取并归纳与应激综合症相关的关键特征信息，以确定运输应激综合症的基因表达谱情况，进而利于选择功效相关稳定的中药方剂，从而建立相应的运输应激模型评价体系，其对中兽药的新药研发具有重要意义为后续研究某个具体基因的功能指明方向，提高研究的目的性和有效性；同时可以在充分分析基因芯片数据的生物学意义的基础上，利用基因敲除和基因高表达等分子生物学实验手段，对某些重要功能基因在细胞活动中的生物学功能改变提供了基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种用于评价运输应激模型的基因芯片，其具有针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，还包括针对下述基因产生的RNA、cRNA或cDNA进行检测的探针中的一种或多种：RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scd1、Gpx2、Akr1c21、Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Fmo1、Cyp2j10、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp1r15b、Casc3、Hspa8、Tfrc。
3.根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于，所述探针为来自下述基因的核酸序列或其互补序列：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax、RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S 100a9、Itga6、Scd1、Gpx2、Akr1c21、Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Fmo1、Cyp2j10、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp1r15b、Casc3、Hspa8、Tfrc。
4.一种用于评价运输应激模型的试剂盒，其包括针对下述基因产生的RNA、cRNA、cDNA或其表达产物进行测定的试剂：Gdnf、Lifr、Ppp3r1、Sphk1、B4galt1、Phlda1、Il24、Adm、Gsdma1、Acvr1、Naip2、Aqp2、Ptprc、Bcl2l1、Rela、Ctnnb1、Pdcd6ip、Tgfbr1、Hmox1、Sort1、Tpt1、Aldh1a1、Actc1、Rhot2、Bax。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其还包括针对下述基因产生的RNA、cRNA、cDNA或其表达产物进行测定的试剂：RT1-CE5、RT1-CE16、Tlr9、RT1-CE3、Ptms、Apob、S100a9、Itga6、Scd1、Gpx2、Akr1c21、Ndufc2、Nox1、Cox7c、Cyp1a1、Fmo1、Cyp2j10、Fgb、Nrep、Fga、Tnrc6a、Ppp 1r15b、Casc3、Hspa8、Tfrc。
6.根据权利要求4或5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为：a）检测RNA、cRNA、cDNA的试剂盒：荧光定量PCR检测试剂盒，原位杂交及原位RT-PCR,Nouthern检测试剂盒中的一种或几种；
或b)检测表达产物的试剂盒：ELISA试剂盒或抗体芯片试剂盒中的一种或几种。
7.权利要求1-3任一项所述基因芯片、权利要求4-6任一项所述试剂盒在用于评价运输应激模型中的应用。
8.一种用于评价运输应激模型的方法，其特征在于，利用权利要求1-3任一项所述基因芯片或权利要求4-6任一项所述试剂盒对所述运输应激模型基因进行检测，通过基因的差异性表达进行聚类分析，从而评价运输应激模型。
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| CN106226836A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-14 | 北京农业信息技术研究中心 | 基于太赫兹技术的畜禽体内芯片获取装置及方法 |
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