CN102967715B - 一种新型酶联免疫生化光盘检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型酶联免疫生化光盘检测系统。该检测系统包括酶联免疫检测光盘和检测装置两部分。酶联免疫检测光盘结合了微处理技术、离心流体技术与酶联免疫技术，将微流通道、贮液室和毛细管阀门系统刻录于一张特殊塑料光盘上，当旋转光盘产生的离心力大于阀门处的毛细管力时，贮液室的液体按酶联免疫操作步骤程序性释放，完成酶联免疫反应，其特点是检测自动化，试剂用量少、成本低、快速高效、信号和灵敏度高、操作简单、数据处理和传输方便。本系统可应用于多种临床疾病的预测、诊断、治疗监测，食品安全评价及环境监测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型酶联免疫生化光盘检测系统，该系统结合微处理技术、离心流体技术与酶联免疫技术的优点，可广泛应用在生物医药、临床诊断、食品安全和环境检测等领域。
背景技术
常用的酶联免疫反应分析方法(ELISA)在传统的96孔板上操作，由系列混合、孵育和洗涤过程组成。第一步，将抗体(一抗)加入孔板中，孵育一定时间以使抗体吸附到固体表面，再洗涤除去未吸附的抗体；第二步，加封闭蛋白溶液占领未被一抗吸附的固体表面，以减少蛋白或抗体的非特异性吸附。第三步，加入样品或含已知抗原的标准品，孵育一定时间以促进抗原与抗体的结合。第四步，加入特异酶标记的二抗，孵育一定时间，促进二抗与抗原结合，并洗涤除去多余的二抗。第五步，加入底物，底物经酶催化反应产生检测信号(如颜色或荧光)进行检测。由于每一酶分子可催化大量的底物反应产生检测信号，因此ELISA法检测灵敏度高。然而，常规ELISA分析在96孔板上进行，为技术密集型手工操作，不仅操作步骤繁琐、耗时长(数小时甚至更长时间)、劳动强度大、抗体和试剂消耗大，且结果误差大、重现性差，直接导致ELISA检验费用高。
目前国内市场对酶联免疫试剂耗材和自动化酶联免疫检测的需求量很大，大型医院和研究机构大多从国外进口相关的试剂进行实验。为了适应大量样品的检测，已有机器人操作的384或1536孔板ELISA，但价格昂贵，不适于小型企业和临床日常检验。GyroLab开发的机器人光盘酶联免疫(Compactdisk-Enzyme-linked immunosorbent assay(CD-ELISA))芯片因价格昂贵而限制了其广泛使用。一套完整的GyroLab工作站价值$250,000，且该工作站主要用于蛋白药物早期开发，还未涉足医学临床诊断。因此，开发系列无需机器人操作、低成本、检测快速的自动酶联免疫生化光盘检测系统，是目前最重要的发展方向。国内该领域发展较慢，目前，尚没有企业从事用于酶联免疫蛋白检测的自动生化检测光盘的研究和开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种高效、低廉的酶联免疫生化光盘检测系统。该系统将微流体技术与ELISA结合，实现了自动化的生化检测光盘系统。其特点是快速，易于操作，试剂和样品消耗量少，仅需最少的人工操作，可最大程度降低人员操作所带来的误差，且无需机器人。与常规96孔板相比，将以数量级的倍数降低免疫反应所需试液体积，检测时间，并提高反应灵敏度。
本发明提供的技术方案是：
一种新型酶联免疫生化光盘检测系统，该检测系统包括酶联免疫检测光盘和检测装置两部分。其中，酶联免疫检测光盘包含微流通道、贮液室和阀门系统。酶联免疫检测光盘制作工艺包括微通道刻痕，阀门超疏水改性，检测室的表面改性，一抗的吸附与洗涤，光盘粘接和加盖。检测装置由三部分组成：旋转台，精密的光电倍增管和计算机控制系统。
具体方案包括：
1)超疏水阀门的改进与流速控制；
2)一抗吸附的优化；高效率的抗体有序化固定技术是开发微量免疫分析的关键所在。
3)生物良性芯片的粘；生化检测光盘的粘接和加盖应密封，无泄漏。
所述的超疏水阀门的改进采用非晶型的氟聚合物(CYTOP 805A)和聚苯胺纳米纤维覆盖于PMMA表面。
所述的一抗的有序化固定采用聚乙烯亚胺PEI为桥接剂，络氨酸酶(TR)催化反应，使得抗体有足够的空间进行有序排列并保持良好活性。
所述的生化检测光盘的粘接和加盖采用间隙键合和CO2介导键合。
本发明提供的新型酶联免疫生化光盘检测系统，光盘微流通道比表面积大，体积小，不仅大大减少的抗体和试液的消耗、洗涤和孵育所需时间大大缩短，且提高了检测灵敏度，缩短了分析时间。检测光盘被固定在离心分析仪上，通过离心力的控制，实现在一张光盘上完成许多常规的分析操作如称量、稀释、混合、标定和分离等，具有制作简便，流速可控，调试简单，在处理大量样品时的功能强大等优点。底物经酶催化反应产生的荧光作通过光电倍增管为主要检测信关联到电脑，，并且实验数据自动地被保存在电脑上。实现了体外诊断的自动化，成本低、快速高效、操作简单、数据处理和传输方便。
本发明提供的新型酶联免疫生化光盘检测系统将光盘微流体技术与酶联免疫结合，实现了酶联免疫检验的自动化。该检测系统可作为一个标准的临床检测手段，用于多种临床疾病如癌症、爱滋病、肝病及其他疾病的预测/诊断/治疗监测等。可用于乙肝表面抗原(HbsAg)的测定，筛选乙肝病毒通过；通过丙型肝炎病毒(HCV)的测定，筛选丙肝病毒；以及优生优育五项(TORCH)检查中的风疹病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、E19微小病毒及弓形体病毒的测定；γ-干扰素的定量测定，监测恶性肿瘤的治疗效果；通过IgG单克隆抗体的监测，评价器官移植的排异反应等；通过爱滋病(HIV-A/HIV-2)多肽EIA的测定，诊断人类免疫缺陷病毒(HIV)，通过L嗜肺军团菌血清组1抗原的测定，以诊断军团病。此外，本检测系统也可实现在一张检测光盘上同时完成多个样品快速蛋白检测或一个样品多个蛋白指标检测。
附图说明
图1.酶联免疫生化检测光盘的设计原理
图2用CYTOP-聚苯胺纳米纤维方法来改性生物光盘的控制阀区域从a图看到没有改型的表面，便面光滑，接触角越是72°，改性之后(b图)，表面非常憎水，接触角越是160°。
图3各个阀门的临界速度比较
图4TR催化蛋白A(protein A)为基础的抗体固定技术的示意图
图5不同方法固定微流控轨道的生物活性比较
图6(a)食用染料充满键合后的微流芯片通道内；(b)微通道键合良好的剖面图
图7(a)酶联免疫生化检测光盘的设计示意图；(b)酶联免疫生化检测光盘的实物照片
图8酶联免疫生化检测光盘检测分析系统照片
图9分析仪的得到的线性曲线
具体实施方式
实施例1：酶联免疫生化检测光盘的设计
图1是酶联免疫生化检测光盘的设计原理图。抗体和抗原放入1和1’试剂槽，标记物和基质分别放入3号和5号试剂槽，2号和4号试剂槽用于洗液。本发明设计的检测光盘包含了许多微流设计组件，例如，阀门的设计，注入孔，试剂槽，检测区，以及废液收集池。一张酶联免疫生化检测光盘可以检测12、24或48个样品，或一张光盘可对1个样品进行12、24或48种酶联免疫分析检测。
实施例2：超疏水阀门的改进与流速控制
采用非晶型的氟聚合物(CYTOP 805A)和聚苯胺纳米纤维覆盖于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)表面，比较了吸附蛋白前后的接触角和SEM照片，见图2。结果显示，CYTOP 805A-聚苯胺纳米纤维改性的PMMA表面呈超疏水性，蛋白吸附对阀门接触角影响很小(仅由175°降至167°)。加载染料溶液后的快照照片显示，CYTOP-聚苯胺纳米纤维改性的阀门能有效控制液体程序性突释和流速。与其他商业化表面改性技术相比，CYTOP-聚苯胺纳米纤维表面改性操作简单、几乎无需任何仪器设备，成本低，改性表面分布均匀，批内和批间差异更小，试验重现性更好。
比较了各个阀门的临界转速，每两个阀门之间的临界转速相差大于300rpm，保证了各个阀门的正常运转。并且试验值和理论计算值匹配得很好，结果见图3。
实施例3：一抗吸附的优化
如示意图4所示，采用聚乙烯亚胺PEI为桥接剂，络氨酸酶(TR)催化反应，固定蛋白A于PMMA表面，用于γ-干扰素抗体的检测。结果表明，因PEI链形成的空间距离，使得抗体有足够的空间进行有序排列并保持良好活性。与传统戊二醛交联法相比，不仅提高了抗体的结合率和检测灵敏度(提高了5-10倍)，而且检测信号强度提高了62倍(图5)。
实施例4：生物良性芯片的粘接
微流芯片的的粘接采用间隙键合和CO2介导键合。间隙键合采用紫外光固化树脂法在塑料微流芯片表面完成复杂的键合方式，并获得较高键合率；且没有通道变形或外来物质污染。从图6(a)可见，食用染料装载键合后的微流芯片贮液室后，微通道内充满了液体，无泄漏。从图6(b)的剖面图可见，微通道键合良好，仅可见一层非常薄的树脂。
二氧化碳(CO2)是一种低成本，无毒性，无爆炸性气体。超临界CO2是一种具有气体样粘度的液体，是一种理想的聚合物溶剂，尤其在微型和纳米芯片中。当大量CO2溶于聚合物以后，可降低聚合物玻璃化转变温度(Tg)、粘度和表面张力(如聚合物在熔融状态)，以促进界面的微观融合；当压力释放后，CO2易从聚合物基质中扩散除去。我们成功将该技术用于聚苯乙烯微通道的PLGA加盖，结果表明PLGA内层和聚苯乙烯微通道键合完好。
实施例5：基于本酶联免疫生化光盘检测系统开发的γ-干扰素的检测试剂盒
γ-干扰素的检测试剂盒，用于监测恶性肿瘤的治疗效果。以下对常规酶联法和生化光盘检测法定量测定γ-干扰素进行了比较：
用传统96孔板：总共需要600微升试剂，耗时13小时。
用生化检测光盘：仅仅需要40微升试剂，耗时不到1.4小时。
(1)试剂用量比较
(2)检测用时比较
本发明将微刻录技术、离心流体技术与ELISA技术相结合，刻录微流通道、贮液室和毛细管阀门系统于一张塑料光盘上。当旋转光盘产生的离心力大于阀门处的毛细管力时，贮液室的液体按ELISA操作步骤程序性释放，完成ELISA检验。图7是目前我们开发出的含24对48样的酶联免疫生化检测光盘，图8是配套的检测装置，图9显示了检测分析得到的线性曲线。
Claims (2)
1.一种新型酶联免疫生化光盘检测系统，其特征在于：该检测系统由酶联免疫检测光盘和检测装置两部分组成；酶联免疫检测光盘由离心力驱动，包含微流通道、贮液室和阀门系统；酶联免疫检测光盘制作工艺由微通道刻痕，阀门超疏水改性，检测室的表面改性，一抗的吸附与洗涤，光盘粘接和加盖组成；通过超疏水阀门的设计与流速控制，控制微芯片上生物试剂按酶联免疫步骤程序性释放；采用聚乙烯亚胺为桥接剂，络氨酸酶催化反应，固定蛋白A于PMMA表面，使得抗体有足够的空间进行有序排列并保持良好活性；酶联免疫生化光盘的粘接采用紫外光固化树脂法在塑料微流光盘表面完成复杂的键合；所述超疏水阀门采用非晶型的CYTOP 805A和聚苯胺纳米纤维覆盖于聚甲基丙烯酸甲酯PMMA表面制成，并且每两个阀门之间的临界转速相差大于300rpm。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫生化光盘检测系统，其特征在于：检测装置由三部分组成：旋转台，精密的光电倍增管和计算机控制系统。
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| 基于微流控芯片的免疫传感器和蛋白质组学研究;王慧香;《中国博士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20111121;参见第8页第1行至第9页第18行、第60页第18行至第24行及第63页第1行至第7行 * |
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