CN102978173A - 菥蓂脂肪酸延长酶及其编码基因 - Google Patents

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孙小芹
李莹
庞慧
李密密
郭建林
严琴琴
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Abstract

本发明提供了一种来源于菥蓂的脂肪酸延长酶及其编码基因TaFAE1。将该基因导入酵母，重组酵母芥酸含量达0.43±0.15％。本发明的蛋白及其编码基因对于植物芥酸遗传调控机制的研究以及提高植物的芥酸含量和相关性状的改良具有重要的理论和实际意义，将在植物的芥酸基因基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

菥蓂脂肪酸延长酶及其编码基因
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域，更具体地，涉及菥蓂(Thlaspiarvense L.)脂肪酸延长酶(FAE1)及其编码基因。
背景技术
芥酸(erucic acid，C22：1)是一种超长链不饱和脂肪酸，主要存在于十字花科(Brassicaceae)和金莲花科(Tropaeolaceae)植物种子中。作为植物的代谢产物，芥酸还在一定程度上影响植物的生长发育，在植物与环境的相互作用中，参与了生物膜角质或蜡质的合成。从营养价值来说，芥酸是食用油的抗营养成分，不易被人体消化吸收，容易导致冠心病和脂肪肝等病害发生。然而，在工业上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有较好的增塑性和疏水性，因此，具有广泛的用途，是生产润滑剂、防腐剂、化纤原料和化妆品等化工产品的重要原料。
FAE1(Fatty Acid Elongase 1)基因是调控芥酸合成的关键基因，虽然自James等最先从拟南芥中克隆到FAE1基因以来，陆续有完整的FAE1基因从各种十字花科植物中被分离出来，但目前对于FAE1基因的克隆仅局限于拟南芥及芸苔属少数几种植物中，而十字花科是芥酸分布的主要种质资源，植物种类多，芥酸含量复杂，是FAE1基因克隆的合适材料。
本发明通过TaFAE1基因的真核表达，获得活性蛋白，同时脂肪酸含量检测分析发现该基因所编码的蛋白对芥酸合成有催化活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于芥酸含量较高的埃塞俄比亚芥中的脂肪酸延长酶(Fatty Acid Elongase 1，FAE1)及其编码基因。
本发明的菥蓂的FAE1基因由1251个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框，为序列表中的1号序列，将此基因命名为TaFAE1。
本发明的菥蓂FAE1蛋白由506个氨基酸组成，开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。TaFAE1蛋白的理论分子量为56.64kDa，等电点为9.56。
含有上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸的载体，以及用上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞，均是本发明需要保护的内容。
本发明基因的发现，使通过转基因来调控芥酸合成成为可能，对于培育高芥酸的转基因十字花科作物具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为菥蓂基因组DNA
图2为TaFAE1基因全长PCR扩增产物
图3为真核表达载体pYES-TaFAE1的构建流程图
图4为载体pYES-TaFAE1的酶切图谱
图5为酵母中TaFAE1表达产物的Western Blot分析
具体实施方式
实施例1、基因TaFAE1的克隆
克隆TaFAE1，具体步骤如下：
一、TaFAE1基因的获得
菥蓂在正常条件下栽培，待真叶长出，采集叶片，从叶片中提取DNA，进行聚合酶链式反应，最终获得TaFAE1基因。
1、菥蓂基因组DNA的提取
取新鲜幼嫩的活体植物叶片约0.2g，在液氮冷冻条件下充分研磨，转入1.5mL的离心管中，加入500μLCTAB提取液，65℃水浴45min，期间颠倒混匀3次；加入500μL体积比为24∶1的氯仿-异戊醇，混合均匀，12000r·min-1离心15min；取上清，加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱中过夜；4000r·min-1离心15min使DNA沉淀；700μL70％乙醇清洗2次，4000r·min-1离心10min，再用700μL无水乙醇清洗1次，4000r·min-1离心10min，得DNA沉淀晾干；最后加100μL去离子水使沉淀溶解。电泳检测结果如图1所示。
2、聚合酶链式反应PCR
以上述得到的菥蓂基因组DNA为模版，以分别带有KpnI与BamHI酶切位点的TFK(5′CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC  3′)与TRB(5′CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC 3′)为引物，按以下反应扩增出TaFAE1基因。反应体系如下：
Figure BSA00000794867700031
Figure BSA00000794867700041
按以下程序进行扩增反应：先94℃预变性3min；然后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。电泳检测PCR产物，如图2所示，有一大小约1500bp大小的条带，与理论值相符。
回收1500bp的条带，将该DNA片段连接到pMD18-T载体上，生成pMD-TaFAE1重组载体，转化大肠杆菌DH5，经测序后在GenBank中进行Blastn比较，结果表明，该DNA与多种植物FAE1基因有较高的同源性，因此推测所扩增的DNA为一个FAE1基因。测序后进行BLAST检索，结果表明已分离得菥蓂FAE1基因序列。
二、TaFAE1基因的同源性分析及二级结构分析
为将菥蓂的FAE1基因的蛋白序列与其他高等植物的FAE1基因编码的蛋白进行同源性分析，从NCBI网站上检索到拟南芥(Arabidopsis thaliana)，芥菜(Brassica juncea)，欧洲油菜(Brassica napus)，花椰菜(Brassica oleracea)，芜青(Brassica rapa)，Camelina hispida，Cardamine graeca，海甘蓝(Crambeabyssinica)，菘蓝(Isatis tinctoria)，绿独行菜(Lepidium campestre)，银扇草(Lunaria annua)，白芥(Sinapis alba)，中欧芥(Teesdalia nudicaulis)等植物同源基因的蛋白序列。通过Megalign软件分析结果表明：菥蓂FAE1蛋白的氨基酸序列与菘蓝中FAE1蛋白的同源性达92.3％，与其它几种植物的同源性在80％-90％左右，与芥菜的FAE1蛋白同源性最低，仅为81.3％。
Pfam结果显示TaFAE1基因所编码蛋白具有典型的FAE1蛋白特有的FAE1_CUT1_RppA与ACP_syn_III_C结构域。
实施例2、TaFAE1基因的功能验证
一、TaFAE1基因在酵母中的高效表达
为了表明TaFAE1基因的编码功能，本发明将TaFAE1基因克隆到Invitrogen公司的pYES2/NT C的BamHI和KpnI位点之间，并转化酵母菌株InvSc1，获得了高效表达。
本发明是利用Invitrogen公司的pYES2/NT C高效表达载体的多克隆位点来实现TaFAE1的高效表达的。本实验采用的酶切位点使pYES2/NT C表达载体表达出的产物5’端附加6个连续His的融合蛋白，这6个连续的His构成了i-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。
将携带TaFAE1基因的pMD-TaFAE1重组载体与pYES2/NT C表达载体用相同的酶(BamHI和KpnI)酶切后，再连接，将连接产物转化酵母InvSc1菌株，并用添加了2％(w/v)葡萄糖但不含脲嘧啶的培养基上(SC-ura)培养并选择。载体的构建流程见图3。经质粒酶切鉴定(如图4所示)，1，2为质粒pYES-TaFAE1用BamHI和KpnI酶切后，再经过PCR鉴定后，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。把构建成带有TaFAE1基因的表达载体，命名为pYES-TaFAE1，用于诱导表达分析。
将筛选并经鉴定确认的重组子，接种到添加了2％(w/v)葡萄糖的SC-ura液体培养基中，在28℃下振荡培养过夜。用添加了2％(w/v)半乳糖的SC-ura液体培养基将过夜培养物稀释到OD600值为0.02，并继续振荡培养到OD600值为1.4。收集菌体，按凯基公司提供的方法提取细胞总蛋白，然后用HisBind resin纯化并进行10％SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示，从图中可以看出，TaFAE1基因在InvSc中得到了高效表达。
二、功能鉴定
为检测TaFAE1基因的功能，本发明采用对转化有pYES-TaFAE1质粒的酵母细胞的芥酸含量进行测定，TaFAE1基因促进了芥酸合成，芥酸在酵母细胞中得到累积。
本发明所采用的酵母菌株InvSc的脂肪酸延长酶活性很低，只合成微量的超长链脂肪酸，因此是研究FAE1编码蛋白活性的常用体系。将步骤一中筛选并经鉴定确认的重组子，接种到添加了2％(w/v)葡萄糖的SC-ura液体培养基中，在28℃下振荡培养过夜。用添加了2％(w/v)半乳糖的SC-ura液体培养基将过夜培养物稀释到OD600值为0.02，并继续振荡培养到OD600值为1.4。收集菌体，用超纯水洗涤。酵母细胞在80℃氢氧化钾-甲醇溶液(10％(w/v)KOH，5％(v/v)H2O in methanol)中皂化2h。皂化后，样品置于冰上冷冻，然后用正己烷洗涤，以去除未皂化物。剩余的水相用6mol/L HCl酸化。自由脂肪酸被萃取在正己烷中，抽真空去除溶剂。自由脂肪酸在2ml含1％H2SO4的甲醇溶液中60℃甲基化1h。酵母脂肪酸甲酯(FAMEs)被萃取在正己烷中，抽真空去除溶剂，剩余物溶解在正己烷中用于气相色谱分析。结果显示，转化有pYES-TaFAE1质粒的酵母中芥酸含量为0.43±0.15％，作为对照的空质粒pYES2/NT C无芥酸累积。结果证实了TaFAE1基因编码蛋白的体外活性。
Figure ISA00000794867900011
Figure ISA00000794867900021
Figure ISA00000794867900031

Claims (7)

1.一种脂肪酸延长酶多肽，该多肽选自：
(a)具有序列2氨基酸序列的多肽；
(b)将序列2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的具有脂肪酸延长酶功能的多肽。
2.根据权利要求1所述脂肪酸延长酶的编码基因，其特征在于所述脂肪酸延长酶的基因cDNA为下述核苷酸序列之一：
(a)序列表中序列1的核苷酸序列；
(b)与多核苷酸(a)互补的核苷酸序列；
(c)编码序列表中序列2蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。
3.含有权利要求2任一所述的基因的重组表达载体。
4.含有权利要求2任一所述的基因的转基因细胞系。
5.含有权利要求2任一所述的基因的工程菌。
6.权利要求1任一所述的蛋白在培育脂肪酸改良植物中的应用。
7.权利要求2任一所述的基因在培育脂肪酸改良植物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226196A (zh) * 2011-05-18 2011-10-26 上海海洋大学 一种编码缺刻缘绿藻δ-6脂肪酸延长酶的dna序列及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102226196A (zh) * 2011-05-18 2011-10-26 上海海洋大学 一种编码缺刻缘绿藻δ-6脂肪酸延长酶的dna序列及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《GenBank》 20050404 Lu,C.等 "Accession No：AAX58615.1" 第1-2页 1-5 , *
《中国粮油学报》 20120930 王超 等 "遏蓝菜种子油理化性质及脂肪酸组成的GC-MS分析" 第67-70页 1-7 第27卷, 第9期 *
LU,C.等: ""Accession No：AAX58615.1"", 《GENBANK》 *
王超 等: ""遏蓝菜种子油理化性质及脂肪酸组成的GC-MS分析"", 《中国粮油学报》 *

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