CN102985820A - 使用细胞系筛选线粒体katp调节剂的方法 - Google Patents

Abstract

公开涉及调控K_ATP通道的组合物和方法以及通过调控K_ATP和mito-K_ATP通道治疗肝脏紊乱的方法。

Description

使用细胞系筛选线粒体KATP调节剂的方法

要求在先提交的美国申请的优先权

本申请要求2010年3月30日提交的美国临时申请第61/319,061号的优先权，其内容通过引用纳入本文。

背景技术

三磷酸腺苷敏感性钾通道（K_ATP通道）作为连接所述细胞代谢水平和细胞膜兴奋性的分子传感器。迄今为止，就调节K_ATP通道能力来快速和有效评估分子的机制局限于繁琐的电学分析。本文提供在细胞如肝细胞中进行K_ATP通道试验并可特异分析线粒体K_ATP通道的方法、组合物和机器。还公开通过调节肝细胞中K_ATP通道治疗肝紊乱的方法。

发明内容

本文公开使用线粒体ATP-敏感性钾离子通道（mito-K_ATP）作为药物靶标的方法。在一些实施方式中，所述方法可鉴定能预防或治疗肝病的化合物。在一些实施方式中，所述化合物是mito-K_ATP通道调节剂。本文还公开使用无标记生物传感器细胞试验筛选肝细胞中mito-K_ATP通道调节剂的方法。

附图简要说明

图1显示内源K_ATP通道在肝细胞系HepG2C3A中的表达。

图2显示内源K_ATP离子通道存在于HepG2C3A细胞的线粒体中，由其Kir6.2亚基的Western印迹表明。

图3显示HepG2C3A细胞中K_ATP开放剂吡那地尔（pinacidil）诱导的DMR信号，如本发明所述一个实施方式的实时记录所示。(A)显示HepG2C3A响应不同剂量的吡那地尔刺激的实时动力学DMR信号。(B)显示刺激30分钟后吡那地尔DMR信号的幅度，以及吡那地尔DMR信号的动力学(t_1/2)，其为吡那地尔剂量的函数。

图4显示通过siRNA的SUR敲减对hepG2C3A细胞中吡那地尔诱导的DMR信号的影响。(A)显示有或没有RNAi敲减SUR2或SUR1时吡那地尔DMR信号的实时动力学。(B)显示细胞响应吡那地尔的幅度（刺激后30分钟）是不同RNAi敲减预处理的函数。也包括阴性对照（即对载剂缓冲液的细胞响应）。

图5显示通过siRNA的Kir6.x敲减对hepG2C3A细胞中吡那地尔诱导的DMR信号的影响。(A)显示有或没有RNAi敲减Kir6.1或Kir6.2时吡那地尔DMR信号的实时动力学。(B)显示细胞响应吡那地尔的幅度（刺激后30分钟）是不同RNAi敲减预处理的函数。也包括阴性对照（即对载剂缓冲液的细胞响应）。

图6显示HepG2C3A细胞中mito-K_ATP通道的药理学特性。(A)显示通过已知K_ATP阻断剂甲磺氮卓脲对吡那地尔DMR信号的剂量依赖性抑制。(B)显示通过已知K_ATP阻断剂组对吡那地尔DMR信号的剂量依赖调节，如作为其剂量函数的吡那地尔DMR信号的幅度所图示。(C)显示各32μM的不同阻断剂对吡那地尔DMR信号的影响。在所有实验中，所述吡那地尔浓度是40μM。

图7显示Mito-K_ATP信号传导关联Rho激酶活性。ROCK抑制剂Y-27632剂量依赖性减弱HepG2C3A细胞中的吡那地尔DMR信号。(A)显示存在不同剂量的Y-27632时的实时动力学吡那地尔DMR信号。(B)显示吡那地尔DMR信号的幅度是Y27632剂量的函数。在所有实验中，所述吡那地尔浓度是40μM。

图8显示Mito-K_ATP信号传导关联Rho激酶活性。RNAi敲减ROCK1或ROCK2显著减弱吡那地尔DMR信号：(A)显示实时吡那地尔DMR信号，和(B)显示吡那地尔DMR信号的幅度是不同RNAi敲减的函数。RNAi敲减还显著降低HepG2C3A细胞中的对应蛋白：(C)显示ROCK1敲减，和(D)显示ROCK2敲减。在所有实验中，所述吡那地尔浓度是40μM。

图9显示Mito-K_ATP信号传导关联肌动蛋白重塑。两种熟知的肌动蛋白破坏剂对吡那地尔DMR信号的剂量依赖性抑制，A)显示松胞菌素B,和(B)显示红海海绵素A。在所有实验中，所述吡那地尔浓度是40μM。

图10显示Mito-K_ATP信号传导关联JAK激酶活性。JAK抑制剂AG490剂量依赖性抑制HepG2C3A细胞中的吡那地尔DMR信号：(A)显示实时动力学，和(B)显示吡那地尔DMR的幅度是AG490剂量的函数。在所有实验中，所述吡那地尔浓度是40μM。

图11显示mito-K_ATP通道信号传导关联JAK活性。RNAi敲减JAK2或JAK3但非JAK1可显著减弱吡那地尔DMR信号：(A)显示实时吡那地尔DMR信号，和(B)显示吡那地尔DMR信号的幅度是不同RNAi敲减的函数。

图12显示mito-K_ATP通道调节抑制利福平引起的初级肝细胞中CYP3A4活性诱导。(A)显示吡那地尔对CYP3A4活性的影响。(B)显示吡那地尔对利福平诱导CYP3A4活性的影响。(C)显示格列甲嗪对CYP3A4活性的影响。(D)显示格列甲嗪对利福平诱导CYP3A4活性的影响。(E)显示吡那地尔对CYP1A2活性的影响。(F)显示格列甲嗪对CYP1A2活性的影响。CYP酶活性测量前，所述初级肝细胞与特定剂量的化合物预孵育3天。

具体实施方式

材料、组合物和试验

离子通道

离子通道是膜整合蛋白，控制离子穿过细胞膜的运动。人中，约400基因编码能装配形成多于数千种不同离子通道亚型的蛋白，因为这些通常为具有形成孔和附属亚单元的异源多聚复合物。可根据其离子选择性、序列同源性、四级结构或门控机制来鉴定这些亚型。离子通道通过响应广泛刺激的门控来控制所述细胞的电学性能。迄今为止，已鉴定对以下敏感的离子通道：配体如小分子或离子浓度变化、膜电势变化、温度波动、膜张力变化、和最近的暴露于可见光。

离子通道蛋白可通过胞内或胞外配体或离子、电压、温度或牵张来门控。通过细胞膜内通道的离子流由三种因子测定：功能性通道的数量，用于离子降低其电化学梯度所存在的驱动力和处于开放、离子传导状态的通道比例。该开放可能性可通过大量各种信号传导分子调节，包括G蛋白、脂质、激酶以及其他信号传导分子。

离子通道可在引起人疾病状态的分子途径中有关键作用，所述状态通过疾病和先天离子通道异常（所谓离子通道病）之间的已知关联数量增加来反映。此外，离子通道在5种主要药物靶标家族中，有G蛋白偶联受体、激酶、转运子和酶。治疗高血压的L-型Ca²⁺通道阻断剂、用于治疗糖尿病的细胞膜K_ATP通道开放剂、治疗焦虑的GABAA受体调节剂和给予癫痫和心律不齐患者的使用依赖性Na⁺通道阻断剂是具有巨大销量的药物示例。因此，离子通道是非常吸引人的药物靶标。

然而，大多数市售离子通道药物为偶然发现，且用数百万化合物库开发离子通道药物受到缺少可用于高通量技术的功能试验的阻碍。

肝脏和肝病

肝脏是人每天接触的大量各类化学品代谢的主要位置。肝中最重要的代谢酶类是细胞色素P450，其积极参与药物和其他化学品的清除。P450启动分解化学品的过程，从而所述化学品能被排出，但在代谢期间可能产生一些具有所需药理效应的活性代谢物。然而，反之亦然；代谢可产生毒性代谢物，如常见止痛剂乙酰氨基酚的分解中。

肝脏是血液中许多毒性物质解毒以及许多化合物合成和分泌的主要位置。肝实质细胞是组成70-80%肝胞质团的最丰富细胞，其进行大多数肝中的代谢和生物合成。因此，体外培养的肝实质细胞正逐渐流行用于药物代谢和毒性研究。

肝炎（hepatitis，复数为hepatitides）指肝脏受伤，其表征为器官组织存在炎症细胞。所述病症可为自限的、自愈的或可进展为肝脏瘢疤。肝炎持续少于6个月被认为是急性的，持续更长则为慢性。肝炎可通过肝炎病毒引起，其导致全世界大多数肝损伤病例。肝炎还可由于毒素（特别是酒精）、其他感染引起或源自自身免疫过程。

有许多肝炎类型，包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝、戊肝、己肝和庚肝和缺血性肝炎。肝炎可由病毒诱导（如甲肝-戊肝主要由病毒感染引起）。肝炎还可缘于毒素、化学品和药物分子（如酒精、毒素、扑热息痛、羟氨苄青霉素、抗结核药物、二甲胺四环素）。肝炎还可由循环不足（即缺血性肝炎）、自身免疫病症、代谢病或遗传如威尔逊氏病引起。

急性肝炎可由下述病毒引起：甲肝-戊肝病毒（多于95%的病毒原）、单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、黄热病毒和腺病毒。急性肝炎还可由非病毒感染引起，如弓形虫、钩端螺旋体、Q热和落矶山斑疹热，以及通过化学品和毒素如酒精、毒素和药物(如扑热息痛、羟氨苄青霉素、抗结核药物、二甲胺四环素和许多其他)引起。慢性肝炎通常由病毒性肝炎（即乙肝病毒，有或没有丁肝、丙肝）、自身免疫、酒精、某些药物（如米诺环素、甲基多巴、呋喃妥因、异烟肼、酮康唑）引起，还可由于遗传如威尔逊氏病和α1-抗胰蛋白酶缺陷引起。

人体将几乎所有药物识别为外来物质且对其进行各种化学过程（即代谢）以使其适于消除。这涉及化学品转换以(a)降低脂溶性和(b)改变生物活性。尽管体内几乎所有组织都有一些代谢化学品的能力，但肝中滑面内质网是内源化学品（如胆固醇、类固醇激素、脂肪酸和蛋白）和外源物质（如药物或其他非天然化学品）的主要"代谢清除室"。

肝脏在清处和转化化学品中的中心作用还使其易受药物诱导的损伤影响，称为肝中毒。某些药剂摄取过量时，有时甚至在治疗范围内引入时，可能损伤肝脏。其他化学剂如用于实验室和工业的那些、天然化学品（如微藻素）和草药也可诱导肝中毒。

多于900种药物与引起肝损伤有关且其是药物退出市场的最普遍原因。化学品常引起肝脏的亚临床损伤，其仅表示为异常的肝脏酶测试。药物诱导的肝损伤引起5%的所有入院就医和50%的所有急性肝衰竭。数种机制引起诱导肝损伤或损伤过程加重。许多化学品能损伤线粒体，所述线粒体是一种产生能量的胞内细胞器官。其功能障碍会释放过量氧化剂，继而损伤肝细胞。细胞色素P-450系统中一些酶如CYP2E1的活化可引起氧化应激。肝实质细胞和胆管细胞的损伤引起胆酸在肝脏内积累。这可进一步加重肝损伤。非实质细胞如库普弗细胞、脂肪储存星状细胞和白细胞（即嗜中性和单核细胞）也在该机制中起作用。

药物代谢通常分为两个阶段：1阶段和2阶段。认为1阶段反应是为2阶段反应准备药物。然而，许多化合物可在2阶段直接代谢。1阶段反应涉及氧化、还原、水解、水合和许多其他罕见化学品反应。这些过程往往增加所述药物的水溶性并可生成化学上更活跃且更可能有毒性的代谢物。大多数2阶段反应在细胞溶质中发生并通过转移酶参与内源化合物的结合。化学活性1阶段产物相对惰性并适于通过该步骤消除。

称为细胞色素P-450的位于内质网的一组酶是肝中最重要的代谢酶家族。细胞色素P-450是电子传递链的最终氧化酶组分。其不是单一的酶，而是由50种紧密相关同种型的家族组成，其中6种代谢90%的药物。个体P-450基因产物有巨大的多样性且该异质性使肝脏在1阶段中的许多化学品（包括几乎所有药物）上进行氧化。P450系统的三种重要特征：遗传多样性、酶活性变化和竞争性抑制在药物诱导的毒性中起作用。许多物质可影响P-450酶机制。药物与所述酶家族以数种方式相互作用。修饰细胞色素P-450酶的药物称为抑制剂或诱导剂。CYP抑制剂阻断一种或数种P-450酶的代谢活性。该效应通常立即发生。另一方面诱导剂通过增加合成来提高P-450活性。根据诱导药物的半衰期，通常在酶活性提高前有延迟。

不良药物反应分为A型（固有的或药理学的）或B型（特异体质的）。A型药物反应引起80%的所有毒性。具有药理学（A型）肝中毒的药物或毒素是具有可预测剂量响应曲线（较高浓度引起更多肝损伤）和良好表征的毒性机制如直接损伤肝组织或阻断代谢过程的那些。在对乙酰氨基酚过量的情况中，该类型损伤在达到一些毒性阈值不久后发生。当试剂在易受影响个体中引起不可预测肝中毒时，特异体质性损伤没有警告地发生，与剂量无关并具有不同的潜伏期。此类损伤没有清晰的剂量响应或时间关系，且多数通常不具有可预测模型。特异体质性肝中毒甚至是在作为FDA批准过程一部分的严格临床测试后，引起数种药物退出市场；曲格列酮

和曲伐沙星

是特异体质性肝损伤毒素的两种主要示例。抗凝血剂希美加群(ximelagatran)的开发由于考虑到肝损伤而中断。

ATP-敏感性钾离子通道和mito-K_ATP通道

三磷酸腺苷敏感性钾通道（K_ATP通道）作为连接所述细胞代谢水平和细胞膜兴奋性的分子传感器。K_ATP通道通过与胞内MgADP相互作用激活并通过高水平的ATP抑制。一种K_ATP通道蛋白复合物由四种小的成孔内向整流钾通道亚单元（Kir6.1或Kir6.2）和四种称为磺酰脲受体的ATP结合盒（ABC）超家族成员的调节β亚基（SUR1或SUR2A、2B）组成。K_ATP通道在具有不同分子组成的各种组织中表达，所述组织包括心肌细胞、胰岛β细胞、平滑肌细胞和神经元（SeinoS.Annu.Rev.Physiol.1999.61:337-62）。除了在细胞质膜上表达，K_ATP通道还可在线粒体内膜(Inoue I.,等Nature 1991;352:244-7)和核被膜(I.Quesada,等PNAS 2002;99:9544-9549)上发现。

K_ATP通道结构、功能和相关疾病

与其他内向整流K⁺通道类似，Kir6.1和Kir6.2的各亚基具有两个跨膜区段（M1和M2）和有胞内N末端和C末端的成孔区域，其含有数种可能的蛋白激酶A(PKA)或蛋白激酶C(PKC)依赖性磷酸化位点(Seino S.Annu.Rev.Physiol.1999.61:337-62)。SUR亚基各含三种跨膜结构域（TMD 0、1和2）和两种胞内核酸结合域（NBD1和2）。SUR1和SUR2对磺酰脲的结合亲合力和组织分布不同，而SUR2的两种变体仅在最后42个氨基酸上彼此不同。Kir和SUR亚基之间的相互作用不仅决定K_ATP通道在细胞表面的表达，还调控ATP结合和水解后的通道活性。

在胰岛β细胞中，K_ATP通道由Kir6.2和SUR1组成，其在调控胰岛素分泌中有重要作用。血流中的高葡萄糖水平诱导β细胞中的胞质ATP浓度增加，导致K_ATP通道关闭，这引起β细胞膜去极化和压力门控Ca²⁺通道开放以及后续的胰岛素分泌。磺酰脲（如甲磺氮草脲和格列甲嗪）可以高亲和性结合SUR1并抑制K_ATP通道活性从而刺激胰岛素分泌。已发现SUR1或Kir6.2中导致胰岛素过分泌的功能性突变丧失引起婴儿期的持续性高胰岛素低血糖症（PHHI）。相反，引起K_ATP通道持续开放的突变可引起暂时或永久性新生儿糖尿病。

这些年来，不同组织中K_ATP通道的分子组成通过重组表达不同组合的Kir6.x和SURx亚基并与天然ATP敏感性钾电流作比较来测定。K_ATP通道的心肌细胞主要由Kir6.2和SUR2A构成，平滑肌细胞中为Kir6.2和SUR2B，且血管平滑肌细胞中为Kir6.1和SUR2B。在心脏中，显示肌纤维膜和线粒体K_ATP通道都对缺血性预处理（IPC）有保护效应。K_ATP通道在膀胱、结肠和气道的平滑肌收缩调节中起强效作用。K_ATP通道还通过血管扩张剂起始的循环AMP依赖性PKA信号传导途径或循环GMP依赖性PKG途径来引起血管舒张。

K_ATP通道开放剂、阻断剂和其治疗潜力

除了通过胞内ATP/MgADP浓度调节，K_ATP通道还可通过称为钾通道开放剂（KCO）的一组结构多样性化合物和阻断化合物如磺酰脲和其他非磺酰脲化学品来实现（Babenko,A.P.等.J.Biol.Chem.2000;275:717-720）。对不同KCO的通道响应依赖K_ATP通道的分子组成。二氮嗪有效激活Kir6.2/SUR1通道但对Kir6.2/SUR2A通道具有很小的效果；而吡那地尔、克罗卡林和尼可地尔优选激活Kir6.2/SUR2通道。放射性结合试验和用嵌合通道的研究表明KCO结合SUR亚基；具体地，二氮嗪结合TMD1且吡那地尔或其类似物结合TMD2；其对K_ATP通道的效果由核苷酸和NBD之间的相互作用来调节。磺酰脲药物已用于治疗II型糖尿病，因为其结合SUR1亚基且关闭K_ATP通道并引起胰岛素分泌。这些药物还显示对基于SUR2的K_ATP通道的相似抑制。此外，还有非磺酰脲阻断剂如U-37883A，其已被报道为选择性抑制含Kir6.1的K_ATP通道。

K_ATP通道开放剂和阻断剂都有治疗潜力例如，磺酰脲药物已用于治疗II型糖尿病。此外，选择性K_ATP通道阻断剂可用于通过降低动作电位持续时间来预防心律不齐。K_ATP通道开放剂已用于治疗高血压、胰岛素机能亢进、冠状动脉疾病。

肝细胞中的K_ATP通道

关于K_ATP通道的大多数研究已在胰岛β细胞或心肌细胞中进行。Malhi等报道了K_ATP通道的表达和其对大鼠肝实质细胞和人肝癌细胞系中细胞增殖的影响(Malhi,H等J.Biol.Chem.2000,275:26050-26057)。然而，其他研究表明人肝癌细胞系HepG2的细胞表面具有很小的K_ATP通道电流，但K_ATP通道表达可通过转染胰岛素和葡萄糖转运子GLUT2来诱导（Liu,G.J.等FASEB J.2003;17:1682–1684）。

通过用分离自大鼠肝脏线粒体的丝状体记录的单通道，1991年首次报道无神经的线粒体K_ATP通道(Inoue I,等Nature 1991,352:244-247)。由于技术困难和线粒体的复杂性，线粒体K_ATP通道的分子组成仍不清楚(Rodrigo,G.C.和Standen,N.B.Current Pharmaceutical Design,2005,11:1915-1940)。有建议认为线粒体K_ATP通道在心脏组织的IPC中有保护作用，并通过数种可能机制阻止细胞凋亡，所述机制包括调节活性氧(ROS)生成、保持线粒体基质体积和调节线粒体Ca²⁺水平(Ardehali,H.J.Bioenergetics and Biomembranes,2005,37:171-177)。

用无标记试验筛选线粒体ATP敏感性钾离子通道

离子通道仍是一类未充分开发的靶标。一种限制因素是缺少生理相关的筛选工具。包括常规和自动膜片钳的膜片钳具有低至中等的通量，且涉及使用人工系统（即工程改造细胞和/或人工试验环境）。最重要的是这些试验是单细胞试验。然而，细胞响应在单细胞水平高度异质。同样重要的是这些试验是侵入性的，需要的紧密密封可能扰乱离子通道复合物的细胞结构。除了具有侵入性和使用人工系统（即工程改造的细胞和/或染料标记分子），离子流/荧光分析通常产生较差的命中质量-较高的假阳性和阴性，这是由于需要预装载可能改变细胞背景的染料或离子。为了克服这些缺点，本文公开的方法使用无标记细胞试验就天然细胞中的内源离子通道筛选调节剂。在一些实施方式中，所公开的方法使用无标记细胞试验就内源mito-K_ATP离子通道筛选调节剂。在一些实施方式中，所述筛选在非常规细胞系中进行。在一些实施方式中，所述mito-K_ATP通道的功能作用未知，但其活性可通过生物传感器细胞试验准确检测。所述无标记生物传感器，具体为包括SPR和RWG的视觉生物传感器是非侵入性的且可实时检测通过离子通道介导的敏感区内离子通道配体诱导的细胞物质动态再分配。得到的DMR信号是整合的细胞响应，并跟踪离子通道活性的完整发展。实时动力学能对在离子通道和其调控蛋白上作用的调节剂作用模式分类。所述生物传感器离子通道细胞试验的其他益处可包括但不限于所述生物传感器离子通道试验能就连接离子通道活性和细胞生理的离子通道调节剂提供新见解。

内源mito-K_ATP作为治疗靶标用于预防或治疗肝病

内源mito-K_ATP通道在肝细胞或肝组织的生物、生理和病理生理作用未知。然而，有一些证据表明K_ATP通道在转化的肝肿瘤细胞系(HepG2)中内源性表达。所公开的方法还可提供证据显示初级肝细胞中转化的mito-K_ATP通道表达、内源mito-K_ATP通道活化的下游细胞生物学和生理学以及mito-K_ATP通道活化在初级肝细胞药物代谢中的作用。公开的方法还可将下游的mito-KATP活化靶标（如JAK和Rho激酶）鉴定为治疗肝病的潜在治疗靶标。

Rho激酶

Rho激酶又称为ROCK，是RhoA的主要效应子。ROCK是约160kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对应的基因产物是ROCK I和ROCK II（rho-相关卷曲螺旋，含激酶-1和-2，还分别称为Rokb/p160ROCK和Roka）。这两种激酶在人类中具有64%总体相同性，在催化激酶结构域有89%相同性。两种激酶都含由C1保守区域分开的卷曲螺旋区域和普列克底物蛋白同源（PH）结构域。这两种ROCK具有空间上差异的表达。Rho激酶通过其COOH-末端结构域自我调节，其折叠回到活性位点上以抑制其激酶活性。仅RhoA的活性GTP结合形式结合ROCK并阻断所述蛋白的失活。只要Rho的活化形式结合ROCK，则激酶保持活化。Rho激酶还可被花生四烯酸和鞘氨醇磷脂酰胆碱（sphingosylphosphorylcholine）活化。胱冬酶对抑制性COOH-末端的切割可使ROCK活性在凋亡期间增加。

丝氨酸/苏氨酸激酶ROCK1和ROCK2是活化的Rho GTP酶的直接靶标，且异常rho/ROCK信号传导涉及许多人类疾病。ROCK1和ROCK2是AGC亚家族酶的密切相关的成员，其为响应许多胞外刺激的活化Rho的活化下游，所述刺激包括生长因子、整联蛋白活化和细胞应激。ROCK活化引起一系列协同事件，促进力生成和形态改变。这些事件直接引起许多肌动蛋白-肌球蛋白-介导的过程，如细胞运动、粘附、平滑肌收缩、神经突收缩和噬菌作用。此外，ROCK激酶在增殖、分化、凋亡和致癌转化中起作用，尽管这些响应可为细胞类型依赖性的。

ROCK的活化导致许多不同下游靶标的后续磷酸化作用。最熟知的Rho激酶靶标是肌球蛋白轻链（MLC）。肌球蛋白磷酸酶也被Rho激酶磷酸化且该相互作用引起磷酸化MLC的增加。此外，ROCK在LIM激酶-1和激酶-2（LIMK1和LIMK2）的活化环中保守的苏氨酸处将其磷酸化，增加LIMK活性以及丝切蛋白（cofilin）的后续磷酸化，其阻断它们的F肌动蛋白切割活性。参与肌动蛋白细胞骨架重排的许多其他蛋白由ROCK磷酸化。

ROCK酶在许多细胞过程中有重要作用，包括细胞形态、应力纤维形成和功能、细胞粘附、细胞迁移和侵入、上皮-间充质转变、转化、噬菌作用、凋亡、神经突收缩、胞质分裂和细胞分化。因此，ROCK激酶代表用于治疗各种紊乱的抑制剂开发的可能靶标，所述紊乱包括癌症、高血压、血管痉挛、哮喘、早产、勃起机能障碍、青光眼、动脉粥样硬化、心肌梗塞、肥大和神经疾病。

哮喘是慢性炎性气道疾病，特征为早期和晚期的哮喘性反应，所述反应与气道中炎症细胞浸润和活化以及对包括神经递质和炎症介质在内各种刺激的气道高反应性有关。在哮喘中，通过招募炎症细胞和通过驻留结构细胞而释放到气道中的炎症介质导致支气管收缩增加引起的气道高反应性。此外，慢性炎症似乎驱动气道重塑，引起固定气道阻塞的发展和慢性哮喘中气道反应性过高。气道重塑包括数种关键特征，如胞外基质蛋白在气道壁过量沉积（纤维症）和包围气道的收缩性气道平滑肌丰度增加。肌肉中固有功能改变或者肌肉功能的神经性或非神经性控制的改变引起的气道平滑肌收缩增加可部分解释气道高反应。此外，气道高反应性的发展被气道中的物理变化所加重，所述变化如上皮层损伤、粘膜肿胀、杯状细胞增生和气道壁重塑。气道重塑通常表征为网状层增厚、上皮下胞外基质沉积扩大（纤维症）和包围气道的收缩性气道平滑肌丰度增加。目前哮喘治疗不能令人满意地抑制这些特征。当前，过敏性哮喘的急性和慢性特征的治疗主要通过β2-肾上腺素受体激动剂和皮质激素类实现。过度气道平滑肌收缩引起的急性支气管痉挛可令人满意的在多数患者中通过吸入引起气道平滑肌放松的β2-肾上腺素受体激动剂而逆转。然而不幸的是，患者可产生对β2-肾上腺素受体激动剂的耐受性，且这些试剂对体内气道炎症和气道重塑效果很小，尽管报道了它们能体外抑制气道重塑的个体特征（如气道平滑肌增殖）。吸入的皮质激素类是控制包括持续性轻度、中度和严重哮喘在内的数种过敏疾病的主力，且熟知其降低鉴定哮喘的炎症过程强度的广谱活性。然而不幸的是，气道炎症的数种特征（如中性白细胞增多）可能对皮质激素类治疗相对不敏感。此外，皮质激素类仅在抑制气道重塑特征中部分有效。因此，尽管皮质激素类有效阻止气道重塑的数种特征（纤维症、气道平滑肌增厚、黏液腺肥大），但其在逆转气道壁重塑中效果较差。有关β2-肾上腺素受体激动剂和皮质类固醇治疗的限制推动其他药物靶标的研究和鉴定。Rho激酶在其中作为可能的治疗哮喘中气道反应过度的靶标。Rho-激酶是RhoA的效应分子，这是一种单体GTP结合蛋白，通过使肌球蛋白磷酸酶失活而引起Ca2+敏化。Rho-激酶的主要生理功能包括细胞的收缩、迁移和增殖。认为这些作用与哮喘的病理生理特征相关，即气流受限、气道高反应、β-肾上腺素脱敏、嗜伊红细胞招募和气道重塑。

JAK

Janus激酶(JAK)家族在涉及免疫响应的细胞增殖和功能的细胞因子依赖性调节中起作用。当前，有四种已知哺乳动物JAK家族成员：JAKl(又称为Janus激酶-1)、JAK2(又称为Janus激酶-2)、JAK3(又称为Janus激酶,白细胞;JAKL;L-JAK和Janus激酶-3)和TYK2(又称为蛋白-酪氨酸激酶T)。JAK蛋白大小范围为120-140kDa且包括7种保守的JAK同源(JH)结构域;这些之一是功能性催化激酶结构域，且另一是假性激酶结构域，可能作为调节功能和/或作为STAT的停靠位点。

在JAK激酶水平阻断信号转导对开发许多疾病治疗具有良好前景，所述疾病包括炎症疾病、自身免疫疾病和骨髓增生疾病和人类癌症等。JAK激酶的调节剂或抑制可在皮肤免疫紊乱如牛皮癣和皮肤敏化的患者中具有治疗益处。因此，Janus激酶或相关激酶的抑制剂广泛可见且许多出版物报道了有效种类的化合物。JAK相关疾病的另一示例包括自身免疫疾病如多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年关节炎、银屑病关节炎、I型糖尿病、狼疮、牛皮癣、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、自身免疫甲状腺紊乱等。在一些实施方式中，所述自身免疫疾病是自身免疫大疱皮肤病如寻常性天疱疮(PV)或大疱性天疱疮(BP)。JAK相关疾病的其他示例包括过敏病症如哮喘、食物过敏、遗传性过敏皮炎和鼻炎。JAK相关疾病的其他示例包括病毒性疾病如EB病毒(EBV)、乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、HTLV 1、水痘带状疱疹病毒(VZV)和人乳头状瘤病毒(HPV)。

其他JAK相关疾病包括发炎和炎症疾病。示例性的炎症疾病包括眼部炎症疾病（如虹膜炎、眼色素层炎、巩膜炎、结膜炎或相关疾病）、呼吸道炎症疾病(如上呼吸道，包括鼻和窦如鼻炎或窦炎，或下呼吸道，包括支气管炎、慢性阻塞性肺病等)、炎症肌肉病如心肌炎和其他炎症疾病。

声学生物传感器

声学生物传感器例如石英晶体谐振器使用声波以鉴定细胞反应。所述声波通常使用压电产生和接收。声学生物传感器经常设计成在共振类型传感器配置上操作。在通常设定中，薄石英盘夹在两个金电极之间。应用跨电极的AC信号造成晶体的激发和振荡，作为敏感振荡电路。所述输出传感器信号是所述共振频率和动态电阻。当生物传感器表面是刚性时，所述共振频率是吸收材料总质量的高度线性函数。在液体环境下，所述声学生物传感器反应不仅对结合分子质量敏感，而且对粘弹属性的改变和所形成分子复合物或活细胞的电荷敏感。通过测量与晶体相关的细胞的所述共振频率和所述动态电阻，实时研究细胞过程，包含细胞粘附和细胞毒性。

电学生物传感器

电学生物传感器使用阻抗来鉴定细胞响应，包括细胞粘附。在通常设定中，使活细胞接触嵌入集成电极阵列的生物传感器表面。恒定电压和高频下的小AC脉冲用于产生电极间电场，其被存在的细胞所阻碍。所述电脉冲使用集成电路原位产生，并且随着时间跟踪通过所述电路的电流。所得阻抗是对细胞层电导率变化的测量。所述细胞质膜作为绝缘剂迫使电流在细胞间或之下流动，造成阻抗上的相当强的改变。基于阻抗的测量用于研究广泛的细胞事件，包括细胞粘着和扩散、细胞微动、细胞形态变化、和细胞死亡和细胞信号传递。

光学生物传感器

光学生物传感器首先使用表面结合电磁波以鉴定细胞反应。所述表面结合波能在金底物上使用光激发表面等离子体（表面等离体共振，SPR）或在介电基底上使用衍射光栅偶联的波导模式共振（共振波导光栅，RWG）来实现。对包含中红外（mid-IR）SPR的SPR而言，所述读取是发生最小反射光强度时的共振角度。相似地，对包含光子晶体生物传感器的RWG生物传感器而言，所述读取是实现最大入偶联效率时的共振角度或波长。所述共振角度或波长是传感器表面或附近的局部折射率的函数。由于近期设备和试验的改进，不同于限定在试验的几个流道的SPR，RWG生物传感器可用于高通量筛选（HTS）和细胞试验。在典型RWG中，所述细胞直接置于微量滴定板的孔内，其中置入由高折射率材料组成的生物传感器。局部折射率的改变造成活细胞在刺激后的动态质量再分布（DMR）信号。所述生物传感器已经用于研究不同细胞过程，包含受体生物学、配体药理学和细胞粘附。

本发明优选使用共振波导光栅生物传感器，例如康宁（Corning）

系统。系统包含市售可得波长整合系统，或角度调制系统或扫频波长成像系统（纽约州康宁的康宁公司（Corning Inc.））。所述市售系统由温度控制单元、光学检测单元、和用机器人的机载液体操作单元或用机器人的外部液体附属系统组成。所述检测单元以集成光纤为核心，能以约7或15秒的时间间隔对细胞响应进行动力学测量。所述化合物溶液通过使用机载液体操作单元或外部液体附属系统引入；两者都使用传统液体操作系统。也能使用包含高分辨成像系统和高采集光学生物传感器系统的不同RWG生物传感器系统。

生物传感器和生物传感器细胞试验

基于无标记细胞的试验常使用生物传感器监控活细胞中分子诱导的响应。分子可以是天然产生或是合成的，可以是纯化的或未纯化的混合物。生物传感器常利用传感器，例如光、电、热量、声、磁、或类似传感器将与生物传感器接触的细胞内的分子识别事件或分子诱发变化转化成可定量的信号。这些无标记生物传感器可用于涉及鉴定分子复合物如何随时间形成和解离的分子相互作用分析，或用于涉及鉴定细胞如何响应刺激的细胞响应。可用于本方法的生物传感器包括例如，光学生物传感器系统如表面等离子体共振（SPR）和包括光子晶体生物传感器的共振波导光栅（RWG）生物传感器、共振镜、椭圆计，和电生物传感器系统如生物阻抗系统。

SPR生物传感器和系统

SPR依靠棱镜把覆盖一定入射角范围的楔形偏振光导入装有导电金属膜（例如金）的平面玻璃基材上以激发表面等离子体。所产生的渐消波与金层中的游离电子云相互作用并被吸收，产生电荷密度波（即表面等离子体）并导致反射光强度的减弱。产生最小强度的共振角随传感器表面的反面上接近金层溶液的折射率而变化。

RWG生物传感器和系统

RWG生物传感器可包括，例如基材（例如玻璃）、包埋了光栅或周期性结构的波导薄膜、和细胞层。RWG生物传感器通过衍射光栅的方式将光共振偶联进入波导，导致在溶液-表面界面的全内反射，进而在界面产生电磁场。这一电磁场本质是渐消的，表示它从传感器表面指数衰减；它衰减到初始值的1/e的距离称为贯穿深度，它随具体的RWG生物传感器的设计而变化，但通常在约200纳米左右。这类生物传感器利用这种渐消波鉴定传感器表面上或靠近该表面的细胞层由配体诱导的变化。

RWG仪器可以根据角位移或波长移位测量细分为不同系统。在波长移位测量中，采用具有恒定角度的覆盖一定入射波长范围的偏振光照射波导，特定波长的光被偶联入并沿波导传播。或者，在角位移仪器中，用单色光照射传感器并测量光的共振偶联角度。

共振条件受与生物传感器表面直接接触的细胞层影响（例如细胞融合、粘附和状态）。当配体或分析物与活细胞内的细胞靶标（例如，GPCR、离子通道、激酶）相互作用时，细胞层内局部折射率的任何变化可以通过共振角（或波长）的变化检测出。

系统采用RWG生物传感器进行无标记生化或基于细胞的试验（康宁公司，纽约州康宁）。所述系统由RWG读板仪和SBS（生物分子筛选学会）标准微量滴定板组成。读板仪的检测器系统利用集成光纤测量细胞内配体诱导变化所引起的入射光波长移位。一系列照射-检测头以线性方式排列，从而能从384孔微孔板的列中各孔同时采集反射光谱。扫描整块板使得每个传感器被多次访问，每列被依序访问。采集入射光的波长并用于分析。所述仪器可包括温控单元以尽可能减少因温度波动导致的入射波长假移位。测得的响应代表细胞群的平均响应。系统的不同特征例如样品加载可以自动化，也可以多通路化，例如用96孔或384孔微量滴定板。可以用机载的液体处理器或外接的液体处理附件进行液体操作。具体地，在各孔底部培养了细胞的细胞试验板的孔内直接添加或抽吸入分子溶液。细胞试验板包含一定体积试验缓冲液覆盖细胞。在分子添加步骤中还可以加入通过上下抽吸数次完成的简单混合步骤。

电生物传感器和系统

电生物传感器由基底（例如，塑料）、电极、和细胞层组成。在这种电检测方法中，在排列于基底上的小金电极上培养细胞，并随时间跟踪系统的电阻抗。阻抗是对细胞层电导率变化的量度。通常，在电极或电极阵列上施加固定频率或变频的微小恒定电压，随时间监控通过电路的电流。配体诱导的电流变化提供了细胞响应的量度。用于全细胞感测的阻抗测量最初于1984年实现。从那时起，基于阻抗的测量被应用于研究广泛的细胞事件，包括细胞粘着和扩散、细胞微动、细胞形态变化、和细胞死亡。经典阻抗系统的问题在于因使用小检测电极和大参照电极导致的高试验变化性。为克服这一变化性，最新一代的系统例如CellKey系统（美迪希实验仪器公司(MDS Sciex)，加利福尼亚州南旧金山）和RT-CES（艾森生物科学公司(ACEA Biosciences Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥）采用具有微电极阵列的集成电路。

高空间分辨率生物传感器成像系统

光生物传感器成像系统包括SPR成像系统、椭圆计成像系统、和RWG成像系统，提供了高空间分辨率，可用于本公开的实施方式中。例如，SPR

II（GWC技术公司（GWC Technologies Inc））采用棱镜偶联SPR，在固定的入射角进行SPR测量，并用CCD相机采集反射光。记录表面的变化作为反射率变化。因此，SPR成像同时采集阵列中所有元件的测量。

基于RWG生物传感器的扫频波长光解调系统能用于以成像为基础的应用。该系统中，采用快速可调激光源照射传感器或微孔板形式的RWG生物传感器阵列。可以通过检测激光波长扫描时传感器上反射的光功率随时间的变化来构建传感器光谱，用计算机化共振波长解调模型分析所测数据得到有固定受体或细胞层的生物传感器的空间解析图像。使用图像传感器自然生成基于成像的解调方案。可以无需移动部件获得二维无标签图像。

或者，可以采用具有横向磁力或p-偏振光TM₀模式的角度调制系统。该系统由发射系统和基于CCD相机的接收系统组成，发射系统产生光束阵列从而各以约200μmx3000μm或200μmx2000μm的维度照射RWG传感器，基于CCD相机的接收系统用于记录从这些传感器反射的光束角度变化。通过分光器和衍射光学镜片的组合获得排列的光束。该系统能每3秒对最多49个传感器（在7x7孔传感器阵列中）同时取样，或每10秒对最多整个384孔微孔板进行同时取样。

或者，还可使用扫描波长解调系统。该系统中，采用以恒定角度覆盖一定入射波长范围的偏振光照射并扫描波导光栅生物传感器，可同时记录各位置的反射光。通过扫描，也可以获得生物传感器的高分辨率图像。

生物传感器参数

无标签生物传感器如RWG生物传感器或生物阻抗生物传感器能实时跟踪配体诱导的细胞响应。非侵入性和无操作的生物传感器细胞试验不要求对细胞信号传导的现有知识。所得生物传感器信号包含涉及受体信号传导和配体药理学的重要信息。可以从细胞受刺激后的动力学生物传感器响应中提取多种参数。这些参数包括但不限于，总体动态、阶段、信号幅度、以及动力学参数，包括从一个阶段到另一阶段的转变时间和各阶段的动力学（参见Fang,Y.和Ferrie,A.M.(2008)“label-freeoptical biosensor for ligand-directed functional selectivity acting onβ2adrenoceptorin living cells（无标签光生物传感器用于活细胞内β2肾上腺素受体的配体定向功能选择性）”，FEBS Lett.582,558–564；Fang,Y.等，(2005)“Characteristics of dynamicmass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label freeoptical biosensors（用无标签光生物传感器测得的活细胞内EGF受体信号转导的动态质量再分布的特征）”.Anal.Chem.,77,5720-5725；Fang,Y.等，(2006)“Resonantwaveguide grating biosensor for living cell sensing（用于活细胞感测的共振波导光栅生物传感器）”.Biophys.J.,91,1925-1940）。

对聚类或相似性分析而言，每个节点（即分子）的所述边缘属性（即生物传感器细胞反应数据）能不同。例如，对于细胞中的分子概况（初级次级），边缘属性能是特定动力学参数（如DMR信号中的DMR事件的幅度或动力学），或在刺激后给定时间的生物传感器信号的真实值，或刺激后多个或所有时间点的生物传感器信号的真实值。就分子生物传感器次级概况而言，边缘属性也能是在对各标记初级概况标准化后，相对特定标记的生物传感器信号输出参数的调节百分比。因此，所述共同边缘属性代表显示节点分子的无标记药理学的有效方法，从而能根据本公开方法比较和测定该分子与已知分子的相似性。

生物传感器输出参数

本文讨论了多种不同的生物传感器输出参数。例如，确定刺激诱导的细胞内定向质量再分布动力学的六个参数可以是：总体动态（即形状）、响应的阶段（在A431静息细胞内EGF所诱导DMR信号的具体实施例中，涉及细胞响应有三个主要阶段：正动态质量再分布(P-DMR)、负动态质量再分布(N-DMR)、和恢复性正动态质量再分布(RP-DMR)）、动力学、各阶段总持续时间、各DMR事件的总幅度、和从P-到N-DMR阶段或从N-DMR到RP-DMR阶段的转变时间。动态质量再分布常称为动态细胞物质再分布或定向质量再分布。可以从共振峰获得其它生物传感器输出参数。例如，可以采用峰位置、强度、峰形和半峰宽（PWHM）。还可以从生物传感器的共振带图像获得生物传感器输出参数。五种附加特征：带形、位置、强度、分布和宽度。对于采用本文所公开生物传感器的任何细胞试验给定应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用参数的任何子集或组合可就给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体试验的特定特征。

涉及刺激诱导的定向质量再分布动力学的参数

有多种生物传感器输出参数涉及刺激诱导DMR的动力学。这些参数考察当出现细胞的刺激事件时生物传感器数据输出发生的变化速率。刺激事件是能改变细胞状态的任何事件，举例来说，如向培养基中添加分子、从培养基中除去分子、改变温度或改变pH、或对细胞引入辐射。刺激事件能产生刺激效果，这可以是由刺激事件对细胞产生的任何效果，例如定向质量再分布。刺激事件可以是分子、化学物质、生化物质、生物物质、聚合物。所述生化物质或生物物质可以是肽、合成肽、或天然产生的肽。例如，很多不同的肽作为信号分子，包括促炎肽缓激肽、蛋白酶凝血酶、和血压调节肽血管紧张素。尽管这三种蛋白质的序列和生理学不同，通过不同细胞表面受体发挥作用，它们共用一类称为G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞表面受体。GPCR的其它多肽配体包括：加压素、催产素、促生长素抑制素、神经肽Y、GnRH、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、食欲素、硬骨鱼紧张肽II、内啡肽、脑啡肽等。GPCR属于广泛且多样的基因家族，不仅响应肽配体，还响应小分子神经递质（乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺和肾上腺素）、光、增味剂、味道、脂质、核苷酸和离子。GPCR使用的主要信号传导机制是和G蛋白GTP酶蛋白相互作用，其与包括胞内钙释放和cAMP生成在内的下游第二信使系统偶联。肽GPCR使用的胞内信号传导系统和所有GPCR所使用的相似，常根据与其相互作用的G蛋白和被激活的第二信使系统进行分类。对Gs偶联的GPCR，由受体激活的G蛋白Gs刺激下游活化腺苷酸环化酶和生成环AMP，而Gi偶联的受体抑制cAMP的生成。cAMP生成的一个关键结果是蛋白激酶A的激活。Gq偶联受体刺激磷脂酶C，释放IP3和二酰甘油。在ER内IP3与受体结合导致胞内钙的释放，随后激活蛋白激酶C、钙调蛋白依赖性通路。除了GPCR的这些第二信使信号传导系统以外，GPCR通路显示与其它信号传导通路（包括酪氨酸激酶生长因子受体和MAP激酶通路）的串扰。受体酪氨酸激酶如EGF受体或黏着斑复合物的反式激活可通过衔接蛋白She、Grb2和Sos，以及下游Map激酶激活Erkl和Erk2来刺激ras激活。Src激酶还能在GPCR激活ras和map激酶通路中起到关键的中介作用。

可能发生一些刺激事件但数据输出没有改变。这种情况仍是刺激事件，因为细胞的情况在某些方面已经改变，这可能导致细胞或细胞培养中的定向质量再分布或变化。

应当理解对本文公开的任何试验或任何细胞情况都能确定具体的特征。本文对很多不同试验公开了大量“特征”，但对于本文进行的任何试验，该试验的“特征”可以确定。对于任何给定试验也可能有多于一个“特征”并且其中每个都能如本文所述确定。在采集生物传感器输出数据并考察一个或多个参数后，可以得到给定试验的特征。需要进行多次实验以鉴定最优特征，并且需要在不同条件下进行实验以找出最优特征，不过这能够完成。应当理解，本文公开的任何方法可含有步骤用于例如“识别”或“确定”或“提供”添加其上的特征。

总体动态

数据输出的总体动态是可供考察的一个参数。该总体动态参数观察数据集合的完整动力学情况。总体动态可供观察的一个方面是数据输出所产生曲线形状随时间的形状变化。因此，由数据输出产生的曲线形状在发生刺激事件时或者发生改变或者保持不变。改变的方向表明总体质量分布；例如正DMR（P-DMR）阶段表明在传感器的渐消尾部内的质量增加；净零的DMR表明在传感器渐消尾部内几乎没有净质量变化；而负DMR表明在传感器渐消尾部内的净质量减少。

采用光生物传感器所得刺激诱导细胞响应的总体动态可以由单个阶段（P-DMR或N-DMR或净零DMR）、或两个阶段（例如，所述两个阶段可以是这三种阶段的任意组合）、或三个阶段或多个阶段（例如，在时程中可以出现超过一个P-DMR阶段）组成。

响应的阶段

可作为时间函数观察的另一参数是在数据输出中发生的阶段变化。无标签生物传感器产生数据输出，可供作图生成曲线。该曲线具有转变点，例如数据从增加状态变为减少状态或相反。这些变化可称为阶段转变，举例来说，它们发生的时间和它们采取的形状可用作生物传感器输出参数。例如，可以有P-DMR、净零DMR、N-DMR、或RP-DMR。所述P-DMR、N-DMR和RP-DMR的幅度能作为单独生物传感器输出参数测量。

动力学

另一生物传感器输出参数可以是数据输出任何方面的动力学。例如，完成阶段转变的速度。例如，阶段转变多快完成或完成数据输出耗时多长。另一可测量的动力学示例是数据输出整体阶段占用的时间长度。另一示例是P-和N-DMR阶段之一或两者的总持续时间。另一示例是P-和N-DMR阶段之一或两者达到总幅度的速度或时间。另一示例可以是从P-到N-DMR阶段的转变时间τ。还可以测量P-DMR和N-DMR事件或阶段的动力学。

涉及共振峰的参数

给定导模的共振峰是通过考察例如光强度与光偶联入生物传感器的角度，或光强度与进入生物传感器的偶联光波长而产生的一种数据输出。光波导光模光谱是通过采用大角度范围的光照射生物传感器的方式考察光强度与偶联光进入生物传感器的角度并监测入偶联强度随角度的变化而产生的一种数据输出。在该光谱中，多个导模的多个共振峰共同出现。由于共振峰和OWLS光谱的原理相同，当发生特定波长的光或当光的产生使其以特定角度射到生物传感器上时，可以在生物传感器中互换采用给定导模的共振峰或多个导模的OWLS光谱，光源发射的光与生物传感器偶联并且这种偶联增强了生物传感器产生的信号。这种随偶联光的角度或波长变化的强度改变称为共振峰。传感器不同的给定模会产生具有不同特征的相似共振峰。有许多不同参数定义给定模式的共振峰或共振光谱，可与该峰相关使用以评价DMR或细胞效应。下面讨论其中的子集。

峰位置

当用数据输出作图时，共振峰出现在例如光偶联进入生物传感器的特定波长或特定入射角。该峰发生的角度或波长位置会在刺激事件的响应中由于质量再分布或细胞事件而改变。例如，存在特定受体如EGF受体的潜在生长因子时，培养细胞的共振峰的位置会提高或降低偶联角度或偶联波长，这会造成共振峰中心位置改变。应当理解峰强度位置处可以测得，这也是一个良好的测量点，还可以测量共振峰上任意点的位置，例如，75%峰强度或50%峰强度或25%峰强度或66%峰强度或45%峰强度（认为公开了1-100%峰强度的所有水平）。但是，当使用峰强度以外的点时，总会有某一个峰强度之前的位置和峰强度之后的位置都处于例如45%峰强度。因此，对任何峰强度以外的强度，在峰内总有两个位置产生所述强度。这些非峰强度的位置可用作生物传感器输出参数，但需要简单知道所述强度的位置是在峰强度之前或峰强度之后。

强度

正如共振峰特定强度的位置可用作生物传感器输出参数，强度本身的量也可以是生物传感器输出参数。一种特定相关强度是给定模式的共振峰的最大强度。和位置相似，所述最大强度的量级会根据对细胞或细胞培养有特定影响的刺激事件的存在而改变，这种改变可以测得并用作特征。正如共振峰的位置，也可在峰内的任何强度或位置测得共振峰强度。例如，可以采用最大强度的50%或最大强度的30%或最大强度的70%或最大强度的1%和100%之间任意百分数作为生物传感器输出参数。同样，和强度的位置相似，若采用最大强度以外的强度，例如最大强度的45%，在共振峰内总会有两个位置具有该强度。正如强度位置参数，可以采用非最大强度，只是必须考虑所述强度是最大值前的强度或是最大值后的强度。

例如，当初始的细胞融合约为50%（约50%融合时，传感器表面的细胞往往产生最大的PWHM值）时，抑制剂和激活剂的同时存在导致培养后半峰宽（PWHM）降低；但是，另一生物传感器输出参数，例如总体角位移（即共振峰的中心位置）可用于区分抑制剂和激活剂和完全无效的分子。PWHM是在峰最大强度（高度）一半处的峰上两点间连线的长度，如图6B所示。例如，当所有传感器上的细胞密度基本一致或大致相同时，细胞增殖的抑制剂产生的角位移往往小于完全未受处理的细胞，而激活剂产生的角位移往往大于细胞未经任何处理的传感器。所有分子的浓度相同时，可以通过分子对PWHM值的影响确定分子抑制（作为抑制剂）或刺激（作为激活剂）细胞增殖的效能或能力。与共振峰中心位置的变化联用，预先确定的PWHM变化值可用来过滤出抑制剂或激活剂。取决于检测给定模式共振峰所用的解调系统，PWHM的单位或数值可以不同。例如，对于角度解调系统，单位可以是度。例如，PWHM的变化度数可以是千分之一、千分之二、千分之三、千分之五、千分之七、或千分之十。

峰形

可采用的另一生物传感器输出参数是总体峰形、或在某强度之间或该处的峰形。例如，可采用最大峰强度一半、或任何其它强度（例如30%、40%、70%、或88%、或20-100%的任何百分数）处的峰形作为生物传感器输出参数。形状可以用特定强度之下或之上的峰面积鉴定。例如，在最大峰强度的一半处，有一个峰前强度点和一个峰后强度点。可以在这两点间划线，可以确定共振峰内该线上面的面积或共振峰内该线下面的面积并成为生物传感器输出参数。应当理解给定峰的积分面积也可用于分析分子作用于细胞的效果。

另一种涉及形状的生物传感器输出参数可以是特定峰强度的共振峰宽度。例如，可以通过测量50%峰强度的共振峰上峰前强度点和50%峰强度的峰后线上点之间连线的尺寸来确定最大峰强度一半处的共振峰宽（HMPW）。该测量可用作生物传感器的输出参数。应当理解可以用这一方式确定20到100%峰强度之间任何强度的的共振峰宽度。（此实施例可参见附图，例如图6B）。

生物传感器共振带图像的相关参数

目前，多数光生物传感器一次一项地监控靶分子与固定在传感器表面的探针分子的结合、或者传感器表面的细胞粘着或细胞活力。对于多个生物传感器上的结合事件或细胞粘着或细胞活力，研究人员通常以时序的方式监控这些事件。因此，不同传感器之间的直接比较是个挑战。此外，这些检测系统不论是波长或是角度调制都采用小点（~100-500μm直径）的激光照射传感器。响应或共振峰代表照射区域的平均细胞响应。对于96孔生物传感器微孔板（例如康宁的Epic微孔板），各RWG传感器约为3x3mm²并位于各孔底部，而对于384孔形式的微孔板，传感器尺寸一般为1x1mm²。因此，采用现有传感器技术所得响应仅代表传感器表面的一小部分。理想地，检测系统应不但能同时监控附着在多个生物传感器上的活细胞响应，还能对各传感器上的较大区域或多个区域进行信号解调。

由成像光学解调系统（例如CCD相机）得到的共振带是通过考察例如跨单个传感器限定位置反射（即出偶联的）光强度相比物理位置，产生的数据输出类型。反射光与入偶联光直接相关。或者，可以通过扫描解调系统采集共振带，采用小激光点照射传感器，以一维或二维形式扫描整个传感器、并采集给定导模的共振峰。最后可重新组成随传感器内位置而变化的共振峰或光强度以形成传感器的共振带。在生物传感器中，当产生特定波长的光或者当产生光使之以特定角度射到生物传感器上时，出偶联光随传感器表面/接近传感器表面的折射率变化而改变，这种改变导致成像系统采集的各传感器的共振带特征改变。此外，培养后细胞在整个传感器上的不均匀粘着可以采用共振带直接显现（例如，参见图1中圈注的共振带）。在理想的多孔生物传感器微孔板中，各传感器的位置相对其它生物传感器标准化；即传感器通过微孔板中整行或整列各孔的中心对齐。因此，所得共振带图像可用作细胞粘着或响应刺激的细胞变化的内部参照。因此，各给定模式传感器的共振带提供了可涉及此带使用的额外参数以评价DMR或细胞影响。下面讨论其中的子集。

带形

另一可采用的生物传感器输出参数是各给定模式生物传感器的共振带形状。所述形状由跨越各传感器较大区域的强度分布定义。所述形状可用于指示所粘附细胞的均一性或所述较大区域内响应刺激的细胞改变（例如，如图1所示，各共振带代表跨越尺寸为约200mmx3000mm的完整传感器的响应）。

位置

和给定模式的各传感器共振峰的位置类似，各共振带的位置可用作生物传感器输出参数。可以采用成像软件定量强度以产生各带最大强度的中心位置。该位置可用于检测响应刺激或分子处理的细胞变化。

强度

正如共振带的位置，采用成像系统采集的出偶联光强度可用作生物传感器输出参数。整个带的平均强度或成像带中各像素的绝对强度可用于检测细胞粘附的质量并评价细胞响应。

分布

采用成像系统采集到的具有确定角度或波长的出偶联光的分布可用作生物传感器输出参数。该参数可在无固定细胞或探针分子时用于评估传感器本身的表面性质，也可检测传感器表面照射区域中细胞粘附的质量。同样，该参数还可在整个区域的细胞密度一致时用于检测分子对细胞影响的均一性；或在受照面内某一区域与其它区域的细胞密度不同时用于检测细胞密度对分子诱导的细胞响应的影响。

宽度

正如给定模式共振峰的PWHM，采用成像系统获得的共振带宽度可用作生物传感器输出参数。该参数和共振峰的PWHM值共有几乎相同特征，从而共享有用信息内容，区别在于，本参数能获得传感器受照面多个区域的多个带宽，而不是只有一个PWHM用于共振峰。与其它通过共振带图像获得的参数相似，宽度可用于上述应用。

对于采用本文所公开生物传感器的任何细胞试验给定应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用参数的任何子集或组合可就给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体试验的特定特征。

活细胞内的动态质量再分布（DMR）信号

通过细胞靶标对刺激的细胞响应可以由下游信号网络的空间和时间动力学编码。为此，实时监控细胞信号转导的整合能提供用于细胞生物学和生理学理解的生理学相关信息。

光学生物传感器包括共振波导光栅（RWG）生物传感器，能检测动态细胞物质再分布相关的整合细胞响应，从而提供研究细胞信号转导的非侵入性手段。所有光学生物传感器的共同点在于它们能测量传感器表面或极接近该表面的局部折射率的变化。原则上，几乎所有光学生物传感器都可用于细胞感测，因为它们能使用渐消波鉴定细胞内配体诱导的变化。渐消波是电磁场，由光在溶液-表面界面的全内反射产生，它通常延伸到溶液内较短距离（约数百纳米），其特征深度称为贯穿深度或感测容积。

近来，开发出理论和数学模型描述在活细胞响应配体刺激中测得光学信号的参数和特性。这些模型基于3层波导系统与已知细胞生物物理的组合，将配体诱导的光信号与通过受体介导的特定细胞过程联系起来。

因为生物传感器测量位于入射光照射区域的细胞平均响应，可以采用细胞高度融合层以获得最佳试验结果。由于与生物传感器的短贯穿深度相比细胞尺寸较大，传感器配置视作非传统的三层系统：基材、具有光栅结构的波导膜和细胞层。因此，配体诱导的有效折射率（即，测得的信号）变化可以是，以一阶形式，直接与细胞层底部折射率变化成比例：

ΔN=S(C)Δn_c

其中S(C)为对细胞层的灵敏度，Δn_c为生物传感器感测的配体诱导的细胞层局部折射率变化。因为细胞内给定体积的折射率主要由生物分子如蛋白质的浓度决定，Δn_c可以假定为与局部细胞靶标浓度或感测体积内分子组件的配体诱导变化直接成比例。考虑到渐消波从传感器表面延伸的指数式衰减性质，配体诱导的光信号受下式支配：

$\mathrm{\ΔN}=S\left(C\right)\mathrm{\αd}\underset{i}{\mathrm{\Σ}}\mathrm{\Δ}{C}_i[e^{\frac{-z_i}{\mathrm{\Δ}{Z}_C}}-e^{\frac{{-z}_{i+1}}{{\mathrm{\ΔZ}}_C}}]$

其中，ΔZ_c为进入细胞层的贯穿深度，α为特定折射增量（蛋白质为约0.18/mL/g），z_i为质量再分布发生的距离，和d是细胞层内片层的假想厚度。在此细胞层在竖直方向上分成等间距的片层。上述等式表明配体诱导的光信号是离传感器表面不同距离发生的质量再分布之和，各自对总响应的贡献不等。此外，采用波长或角度变化形式的所测信号主要对发生在传感器表面垂直方向上的质量再分布敏感。因为其动态本质，它也称为动态质量再分布（DMR）信号。

细胞和生物传感器

细胞依靠多种细胞通路或组件进行处理、编码和整合它们接收的信息。不同于用光学生物传感器特异性测量分析物与蛋白靶标结合的亲和分析，活细胞更为复杂和动态。

为研究细胞信号转导，可以将细胞与生物传感器的表面接触，这能通过细胞培养实现。这些培养的细胞可以通过三种类型接触附着于生物传感器表面：点状接触、紧密接触和胞外基质接触，其中每种具有与表面的特征分离距离。因此，基础细胞膜常位于离表面约10-100nm。对于悬浮细胞，细胞可以通过细胞表面受体的共价偶联或细胞表面受体的特异性结合、或重力导致的简单沉降而与生物传感器表面接触。为此，生物传感器能感测细胞的底部部分。

在很多情况下，细胞表现出表面依赖性粘着和增殖。.为获得稳健的细胞试验，需要包被生物传感器表面以增强细胞粘着和增殖。然而，表面性质会对细胞生物学有直接影响。例如，表面结合的配体能影响细胞的响应，基材的机械顺从性同样会影响，机械顺从性决定了在细胞施加的力作用下材料如何变形。由于培养条件（时间、血清浓度、融合度等）不同，不同表面和不同条件得到的细胞状态可能不同。因此，需要特定努力控制细胞状态以开发基于生物传感器的细胞试验。

细胞是相对尺寸较大（通常在数十微米范围内）的动态物体。正如组织培养中用延时显微镜在亚细胞分辨率下和生物阻抗测量在纳米水平下所观察到的，即使没有刺激，细胞也在不断进行微动–细胞结构的动态移动和重塑。

在未刺激条件下，细胞一般产生几乎为净零的DMR响应，如RWG生物传感器所检测。这部分是因为光生物传感器的低空间分辨率，如大尺寸激光点和长传播距离的偶联光所确定。激光点的尺寸决定所研究区域的尺寸–且通常在一个时间只能追踪一个分析点。因此，生物传感器通常测量位于光入射区域的大细胞群的平均响应。虽然细胞在单细胞水平进行微动，大细胞群产生平均为净零的DMR响应。此外，在哺乳动物细胞中胞内大分子高度有序且空间限定于适当位点。细胞上和细胞内蛋白质定位的严格控制决定了特定细胞功能和响应，因为定位使细胞能调节蛋白质与其合适伴侣相互作用的特异性和效率并将蛋白质激活和失活机制进行空间隔离。.因为这种控制，在未刺激条件下，在感测体积内细胞的局部质量密度可以达到平衡状态，从而导致光响应为净零。为获得一致的光响应，所检测细胞可以在传统培养条件下培养一段时间，使得多数细胞刚好完成单次分裂周期。

活细胞具有感测和响应外源信号的精细能力。以前认为细胞信号转导通过线性路径作用，其中环境条件引发线性反应链，产生单个明确的响应。但是，研究显示对外界刺激的细胞响应要复杂得多。显然，细胞接收的信息会被处理和编码成信号蛋白磷酸化和拓扑移位的复杂时间和空间模式。将蛋白在空间和时间上靶向到适当位点对于调节蛋白-蛋白相互作用的特异性和效率至关重要，因此决定了细胞信号转导和响应的时间和强度。关键的细胞决策例如细胞骨架重组、细胞周期检测点和凋亡，取决于激活信号转导因子的精确时间控制和相对空间分布。因此，通过细胞靶标例如G蛋白偶联受体（GPCR）介导的细胞信号转导常以有序且受控方式进行，并由一系列空间和时间事件组成，其中很多导致细胞的局部质量密度变化或局部细胞物质再分布。当这些变化或再分布在感测体积内发生时，可以采用光学生物传感器直接实时跟踪。

DMR信号是活细胞生理响应

与研究受体生物学的传统药理学方法的比较显示，当配体对细胞系统中表达的受体特异时，配体诱导的DMR信号是受体特异性、剂量依赖性和可饱和的。对于大量G蛋白偶联受体（GPCR）配体，发现功效（根据EC₅₀值测得）与采用传统方法测得的功效几乎相同。此外，DMR信号表现出预期的脱敏模式，因为脱敏和再次致敏对所有GPCR是共有的。此外，DMR信号还保持了GPCR配体的保真度，这与采用传统技术所得到的类似。另外，生物传感器能区分全激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂和变构调节剂。总之，这些发现表明DMR能监控活细胞中的生理响应。

DMR信号含有活细胞内配体-受体对的系统细胞生物学信息

用配体刺激细胞引起一系列空间和时间事件，非限制性的示例包括配体结合、受体激活、蛋白募集、受体内化和再循环、第二信使交替、细胞骨架重塑、基因表达、细胞粘附变化。因为各细胞事件有其自身特点（例如，动力学、持续时间、幅度、质量移动），而生物传感器主要对涉及感应体积内质量再分布的细胞事件敏感，这些细胞事件能差异性地影响总DMR信号。化学生物学、细胞生物学和生物物理学方法可用来阐明配体诱导DMR信号的细胞机理。近来，直接采用化学物质介入特定细胞信号转导组分的化学生物学已经用于解决生物学问题。这可能是由于鉴定了大量特异性控制很多不同种类细胞靶标的调节剂。该方法已用于对信号转导及其通过受体介导的网状相互作用进行作图，包括表皮生长因子（EGF）受体，和G_q-与G_s-偶联受体。

EGFR属于受体酪氨酸激酶家族。EGF结合EGFR并刺激其内在蛋白-酪氨酸激酶活性，启动信号转导级联，原则上涉及MAPK、Akt和JNK通路。在EGF刺激后，有很多事件导致A431细胞内的质量再分布，A431是内源性过度表达EGFR的细胞系。已知EGFR信号转导取决于细胞状态。因此，EGF诱导的DMR信号也取决于细胞状态。通过0.1%胎牛血清培养20小时得到的静息细胞中，EGF刺激导致DMR信号有三个不同且顺序的阶段：(i)信号增强的正阶段(P-DMR)，(ii)转变阶段，和(iii)衰减阶段(N-DMR)。化学生物学和细胞生物学研究显示EGF诱导的DMR信号主要与Ras/MAPK途径相关，该途径通过MEK进行并引起细胞脱离。两条证据指出，P-DMR主要是由于募集胞内靶标到细胞表面的活化受体处。首先，阻断发动蛋白或网格蛋白活性对P-DMR事件的幅度影响极小。发动蛋白和网格蛋白是EGFR激活的两个下游组分，在EGFR内化和信号转导执行中起关键作用。其次，阻断MEK活性部分减弱P-DMR事件。MEK是MAPK通路的重要组分，在EGF刺激后，它首先从细胞质移位到细胞膜，然后与受体一起内化。

另一方面，N-DMR事件是由于细胞脱离和受体内化。荧光图像显示EGF刺激引起大量受体内化和细胞脱离。已知阻断受体内化或MEK活性可防止细胞脱离，受体内化同时需要发动蛋白和网格蛋白。这表明阻断发动蛋白或网格蛋白会抑制受体内化和细胞脱离，而阻断MEK活性应仅抑制细胞脱离，但不抑制受体内化。正如预期，发动蛋白或网格蛋白的抑制剂完全抑制了EGF诱导的N-DMR(~100%)，而MEK抑制剂仅部分弱化N-DMR(~80%)。荧光图像还证实阻断发动蛋白的活性但不阻断MEK，削弱了受体内化。

DMR信号含有作用于活细胞的配体的系统细胞药理学信息

由于DMR信号是整合的细胞响应，由很多涉及细胞物质在细胞底部动态再分布的细胞事件影响组成，配体诱导的生物传感器信号如DMR信号含有系统细胞药理学信息。已知GPCR常在细胞内显示丰富活动，并且很多配体能诱发有利细胞机理特定部分的操作偏好并显示出途径偏向的功效。因此，取决于受体下游细胞事件如何测量和用作配体药理学读出，配体很可能具有多种功效。实践中很难用传统细胞试验系统性表示GPCR配体的信号转导能力，传统细胞试验大多数为通路偏向性并仅试验单个信号转导事件。但是，因为无标签生物传感器细胞试验对细胞信号转导的现有知识没有要求，而且为通路非偏向且通路灵敏型，这些生物传感器细胞试验能适于研究任何配体的配体选择性信号转导和系统细胞药理学。

用于离子通道调节剂的无标记生物传感器和基于生物传感器的细胞试验

基于无标记细胞的试验常使用生物传感器监控活细胞中化合物诱导的响应。所述化合物可为天然产生或合成、纯化或未纯化的混合物。生物传感器常利用传感器，例如光、电、热量、声、磁、或类似传感器将与生物传感器接触的细胞内的分子识别事件或配体诱导的变化转化成可定量的信号。可用于本发明的生物传感器包括但不限于，光学生物传感器系统如表面等离子体共振（SPR）和共振波导光栅（RWG）生物传感器、共振镜、或椭圆计，和电生物传感器系统如生物阻抗系统。

离子通道是重要的药物靶标，因为其在控制非常广泛的生理过程中起关键作用，且因为其功能紊乱会引起病理生理异常。然而历史上，难以开发靶向此蛋白类型的药物。开发新的功能性、高通量筛选（HTS）策略以鉴定易控制的通常在小分子库中并不丰富的前导结构已产生有希望的结果。自动化基于细胞的HTS试验可就许多不同类型离子通道配制，用高密度形式的读板仪通过荧光方法监控膜电势变化或胞内钙。新的自动化膜片钳技术提供二级筛选以确保通道水平的命中活性、测定通过离子通道超家族的选择性并提供对作用机制的认识。相同的初级和二级试验有效支持了药物化学的先导开发。然而，这些方法极少提供离子通道调节如何影响细胞功能和生理的认识。

方法

本文所述方法和能用于所述方法的所述组合物和化合物能从很多不同种类中获得，例如材料、物质、分子和配体。公开了对无标记生物传感器试验独特的所述种类特定亚组，称为标记，例如吡那地尔作为K_ATP通道活化的标记。

应理解还公开所述种类的混合物，例如分子混合物，并能用于公开的方法。

在某些方法中，可使用未知分子、检测分子、药物候选物分子和已知分子。

在某些方法或情况中，调节或调节剂起作用，如K_ATP调节剂、JAK调节剂或ROCK调节剂以及所有这些的潜能。同样，可使用已知调节剂。

在某些方法以及组合物中涉及细胞、以及细胞系、细胞组、细胞靶标，其可产生来自例如细胞过程的细胞响应。细胞可经过培养且细胞培养物可如本文所述使用。

本文公开的方法涉及使用生物传感器的试验。在某些试验中，以激动或拮抗模式完成。通常，试验涉及用一个或多个种类处理细胞，例如材料、物质或分子。还应理解对象也能如本文所述处理。

在某些方法中，可发生例如分子和细胞间的接触。在公开的方法中，可检测反应如细胞反应，所述反应能显示作为生物传感器反应，例如DMR反应。能测试所述和其他反应。在某些方法中，生物传感器信号能是强生物传感器信号或强DMR信号。

使用无标记生物传感器的公开方法能生成概况，例如初级概况、二级概况和调节概况。例如，所述和其他概况能用于产生关于分子的测定和能与本文所述的任何种类一起使用。

还公开了化合物或组合物的库和组，例如本文公开的分子、细胞、材料或物质。还公开了特定组，例如标记组和细胞组。

公开的方法能使用多个方面，例如生物传感器信号、DMR信号、标准化、对照、阳性对照、调节比较、指数、生物传感器指数、DMR指数、分子生物传感器指数、分子DMR指数、分子指数、调节剂生物传感器指数、调节剂DMR指数、分子调节指数、已知调节剂生物传感器指数、已知调节剂DMR指数、标记生物传感器指数、标记DMR指数、调节标记的生物传感器信号、调节DMR信号、增强和指数的相似性。

任何组合物、化合物或本文公开的其他物质能以任何本文公开的方法鉴定。

公开了依赖于鉴定的方法，例如更高和抑制等词语。

在某些方法中，使用受体或细胞靶标。某些方法能提供关于信号通路以及经分子处理细胞和其他细胞过程的信息。

在某些实施方式中，某些效能或效力变成特性，并且可分析直接作用（例如药物候选分子）。

筛选K_ATP调节剂和mito-K_ATP作为药物靶标的方法

本文公开使用线粒体ATP-敏感性钾离子通道（mito-K_ATP）作为药物靶标的方法。在一些实施方式中，所述方法可鉴定能预防或治疗肝病的化合物。在一些实施方式中，所述化合物是mito-K_ATP通道调节剂。本文还公开使用无标记生物传感器细胞试验筛选肝细胞中mito-K_ATP通道调节剂的方法。

本文还公开筛选肝细胞中mito-K_ATP离子通道调节剂的方法。在一些实施方式中，所述筛选用无标记试验进行。无标记试验可依赖于使用已知的_KATP开放剂作为参考。在一些实施方式中，所述K_ATP开放剂是吡那地尔。如公开的方法所示，吡那地尔在转化的肝细胞系HepG2C3A中提供强动态质量再分布(DMR)信号。肝细胞中的吡那地尔DMR信号可用于筛选mito-K_ATP调节剂，包括mito-K_ATP途径调节剂。

还公开使用mito-K_ATP调节剂治疗或预防肝病的方法。如公开方法所示，肝细胞系HepG2C3A中的吡那地尔DMR信号与Kir6.2/SUR2K_ATP离子通道有关，且K_ATP离子通道主要位于线粒体内。吡那地尔DMR信号可与肌动蛋白重塑、ROCK活性和JAK活性有关。mito-K_ATP调节剂还可抑制熟知的肝毒性药物利福平诱导的CYP3A4酶活性。因此，mito-K_ATP通道可为治疗或预防肝病的可药化靶标。

本文还提供分析分子的方法，所述方法包括步骤：a.在底物表面培养K_ATP细胞系，其中所述生物传感器表面用于无标记生物传感器分析，b.用所述分子孵育所述细胞系，产生分子处理的细胞系，c.用无标记生物传感器分析所述分子处理的细胞系，产生分子数据输出，d.比较所述分子数据输出和相同细胞系中已知的K_ATP调节剂数据输出，生成分子-K_ATP调节剂比较。

本文还提供分析分子的方法，所述方法包括步骤：a.在生物传感器表面培养K_ATP细胞系，其中所述生物传感器表面用于无标记生物传感器分析，b.用标记物和所述分子孵育所述细胞系，产生孵育细胞系，c.用无标记生物传感器分析所述孵育细胞系，产生标记物-分子数据输出，d.比较所述标记物-分子数据输出和相同细胞系中的标记物-K_ATP调节剂数据输出，生成标记物-分子/标记物-K_ATP调节剂比较。

本文还提供分析分子的方法，所述方法包括步骤：a.在生物传感器表面培养四种不同细胞系，其中所述表面用于无标记生物传感器分析，其中所述四种细胞系为A431、A549、HT29和HepG2，b.用所述分子孵育各细胞系，产生四种孵育细胞系，c.用无标记生物传感器分析各孵育细胞系，产生各孵育细胞系的分子数据输出，和d.比较所述分子数据输出和相同细胞系中的ROCK抑制剂数据输出，生成各细胞系的分子-ROCK抑制剂比较。

本文还公开治疗对象的方法，所述方法包括给予所述对象K_ATP调节剂，其中所述对象需要治疗肝病。

本文还公开降低对象肝毒性的方法，所述方法包括给予所述对象KCO，从而所述KCO能作用于降低给予所述对象的药物的肝毒性。

在一些实施方式中，所述K_ATP细胞系可包括线粒体ATP-敏感性钾离子通道（mito-K_ATP）。

在一些实施方式中，所述细胞系可包括肝细胞。

在一些实施方式中，所述肝细胞可包括肝实质细胞。

在一些实施方式中，所述肝细胞可被肝炎病毒感染。在一些实施方式中，所述肝炎病毒可为甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、黄热病毒或腺病毒。

在一些实施方式中，所述细胞可获自感染有非病毒性感染的来源。

在一些实施方式中，所述非病毒性感染可包括弓形虫、钩端螺旋体、Q热和落矶山斑疹热。

在一些实施方式中，所述细胞可获自已受或受到化学品、毒素或药物影响的来源。

在一些实施方式中，所述化学品或毒素可包括酒精、扑热息痛、羟氨苄青霉素、抗结核药物、米诺环素、甲基多巴、呋喃妥因、异烟肼或酮康唑。

在一些实施方式中，所述已知的K_ATP调节剂数据输出可如下产生：孵育所述K_ATP调节剂和培养的K_ATP细胞系并用无标记生物传感器分析所孵育细胞系，产生K_ATP调节剂数据输出。

在一些实施方式中，所述方法还可包括当所述比较表明所述分子数据输出和所述K_ATP调节剂数据输出相似时鉴定可能的K_ATP调节剂。

在一些实施方式中，所述K_ATP细胞系可选自HepG2或HepG2C3A细胞系。

在一些实施方式中，所述已知的K_ATP调节剂可包含钾通道开放剂（KCO）。

在一些实施方式中，所述KCO可包含二氮嗪、松脂、克罗卡林或尼可地尔。

在一些实施方式中，所述K_ATP调节剂可包括K_ATP抑制剂。

在一些实施方式中，所述K_ATP抑制剂可包括磺酰脲或U-37883A

在一些实施方式中，所述磺酰脲可包括甲苯磺丁脲、甲磺氮卓脲或格列甲嗪。

在一些实施方式中，所述标记物-K_ATP调节剂数据输出可如下产生：孵育所述标记物和K_ATP调节剂与培养的K_ATP细胞系并用无标记生物传感器分析所孵育细胞系，产生标记物-K_ATP调节剂数据输出。

在一些实施方式中，所述方法还可包括当所述比较表明所述标记物-分子数据输出和所述标记物-K_ATP调节剂数据输出相似时鉴定可能的K_ATP调节剂。

在一些实施方式中，所述标记物可包括ROCK1调节剂或ROCK2调节剂。

在一些实施方式中，所述ROCK1调节剂或ROCK2调节剂可包括ROCK1抑制剂或ROCK2抑制剂。

在一些实施方式中，所述ROCK1抑制剂或ROCK2抑制剂包括Y-27632。

在一些实施方式中，所述标记物可包括JAK调节剂。

在一些实施方式中，所述JAK调节剂可包括JAK抑制剂。

在一些实施方式中，所述JAK抑制剂可包括AG490。

在一些实施方式中，所述标记物可包括细胞色素P450酶调节剂。

在一些实施方式中，所述细胞色素P450酶调节剂可包括细胞色素P450活化剂。

在一些实施方式中，细胞色素P450酶可包括CYP2D6或CYP3A4。

在一些实施方式中，所述细胞色素P450活化剂可包括利福平。

在一些实施方式中，所述方法还可包括就ROCK途径活性测试分子。

在一些实施方式中，分析步骤可包括，a.在某表面培养ROCK抑制剂响应细胞系，其中所述表面用于无标记生物传感器分析，b.用所述分子孵育所述细胞系，产生孵育细胞系，c.用无标记生物传感器分析所孵育细胞系，产生分子数据输出，和d.比较所述分子数据输出和相同细胞中已知的ROCK抑制剂数据输出，生成分子-ROCK抑制剂比较。

在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂响应细胞系可包括其中通过已知ROCK抑制剂对ROCK基础活性的抑制产生稳健生物传感器信号的细胞系。

在一些实施方式中，所述细胞系可选自A431、A549或HT29。

在一些实施方式中，所述方法可用至少2种标记物独立进行。

在一些实施方式中，所述标记物可以至少EC70、EC80、EC 90、EC95和EC100的浓度添加。

在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂可为Y27632且所述K_ATP调节剂可为LY-294002。

在一些实施方式中，所述ROCK抑制剂数据输出可如下产生：孵育所述ROCK抑制剂和各细胞系并用无标记生物传感器分析各孵育细胞系，产生各细胞系的ROCK抑制剂数据输出。

在一些实施方式中，所述方法还可包括产生K_ATP调节剂数据输出，和产生各细胞系的分子-K_ATP抑制剂比较。

在一些实施方式中，所述方法还可包含进行其他离子通道试验的步骤。

在一些实施方式中，所述其他离子通道试验可包括常规或自动膜片钳。

在一些实施方式中，所述K_ATP调节剂可包括mito-K_ATP调节剂。

在一些实施方式中，所述肝病可涉及所述K_ATP下游的JAK或Rho激酶信号传导。

在一些实施方式中，所述K_ATP通道可以是Kir6.2和SUR2通道。在一些实施方式中，所述KCO可为吡那地尔。

定义

下面参考附图（若有）详细描述本发明的各种实施方式。参考各种实施方式不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围的限制。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不意在构成限制，而仅是列出要求权利的本发明的许多可能实施方式中的一些。

一种

除非上下文中另有明确说明，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”，“一种”和“该”或类似术语包括复数指示物。因此，例如“一种药物载体”包括两种或更多载体的混合物等。

缩写

可采用本领域普通技术人员熟知的缩写（例如，表示小时的“h”或“hr”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”，表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”，表示摩尔的“M”以及类似缩写）。

约

本公开的实施方式描述中采用对例如，组合物中成分的量、浓度、体积、处理温度、处理时间、产率、流速、压力、和类似数值，及其范围进行修饰的约是指可能发生的数值量变化，例如，通过制备化合物、组合物、浓缩物或使用制剂所用的常规测量和操作过程；通过这些过程中的偶然性误差；通过用来进行所述方法的起始材料或成分的生产、来源或纯度的差异；和类似考虑因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的陈化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。无论是否受术语“约”修饰，所附权利要求书均包括这些量的等同形式。

“整个细胞组和针对标记组”

短语“整个细胞组和针对标记组”是指检测分子作用于细胞组内各细胞的初级概况以及分子调节标记组的调节概况的系统过程。对于标记/细胞对，所述过程首先从检测分子独立作用于每个类型细胞的初级概况开始，然后检测相同细胞内标记在分子存在下的二级概况。术语“针对”具体用于表示分子调节标记诱导的生物传感器响应的能力。

激动剂

激动剂是产生作用的分子或物质，如结合细胞上受体的分子，由所述细胞产生响应，其可为胞内的。

拮抗剂

拮抗剂是抑制如阻断作用如激动剂作用的分子或物质，如结合受体的分子，其阻止激动剂结合并因此抑制所述激动剂作用。

活化剂

活化剂是引起状态相比基底状态增加的任何物质。例如，吡那地尔是K_ATP通道的活化剂，K_ATP和K_ATP通道的结合引起信号传导事件。

测试

测试、试验或类似术语是指用以确定物质如分子或细胞特征的分析，例如细胞受一种或多种外源刺激如配体或标记刺激后光学或生物阻抗响应的存在、缺乏、量、程度、动力学、动态或类型。细胞响应刺激产生的生物传感器信号可以是试验。

测试响应

“测试响应”或类似术语是指采用某一方法来鉴定响应。例如，若使分子与细胞接触，可以采用生物传感器测试细胞在暴露于所述分子后的响应。

结合

“结合”、“附着”、“粘附”、“粘着”、“贴壁”、“固定化”、或类似术语一般指例如，表面修饰物质、相容剂、细胞、配体候选分子、和本公开的类似实体通过如物理吸附、化学结合、和类似过程或其组合固定化或固着在表面上。具体而言，“细胞附着”、“细胞粘着”或类似术语是指细胞与表面的相互作用或结合，例如通过培养、或与细胞锚定材料、相容剂（例如纤连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等）相互作用、或两者一起。“贴壁细胞”、“固定化细胞”或类似术语是指保持与生物传感器外表面结合、固定或某种接触的细胞或细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。这类细胞在培养后能承受或经受清洗和介质交换过程而保持附着，所述过程是很多基于细胞的试验的先决条件。

激动和拮抗模式

激动模式或类似术语是指细胞暴露于分子以确定所述分子引起生物传感器信号如DMR信号的能力的试验，而拮抗模式是指细胞在分子存在情况下暴露于标记以确定所述分子调节细胞响应所述标记的生物传感器信号的能力的试验。

生物传感器

生物传感器或类似术语是指用于检测分析物的联合了生物组件和理化检测器组件的装置。生物传感器通常由三部分组成：生物组件或元件（例如组织、微生物、病原体、细胞、或其组合）、检测器元件（以理化方式例如光学、压电、电化学、热学或磁力运作）、和与两种组件关联的换能器。生物组件或元件可以是例如，活细胞、病原体或其组合。在实施方式中，光学生物传感器可以包括将活细胞、病原体、或其组合中的分子识别或分子刺激事件转化成可量化信号的光换能器。

以生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学

“以生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学”或类似术语是采用无标记生物传感器细胞试验确定分子的药理学的方法。

生物传感器指数

“生物传感器指数”或类似术语是由生物传感器数据的集合构成的指数。生物传感器指数可以是生物传感器概况，例如初级概况、或二级概况的集合。所述指数可以包含任何种类的数据。例如，概况的指数可以只包括N-DMR数据点，它可以是P-DMR数据点、或者两种都有或者它可以是阻抗数据点。它可以是与概况曲线相关的所有数据点。

生物传感器响应

“生物传感器响应”、“生物传感器输出信号”、“生物传感器信号”或类似术语是指具有细胞的传感器系统对细胞响应的任何反应。生物传感器将细胞响应转化成可量化的传感器响应。生物传感器响应是由光生物传感器例如RWG或SPR测得的刺激后的光学响应或者是由电生物传感器测得的细胞在刺激后的生物阻抗响应。因为生物传感器响应与刺激后的细胞响应直接相关，在公开的实施方式中，生物传感器响应和细胞响应可以互换使用。

生物传感器信号

“生物传感器信号”或类似术语是指生物传感器测得的由细胞受刺激后响应产生的细胞信号。

生物传感器表面

生物传感器表面或类似术语是指能在其上具有培养细胞的任何生物传感器的表面。所述生物传感器表面能用组织培养物处理，或细胞外基质材料（如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等）包被或合成材料（如聚赖氨酸）包被。

细胞

细胞或类似术语是指外部被半透膜限定的小且通常微量的原生质，可选包括一个或多个核和各种其它细胞器，能独自或与其它类似物质相互作用运行生命的所有基本功能，并形成能独立作用的活性物质的最小结构单元，包括合成细胞构建体、细胞模型系统和类似人工细胞系统。

细胞可包括不同的细胞类型，例如与特定疾病相关的细胞、来自特定来源的细胞类型、与特定靶标相关的细胞类型、或与特定生理功能相关的细胞类型。细胞还可以是天然细胞、工程细胞、转化细胞、永生细胞、原代细胞、胚胎干细胞、成人干细胞、肿瘤干细胞、或干细胞衍生的细胞。

人体由约210种已知的不同细胞类型构成。考虑到细胞的制备方式（例如工程改造、转化、永生化、或新鲜分离自人体）和获取细胞的来源（例如不同年龄或不同疾病阶段的人体等），细胞类型的数目几乎是无限的。

细胞系

“细胞系”或类似术语指可通过至少一种常见特征集合在一起的细胞，其具有在培养中传代的能力。

细胞背景

“细胞背景”或类似术语是有特定状态的细胞类型。例如，不同细胞类型有不同的细胞背景（如细胞受体的差异表达或组成）。相同类型但不同状态的细胞也有不同的细胞背景。通过培养（例如细胞周期停滞或增殖或静息状态）或处理（例如不同药理学试剂处理的细胞）能形成所述相同类型但有不同状态的细胞。

细胞培养

“细胞培养”是指原核或者真核细胞在受控条件下生长的过程。“细胞培养”不单指衍生自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞的培养，也指复合组织和器官的培养。

细胞组

“细胞组”或类似术语是指包括至少两种细胞的组。所述细胞可以是本文公开的任何种类的细胞或组合。

细胞响应

“细胞响应”或类似术语是指细胞对刺激的任何反应。

细胞过程

细胞过程或类似术语是指在细胞内或通过细胞发生的过程。细胞过程的例子包括但不限于，增殖、凋亡、坏死、分化、细胞信号传导、极性变化、迁移或转化。

细胞靶标

“细胞靶标”或类似术语是指能通过外部刺激改变其活性的生物聚合物例如蛋白质或核酸。细胞靶标通常是蛋白，例如酶、激酶、离子通道、和受体。

鉴定

鉴定或类似术语是指收集关于物质，例如配体、分子、标记或细胞的任何性质的信息，例如获得配体、分子、标记或细胞的概况。

包含

在本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和该词语的其它变化形式，如“含有”和“包括”，表示“包括但不限于”并且不意在排除例如其它添加物、组分、整数、或步骤。

主要由……组成

实施方式中的“主要由……组成”指例如表面组合物、在本公开的生物传感器、制品、装置、或设备表面上制作或使用表面组合物、制剂或组合物的方法，还可包括权利要求中列出的组分或步骤，以及实质上不影响本公开组合物、制品、设备和制备使用方法的基本和新性质的其它组分或步骤，如所选的特定反应物、特定添加剂或成分、特定试剂、特定细胞或细胞系、特定表面调节剂或表面条件、特定候选配体、或类似结构、材料或过程变量。可对本发明的组分或步骤的基本性质产生实质影响或可产生本发明不需要特征的项目包括例如，细胞对生物传感器表面的亲和性降低、刺激对细胞表面受体或胞内受体的异常亲和性、响应候选配体或类似刺激的异常或相反细胞活性、和类似特征。

组分

公开了用于制备所公开组合物的组分和本文所述方法中使用的组合物本身。本文公开了这些和其它的材料，应理解当公开这些材料的组合、子集、相互关系、组等等而未明确地具体提及这些分子的每个不同的单独和共同组合及排列时，在本文中具体设想和描述了它们中的每一种情况。因此，如果公开了一类分子A、B、和C以及一类分子D、E、和F和分子组合A-D的实施例，则即使没有分别列举每个单独和共同视为有意义的组合，也应当认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F。同样，还公开这些组合的任意子集或组合。因此，例如，应认为已公开亚组A-E、B-F和C-E。此观念可应用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开组合物的方法。因此，如果存在可进行的多个附加步骤，应当理解可通过所公开方法的任一特定实施方式或实施方式的组合来进行这些附加步骤中的每一个。

接触

接触(contacting)或类似术语是指，若至少两种物品，例如分子、细胞、标记、至少一种化合物或组合物、或至少两种组合物、或这些中的任意一种和制品或机器间可能发生分子相互作用，使之相互靠近从而能发生分子相互作用。例如，接触是指将至少两种组合物、分子、制品、或物品接触，即，使其接近以混合或碰触。例如，有组合物溶液A和培养的细胞B并将组合物溶液A倾倒到培养的细胞B上，使组合物溶液A与细胞培养物B接触。用配体接触细胞会将配体带到细胞以确保细胞能接近配体。

应当理解本文公开的任何物品可与任何其它物品接触。例如，可以使细胞接触标记或分子、生物传感器等。

化合物和组合物

化合物和组合物在本领域中具有标准含义。应当理解，在任何情况下，公开了具体名称例如分子、物质、标记、细胞、或试剂组合物，所述组合物包含这些名称、由其组成、和基本由其组成。因此，当使用具体名称标记时，应当理解还公开了包含该标记，由该标记组成、或基本由该标记组成的组合物。在适当之处，当给出具体的名称时，应当理解也公开了该名称的化合物。例如，若公开具体的生物材料例如EGF，EGF的复合形式也被公开。

对照

术语对照或“对照水平”或对照细胞“或类似术语定义为测量变化的标准，例如对照不进行实验，而是接受确定的参数组，或对照是基于处理前或处理后的水平。它们或者与测试平行进行，或者在其之前或之后进行，或者它们可以是预先确定的标准。例如，对照可以指对象或客体或试剂等在除了略去受测过程或试剂或变量等以外按平行实验处理的实验所得结果，该结果用作判断实验效果的比较标准。因此，对照可以用来确定与过程或试剂或变量等相关的效果。例如，若所研究的是测试分子对细胞的影响，可以a)简单地记录细胞在分子存在下的特征，b)执行a且随后添加具有已知活性或无活性的对照分子、或对照组合物（例如，试验缓冲溶液(载剂)）并记录影响，然后将测试分子的影响与对照作比较。在某些情况中，一旦进行了对照，所述对照就可用作标准，其中不必再进行对照实验，而在另一些情况中每当要作出比较时都应平行进行对照实验。

细胞色素P450酶调节剂

“细胞色素P450酶调节剂”是能调节P450、增加或降低P450活性的任何分子。已知的P450调节剂包括但不限于利福平。

细胞色素P450酶活化剂

“细胞色素P450酶活化剂”是能调节P450、增加P450活性的任何分子。已知的P450活化剂包括但不限于利福平。

细胞色素P450酶抑制剂

“细胞色素P450酶抑制剂”是能调节P450、降低P450活性的任何分子。

数据输出

数据输出指使用分析机器进行试验之后收集的结果，例如无标记生物传感器。例如，所述无标记生物传感器的数据输出可以是DMR信号。例如，应理解能操控数据输出到指数。也理解能有任何数据输出类型，所述试验用例如分子、K_ATP通道、Rho激酶、标记物、抑制剂、K_ATP抑制剂、标记物-分子、标记物-K_ATP抑制剂等运行。也理解能比较任何两种输出，例如分子数据输出和K_ATP抑制剂数据输出形成分子-K_ATP抑制剂比较。通常，能与类似的数据输出进行所述比较，例如DMR数据输出与DMR数据输出。

定义的途径

“定义的途径”或类似术语是特定途径，例如G_αq途径、G_αs途径、G_αi途径、G_12/13、EGFR(表皮生长因子受体)途径、或PKC(蛋白激酶C)途径。

失调的PI3K途径细胞系

失调的PI3K途径细胞系是其中PI3K途径超活化的细胞系，这是由于途径中关键信号级联蛋白的改变。这些改变包括但不限于引起未刺激细胞中Ras和PI3K组成型活化的K-Ras(PI3K上游蛋白)的突变，或也引起PI3K组成型活化的PTEN(PI3K的下游负调控因子)的功能丧失。例如，失调的PI3K途径细胞系是含未刺激细胞中组成型活化的K-Ras突变体的A549细胞系（Krypuy,M.等.“Highresolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinicalsamples:KRAS codon 12and 13mutations in non-small celllung cancer.（快速灵敏检测临床样品中突变的高分辨率解链分析：非小细胞肺癌中KRAS密码子12和13突变）”BMC Cancer 2006,6,e295）。

PI3K途径中涉及的蛋白包括但不限于(1)AKT和PI3K家族成员和其调节剂:AKT1、AKT2、AKT3、APPL、BTK、CTMP、GNB1、GRB10、GRB2、HSPB1、HSPCA、HSPCB、ILK、INPP5D(SHIP)、INPPL1、MAPK8IP1(JIP1)、MTCP1、PDK2、PDPK1、PIK3CA(p110a)、PIK3CB(p110b)、PIK3CG、PIK3R1(p85a)、PIK3R2(p85b)、PIK3R3、PRKCA、PRKCB1、PRKCZ、PTEN、TCL1A、TCL1B;(2)IGF-1或其他RTK信号途径:CSNK2A1、ELK1、FOS、GRB2、HRAS、IGF1、IGF1R、IRS1、JUN、MAP2K1、MAPK3、MAPK8、PIK3CB、PTPN11、RAF1、KRAS、RASA1、SHC1、SOS1、SRF;(3)肌动蛋白构成和细胞迁移的PI3K亚基的p85-相关调节:AICDA、CDC42、CUTL1、PAK1、PDGFRA、RAC1、RHOA、WASL、ZFYVE21;(4)PTEN依赖性细胞周期停滞和凋亡:AKT1、CDKN1B(p27)、CUTL1、FASLG、FOXO3A、GRB2、ILK、ITGB1、MAPK1、MAPK3、PDK1、PDK2、PTEN、PTK2、RBL2、SHC1、SOS1、ZFYVE21;(5)BAD磷酸化相关抗凋亡途径:AKT1、ASAH1、BAD、CUTL1、GRB2、HRAS、IGF1R、IRS1、MAP2K1、MAPK1、MAPK3、PRKAR1B、RAF1、RPS6KA1、SHC1、SOS1、YWHAH、ZFYVE21;和(6)参与mTOR信号传导途径的蛋白:AKT1、CUTL1、EIF3S10、EIF4A1、EIF4B、EIF4E、EIF4EBP1、EIF4G1、FKBP1A、FRAP1、MKNK1、PDK1、PDK2、PR48、PTEN、RHEB、RPS6、RPS6KB1、TSC1、TSC2、ZFYVE21。

检测

检测或类似术语是指本公开中的设备和方法发现或感测分子或标记诱导的细胞响应以及区分对不同分子感测到的响应的能力。

（药物候选分子的）直接作用

“直接作用”或类似术语是指（药物候选分子）独立作用于细胞的结果。

DMR信号

“DMR信号”或类似术语指光生物传感器测得的由细胞受刺激后响应产生的细胞信号。

DMR响应

“DMR响应”或类似术语是指采用光生物传感器的生物传感器响应。DMR指动态物质再分布或动态细胞物质再分布。P-DMR是阳性DMR反应，N-DMR是阴性DMR反应，并且RP-DMR是恢复性P-DMR反应。

药物候选分子

药物候选分子或类似术语是指对其用作药物或药效团的能力进行检测的测试分子。该分子可视为先导分子。

功效

功效或类似术语是指在理想或最优条件下产生所需规模效应的能力。这些条件区分了功效和相关的有效性概念，后者涉及在现实条件下的改变。功效是受体占用和启动分子、细胞、组织或系统水平响应能力之间的关系。

更高和抑制和类似词语

术语更高、提高、提升或升高或类似术语或这些术语的变体是指提高到基础水平以上，例如与对照相比。术语低、更低、减少、降低或下降或类似术语或这些术语的变体是指降低到基础水平以下，例如与对照相比。例如，在向细胞内添加分子例如激动剂或拮抗剂之前或不存在添加时基础水平是正常体内水平。抑制或抑制形式或类似术语是指降低或遏制。

HepG2C3A细胞系

术语“HepG2C3A”或其他术语是有关HepG2细胞系的肿瘤细胞系。

HepG2细胞系

HepG2(ATCC号HB-8065)是人肝细胞癌细胞系，并且是患有高分化肝细胞癌的15岁高加索美国男性的肝组织衍生的永生细胞系。这些细胞形态学上为上皮细胞，模式染色体数量为55且在裸小鼠中不致癌。该细胞分泌各种主要血浆蛋白如白蛋白、转铁蛋白和急性期蛋白纤维蛋白原、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白和血纤维蛋白溶酶原。该细胞会响应人生长激素的刺激。

HepG2细胞适于体外模型系统，用于研究极化的人肝实质细胞。另一良好表征的极化肝实质细胞系包括大鼠肝细胞瘤衍生的杂交细胞系WIF-B。用合适的培养条件，HepG2细胞表现出形态学和功能上的稳健分化，可控地形成顶端和基底侧细胞表面结构域，其分别类似体内的胆小管(BC)和窦状隙（sinusoidal）结构域(概述参见http://www.ATCC.org)。

JAK(Janus激酶)介导的信号传导

JAK介导的信号传导指与JAK相互作用的分子或物质的上游或下游的信号传导。用于内源ATP敏感性钾（K_ATP）离子通道的开放剂如吡那地尔可为JAK介导的信号传导的活化剂。JAK和STAT(信号转导和转录蛋白)是许多细胞因子受体系统的关键组分，调节生长、存活、分化和病原体抗性。示例为IL-6(或gp130)受体家族，其共调节B细胞分化、血浆细胞发生和急性期反应。细胞因子结合诱导受体二聚化，活化关联的JAK，其磷酸化自身和该受体。所述受体和Jak上的磷酸化位点作为停靠位点用于含SH2的Stat如Stat3和含SH2的蛋白，以及连接所述受体与MAP激酶、PI3激酶/Akt和其他细胞途径的衔接子。

Janus激酶突变是人血液恶性肿瘤的主要分子事件。Jak2假激酶结构域（V617F）中的独特体细胞突变在>90%的真性红细胞增多患者以及较大比例的原发性血小板增多症和特发性骨髓纤维变性患者中发生。该突变导致病理性活化Jak2激酶，其引起造血祖细胞的恶性转化。在一些急性巨核细胞白血病患者中存在的数种Jak3假激酶结构域突变，也使Jak3组成型活化。Jak1中的体细胞获得性功能获得突变已在约20%的成人T细胞急性淋巴细胞白血病中发现。

JAK活化剂

“JAK活化剂”是能活化JAK的任何分子。

JAK抑制剂

“JAK抑制剂”是能抑制JAK的任何分子。已知的JAK抑制剂包括但不限于AG490。

JAK调节剂

“JAK调节剂”是能调节JAK、增加或降低JAK活性的任何分子。已知的JAK调节剂包括但不限于AG490。

在分子存在下

“在分子存在下”或类似术语是指将培养的细胞接触或暴露于分子。所述接触或暴露可以在细胞接触刺激之前、或同时发生。

指数

指数或类似术语指数据的集合。例如，指数可以是含有一种或多种调节概况的列表、表格、文档、或编目。应当理解，可以由任何数据组合生成指数。例如，DMR概况可以有P-DMR、N-DMR和RP-DMR。可以采用完整的概况数据、P-DMR数据、N-DMR数据、RP-DMR数据、或其中的任意点、或这些或其它数据的组合来生成指数。指数是任何此类信息的集合。通常，在比较指数时，所述指数具有类似数据，即P-DMR对P-DMR数据。

生物传感器指数

“生物传感器指数”或类似术语是由生物传感器数据的集合构成的指数。生物传感器指数可以是生物传感器概况，例如初级概况、或二级概况的集合。所述指数可以包含任何种类的数据。例如，概况的指数可以只包括N-DMR数据点，它可以是P-DMR数据点、或者两种都有或者它可以是阻抗数据点。它可以是与概况曲线相关的所有数据点。

DMR指数

“DMR指数”或类似术语是由DMR数据的集合构成的指数。

缺失和存在分子时细胞/标记的动力学响应

“缺失和存在分子时细胞/标记的动力学响应”或类似短语是指缺失和存在分子时标记所诱导细胞响应的整个试验或部分试验的时间系列，采用例如模式识别分析，其可直接用于检测分子的药理学或作用模式。

已知分子

已知分子或类似术语指具有已知药理/生物/生理/病理生理活性的分子，其精确作用模式可以是已知或未知的。

已知调节剂

已知调节剂或类似术语是指对至少一种已知靶标具有已知亲和性的调节剂。例如，已知调节剂可以是PI3K抑制剂、PKA抑制剂、GPCR拮抗剂、GPCR激动剂、RTK抑制剂、表皮生长因子受体中和抗体、或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制剂或激活剂等。

已知调节剂生物传感器指数

“已知调节剂生物传感器指数”或类似术语是由就已知调节剂采集的数据生成的调节剂生物传感器指数。例如，已知调节剂生物传感器指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

已知调节剂DMR指数

“已知调节剂DMR指数”或类似术语是由就已知调节剂采集的数据生成的调节剂DMR指数。例如，已知调节剂DMR指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

配体

配体或类似术语是指能与生物分子结合并形成复合物以用于生物学目的的物质或组合物或分子。在生物系统中配体及其靶分子之间实际的不可逆共价结合是罕见的。配体与受体的结合改变了化学构象，即受体蛋白质的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或强度称为亲和性。配体包括底物、阻断剂、抑制剂、激活剂和神经递质。放射性配体是放射性标记的配体，而荧光配体是荧光标记的配体；两者都可视为配体，常用作受体生物学和生物化学研究中的示踪剂。配体和调节剂可互换使用。

库

库或类似术语指集合。库可以是本文公开的任何物品的集合。例如，它可以是指数的集合，指数库；它可以是概况的集合，概况库；或者它可以是DMR指数的集合，DMR指数库；同样，它可以是分子的集合，分子库；它可以是细胞的集合，细胞库；它可以是标记的集合，标记库；例如，库可以是随机或非随机的，确定或不确定的。例如，公开了已知调节剂的DMR指数库或生物传感器指数库。

肝细胞

“肝细胞”或类似术语指源自或获自肝组织的细胞。肝细胞可包括初级肝细胞、转化肝细胞如肝实质细胞C3A、和永生肝细胞如F2N4细胞。在实施方式中，所述肝细胞可包括辅助细胞如成纤维细胞NIH3T3。合适的辅助细胞的示例包括成纤维细胞如NIH 3T3成纤维细胞、鼠3T3-J2成纤维细胞或人成纤维细胞；人或大鼠肝星状细胞；和库普弗细胞。

长期试验

“长期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的长期影响。一种具体的长期试验是“长期生物传感器细胞试验”。在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于所述分子一段较长的时间（例如，8小时、16小时、24小时、32小时、48小时、和72小时）。这一长期试验用于确定分子对细胞健康状态（例如，活力、凋亡、细胞周期调节、细胞粘附调节、增殖）的影响。这一长期试验还包含可直接用于分子诱导细胞信号传导事件或通路研究的早期细胞信号传导响应（例如，分子刺激后30分钟、60分钟、120分钟、180分钟）。

在另一种实施方式中，标记存在下的长期生物传感器细胞试验用于研究长期交叉调节对分子和标记间细胞生物学和生理学的影响。标记的添加可以在分子之前、同时、和之后。例如，当标记（例如，H₂O₂）引发细胞组中至少一种细胞的凋亡时，可以采用这种长期试验确定分子是否为保护性。反之，这种长期试验也可用于确定标记对分子诱导的细胞事件（例如，凋亡、或坏死）的保护或协同作用。

长期生物传感器信号

“长期生物传感器信号”是长期试验产生的生物传感器信号。

长期DMR信号

长期DMR信号或类似术语是指长期光生物传感器细胞试验产生的光生物传感器信号。

标记物

标记或类似术语是指在生物传感器细胞试验中产生信号的配体。所述信号还必须是至少一种特定的细胞信号传导通路和/或至少一种特定靶标所介导至少一种特定细胞过程的特征。所述信号可以是阳性、或阴性、或任何组合（例如振荡）。

标记物组

“标记组”或类似术语是包括至少两种标记的组。标记可用于不同的通路、相同的通路、不同的靶标、或甚至相同的靶标。

标记生物传感器指数

“标记生物传感器指数”或类似术语是由就标记采集的数据生成的生物传感器指数。例如，标记生物传感器指数可以由标记作用于细胞组的概况、和标记针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

标记DMR指数

“标记DMR指数”或类似术语是由就标记采集的数据生成的生物传感器DMR指数。例如，标记DMR指数可以由标记作用于细胞组的概况、和标记针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

材料

材料是用于构成物理实体的某种物品（化学的、生物化学的、生物的、或混合的）的有形部分。

培养基

培养基是能培养细胞的任何混合物。生长培养基是微生物或细胞在其中经历生长的物体。

模拟

本文所用的“模拟”或类似术语指执行参考对象的一种或多种功能。例如，分子模拟物执行分子的一种或多种功能。

调节

调节或其形式，是指提高、或降低、或维持通过细胞靶标介导的细胞活性。应当理解，在使用这些词语之一时，也公开了其可比对照提高1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%，或可以比对照降低1%、5%、10%、20%、50%、或100%。

调节剂

调节剂或类似术语是控制细胞靶标活性的配体。它是结合细胞靶标，例如靶蛋白的信号调节分子。

调节比较

“调节比较”或类似术语是初级概况和二级概况标准化的结果。

调节概况

“调节概况”或类似术语是分子存在时标记的二级概况和不存在任何分子时标记的初级概况之间的比较。例如，所述比较可以通过从二级概况中减去初级概况或从初级概况中减去二级概况或将二级概况对初级概况进行标准化。

调节剂生物传感器指数

“调节剂生物传感器指数”或类似术语是由就调节剂采集的数据生成的生物传感器指数。例如，调节剂生物传感器指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

调节剂DMR指数

“调节剂DMR指数”或类似术语是通过就调节剂采集的数据生成的DMR指数。例如，调节剂DMR指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

调节标记的生物传感器信号

“调节生物传感器信号”或类似术语是指使细胞响应标记刺激发生生物传感器信号或概况改变。

调节DMR信号

“调节DMR信号”或类似术语是指使细胞响应标记刺激发生DMR信号或概况改变。

分子

本文所用的术语“分子”或类似术语是指以化学分子或有确定分子量的分子形式存在的生物或生物化学或化学实体。不论其大小，分子或类似术语是化学、生物化学或生物分子。

很多分子是称为有机分子（含有碳原子和其它原子，通过共价键连接的分子）的类型，尽管一些分子不含碳（包括简单的分子气体例如分子氧和更复杂的分子例如一些硫基聚合物）。通用术语“分子”包括大量描述性分子类型或组，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇、有机药物、小分子、受体、抗体和脂质。适当时，由于所述方法应用于分子亚组，本文中采用这些更具描述性的术语（其中很多，例如“蛋白质”，本身描述了重叠的分子组）中的一个或多个，但不减损这些分子用作代表一般类别“分子”和指定亚类（例如蛋白质）的意图。除非明确说明，“分子”一词应包括特定的分子及其盐，例如药学上可接受的盐。

分子混合物

分子混合物或类似术语是指含有至少两种分子的混合物。所述两种分子可以是但不限于，结构不同（即对映异构体）、或组成不同（例如，蛋白质同种型、糖形、或带有不同聚乙二醇（PEG）修饰的抗体）、或结构和组成不同（例如未纯化的天然提取物、或未纯化的合成化合物）。

分子生物传感器指数

“分子生物传感器指数”或类似术语是由就分子采集的数据生成的生物传感器指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

分子DMR指标

“分子DMR指数”或类似术语是通过就分子采集的数据生成的DMR指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标记组的调节概况构成，每组标记针对细胞组中的一种细胞。

分子指数

“分子指数”或类似术语是涉及分子的指数。

经分子处理的细胞

经分子处理的细胞或类似术语是已暴露于分子的细胞。

分子调节指数

“分子调节指数”或类似术语是指显示分子对标记组作用于细胞组的生物传感器输出信号的调节能力的指数。通过将分子存在下受标记刺激后细胞响应的特定生物传感器输出信号参数对没有任何分子时的情况进行标准化而生成调节指数。

分子药理学

分子药理学或类似术语是指分子作用于细胞的系统细胞生物学或系统细胞药理学或作用模式。通常通过但不限于，毒性、影响特定细胞过程（例如，增殖、分化、活性氧信号转导）的能力、或调节特定细胞靶标（例如，K_ATP通道、PKA、PKC、PKG、JAK2、MAPK、MEK2或肌动蛋白）的能力来鉴定分子药理学。

天然细胞

天然细胞是任何没有经过遗传工程改造的细胞。天然细胞能是原代细胞、永生细胞、转化细胞系、干细胞或干细胞衍生细胞。

正常K_ATP途径细胞系

正常K_ATP途径细胞系是其中K_ATP途径未失调且因此未被组成型活化的细胞系。然而，该细胞系还可含有不能引起K_ATP途径组成型活化的某些蛋白突变体。

标准化

标准化或类似术语是指调整数据、或概况、或响应以例如去除至少一个共变量。例如，若产生了两种响应，一种针对作用于细胞的标记且一种针对作用于细胞的标记与分子，标准化是指比较没有分子时标记诱导的响应和存在分子时的响应，并消除仅由标记引起的响应，使得标准化的响应代表由于分子对标记的调节造成的响应。通过在分子存在下标准化标记的初级概况和标记的二级概况（调节概况）得到调节比较。

非病毒性感染

术语“非病毒性感染”或类似术语指细胞被非病毒生物体如细菌或寄生虫感染的状态。这是细胞被病毒以外的生物体污染的状态。

可选的

“可选的”或“可选地”或类似术语表示随后描述的事件或情形可以发生或不发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和事件或情形不发生的实例。例如，短语“组合物可选包含组合”是指组合物可以包含不同分子的组合或不包含组合，从而该描述包括了组合和组合缺失（即组合中单独的成员）。

或

本文所用的词语“或”或类似术语表示特定列表中的任意成员且还包括该列表中成员的任意组合。

组

组或类似术语是指预先确定的样本组（例如，标记、或细胞、或通路）。可以从库中选取样本产生组。

淘选

淘选或类似术语是指筛选一种或多种细胞是否存在一种或多种受体或细胞靶标。

途径

本文所用途径是细胞中发生的一系列化学反应。某一途径内，一种分子或物质被修饰，然后导致另一种分子或物质被修饰，依此类推。通常，酶如激酶参与这些修饰。途径的发生可从细胞表面到细胞核，以及在细胞内从细胞器官到细胞器官，或从细胞溶质到细胞器官或从细胞器官到细胞溶质。所述修饰包括化学（如磷酸化）或物理（如从一个位置移位到另一位置）修饰。

时间段

“时间段”是指代表时间推移的任何阶段。例如，1秒、1分钟、1小时、1天和1周都是时间段。

概况

概况或类似术语是指就组合物，例如细胞采集到的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器采集。

初级概况

“初级概况”或类似术语是指当分子接触细胞时产生的生物传感器响应或生物传感器输出信号或概况。通常，在将初始细胞响应对净零生物传感器信号（即基线）标准化以后获得初级概况。

二级概况

“二级概况”或类似术语是指细胞在分子存在时响应标记的生物传感器响应或生物传感器输出信号。二级概况可以用作分子对标记诱导的细胞响应或生物传感器响应的调节能力的指示物。

调节概况

“调节概况”或类似术语是分子存在时标记的二级概况和不存在任何分子时标记的初级概况之间的比较。例如，所述比较可以通过从二级概况中减去初级概况或从初级概况中减去二级概况或将二级概况对初级概况进行标准化。

阳性对照

“阳性对照”或类似术语是一种对照，其显示数据采集的条件能产生数据集合。

刺激后

刺激后或类似术语是指在细胞试验中用分子刺激细胞后的时间。

可能的K_ATP抑制剂

可能的K_ATP抑制剂是测定为与本文所述已知K_ATP抑制剂相似的任何分子。所述已知的K_ATP抑制剂包括但不限于磺酰脲。已知的K_ATP抑制剂可用作比较的参考分子。

可能的K_ATP调节剂

“可能的K_ATP调节剂”是与本文所公开试验中的K_ATP调节剂功能类似的任何分子、化合物或组合物。

可能的Rho激酶抑制剂

可能的Rho激酶(ROCK)抑制剂是测定为与本文所述已知ROCK抑制剂相似的任何分子。已知的ROCK抑制剂包括但不限于Y27632、H-89和H-8。

K_ATP抑制剂和已知的K_ATP抑制剂

K_ATP抑制剂是测定为K_ATP.抑制剂的任何分子。所述已知的K_ATP抑制剂包括但不限于磺酰脲。已知的K_ATP抑制剂可用作比较的参考分子。

K_ATP细胞系

“K_ATP细胞系”或类似术语指表达至少一种K_ATP通道的细胞类型。K_ATP细胞系的非限制性示例为HepG2或HepG2C3A。应理解mito-K_ATP或类似术语指线粒体中的K_ATP。

K_ATP抑制剂

“K_ATP抑制剂”是能抑制K_ATP通道开放的任何分子、化合物或组合物。

K_ATP调节剂

“K_ATP调节剂”是能调节K_ATP通道开放或抑制其开放的任何分子、化合物或组合物。

钾通道开放剂(KCO)

“钾通道开放剂”是能打开K_ATP通道的任何分子、化合物或组合物。

增强

增强、增强的或类似术语是指由分子引起的细胞内标记的生物传感器响应的特定参数提高。通过比较标记的初级概况和分子存在下相同标记在同一细胞内的二级概况，可以计算出分子对细胞的标记诱导生物传感器响应的调节。正调节是指分子引起标记诱导的生物传感器信号增加。

概况

概况或类似术语是指就组合物，例如细胞采集到的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器采集。

脉冲刺激试验

“脉冲刺激试验”或类似术语可用于细胞仅暴露于分子中极短时间（例如，数秒、或数分钟）的情况。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标记诱导的生物传感器信号的影响。可通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来完成脉冲刺激试验。

效能

效能或类似术语是用产生给定强度效应所需的量表述的分子活性的度量。例如，高效能药物在低浓度引起较高的响应。效能与亲和性及功效成比例。亲和性是药物分子与受体结合的能力。

出版物

整篇申请中引用了多个出版物。这些出版物的公开内容通过引用全文纳入本申请中以更完整地描述本申请所属领域的状态。所公开的参考文献也根据引用所依赖的讨论中包含的材料被单独地和具体地通过引用纳入本文。

脉冲刺激试验

“脉冲刺激试验”或类似术语可用于细胞仅暴露于分子中极短时间（例如，数秒、或数分钟）的情况。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标记诱导的生物传感器信号的影响。可通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来完成脉冲刺激试验。

范围

在本文中，范围可以表述为自“约”某一具体值始和/或至“约”另一具体值止。表述这种范围时，另一种实施方式包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。.类似地，用先行词“约”将数值表示为近似值时，应该理解，该具体值构成另一个实施方式。应该进一步理解，各范围的端点不论与另一端点相关联还是独立于该端点，都是有意义的。还应理解，本文公开了许多数值，每个数值也在本文中公开为数值本身以外的“约”具体值。例如，如果公开数值“10”，那么也公开了“约10”。还应理解，当数值公开为“小于或等于”该值，“大于或等于”该值时，也公开由技术人员适当理解的数值之间可能的范围。例如，如果公开数值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解在通篇申请中，提供了许多不同格式的数据，这些数据代表终点和起点以及由这些数据点的任意组合的范围。例如，如果公开具体数据点“10”和具体数据点“15”，应理解，可以认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于“10”和“15”、以及10-15。还应理解，还公开了两个具体单位之间的各单位。例如，如果公开10和15，则也公开了11,12,13和14。

受体

受体或类似术语是指包埋在细胞的质膜或胞质内的，可以结合移动信号（或“信号”）的蛋白分子。与受体结合的分子称为“配体”，并可以是肽（例如神经递质）、激素、药物、或毒素，当产生这种结合时，受体发生的构象变化通常启动细胞响应。但是，一些配体只是阻断受体而不诱导任何响应（例如拮抗剂）。配体诱导的受体变化导致生理变化，这构成配体的生物活性。

强生物传感器信号

“强生物传感器信号”是幅度显著超过噪音水平或阴性对照响应（例如3x,10x,20x,100x,或1000x）的生物传感器信号。阴性对照响应通常是添加试验缓冲溶液（即载剂）后细胞的生物传感器响应。噪音水平是不另外添加任何溶液时细胞的生物传感器信号。值得注意的是，在添加任何溶液前，细胞总是被溶液覆盖。

强DMR信号

“强DMR信号”或类似术语是指“强生物传感器信号”的DMR形式。

Rho-介导的信号传导

Rho介导的信号传导指与Rho激酶相互作用的分子或物质的上游或下游的任何信号传导。用于内源ATP敏感性钾（K_ATP）离子通道的开放剂如吡那地尔可为Rho介导的信号传导的活化剂。

Rho激酶抑制剂

Rho激酶(ROCK)抑制剂是测定为抑制Rho激酶的任何分子或物质，如Y-27632、ROCK激酶抑制剂III Rockout、Rho激酶抑制剂IV、H89和H8。

ROCK抑制剂响应细胞系

ROCK激酶抑制剂响应细胞系是其中通过已知ROCK抑制剂来抑制ROCK基础活性，引起所述细胞中可检测生物传感器信号的任何细胞系。例如，A549还是ROCK抑制剂响应细胞系。由于存在活化的K-RAS突变体，未刺激的A549含有失调的PI3K/Akt活性。ROCK是PI3K的下游靶标。因此，已知ROCK抑制剂如Y27632或H89对ROCK基础活性的抑制可引起A549细胞中的强DMR信号。

ROCK抑制剂

“ROCK抑制剂”是能抑制ROCK的任何分子。已知的ROCK抑制剂包括但不限于Y27632、H-89和H-8。

ROCK调节剂

“ROCK调节剂”是能调节ROCK、增加或降低ROCK活性的任何分子。已知的ROCK调节剂包括但不限于Y27632、H-89和H-8。

响应

响应或类似术语是对任何刺激的任何反应。

样品

样品或类似术语是指按本文所述进行试验的动物、植物、真菌等；天然产物、天然产物提取物等；动物的组织或器官；细胞（在对象内的、或直接取自对象、或在培养物中维持的细胞或来自培养细胞系的细胞）；细胞裂解物（或裂解物的部分）或细胞提取物；或含有一种或多种来自细胞或细胞材料的分子（例如多肽或核酸）的溶液。样品还可以是含有细胞或细胞组分的任何体液或分泌物（例如但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。

包含血清的培养基

包含血清的培养基或类似术语是任何包含血清（例如胎牛血清）的细胞培养基。胎牛血清（或牛胎儿血清）是血液凝结后剩余的血浆部分，在这过程中血浆蛋白纤维蛋白原转化成纤维蛋白且在凝块后残留。通过屠宰中封闭系统静脉穿刺从未出生胎牛流出的血中获得胎牛血清。胎牛血清（FBS）是最广泛应用的血清，因为抗体含量低并且包含更多的生长因子，可在很多不同应用中有多用性。FBS用于培养真核细胞。

血清耗尽的培养基

血清耗尽的培养基是任何不包含血清的细胞培养基。

“短时间段”

短时间段或类似术语是通常为1-30分钟的时间段。

短期试验

“短期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的短期影响。一种具体的短期试验是“短期生物传感器细胞试验”。在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于所述分子中一段短的时间（例如，5分钟、10分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、240分钟）。这一短期试验常用于检测早期细胞信号传导响应，其可直接用于研究分子诱导的细胞信号传导事件或通路或研究分子对标记诱导的细胞响应的调节能力。

信号传导

信号传导指途径中一种分子或物质的修饰引起途径中另一分子或物质的另一修饰。

信号传导通路

“定义的通路”或类似术语是指从接收信号（例如外源配体）到细胞响应（例如细胞靶标表达的提高）的细胞通路。在一些情况中，配体与受体结合导致的受体激活与细胞对配体的响应直接偶联。例如，KCO吡那地尔能激活作为离子通道一部分的细胞表面受体。吡那地尔结合K_ATP通道打开作为所述受体一部分的钾选择性离子通道。K_ATP活化使带负电的钾离子移到所述细胞内，这会促进依赖于通道所驻留细胞的各种作用。但是，对于很多细胞表面受体，配体受体相互作用不直接与细胞响应关联。在配体产生对细胞行为的最终生理效应之前，激活的受体必须首先与细胞内的其它蛋白质相互作用。通常，一系列相互作用的细胞蛋白质的作用在受体激活后发生改变。由受体激活诱导的整套细胞变化称为信号传导机理或通路。信号传导通路可以相对简单或相当复杂。

指标相似性

“指数相似性”或类似术语是表示两种指数之间、或至少三种指数之间（一种用于一个分子）基于指数的模式、和/或分数矩阵的相似性的术语。分数矩阵与其对应物密切相关，例如在相应细胞中不同分子的初级概况的特征，和不同分子对各标记的调节概况的本质和百分比。例如，将更高的分数给予更相似的特征，将较低或负的分数给予不相似的特征。因为分子调节指数只有三种调节类型，正、负和中性，相似性矩阵相对简单。例如，简单的矩阵可以给相同的调节（例如正调节）评分为+1，给不同的调节评分为-1。

或者，对具有不同规模的一种调节类型可以给不同的分数。例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、100%、200%等的正调节可以相应评分为+1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。相反，对于负调节，可以给出相似但相反的评分。

稳定

在用于药物组合物时，术语“稳定”或类似术语一般在本领域理解为表示于特定保存条件下经过给定时间段后活性成分的损失低于一定量，通常为10%。组合物被认定为稳定所需要的时间与各产品的用途有关，并由以下商业实用性所确定：生产所述产品、保留产品用于质量控制和检验、运送给批发商或直接到消费者处，其中所述产品在其最终使用前被再次保存。包括数月时间的安全因子在内，药物的最短产品寿命一般是一年，优选超过18个月。本文所用的术语“稳定”参考了这些市场现实和在容易实现的环境条件例如2°C-8°C冷藏条件下保存与运输产品的能力。

物质

物质或类似术语是任何物理实体。材料是物质。分子、配体、标记、细胞、蛋白质和DNA可认为是物质。机器或制品应视为由物质组成，而本身不视为物质。

对象

全文中使用的对象或类似术语是指个体。因此，“对象”可以包括，例如驯养的动物如猫、狗等，牲畜（例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等）、实验室动物（例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等）和哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类动物、非人灵长类动物、啮齿动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其它动物。在一个方面，对象是哺乳动物，例如灵长动物或人。对象可以不是人。

悬浮细胞

“悬浮细胞”是指优选在培养基中培养的细胞或细胞系，其中细胞在培养过程中不附着或粘着在基底表面。但是，悬浮细胞通常可以通过化学（例如共价结合、或抗体-细胞表面受体相互作用）、或物理方式（例如，由于重力作用沉降到包埋了生物传感器的孔底部）与生物传感器表面接触。因此，悬浮细胞也可用于生物传感器细胞试验。

测试分子

测试分子或类似术语是指在获得该测试分子信息的方法中使用的分子。测试分子可以是未知分子或已知分子。

处理

处理或治疗或类似术语可至少以两种方式使用。首先，处理或治疗或类似术语可以指给予或作用于对象。其次，处理或治疗或类似术语可以指将任何两种物品例如任何两种或多种物质如分子和细胞，混合到一起。这种混合将至少两种物质汇集到一起使它们之间可发生接触。

当处理或治疗或类似术语用于有疾病的对象时，并不意味治愈或甚至例如症状的减轻。当术语治疗性或类似术语与处理或治疗或类似术语联用时，指潜在疾病的症状减轻，和/或一种或多种潜在的细胞、生理、或生化病因或引起症状的机理减少。应当理解，本文使用的减轻表示相对于疾病的状态，包括疾病的分子状态，而不仅指疾病的生理状态。

引发

引发或类似术语是指引起或启动事件如响应的行为。

未知分子

未知分子或类似术语是具有未知生物/药理/生理/病理生理活性的分子。一

数值

就组分、成分、添加剂、细胞类型、标记和类似方面公开的具体和优选数值及其范围仅用于说明，它们不排除其它定义数值或定义范围内的其它数值。本发明的组分、设备和方法包括具有本文所述任何数值或任何数值组合、具体数值、更具体数值和优选数值的组分、设备和方法。

因此，所公开的方法、组合物、制品、和机器可以包含或由其组成、或基本由其组成的方式联合本文讨论的不同组分、步骤、分子和组合物等。例如，它们可用于本文定义的分子（包括配体）鉴定方法；本文定义的指数生成方法；或本文定义的药物开发方法。

病毒性感染

术语“病毒性感染”或类似术语指细胞被病毒感染的状态。这表示细胞被病毒污染的状态。

实施例

实验程序(用于实施例1-5)

试剂

所有化合物购自西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，除了激酶抑制剂库和离子通道调节剂库、红海海绵素A，其购自生物分子国际公司（BIOMOLInternational,L.P.）（宾夕法尼亚州的普利茅斯会议市）。所有的细胞培养试剂购买自吉布可公司（GIBCO）细胞培养产品。

细胞培养

所有的细胞系购自ATCC并按照ATCC的说明保持。细胞按照ATCC的说明每周传代培养1-2次。传代少于15的细胞用于所有实验。

RT-PCR

HepG2C3A细胞的总RNA用凯杰公司(Qiagen Inc.)的RNeasy试剂盒(货号75144)提取自一个含有单层汇合细胞（1.5-3千万个细胞）的T-75烧瓶，所述总RNA提取物中可能的DNA污染物用无RNA酶的Dnase Set(货号79254,凯杰公司)消化。用于RT-PCR的引物序列来自Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.(2002)26:135-143和FASEB J.(1999)13:1833-1838。所有引物由西格玛-艾尔德里奇公司合成。RT-PCR用凯杰公司的一步RT-PCR试剂盒(货号210212)进行。PCR条件如下：50°C 30分钟，95°C 15分钟，然后94°C 1分钟、57°C 1.5分钟和72°C 2分钟进行60轮，最后72°C延伸10分钟。

RNAi敲减

所有siRNA选自西格玛-艾尔德里奇公司的预设计的siRNA数据库，这是基于所预测敲减效率的排列顺序。siRNA ID是用于SUR1(Refseq ID:NM_000352)的SASI_Hs01_00092347、SASI_Hs01_00092348和SASI_Hs01_00092349;用于SUR2(Refseq ID:NM_005691)的SASI_Hs01_00061301、SASI_Hs01_00061302和SASI_Hs01_00061303;用于Kir6.1(Refseq ID:NM004982)和SASI_Hs01_00113357、SASI_Hs01_00113358和SASI_Hs01_00113359;用于Kir6.2(Refseq ID:NM000525)的SASI_Hs01_00220256、SASI_Hs01_00220257和SASI_Hs01_00220258。用于ROCK1(RefseqID:NM_005406)的SASI_Hs01_00065573、SASI_Hs01_00065571、SASI_Hs01_00065570。用于ROCK2(RefseqID:NM 004850)的SASI_Hs01_00204253、SASI_Hs01_00204252、SASI_Hs01_00204251。用于JAK1(ReqID:NM_002227)的SASI_Hs01_00174614、SASI_Hs01_00174613。用于JAK2(ReqID:NM_004972)的SASI_Hs02_00338675、SASI_Hs01_00041547。用于JAK3(ReqID:NM_000215)的SASI_Hs01_00118128、SASI_Hs02_00302103。

siRNA的转染用西格玛-艾尔德里奇公司的N-TER纳米颗粒siRNA转染系统（货号N2913）按照生产商说明进行。简单的说，将5000个细胞接种于Epic 384-孔板的各孔。细胞在第二天用50nM siRNA转染并在含培养基的siRNA中孵育24小时，然后用新鲜细胞培养基替代。Epic细胞试验在转染48小时后进行。

对于western印迹实验，C3A细胞以3x105/孔接种于6孔组织培养基处理的板上。细胞接种后用ROCK1或ROCK2siRNA(等级1)以50nM终浓度转染20小时。移除含培养基的转染试剂并在转染后24小时用新鲜培养基替代。细胞在转染后48小时裂解以用于western印迹。

免疫沉淀和Western印迹

对于ROCK1和ROCK2Western印迹，120μl各样品的细胞裂解物与40μl4xSDS样品缓冲液混合，然后100°C沸腾5分钟。蛋白在10%SDS凝胶上分离，15μl各样品上样于所述凝胶。膜用兔抗ROCK1(sc-5560)或兔抗ROCK2(sc-5561)或羊抗肌动蛋白(sc-1616)(1:500稀释)印迹1小时，然后与偶联羊抗兔或马抗羊抗体的第2HRP孵育(1:2000稀释)15分钟。

对于Kir6.2，1亿C3A细胞在1％NP40裂解液中裂解，用偶联蛋白A琼脂糖（西格玛公司(Sigma),P3391）的羊抗Kir6.2(sc-11228,G16)免疫沉淀。蛋白在10%SDS凝胶上分离，30μl全细胞裂解物或线粒体裂解物上样于所述凝胶。膜用羊抗Kir6.2(sc-11228,1:200)印迹1小时，然后用偶联羊抗兔或马抗羊抗体的第2HRP孵育(1:2000稀释)30分钟。用英杰公司（Invitrogen，货号KHM3031）针对培养细胞的线粒体分离试剂盒从1亿C3A细胞中分离C3A线粒体。

人肝实质细胞

人主要肝实质细胞购自XenoTech(H1500.H15A+Lot No.770)。解冻细胞并按照生产商说明用Xenotech肝实质细胞分离试剂盒（货号:K2000）进行纯化。用含10%FBS的无半乳糖MFE平板培养基(康宁公司（Corning Inc.）)在第1天将细胞(50,000/孔)接种于胶原I包被的96-孔板(BD生物科学公司（BD Bioscience），货号354407)。第2天将培养基变为含10%FBS和0.25mg/ml基质胶（Matrigel）（BD生物科学公司，货号356234）的MFE维持培养基。从第1天-第8天，细胞用5%CO2在37°C孵育。从第5天开始，细胞用10μM利福平（货号R3501，西格玛-艾尔德里奇公司）处理用于CYP3A4诱导，或50μM奥美拉唑（货号O104，西格玛-艾尔德里奇公司）处理用于CYP1A2诱导，或等体积DMSO处理72小时。第8天，CYP3A4和CYP1A2试验用P450-Glo^TM CYP3A4试验试剂盒或P450-Glo^TM CYP1A2试验试剂盒（货号V8902和V8772，普洛麦格(Promega)）进行。细胞数量用CytoTox

非放射性细胞毒性试验（货号G1780，普洛麦格）标准化。

PCR-阵列

人肝实质细胞如上所述培养。第5天，收获细胞并用具有柱上DNA酶消化（货号79254）的凯杰RNeasy小试剂盒（货号74104）提取总RNA。各样品的RNA浓度用Quant-iT^TM

RNA试验试剂盒（英杰公司（Invitrogen），货号R11490）定量并在PCR阵列实验前存于-80°C。阵列板（人类癌症药物抗性和代谢PCR阵列，货号PAHS-004，马里兰州福德里克的SA生物科学公司（SABioscience））按照SA生物科学公司手册（部分号1022A）制备。每96孔阵列板使用1μg总RNA，各总RNA样品测试双份。所述PCR阵列用软件SDS2.3在具有96孔标准块的ABI-7900HT上进行。如用户手册中所示设置PCR条件（部分号1022A）。用SA生物科学公司在线分析工具分析数据。

光生物传感器系统和细胞试验

使用

波长解调系统（纽约州康宁的康宁公司）进行全细胞感测。该系统由温度控制单元、光学检测单元、和用机器人的机载液体操作单元组成。所述检测单元以集成光纤为核心，能以约15秒的时间间隔对细胞响应进行动力学测量。所述化合物溶液通过使用机载液体操作单元（即移液（pippetting））引入。

RWG生物传感器能检测传感器表面附近的局部折射率的微小变化。由于细胞内局部折射率随密度及其生物质（例如，蛋白质，分子复合物）分布而变化，生物传感器利用其渐消波非侵入性地检测天然细胞内配体诱导的动态质量再分布。渐消波延伸入细胞并随距离呈指数衰减，产生约150纳米的特征感测容量，提示任何通过受体激活介导的光响应仅代表进行渐消波取样的细胞部分的平均值。受体激活下游许多细胞事件的集合确定配体诱导DMR的动力学和幅度。

对于生物传感器细胞试验，通过用HBSS（1x汉克斯平衡盐溶液(Hanksbalanced salt solution)，添加20mM Hepes，pH 7.1）稀释保存的浓缩溶液制得化合物溶液，并转移到384孔聚丙烯化合物保藏板以准备化合物源板。当进行两步试验时，分别制备两种化合物的源板。平行地，细胞用HBSS清洗两次并保持在30μlHBSS中以准备细胞试验板。然后将细胞试验板和所述化合物源板在读板系统的厢内孵育。孵育后，记录细胞试验微孔板中所有生物传感器的基线波长并标准化到0。然后，进行2-10分钟连续记录以确立基线，并确保细胞达到稳态。随后，通过用机载液体处理器将10μl所述化合物溶液移入细胞试验板来引发细胞响应。

所有研究在受控温度（28°C）下进行。进行至少两组独立实验，各组至少有三个重复样。发现试验的变异系数为<10%。

实施例1：肝细胞中存在线粒体K_ATP通道

K_ATP通道作为连接细胞代谢水平和细胞膜兴奋性的分子感应器。K_ATP通道通过与胞内MgADP相互作用激活并通过高水平的ATP来抑制。已在细胞质膜线、粒体内膜和核被膜中发现K_ATP通道。为了证实肝细胞系HepG2C3A中K_ATP通道的表达并测定特异K_ATP通道亚基，用对Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B特异的引物与来自HepG2C3A细胞的分离总RNA进行RT-PCR。如图1所示，Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B在HepG2C3A细胞中表达，但SUR1亚基没有。

全细胞膜片钳记录未能在HepG2C3A细胞中检测到任何K⁺选择性电流，表明K_ATP通道可能在所述细胞质膜中不存在。已报道了大鼠肝细胞中的线粒体K_ATP通道。从HepG2C3A细胞分离线粒体，然后进行western印迹，表明全细胞裂解物和线粒体裂解物中存在Kir6.2（图2）。

实施例2：无标记细胞试验检测肝细胞中的K_ATP通道

无标记RWG生物传感器细胞试验测量给定细胞群体中化合物诱导的质量再分布。获得的信号可为多重细胞信号传导事件之和。然而，K_ATP通道是内向整流K⁺通道，其可通过生理条件下的细胞内MgADP和特异KCO而被活化。通道组合物特异性KCO的可用性和无标记RWG生物传感器的敏感性使直接监控K_ATP通道活化和后续细胞信号传导事件成为可能。

为了证明肝细胞中无标记mito-K_ATP通道试验的可行性和特异性，我们先检测了Kir6.2/SUR2特异性KCO吡那地尔（图3A）诱导的HepG2C3A细胞的剂量依赖性响应。图3B显示吡那地尔诱导的DMR信号的幅度和动力学是浓度依赖性。由于吡那地尔活化的mito-K_ATP通道是内源表达的，我们推测任何特异K_ATP通道亚基的敲减可引起吡那地尔诱导的DMR信号降低。如图4所示，用SUR1特异siRNA转染的HepG2C3A细胞对吡那地尔诱导的DMR信号没有影响，而用SUR2特异siRNA的转染引起吡那地尔诱导的DMR信号降低。类似地，图5显示Kir6.1特异siRNA对吡那地尔诱导的DMR信号没有影响，而用Kir6.2特异siRNA的转染相比对照显著降低DMR信号。

K_ATP通道可被常见磺酰脲药物阻断，如甲磺氮卓脲、甲苯磺丁脲、格列甲嗪等。图6显示HepG2C3A细胞中吡那地尔诱导的DMR信号可被这些磺酰脲组剂量依赖性抑制。应注意，报道为选择性抑制含K_ATP通道Kir6.1的非磺酰脲阻断剂U-37883A对吡那地尔诱导的DMR信号没有影响。这些实验共同证明了无标记细胞试验可检测肝细胞中线粒体K_ATP通道的活化且起作用的线粒体K_ATP通道的分子组合物可能为Kir6.2和SUR2。

实施例3：肝细胞中mito-K_ATP信号传导与ROCK活性有关

Rho激酶(ROCK1和ROCK2)在小GTP酶rhoA起始的信号传导途径中有重要作用。已知Rho激酶参与各种细胞功能，包括细胞骨架组织、细胞增殖和凋亡。如图7所示，与ROCK抑制剂Y-27632预孵育会剂量依赖性降低吡那地尔诱导的DMR信号。ROCK1或ROCK2特异siRNA的转染显著降低吡那地尔诱导的DMR信号（图8A和8B）。用ROCK1和ROCK2特异抗体的western印迹证实HepG2C3A细胞中ROCK1和ROCK2蛋白水平的敲减（图8C和8D）。与两种不同肌动蛋白丝破坏试剂松胞菌素B或红海海绵素A预孵育也可剂量依赖性降低HepG2C3A细胞中吡那地尔诱导的DMR信号。这些结果表明肝细胞中mito-K_ATP通道起始的信号传导与ROCK活性有关。

实施例4：肝脏中mito-K_ATP信号传导与JAK活性有关

Janus激酶(JAK1,2,3)是参与细胞因子所介导细胞信号传导的蛋白酪氨酸激酶;其对包括细胞存活、增殖、分化和凋亡在内的各种细胞功能至关重要。图10显示与JAK抑制剂AG490预孵育会剂量依赖性降低HepG2C3A细胞中吡那地尔诱导的DMR信号。如图11所示，转染JAK1特异siRNA对吡那地尔诱导的DMR信号没有影响，而JAK2或JAK3特异siRNA显著削弱吡那地尔诱导的DMR信号。这些结果表明mito-K_ATP通路信号传导的激活与JAK活性有关，尤其是JAK2和JAK3。

实施例5：mito-K_ATP调节剂抑制利福平对CYP3A4活性的诱导

利福平是源自利福霉素形式的半合成抗生素，其干扰RNA合成并用于治疗细菌和病毒性疾病。利福平通常用于治疗分支杆菌感染，包括结核病和麻疯病；且还在与梭链孢酸组合治疗新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（MRSA）中有作用。其用于针对脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）（脑膜炎球菌）感染的预防治疗。

利福平通过结合其β亚基，从而阻止信使RNA（mRNA）转录和后续翻译为蛋白来抑制细菌细胞中DNA-依赖的RNA聚合酶。其亲脂特性使其成为治疗脑膜炎形式结核病的良好候选物，这需要分布到中枢神经系统并穿过血脑屏障。

然而，利福平表现出主要涉及药物的肝毒性的副作用，接受利福平的患者通常需要经受肝功能测试，包括天冬氨酸氨基转移酶（AST）。利福平是肝细胞色素P450酶（如CYP2D6和CYP3A4）的潜在诱导剂且会增加许多药物的代谢，所述药物被肝脏通过该酶系统清除。这导致神经药物相互作用如降低激素避孕的效力。例如，利福平能增加包括肾上腺激素、甲状腺激素和维生素D在内的内源底物的代谢。

使用胶原I基质胶夹心条件下培养的人初级肝实质细胞，研究mito-K_ATP调节剂以及利福平对CYP酶活性的影响。如图12A所示，吡那地尔剂量依赖性引起CYP3A4的诱导，最大诱导约2倍。如所预期，利福平引起3倍的CYP3A4诱导。然而，吡那地尔还剂量依赖性抑制所述利福平诱导（图12B）。对mito-K_ATP阻断剂格列甲嗪也观察到相似结果（图12C和图12D）。另一方面，吡那地尔和格列甲嗪对CYP1A2活性影响都很小。总之，这些数据表明mito-K_ATP调节剂可抑制肝毒素利福平的CYP3A4酶诱导活性，表明mito-K_ATP离子通道可针对肝毒素诱导的损伤具有保护性。

参考文献

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2.Fang,Y.,Ferrie,A.M.,Fontaine,N.H.,和Yuen,P.K.(2005)Anal.Chem.77:5720-5725.

3.Fang,Y.(2006)Assays and Drug development Technologies.4:583-595.

4.WO2006108183A2Fang,Y.,Ferrie,A.M.,Fontaine,N.M.,Yuen,P.K.和Lahiri,J.“Optical biosensors and cells（光学传感器和细胞）”

Claims (46)

1.一种测试分子的方法，所述方法包含步骤：

a.在生物传感器表面培养K_ATP细胞系，其中所述生物传感器表面用于无标记生物传感器分析，

b.用所述分子孵育所述细胞系，产生分子处理的细胞系，

c.用无标记生物传感器分析所述分子处理的细胞系，产生分子数据输出，

d.比较所述分子数据输出和相同细胞系中已知的K_ATP调节剂数据输出，生成分子-K_ATP调节剂比较。

2.一种测试分子的方法，所述方法包含步骤：

a.在生物传感器表面培养K_ATP细胞系，其中所述生物传感器表面用于无标记生物传感器分析，

b.用标记物和所述分子孵育所述细胞系，产生孵育细胞系，

c.用无标记生物传感器分析所述孵育细胞系，产生标记物-分子数据输出，

d.比较所述标记物-分子数据输出和相同细胞系中的标记物-K_ATP调节剂数据输出，生成标记物-分子/标记物-K_ATP调节剂比较。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述K_ATP细胞系包括线粒体ATP-敏感性钾离子通道（mito-K_ATP）。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞系包括肝细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝细胞包括肝实质细胞。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝细胞感染有肝炎病毒。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肝炎病毒是甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、单纯疱疹病毒、细胞巨化病毒、EB病毒、黄热病毒和腺病毒。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞获自感染非病毒性感染的来源。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述非病毒性感染包括弓形虫、钩端螺旋体、Q热和落矶山斑疹热。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞获自被化学品、毒素或药物影响的来源。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述化学品或毒素包括酒精、扑热息痛、阿莫西林、抗结核药物、米诺环素、甲基多巴、呋喃妥因、异烟肼或酮康唑。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述已知的K_ATP调节剂数据输出如下产生：孵育所述K_ATP调节剂和培养的K_ATP细胞系并用无标记生物传感器分析所述孵育细胞系，产生K_ATP调节剂数据输出。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述比较表明所述分子数据输出和所述K_ATP调节剂数据输出相似时鉴定可能的K_ATP调节剂。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述K_ATP细胞系选自HepG2或HepG2C3A细胞系。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述已知的K_ATP调节剂包含钾通道开放剂（KCO）。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述KCO包含二氮嗪、吡那地尔、克罗卡林、尼可地尔。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述K_ATP调节剂包括K_ATP抑制剂。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述K_ATP抑制剂包括磺酰脲或U-37883A。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述磺酰脲包括甲苯磺丁脲、甲磺氮卓脲或格列甲嗪。

20.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述标记物-K_ATP调节剂数据输出如下产生：孵育所述标记物和K_ATP调节剂与培养的K_ATP细胞系并用无标记生物传感器分析所述孵育细胞系，产生标记物-K_ATP调节剂数据输出。

21.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当所述比较表明所述标记物-分子数据输出和所述K_ATP调节剂数据输出相似时鉴定可能的K_ATP调节剂。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述标记物包括ROCK1抑制剂或ROCK2抑制剂。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述ROCK1抑制剂或ROCK2抑制剂包括Y27632、H-89、H-8。

24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述标记物包括JAK调节剂。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述JAK调节剂包括JAK抑制剂。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述JAK抑制剂包括AG490。

27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述标记物包括细胞色素P450酶调节剂。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述细胞色素P450酶调节剂包括细胞色素P450活化剂。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述细胞色素P450酶包括CYP2D6或CYP3A4。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞色素P450活化剂包括利福平。

31.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括就ROCK途径活性测试分子。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述测试步骤包括，

a.在生物传感器表面培养ROCK抑制剂响应细胞系，其中所述生物传感器表面用于无标记生物传感器分析，

b.用所述分子孵育所述细胞系，产生孵育细胞系，

c.用无标记生物传感器分析所述孵育细胞系，产生分子数据输出，

d.比较所述分子数据输出和相同细胞中已知的ROCK抑制剂数据输出，生成分子-ROCK抑制剂比较。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂响应细胞系包括其中通过已知ROCK抑制剂对ROCK基础活性抑制而产生稳健生物传感器信号的细胞系。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述细胞系选自A431、A549或HT29。

35.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法用至少2种标记物独立进行。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述标记物以至少EC70、EC80、EC 90、EC95和EC100的浓度添加。

37.一种测试分子的方法，所述方法包含步骤：

a.在生物传感器表面培养四种不同细胞系，其中所述表面用于无标记生物传感器分析，其中所述四种细胞系为A431、A549、HT29和HepG2，

b.用所述分子孵育各细胞系，产生四种孵育细胞系，

c.用无标记生物传感器分析各孵育细胞系，产生各孵育细胞系的分子数据输出，

d.比较所述分子数据输出和相同细胞系中的ROCK抑制剂数据输出，生成各细胞系的分子-ROCK抑制剂比较。

38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂数据输出如下产生：孵育所述ROCK抑制剂和各细胞系并用无标记生物传感器分析各孵育细胞系，产生各细胞系的ROCK抑制剂数据输出。

39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述方法还包括产生K_ATP调节剂数据输出，和产生各细胞系的分子-K_ATP抑制剂比较。

40.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含进行其他离子通道试验的步骤。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述其他离子通道试验包括常规或自动膜片钳。

42.一种治疗对象的方法，所述方法包括给予所述对象mito-K_ATP调节剂，其中所述对象需要治疗肝病。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述肝病涉及所述mito-K_ATP下游的JAK或Rho激酶信号传导。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述mito-K_ATP通道是Kir6.2和SUR2通道。

45.一种降低对象肝毒性的方法，所述方法包括给予所述对象KCO，从而所述KCO能降低给予所述对象的药物的肝毒性。

46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述KCO是吡那地尔。

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