CN103014161B - 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 - Google Patents
一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103014161B CN103014161B CN201210538693.0A CN201210538693A CN103014161B CN 103014161 B CN103014161 B CN 103014161B CN 201210538693 A CN201210538693 A CN 201210538693A CN 103014161 B CN103014161 B CN 103014161B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- nano
- chain
- hcr
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及本发明为一种在纳米材料（nano）表面进行链式杂交反应（HCR）的方法，这种nanoHCR技术是将引发链组装在纳米材料表面，当加入含有发夹结构（或含有发夹结构的DNA tile结构）时，发夹打开实现DNA在纳米材料表面的延伸。此技术不仅可用于信号放大系统的构建，同时，其产物在原子力显微镜下成像观察发现为长度在10-300nm的DNA双链（或多股DNA链），适合携带生物分子进入细胞，从而可作为一种新型的载药工具，因此又为应用于细胞成像、药物载体和肿瘤治疗等领域提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米材料表面的杂交链式反应的制备方法，可用来构建生物检测信号放大系统及用于细胞成像、药物载体和肿瘤治疗等领域，属于纳米材料的功能化领域。
背景技术
HCR技术（hybridization chain reaction）是 2004年美国加州理工学院应用和计算数学系副教授Niles Pierce及同事开发了一种新方法可用于快速检测特异的DNA序列。Pierce课题组利用HCR技术对多种不同mRNAs进行了同时成像分析。另外HCR也被用来检测蛋白质和技术条件性地选择靶向癌细胞，在特异性杀死癌细胞的同时又可以避免传统化疗所带来的副作用。最近，Pierce实验室又利用HCR检测细胞核胚胎，利用反应形成的RNA分子激发细胞中蛋白激酶主导的天然病毒反应，诱导细胞凋亡程序，清楚癌细胞。在上述研究中，HCR扩增聚合物显示了其深样本穿透、高信噪比以及清晰的信号定位等特性。作为一种新型的扩增手段，目前针对HCR的相关研究面临着以下两点主要瓶颈：线性扩增的特性导致相对较低的检测灵敏性； 假阳性信号：非引发链也常常能驱动HCR过程，导致假阳性结果。
现有的研究中，没有刻意将纳米材料表面进行杂交链式反应，该纳米杂交链式反应技术（nanoHCR）本身不仅可以作为一个信号放大手段，另外其产物也可作为一种纳米生物复合探针，不仅可以用于构建信号放大系统，同时也为构建新型药物载体提供了新思路。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种在纳米材料表面进行杂交链式反应的技术方法，可用于信号放大系统的构建，并且其产物可作为一种新型的药物载体。
一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术（hybridization chain reaction，HCR）的制备方法，其特征在于，将引发链组装在纳米材料表面，当溶液中存在亚稳态的发夹DNA结构时使得发夹结构打开，DNA发夹的构象由此发生改变暴露出发夹环，进而不断结合和打开新的DNA发夹，驱动形成一条长的DNA聚合体，包括如下步骤：
（1）引发链加入到纳米材料溶液中，进行组装；
（2）组装后溶液进行离心洗涤；
（3）洗涤后溶液中加入两发夹结构，混合均匀后进行HCR反应；
（3）HCR产物经离心洗涤后进行检测；
所述引发链是一段寡核苷酸序列，其一端5，，或3，可进行标记，如巯基、氨基、生物素标记。
所述纳米材料与引发链的组装浓度比例为1:1～1:5000。
所述纳米材料与引发链的组装条件为：室温振荡反应30分钟～24小时，加入磷酸盐缓冲液后，氯化钠终浓度为0.1～0.15M；
所述组装后洗涤条件为：4℃，3000rpm～150000rpm/min，5～20分钟，1～4次，洗涤液为200～2000毫升，磷酸盐缓冲液pH 为7.4。
所述亚稳态的发夹DNA结构数目至少为2个，当纳米材料表面组装的引发链将其一发夹结构打开时，暴露的单链部分又可作为引发链将另一发夹结构打开；可以由一条寡核苷酸序列构成，也可为几条构成，如形成的DNA tile结构中含有发夹结构。
所述HCR反应时，组装在纳米材料表面的引发链与发夹结构的比例为1:10～1:1000。
所述HCR反应条件为37℃，4～24小时。
所述HCR产物的离心条件为4℃，3000rpm～50000rpm/min，5分钟， 3次，洗涤液为Milli-Q水。
所述HCR产物为一条DNA双链，或为几股DNA链，长度10nm～300nm。
检测产物方法可为10%-15%聚丙烯酰胺凝胶电泳、0.8%-1%琼脂糖电泳、原子力显微镜（tapping模式）等。
在生物检测领域中，痕量生物分子的高灵敏及特异性检测一直是亟待攻克的难题。目前较为常用的信号放大技术主要有PCR (聚合酶链式反应)，以及RCA （滚环扩增放大技术）。前者是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，另外因其涉及高温变性过程，从而限制了其在体内及生物系统的应用；后者是一种高效的常温扩增方法，扩增时需phi29聚合酶参与，同时也只适合体外扩增。而HCR技术，相较前两者，过程更为简单，只需一定比例的引发链和发夹结构在特定温度下即可进行。
本发明涉及一种在纳米材料表面组装引发链，加入发夹结构后，引发链将一发夹结构打开后，暴露出的单链又可作为引发链将另一发夹结构打开，从而在无附加生物酶的作用家即可实现DNA在纳米材料表面的延伸。其产物经过离心洗涤处理后，可通过原子力显微镜进行成像观察，发现纳米材料表面延伸得到的DNA链长度可达300nm， DNA的延伸不仅实现了信号的放大，其产物尺寸也较适合携带生物分子进入细胞，从而作为一种新型的载药工具。纳米材料可用于生物分析领域，具有较好的生物相容性，如纳米金、纳米银、碳纳米管等；
附图说明
图1：使用DNA tile结构进行链式杂交反应的过程图；a为引发链；b和c分别为tile 1和tile2结构组成（红色圈标出部分为发夹结构）；d为发夹打开，HCR过程。
图2：图（a）为1%琼脂糖电泳结果图。进样孔1：单链DNA；进样孔2：DNA tile；进样孔3：nanoHCR产物（引发链：DNA tile=1:1）；进样孔4：nanoHCR产物（引发链：DNA tile=1:10）；M：DNA marker。图（b）为nanoHCR产物的AFM成像：DNA 条带从纳米金表面延伸而出；插入图为细节放大图，扫描范围为2??m。
具体实施方式
实施例1：
1mL 5nm胶体金溶液中加入20 μL巯基修饰的引发链（SH-DNA，10μM），引发链终浓度为0.2μM。室温振荡过夜后加入100mM PB buffer (磷酸缓冲液，pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液（10 mM PB，2M NaCl，pH 7.4）使得溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4℃，15000rpm/min，15min，离心洗涤4次后，沉淀物于1mL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮，4℃保存。
10μL复合物金-引发链中加入10μL DNA发夹结构1（2μM）、10μL DNA发夹结构2（2μM），引发链和发夹结构的物质的量浓度比例为1:10，总体积为30μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜。后4℃，8000rpm/min，5min，离心洗涤1次后，小心去除上清，然后用30μL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮后，取10 μL上样，进行1%琼脂糖电泳，电压120V，30min。另10 μL稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
实施例2：
4条DNA单链（序列分别为，1：5’-GGACTTGTAGCGATACGACTCCGACGAGACTAGTAAC TCTTG-3’；3：5’-GGATGCGGAATGACATGCTACAAGTCCCAAGAGTTAC GCTCTCCATTC-3’；4：5’-TGTCACGAGTAAGTCTATGTCATTCC-3’；5：5’-GGGCTTGAATGGAGAGCCATCACTCATGTGAACCCATGAGTGATGTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCAGACTTACTC-3’）制备的DNA tile1结构中有发夹结构1,；另外四条DNA单链（序列分别为，2：5’-GACGAGACTACTGGTCAGATTCGTAGGTCCGAATACG ACTCC-3’；6：5’-AAGCCCGATTCTCGGAATCACTCATGGGTTCA-3’；7：5’-GCATCCGATCCGTCCTGTCGGACCTACGAATCTGACCATCCGA GAATC-3’；8：5’-CATGAGTGATGTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCAGACTTACTCGTGACAGAGTAAGTCTG CAGGACGGATC-3’） 制备的DNA tile2结构中有发夹结构2，制备条件为：1、3、4及5链（10??M）各6μL，后加入6μL 缓冲液（10×TAE，125mM Mg2+）及30μLMilli-Q水，混合均匀然后放入孵育器中，从高温（95℃）自然冷却降至室温，制得tile 1；tile 2由2、6、7、8链（10??M）制成，条件同上。
1mL 15nm胶体金溶液中加入10 μL巯基修饰的引发链（SH-DNA，100μM），引发链终浓度为1μM。室温振荡过夜后加入100mM PB buffer (磷酸缓冲液，pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液（10 mM PB，2M NaCl，pH 7.4）使得溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4℃，12000rpm/min，15min，离心洗涤4次后，沉淀物于1mL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮，4℃保存。
10μL复合物金-引发链中加入10μL DNA tile1（10??M）、10μL DNA tile2（10??M），引发链和发夹结构的物质的量浓度比例为1:10，总体积为30μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜。后4℃，5000rpm/min，5min，离心洗涤1次后，小心去除上清，然后用30μL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮后，取10 μL上样，进行1%琼脂糖电泳，电压120V，30min。另10 μL稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
实施例3:
1mL 15nm胶体金溶液中加入20 μL巯基修饰的引发链（SH-DNA，10μM），引发链终浓度为0.2μM。室温振荡过夜后加入100mM PB buffer (磷酸缓冲液，pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液（10 mM PB，2M NaCl，pH 7.4）使得溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4℃，12000rpm/min，15min，离心洗涤4次后，沉淀物于1mL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮，4℃保存。
10μL复合物金-引发链中加入10μL DNA发夹结构1（2μM）、10μL DNA发夹结构2（2μM），引发链和发夹结构的物质的量浓度比例为1:10，总体积为30μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜。后4℃，5000rpm/min，5min，离心洗涤1次后，小心去除上清，然后用30μL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮后，取10 μL上样，进行1%琼脂糖电泳，电压120V，30min。另10 μL稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
实施例4：
1mL 30nm胶体金溶液中加入20 μL巯基修饰的引发链（SH-iDNA，10μM），引发链终浓度为0.2μM。室温振荡过夜后加入100mM PB buffer (磷酸缓冲液，pH7.4)，终浓度为10mM，室温过夜后加入老化液（10 mM PB，2M NaCl，pH 7.4）使得溶液中盐的终浓度为0.15M。混合物溶液室温过夜后，4℃，8000rpm/min，15min，离心洗涤4次后，沉淀物于1mL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮，4℃保存。
10μL复合物金-引发链中加入10μL发夹结构1（2μM）、10μL发夹结构2（2μM），引发链和发夹结构的物质的量浓度比例为1:10，总体积为30μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜。后4℃，3000rpm/min，5min，离心洗涤1次后，小心去除上清，然后用30μL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮后，取10 μL上样，进行1%琼脂糖电泳，电压120V，30min。另10 μL稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
实施例5：
1mg单壁碳纳米管溶于1mL pH7的PBS溶液中，超声10min后加入0.4mL EDC（400mM）和NHS(100mM)溶液，室温振荡15min。上述溶液在4℃，15000 rpm/min离心5min，重复两次去除多余的EDC和NHS。然后加入20 μL 1mg/mL链霉亲和素（straptavidin）溶液，室温下振荡组装过夜。然后4℃， 15000 rpm/min离心10min，重复三次去除未连接的链霉亲和素，然后加入20 μL 生物素标记的引发链(biotin-iDNA，10μ M)，室温下振荡连接1h后离心（4℃，15000 rpm/min， 10min）三次。沉淀物于1mL，pH7.4 PB（10 mM，0.15 M NaCl）溶液中重悬浮，4℃保存。
10μL复合物碳纳米管-引发链中加入10μL发夹结构1（2μM）、10μL发夹结构2（2μM），引发链和发夹结构的物质的量浓度比例为1:10，总体积为30μL的溶液充分混匀后置于37℃水浴中孵育过夜。后4℃，8000rpm/min，5min，离心洗涤1次后，小心去除上清，然后用30μL，PB（10 mM，0.15 M NaCl，pH7.4）溶液中重悬浮后，取10 μL上样，进行1%琼脂糖电泳，电压120V，30min。另10 μL稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
Claims (1)
1.一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术（hybridization chain reaction，HCR）的制备方法，其特征在于，将引发链组装在纳米材料表面，当溶液中存在亚稳态的发夹DNA结构时使得发夹结构打开，DNA发夹的构象由此发生改变暴露出发夹环，进而不断结合和打开新的DNA发夹，驱动形成一条长的DNA聚合体，包括如下步骤：
（1）引发链加入到纳米材料溶液中，进行组装；
（2）组装后溶液进行离心洗涤；
（3）洗涤后溶液中加入两发夹结构，混合均匀后进行HCR反应；
（4）HCR产物经离心洗涤后进行检测；
所述HCR反应时，组装在纳米材料表面的引发链与发夹结构的比例为1:10～1:1000；
所述引发链是一段寡核苷酸序列，其一端5，或3，用巯基、氨基、或生物素进行标记；
所述纳米材料与引发链的组装浓度比例为1:1～1:5000；
所述纳米材料与引发链的组装条件为：室温振荡反应30分钟～24小时，加入磷酸盐缓冲液后，氯化钠终浓度为0.1～0.15M；
所述组装后洗涤条件为：4℃，3000rpm～150000rpm，5～20分钟，1～4次，洗涤液为200～2000毫升，磷酸盐缓冲液pH 为7.4；
所述亚稳态的发夹DNA结构数目为2个，当纳米材料表面组装的引发链将其一发夹结构打开时，暴露的单链部分又可作为引发链将另一发夹结构打开；所述发夹DNA结构为DNA tile1、2，各由四条寡核苷酸构成；所述的DNA tile1所使用的四条寡核苷酸序列分别为：5’-GGACTTGTAGCGATACGACTCCGACGAGACTAGTAAC TCTTG-3’； 5GGATGCGGAATGACATGCTACAAGTCCCAAGAGTTAC GCTCTCCATTC-3’； 5’-TGTCACGAGTAAGTCTATGTCATTCC-3’； 5’-GGGCTTGAATGGAGAGCCATCACTCATGTGAACCCATGAGTGATGTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCAGACTTACTC-3’； 所述的DNA tile 2所使用的四条寡核苷酸序列分别为： 5’-GACGAGACTACTGGTCAGATTCGTAGGTCCGAATACG ACTCC-3’； 5’-AAGCCCGATTCTCGGAATCACTCATGGGTTCA-3’； 5’-GCATCCGATCCGTCCTGTCGGACCTACGAATCTGACCATCCGA GAATC-3’； 5’-CATGAGTGATGTAGTCTCGTCGGAGTCGTATCAGACTTACTCGTGACAGAGTAAGTCTG CAGGACGGATC-3’；
所述HCR反应条件为37℃，4～24小时；
所述HCR产物的离心条件为4℃，3000rpm～50000rpm，5分钟， 3次，洗涤液为Milli-Q水；
所述HCR产物长度10nm～300nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210538693.0A CN103014161B (zh) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210538693.0A CN103014161B (zh) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103014161A CN103014161A (zh) | 2013-04-03 |
| CN103014161B true CN103014161B (zh) | 2015-07-08 |
Family
ID=47963273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210538693.0A Expired - Fee Related CN103014161B (zh) | 2012-12-13 | 2012-12-13 | 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103014161B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103940989A (zh) * | 2014-04-25 | 2014-07-23 | 山东大学 | 基于杂交链反应和单分子计数的免疫传感器及其应用 |
| CN110124047B (zh) * | 2019-04-25 | 2022-03-29 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 |
| CN113789373B (zh) * | 2021-08-24 | 2023-09-05 | 中山大学 | 一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用 |
-
2012
- 2012-12-13 CN CN201210538693.0A patent/CN103014161B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DNA-Based Hybridization Chain Reaction for Amplified Bioelectronic Signal and Ultrasensitive Detection of Proteins;Bing Zhang等;《Analytical Chemistry》;20120524;第84卷;第5392－5399页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103014161A (zh) | 2013-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Nucleic acid tests for clinical translation | |
| Zhang et al. | CRISPR/Cas12a-mediated interfacial cleaving of hairpin DNA reporter for electrochemical nucleic acid sensing | |
| Zhang et al. | A strategy combining 3D-DNA Walker and CRISPR-Cas12a trans-cleavage activity applied to MXene based electrochemiluminescent sensor for SARS-CoV-2 RdRp gene detection | |
| Cheng et al. | Mesoporous silica containers and programmed catalytic hairpin assembly/hybridization chain reaction based electrochemical sensing platform for MicroRNA ultrasensitive detection with low background | |
| Duan et al. | The development of nanostructure assisted isothermal amplification in biosensors | |
| Wang et al. | Selective single molecule nanopore sensing of microRNA using PNA functionalized magnetic core–shell Fe3O4–Au nanoparticles | |
| Hu et al. | Double-strand DNA-templated formation of copper nanoparticles as fluorescent probe for label free nuclease enzymedetection | |
| Chen et al. | Physical and biochemical insights on DNA structures in artificial and living systems | |
| ES2574137T3 (es) | Estrategias y métodos de detección de ácidos nucleicos mediante biosensores | |
| Wang et al. | Amplified electrochemical detection of mecA gene in methicillin-resistant Staphylococcus aureus based on target recycling amplification and isothermal strand-displacement polymerization reaction | |
| CN107254550B (zh) | 一种检测hiv相关基因的spr传感器及其制备与应用 | |
| Qu et al. | Framework nucleic acid-mediated pull-down microRNA detection with hybridization chain reaction amplification | |
| Yang et al. | PCR-free colorimetric DNA hybridization detection using a 3D DNA nanostructured reporter probe | |
| Liu et al. | Binding induced isothermal amplification reaction to activate CRISPR/Cas12a for amplified electrochemiluminescence detection of rabies viral RNA via DNA nanotweezer structure switching | |
| CN103014161B (zh) | 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 | |
| Zhu et al. | A competitive strategy coupled with endonuclease‐assisted target recycling for DNA detection using silver‐nanoparticle‐tagged carbon nanospheres as labels | |
| CN105385770A (zh) | 检测博来霉素的双环发夹探针介导免标记链置换扩增方法 | |
| Wasiewska et al. | Highly sensitive electrochemical sensor for the detection of Shiga toxin-producing E. coli (STEC) using interdigitated micro-electrodes selectively modified with a chitosan-gold nanocomposite | |
| CA3146453A1 (en) | Systems and methods for assessing a target molecule | |
| He et al. | Detection of biotin-streptavidin interactions based on poly (thymine)-templated copper nanoparticles coupled with Exo III-aided DNA recycling amplification | |
| Hou et al. | DNAzyme-triggered sol–gel–sol transition of a hydrogel allows target cell enrichment | |
| Xia et al. | Autocatalytic MNAzyme-integrated surface plasmon resonance biosensor for simultaneous detection of bacteria from nosocomial bloodstream infection specimens | |
| Zhang et al. | Electrochemiluminescent carbon dot-based determination of microRNA-21 by using a hemin/G-wire supramolecular nanostructure as co-reaction accelerator | |
| Hua et al. | A specially designed DNA-assembled framework structure probe coupled with loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-DNA signal transducer for rapid and sensitive electrochemical detection of miRNA | |
| Mo et al. | Recent progress in the development of DNA-based biosensors integrated with hybridization chain reaction or catalytic hairpin assembly |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150708 Termination date: 20171213 |