CN102964340A - 一类治疗阿尔茨海默病的选择性多巴胺d1受体激动剂 - Google Patents

一类治疗阿尔茨海默病的选择性多巴胺d1受体激动剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一类具有多巴胺D1受体激动活性的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。此类化合物有很强的体外激动多巴胺D1受体的活性，EC50可达到nM水平，其中活性最强的化合物的EC50为7.56±0.45，可作为Aβ抑制剂，用于治疗阿尔茨海默病。

Description

一类治疗阿尔茨海默病的选择性多巴胺D1受体激动剂
技术领域
本发明涉及一类先导化合物选择性多巴胺D1受体激动活性的及其治疗阿尔茨海默病的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以认知记忆障碍为主要特征的退化性神经系统疾病，在发达国家已经成为仅次于心血管病、肿瘤和中风而位居第四位的致死原因。目前全球有AD患者约2430万人，预计到2040年全球将共有AD患者8100万。AD的病因至今尚不明确，可能是多种因素共同参与的结果。围绕着AD的发生，存在包括基因突变学说、胆碱能学说、淀粉样蛋白(Aβ)级联学说、tau蛋白异常修饰学说、免疫与炎症学说以及氧化应激学说在内的各种学说。其中Aβ级联学说占据主导地位。该学说认为Aβ是AD发病的中心环节，Aβ的聚集和沉积促发炎症级联反应、神经元纤维缠结、轴突损伤和突触丢失，最终导致神经元凋亡和痴呆。
目前治疗AD的药物主要是针对AD不同的发病机理而产生的，主要包括作用于胆碱能系统的药物、雌激素、神经营养因子、非甾体抗炎药、抗氧化剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、抗Aβ药物、改善脑代谢的药物等，但只有抗Aβ药物是针对疾病的中心环节的治疗措施。因此抗Aβ药物治疗被认为是AD最有希望的治疗方法。
AD患者Aβ蛋白逐渐在细胞内外通过成核作用形成毒素斑点，导致神经元缺失，变性，产生认知和记忆障碍。因此减少Aβ的产生对改善AD的认知和记忆障碍有理论依据。目前美国犹他州盐湖城的一家生物制药公司MyriadGenetic(Nasdaq：NYGN)正在进行特异性减少毒性多肽淀粉样Aβ42药的II期临床，但临床上尚无此类药物出现。
多巴胺受体按照不同受体亚型与激动剂结合后信号转导机制的差异，可分为两类：D1类和D2类受体。D1类受体与Gs蛋白偶联，受到刺激后是腺苷酸环化酶活性升高，这类受体包括D1和D5两种亚型。D2类受体与Gi蛋白偶联，受刺激后不改变腺苷酸环化酶的活性或使其活性降低，它包括D2，D3，D4三种亚型。在中枢神经系统(CNS)中D1受体是分布最广泛的DA受体，以尾状壳核，横核，黑质网状部和嗅球表达最多，外周D1受体主要分布在心脏和肾脏。
近几年研究发现D1与阿尔兹海默症发病机制有关联，有望成为AD的防治新靶点。研究表明激动D1受体能保护神经元免受Aβ低聚物导致的突触功能障碍，且多巴胺在体外具有分解Aβ纤维蛋白的作用，另外脑内注射D1受体激动剂能改善东莨菪碱造成的痴呆状况，这些都提示D1受体激动剂能够用于AD的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的化合物，该化合物是多巴胺D1受体激动剂，对阿尔茨海默病有预防或者治疗作用。本发明所述的化合物包括含治疗有效量的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明采用高通量筛选技术，建立了多巴胺D1受体激动剂高通量筛选模型并应用于化合物大规模筛选，通过筛选一批从CHEMDIV公司购买的化合物并进行功能性验证寻找到了具有化学式(I)的多巴胺D1受体激动剂。本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染多巴胺D1受体，建立D1受体激动剂高通量筛选模型，进行初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有抗AD作用的候选药物。具体步骤如下：
步骤一：建立及培养稳定转染D1受体的CHO细胞株。
步骤二：标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
步骤三：阳性药验证。
步骤四：采用稳转细胞株和摸索的最佳检测条件对化合物进行D1受体激动剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
附图说明
图1：标准曲线及最佳细胞数曲线
图2：阳性药氢溴酸盐(SKF81297)量效曲线
图3：化合物1-5的量效曲线
图4：化合物6-11的量效曲线
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式
1.建立及培养稳定转染多巴胺D1受体的CHO细胞株。
应用重组酶介导的盒交换技术(Recombinase-Mediated Cassette Exchange，RMCE)批量构建G蛋白偶联受体细胞株，并使其稳定转染多巴胺D1受体，培养CHO-D1细胞使其达到稳定生长状态。
2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
为验证实验体系的正确性以及能筛选出可靠的多巴胺D1受体激动剂，在建立模型时需要测定标准曲线并确定最佳细胞数。待CHO-D1细胞生长到80％的时用0.5mM EDTA的PBS消化细胞，离心去除上层液体，最后将细胞用刺激缓冲液重悬用于确定最佳细胞数。使用PerkinElmer公司的LANCETM cAMP 384Kit试剂盒，配制标准环磷酸腺苷(cAMP)梯度稀释液及腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)梯度稀释液。标准曲线测定方法：将cAMP的标准溶液50μmol/L(
Figure BSA00000823941800031
cAMP检测试剂盒自带)，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，cAMP与抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后检测；最佳细胞数检测方法：将50mM的forskolin母液用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，forskolin与含有细胞的抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后在EnVision微孔板测读仪上检测。根据forskolin量效曲线窗口(性噪比S/B)及曲线与cAMP标准曲线斜率相近的细胞浓度作为最佳细胞数。标准曲线及最佳细胞数确定见图1。
3.选用多巴胺D1受体激动剂的阳性药SKF81297对所建立的多巴胺D1活性筛选模型进行验证并且根据量效曲线计算其的EC50。
阳性药测定方法：将100mM的SKF81297母液，用刺激缓冲逐级稀释为终浓度2倍的工作浓度，阳性药SKF812975μl与含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液再孵育一个小时后用EnVision微孔板测读仪检测，阳性药量效曲线见图2。
4.在上述的最佳检测条件下进行多巴胺D1受体激动剂的的初筛和复筛。
初筛与复筛过程相同，初筛只选用一个浓度对8万个化合物进行初步筛选，再选择初筛有效的化合物梯度稀释8个浓度进行复筛，过程如下：用Janus全自动加样工作站稀释化合物并吸取5μl转移到384孔板中，再用Multidrop自动加样仪将含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中，两者共同孵育45分钟后，Multidrop自动加样仪将10μl终止液加入384孔板中，再次孵育一个小时，用EnVision微孔板测读仪检测。复筛得到一系列具有D1受体激动作用的化合物，各个化合物的EC50结果见图3，图4.
复筛实验结果
Figure BSA00000823941800041
表1复筛得到的对D1受体有激动作用的一类化合物母核，结构式及EC50
Figure BSA00000823941800042
Figure BSA00000823941800051

Claims (3)

1.下式化合物或其药学上可以接受的盐：
Figure FSA00000823941700011
其中：
R1代表氢原子或者甲基；
R2代表氢原子，甲基或者乙基；
R3代表苯环，其中苯环上可以接氟原子，氯原子或者含氧原子的三元或四元环。
2.根据权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其作用于多巴胺D1受体的选择性激动活性。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗或预防阿尔茨海默病的用途。
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