CN103018388A - 一种以己醛含量判别甜玉米烫漂终点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甜玉米烫漂终点的判别方法。具体步骤为:1)甜玉米粒液氮速冻后,与pH7.0的磷酸缓冲液1∶4(w/v)进行冰浴匀浆;2)取8mL匀浆于萃取瓶中,升温至60℃,并在此温度下,顶空固相微萃取20min;3)采用气相色谱质谱联用法检测挥发性成分,解析温度220℃,解析2min;4)在设定升温程序及分离色谱柱条件下,综合质谱图、标准样品的保留时间比对以及保留指数对己醛定性分析,再根据标准曲线进行定量分析。5)甜玉米中己醛含量低于4μg/g时,为烫漂终点。试验结果表明该方法具有准确率高、与速冻甜玉米贮藏期品质具有良好相关性等优点。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种甜玉米中己醛生成量的测定方法,可用于甜玉米烫漂终点的判定。
二、背景技术
甜玉米是指乳熟期采收并用于食用的玉米,甜玉米在氨基酸、水溶性蛋白、维生素及微量矿物质元素等营养成分上高于老玉米,并且甜玉米具有适口性好,香甜可口,易于消化吸收等特点而受到消费者欢迎。
但由于甜玉米采收时处于玉米生命活动的旺盛期,采收后品质下降很快,速冻为甜玉米最常用的加工方法。但是在低温下,酶仍保持一定的活性,尤其是一些参与脂肪氧化的酶使得速冻玉米易出现氧化味、陈腐味等不良风味。因此用于速冻或其它加工前,甜玉米需要经过烫漂灭酶。
甜玉米的烫漂一般以过氧化物酶的活性为指标来判断终点。过氧化物酶为最耐热的酶,基于节约能源的角度,很多专家提出以与风味直接相关的关键酶,脂氧合酶的失活为标志。脂氧合酶活性的测定一般采用分光光度计法,如专利“一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法”(申请号201110096159.4),此种方法基于脂氧合酶以亚油酸为底物时,产物羟过氧化物(在234nm有特定吸收)的生成速率与酶活力之间的线性关系。这种方法在用于新鲜玉米胚中脂氧合酶活性时具有良好的准确性与重现性。但在我们的测定中发现,经过一定程度烫漂后的甜玉米整粒,由于出现淀粉糊化以及蛋白变性等诸多变化,提取得到的酶粗提液的体系与新鲜样品存在很大的不同,最终使得234nm的吸光值在加入酶液后的升高趋势与鲜样的测定值不具有可比性。
从另一角度,作为脂氧合酶启动的脂肪氧化反应的代表性产物,已多有方报道己醛为脂氧合酶活性的标志性成分,如江巨鳌和田森林2004年发表论文研究己醛生成量与大豆种子脂氧合酶基因表达缺失情况的评价。但就甜玉米而言,国外虽有专家提出脂氧合酶的失活作为甜玉米烫漂程度的标志,但一直未有相关试验数据发表,并且未建立脂氧合酶活力与烫漂终点的对应关系。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种判断甜玉米烫漂终点的方法,该方法以己醛的含量为标志。
本发明所提供的己醛含量的测定方法,包括如下步骤:
1)己醛的生成与固相微萃取:甜玉米按照玉米粒与磷酸缓冲液的质量与体积比1∶4进行匀浆,取适量匀浆于顶空萃取瓶中,将萃取瓶及玉米浆升温至60℃,并在此温度顶空萃取20min;萃取结束后,将萃取头取出,气相色谱进样。
2)气相色谱与质谱联机测定:进样口温度250℃,固相微萃取解析时间2min;离子源温度230℃,MS四极杆温度为150℃,质量扫描范围30-450m/z,扫描速率为5.27scan/s。色谱柱为HP-Innowax毛细管色谱柱(30m×ID 0.25mm×0.25μm)。升温程序:50℃保留2min,然后4℃/min升温至220℃。综合离子扫描质谱图、保留指数、标准样品的保留时间,对己醛进行定性;
3)建立己醛定量标准曲线:确称取5mg己醛标准品,用色谱纯甲醇溶解并定容至10mL,混匀,制成浓度为500μg/mL的标准液。再分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL标准液置于5mL容量瓶中,用稀释溶剂定容并混匀,制成浓度为10、20、30、40、50μg/mL的系列标准液,按照与甜玉米中己醛测定相同的固相微萃取及气相色谱质谱联机条件测定,以进样量为横坐标,相应的吸收峰面积为纵坐标,进行线性回归分析。
4)通过标准定量曲线计算测得己醛的含量。己醛含量低于4μg/g甜玉米时,为烫漂终点。
本发明通过己醛的含量来作为判断甜玉米烫漂终点,这种方法相对于目前现有的方法,具有以下优点:
一、本发明确定了以己醛作为甜玉米中脂氧合酶启动的脂肪氧化反应的标志成分。虽然已有报道将己醛作为大豆豆腥味的代表成分,但尚未建立甜玉米风味成分与酶促脂肪氧化产物之间的关系。如图1所示,在新鲜玉米浆中加入亚油酸后,己醛、己醇、庚醛、庚醇等几种成分含量增加,其中己醛的生成量增加为未添加的3.22倍,高于其他成分的增长幅度,是玉米中酶促反应产物的代表成分。
二、本发明建立了甜玉米中己醛生成量测定的固相微萃取条件。此条件既需要充分体现酶促反应过程,体现脂氧合酶活力的作用,又需要满足固相微萃取对目标成分的富集。虽然固相微萃取及保持酶活力的温度、时间等参数调整均为公知技术,但本发明将二者结合,选择了以磷酸缓冲液(pH7.0)与甜玉米按照特定质量比匀浆,并设定在60℃下萃取20min,测定结果很好体现了烫漂条件对酶的作用效果。如图2所示,烫漂6min的甜玉米,己醛的含量仅为未烫漂样品的8.56%,而烫漂10min的样品则未检测到己醛。
三、本发明确定了以己醛含量作为甜玉米烫漂终点的判别方法,弥补了紫外分光光度法测定酶促反应产物缺乏针对性的缺陷,提高了判别的准确性。国外有诸多报道认为冷冻甜玉米风味劣变的关键酶为脂氧合酶,并建议将脂氧合酶活力作为烫漂标志。而测定脂氧合酶的常用方法——紫外分光光度法通过特定波长234nm下吸光值的上升作为存在酶活的标志,进而通过残余酶活的方法来判断是否到达烫漂终点,这种方法缺乏足够的针对性,尤其对于烫漂后的甜玉米,由于酶活的降低与玉米体系的改变,很难判断吸光值的上升是否由酶的活力造成。如图3所示,在甜玉米烫漂0min-6min内,测得的酶活呈下降趋势,但随烫漂时间的延长,酶活又有所增加。为证明这种上升趋势与酶的活力无关,我们将玉米匀浆煮沸,使酶充分灭活,在亚油酸反应体系中,加入酶液(粗提液)后,仍出现吸光值的上升趋势(图4)。因此可以判定此吸光值上升与酶活力无关。
四、本发明建立了固相微萃取——气相色谱质谱联机对己醛含量测定的定性定量方法,通过构建己醛标准样品的磷酸缓冲液测定体系,得回归方程为Y=80787X-155764(R2=0.9942)(见图5),2~500μg/mL范围内测定峰面积和己醛浓度呈良好的线性关系。
五、确定了在本发明条件下,己醛含量低于4μg/g即可认为已达到烫漂终点。经贮藏试验证明,此方法与甜玉米烫漂程度及贮藏过程中品质变化情况有良好的相关性(表1)。
四、附图说明
图1玉米浆萃取体系中加入外源亚油酸后挥发性成分的变化情况
图2甜玉米蒸汽烫漂0min、6min、10min后,测得的挥发性成分色谱图
图3分光光度计法测得不同烫漂时间的甜玉米脂氧合酶酶活
图4不同脂氧合酶活力样品采用分光光度计法测得的吸光值变化
图5己醛定量标准曲线
图6保留时间为10.990min色谱峰的离子扫描图谱
五、具体实施方式
下面的实施例可以更好地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例
1、实验仪器与试剂
1)实验仪器
Agilent 7890 GC-8963 MS联用仪(美国Agilent公司)
可加热磁力搅拌器(PC-420,北京康林科技有限公司)
CAR/PDMS/DVB萃取头(Supelco,USA)
2)实验试剂
己醛标准品(≥98%,美国Sigma公司)
色谱纯甲醇(美国天地公司)
C6-C20系列正构烷烃标准品(美国Sigma公司)
2、实验设计
在本实施例中,采用将玉米与缓冲液匀浆的方法使酶与底物充分接触并反应;
采用购买的己醛参照样品,结合保留指数的计算以及Agilent 7890GC-8963MS联用仪对检测得到的己醛进行定性分析;
建立己醛测定的标准曲线,进行定量分析;
对冷冻贮藏7个月的不同烫漂程度的甜玉米的风味进行了感官评价,确定了烫漂终点的己醛含量范围。
3、实验方法
1)玉米的烫漂和匀浆
取新鲜采收的甜玉米棒,除去苞叶,分离完整玉米粒,平铺(3-4层玉米粒)于蒸锅的屉中。待水沸腾开始计时,未烫漂的样品记为烫漂0min,达到设定时间时取出样品,迅速置于冰水中冷却。
称取约5.0g玉米粒至研钵,记录其质量精确至0.1g,利用适量液氮速冻。加入磷酸缓冲液(pH 7.0)20mL冰浴研磨匀浆。
2)玉米中己醛的萃取
上述玉米浆摇匀后,取8mL于15mL样品瓶,置于磁力搅拌器上,加入搅拌子搅拌(900r/min),预热至60℃后,旋紧瓶塞,插入CAR/PDMS/DVB萃取头进行顶空萃取,萃取纤维末端距液面0.5cm,气相色谱进样分析。
3)己醛的定性定量分析
HP-Innowax毛细管色谱柱(30m×ID 0.25mm×0.25μm),高纯氦气(99.99%)为载气,进样口温度250℃;离子源温度230℃,MS四极杆温度为150℃,质量扫描范围30-450m/z,扫描速率为5.27scan/s。升温程序:50℃保留2min,然后以4℃/min的速度,升温至220℃。测得烫漂时间分别为0min、6min、10min的玉米样品的总离子流图如图2所示。
系列正构烷烃和己醛标准品采用直接进样的方式,相同色谱条件下获得离子流图,与样品图谱进行比对。
保留时间为11.990的色谱峰,其离子碎片扫描图谱如图6所示,与己醛标准扫描图谱的匹配系数为96,匹配度很高。
根据系列正构烷烃的保留时间计算KI值,计算公式为
I=科瓦茨保留指数,
n=正构烷烃较小碳原子数
N=正构烷烃较大碳原子数
tr=保留时间.
根据癸烷与十一烷的保留时间分别为9.6085和12.4049,以及己醛的保留时间11.990,计算得己醛的保留指数为1087,与美国佛罗里达柑橘研究和教育中心风味数据库中相同色谱柱中己醛的保留指数1099接近。综合保留指数和质谱比对结果,可以判定该峰为己醛。
4)标准曲线的建立
准确称取10mg己醛标准品,用甲醇溶解并定容至10mL,混匀,制成浓度为1mg/mL的标准液。再分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL标准液置于5mL磷酸缓冲液中,再定容至10mL,制成浓度为10、20、30、40、50μg/mL的系列标准液。按照上述的固相微萃取条件测定,以己醛浓度为横坐标,相应的吸收峰面积为纵坐标,进行线性回归分析,得回归方程为Y=80787X-155764(R2=0.9942)(见图5),2~500μg/mL范围内峰面积和样品浓度呈良好的线性关系。计算为单位质量甜玉米中己醛的生成量,未烫漂与烫漂6min的甜玉米样品中己醛的生成量分别为222.5μg/g、4.13μg/g,而烫漂10min的样品未检测到己醛。
5)己醛含量与烫漂终点的确定
如上文所述方法,对甜玉米粒烫漂0min、2min、4min、6min、8min、10min的样品各取80g混匀,分成四份,一份20g(每次5g)用来测定己醛的含量,进行四次重复测定;另三份真空包装速冻,速冻条件为-35℃下10min,然后放入-18℃贮藏。
冷冻贮藏的样品7个月后,参照己醛的测定方法进行感官评定。评定由3个熟悉甜玉米香气特征的评价员进行。具体方法如下:取出玉米粒,加水80g匀浆,移入150mL螺口玻璃瓶中,旋紧瓶盖,水浴加热至60℃,20min后,拧开瓶盖,进行嗅闻,嗅闻后旋回瓶塞,每次嗅闻间隔2min。然后将上述玉米浆移入烧杯,加热煮沸2min后热灌装于相同玻璃瓶中,冷却至60℃,如前进行嗅闻。烫漂当日测定的己醛含量与冷冻贮藏7个月后的感官评价结果见表1。
表1 己醛含量与感官评定结果
在煮沸过程中,60℃水浴20min生成的挥发性成分减少,并且加热过程中伴随新的香气成分的生成,各样品的气味发生变化。烫漂时间短的样品己醛含量很高,短时烫漂的样品,如2min时测得的己醛含量甚至高于未烫漂的样品,这可能与热传质需要一定的时间,并且温度升高可能提高了酶的活力,相应的感官评价均感知到了明显的生味。烫漂6min的样品检测到的己醛含量明显低于烫漂0-4min的样品,玉米浆的气味强度弱,并略有生味。烫漂达10min的样品则未检测到己醛,并表现为熟玉米香,说明已达到甜玉米的熟制程度。而对应后续加热煮沸的过程,在前期形成的生玉米味不能通过后续的加热完全去除,并无法生成熟玉米的特征香气。感官评价表明烫漂终点应在6min与10min之间,烫漂8min的样品则表现为嫩玉米的清香,证实烫漂终点处于6min与10min之间的推测,此时可检出痕量己醛。综合考虑测定误差以及烫漂能量消耗等因素,应控制己醛含量<4.0μg/g为宜。
对比例
分光光度计法的脂氧合酶测定方法与甜玉米烫漂程度间的关系
1)甜玉米的烫漂方法同实施例
2)玉米的处理方法
取完整玉米籽粒5.0g左右放入研钵,加入液氮,迅速研碎,加入15mL经4℃预冷的(pH 7.0)磷酸缓冲液,冰浴匀浆,多次浸提后定容至25mL,取5mL10000×g(4℃)离心30min,上清液用于酶活的测定。
3)脂氧合酶的测定方法
采用3.00mL反应体系,其中磷酸缓冲液(0.2mol/L,pH 6.0)2.7mL,亚油酸底物溶液(取70μL亚油酸加入70uL tween-20,4mL无氧水,摇匀后加入0.5mL 0.5mol/L氢氧化钠溶液,定容至25ml)0.2ml,酶提取液0.1mL,在25℃下反应,于234nm测定其吸光值(TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司)加酶液15秒开始计时,每10秒读数一次,记录1min内吸光值的变化。以pH 7.0的磷酸缓冲液代替酶提取液做空白对照。重复3次。
酶活力A=[OD(75s)-OD(15s)]/0.01
式中:A为酶活性单位数(U);OD(75s)为反应75秒时的吸光值;
OD(15s)为反应15秒时的吸光值;
0.01为一个常数,即每分钟增加0.01吸光度值所需要的活性作为LOX的一个活性单位。
3)不同烫漂时间甜玉米脂氧合酶酶活的测定
如图3所示,采用分光光度计法测得玉米烫漂6min时,残余LOX酶活为初始活力的22.2%,随烫漂时间的延长,反表现出更高的酶活力,如烫漂10min的样品反测出残余酶活为初始活力的31.2%。
4)不同灭酶程度下甜玉米粗提液加入亚油酸体系后吸光值的变化
将新鲜玉米粒按照2)的方法匀浆定容至25mL后,取5mL提取液加热煮沸3min充分灭酶后,再进行离心处理,如3进行测定,与不添加提取液的反应体系空白以及新鲜样品的提取液进行比较。如图4所示,充分灭酶的样品在测定的前1min表现出明显的上升趋势。按照公式计算,仍具有44.9%的酶活力,这说明因为加热导致的玉米体系的改变,使得吸光值的增加不能反应脂氧合酶的活力,这种方法在用于测定烫漂后甜玉米的酶活时存在其局限性。
Claims (2)
1.一种甜玉米烫漂终点的判别方法,其特征在于以甜玉米匀浆后生成的挥发性己醛含量作为判别标准,己醛的生成、富集、定性定量方法如下:
1)烫漂后甜玉米的匀浆方法为:取完整玉米粒与已预冷的磷酸缓冲液(4℃,pH 7.0)按照1∶4(w/v)进行冰浴匀浆;
2)取上述玉米浆8mL于15mL萃取瓶,插入CAR/PDMS/DVB固相微萃取头,萃取纤维距离液面0.5cm,升温至60℃并在此温度下萃取20min;
3)气相色谱质谱联机的测定条件为:进样口温度250℃,固相微萃取解析时间2min;离子源温度230℃,MS四极杆温度150℃,质量扫描范围30-450m/z,扫描速率为5.27scan/s。色谱柱为HP-Innowax毛细管色谱柱(30m×ID 0.25mm×0.25μm),升温程序:50℃保留2min,然后以4℃/min升温至220℃。
4)综合离子扫描质谱图、保留指数、标准样品的保留时间,对己醛进行定性;
5)称取5.0mg己醛标准样品溶于10mL色谱纯甲醇,再分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL上述己醛甲醇溶液置于5mL容量瓶中,用pH7.0磷酸缓冲液定容并混匀,制成浓度为10、20、30、40、50μg/mL的系列己醛浓度标准液。按照上述2、3步骤的固相微萃取及色谱条件测定,建立己醛定量回归方程为Y=80787 X-155764(R2=0.9942),在2~500μg/mL浓度范围内峰面积和样品浓度呈良好的线性关系。
2.按照权利要求1所述的方法,测得的己醛含量低于4μg/g甜玉米时,即达到烫漂终点。
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |