CN102952193A - 一种基于单域抗体的抗原表位展示方法 - Google Patents

一种基于单域抗体的抗原表位展示方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于单域抗体的抗原表位展示方法。具体地讲，本发明利用单域抗体的CDR3区展示外源抗原表位，这种在其分子表面展示外源抗原表位的单域抗体骨架蛋白可用于制备针对表位小肽的抗体，也可作为外源抗原之替代抗原，用于免疫动物、制备针对外源抗原的抗体。此外，基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法还可用于制备表位疫苗。

Description

一种基于单域抗体的抗原表位展示方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用单域抗体展示外源抗原表位的方法及应用。
背景技术
表位是蛋白质抗原的一部分，是蛋白质抗原性的基础，抗体的特异性是针对表位的。由于表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成，合成单独的抗原表位肽由于其分子较小，一般没有或仅有极微弱的免疫原性。为增强抗原表位肽的免疫原性，一般是将表位肽与载体蛋白如牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素等相偶联，或者与具有佐剂活性的脂质分子共价连接，形成脂肽，也可将抗原表位肽连接于分支状的多聚赖氨酸骨架上，形成一种具有独特三维空间结构的大分子，用以诱导针对表位的免疫应答。这些方法的不足之处是，偶联过程复杂，需要化学合成和纯化，脂肽和多聚赖氨酸骨架制备困难，并且费用较高，所以，其应用受到限制。另外，对于一些空间表位，合成的表位肽几乎不能模拟其在蛋白质抗原分子中的天然构象。因此，建立合适的抗原表位展示方法，有效展示外源抗原的表位肽对于复杂抗原的抗体制备和表位疫苗的设计具有重要意义。
对于一般抗体而言，其结合抗原表位的部位由抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable domain of lightchain，VL)共同构成，但二者对抗原结合的贡献是不同的。一般情况下，VH发挥主要作用，单独的VH仍具有抗原结合能力，但是VL的缺乏将使VH对抗原的亲和力降低，并且易于积聚和沉淀。
1989年，Ward等(Nature 1989，341：544-546)首次制备了仅由抗体的VH区构成的基因工程抗体，因为仅由一个结构域组成，故称之为单域抗体(single domain antibody)。之后，通过克隆一般抗体的可变区而构建的单域抗体在亲和力和稳定性等方面有了很大提高，但是这类抗体的工程化改造不具有普遍性。因此，分子较小的单域抗体的应用前景受到人们的怀疑。
1993年，Hamers-Casterman等(Nature 1993，363：446-448)报道了在骆驼血清中大量存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavy chainantibody)。重链抗体在骆驼的体液免疫中发挥着重要的作用。与一般抗体相比，重链抗体除了缺少轻链之外，重链抗体的重链可变区(variable domainof heavy chain of heavy chain antibody，VHH)还具有不同于一般抗体可变区(variable domain of heavy chain of conventional antibody，VH)的特征，骆驼的VHH基因通过在几个重要功能位点的选择性进化维持了重链抗体的正常功能，也就是说重链抗体的VHH可以在缺少轻链可变区的情况下单独折叠成稳定的结构，并保持其抗原结合活性。
构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体具有热稳定性好、可溶性好、亲和力高等特点，并且由于其分子较小，仅为12-15kD左右，因此，其在肿瘤成像、亲和纯化等方面具有较好的应用前景。对于单域抗体，人们更多的还是将其作为一种小分子量的抗体去应用。
单域抗体分子虽小，但结构相对稳定，特别是构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体具有较好的热稳定性和可溶解性。在单域抗体的三个抗原互补决定区(complementarity-determining region，CDR)中，抗原互补决定区3(CDR3)在与抗原的结合中发挥主要作用，CDR3的长度变化范围较大，能够形成丰富的构象以参与结合抗原，换一种角度看，也就是说CDR3区能够展示不同长度的肽段，形成各种不同的构象，因此，单域抗体的CDR3应该是一种理想的抗原表位展示部位。
基于以上考虑，本发明建立了基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法，利用单域抗体的CDR3区展示外源抗原表位，使抗原表位形成稳定的、更接近于其在天然抗原中的构象。利用该抗原表位展示方法，可以制备复杂抗原的替代抗原，用于制备针对复杂抗原的抗体。另外，如果用该方法有效展示来源于病原微生物抗原、肿瘤抗原等的特定表位，则这些重组小蛋白可直接作为疫苗，用于疾病的预防和治疗。
发明内容
本发明的目的就是建立一种新的抗原表位展示方法，实现抗原表位的有效展示，以解决目前化学合成的表位肽免疫原性差，以及通过化学偶联法制备表位肽免疫原技术复杂、成本高的问题。
为实现上述目的，本发明实施了以下技术方案：
本发明提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，即为利用单域抗体为分子骨架，利用单域抗体的互补决定区3即CDR3为外源目标抗原表位展示部位。
本发明还提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，即为利用单域抗体为分子骨架，利用单域抗体的CDR3为外源目标抗原表位展示部位，用外源目标抗原表位序列替换CDR3区序列。
所述单域抗体构建自重链抗体的重链可变区。
所述单域抗体构建自骆驼类或鲨鱼类重链抗体的重链可变区。
所述单域抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7所示的单域抗体骨架序列。
所述单域抗体构建自含轻链和重链的常规抗体的重链可变区。
所述单域抗体构建自人或鼠抗体的重链可变区。
所述单域抗体包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的单域抗体骨架序列。
所述外源抗原表位为肽类表位。
所述外源抗原表位为包含“HHHHHH”或“EQKLISEEDL”或“YPDEIEYIFKP”或“ATLRETYGE”氨基酸序列的肽类表位。
本发明提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，具体包括如下步骤：
(1)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；
(2)用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒；
(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。
本发明还提供了一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，具体包括如下步骤：
(1)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2(FR2)和CDR3区的序列；
(2)将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，并用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒；
(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。
本发明还提供了根据上述的基于单域抗体的抗原表位展示方法得到的包含有外源抗原表位的蛋白。
本发明还提供了上述蛋白在制备单克隆抗体领域中的用途。
本发明还提供了上述蛋白在制备疫苗领域中的用途。
本发明还提供了一种单域抗体在展示外源抗原表位中的用途。
本发明所述的上述技术方案与现有技术相比具有以下优点：1、所述基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法，可用于展示某一小肽分子，这种展示有外源小肽的重组蛋白可替代小肽作为免疫原免疫动物，制备针对小肽的抗体，克服了小肽直接作为免疫原存在的免疫原性差的问题；2、利用本发明所述的基于单域抗体骨架的抗原表位展示方法制备表位肽免疫原，避免了通过化学偶联技术制备表位肽免疫原存在的技术复杂、成本高的问题。
本发明所述的抗原表位展示方法还具有广泛的潜在应用领域，如可用于展示某抗原分子上的某一表位，这种展示有外源抗原表位的重组蛋白，可作为某抗原的替代抗原直接用于免疫动物，制备针对该表位的抗体，如果制备的抗体能特异性识别相应的抗原，则通过这种技术就实现了在无相应抗原的情况下制备了该抗原的抗体。本发明所述的抗原表位展示方法也可用于蛋白质表位疫苗的制备。例如，利用该表位展示方法展示病原微生物或肿瘤抗原的中和性抗原表位，这种展示有中和性抗原表位的重组蛋白可直接作为疫苗，用于免疫动物，让动物产生针对中和性表位的抗体，从而在体内清除相应的病原微生物或抑制肿瘤的生长。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为实施例1所述的骆驼重链抗体的重链可变区(VHH)的氨基酸序列；
*：双划线部分为CDR3区；
图2为实施例1所述展示(His)6表位的骆驼单域抗体骨架的氨基酸序列；
*：双划线部分为(His)6表位；
图3为实施例1所述展示(His)6表位的骆驼抗体骨架基因编码序列；
*：双划线部分为限制性核酸内切酶酶切位点；
倾斜部分为终止码序列；
图4为实施例1中应用ELISA法检测基于骆驼单域抗体骨架展示的(His)6表位的小鼠免疫效果；
图5为实施例2所述一种人抗体重链可变区(VH)的氨基酸序列；
*：双划线部分为框架区2(FR2)；
单下划线部分为CDR3区；
图6为实施例2所述展示c-myc表位的人源单域抗体骨架的氨基酸序列；
*：双划线部分为框架区2(FR2)；
加框部分为人工改变的氨基酸残基；
单下划线部分为c-myc表位序列；
图7为实施例2所述展示c-myc表位的人单域抗体骨架的基因编码序列；
*：双划线部分为限制性核酸内切酶酶切位点；
图8为实施例2所述应用ELISA法检测人源单域抗体骨架展示的c-myc表位对家兔的免疫效果。
图9为实施例3所述的一种鲨鱼的单域抗体的氨基酸序列
*：单下划线部分为CDR3区；
图10为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的氨基酸序列
*：单下划线部分为人血管内皮生长因子抗原表位序列；
图11为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的编码基因序列
*：单下划线部分为酶切位点；
图12为实施例3所述的展示人血管内皮生长因子抗原表位的鲨鱼单域抗体的免疫原性检测
图13为实施例4所述的一种小鼠抗体的氨基酸序列
*：双下划线部分为CDR3区，单下划线部分位FR2区；
图14为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的氨基酸序列
*：双下划线部分为人白蛋白抗原表位序列，斜体部分为改变后的氨基酸残基；
图15为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的编码基因序列
*：双下划线部分为酶切位点；
图16为实施例4所述的展示人白蛋白抗原表位的小鼠单域抗体的免疫原性检测。
具体实施方式
实施例1基于骆驼重链抗体的单域抗体骨架展示(His)6表位
进入PDB数据库(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)，在搜索框中输入“camel antibody”，从搜索框中的结构数据中找到一种骆驼抗体与溶菌酶复合物的结构数据(1BZQ)，从中得到一种骆驼的单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(如图1所示，其中双划线部分为CDR3区)。
将图1中所示的CDR3区的氨基酸序列替换为“HHHHHH”表位即(His)6表位，替换后的序列如SEQ ID NO：2所示(见附图2)。
然后，按照大肠杆菌密码子使用偏性将上述SEQ ID NO：2所示的序列转换为其编码基因序列(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)，同时在其上游添加BamH I酶切位点，在其下游添加终止密码子及Xho I酶切位点序列，得到全长序列如SEQ ID NO：3所示(见附图3)。此全长序列由北京英茂盛业生物科技有限公司进行全基因合成并连接到pUCE载体中，命名为pUCE-His。
将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000081
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收目的基因片段。
将pET24a载体(购自Novagen公司)同样用BamH I(Takara)和XhoI(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000082
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pET24a载体的大片段。将回收的目的基因片段和回收的pET24a表达载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：
Figure BDA0000126857480000091
将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却5分钟，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基700μl，37℃震荡培养50分钟；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜，次日挑取3～5个克隆进行测序鉴定。
与SEQ ID NO：3的序列对比，取测序正确的克隆提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，次日，挑取3～5个克隆至Kan抗性的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD600达到0.5～0.6时，加入1mmol/LIPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，电泳分析表达情况，保留表达量大的重组克隆，该克隆表达的重组蛋白即展示有(His)6表位。
由于表达的目的蛋白以包涵体形式存在，所以，工程菌破碎后，通过离心法分离包涵体。
将工程菌置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，收集沉淀即包涵体。将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/LNaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别进行洗涤，然后，4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。
将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml 8mol/L尿素(溶解于20mM Tris-HCl中)的比例将包涵体裂解。次日，将裂解液在室温下10000r/min离心15分钟，收集裂解上清。
由于表达的重组蛋白展示(His)6标签，可在变性状态下，通过Ni2+亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：
将Ni2+亲和层析柱用pH8.0的20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，之后，再用溶解于平衡缓冲液中的100-200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。
将纯化的样品，通过稀释和透析进行复性。首先，用20mmol/L Tris-HCl、8mol/L尿素(pH8.0)溶液将纯化的目的蛋白的浓度调整为400～500μg/ml，然后，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释4倍，4℃放置过12小时，然后，对20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液充分透析，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。
用纯化后的复性重组蛋白免疫Balb/c小鼠3只，免疫程序为，第一次免疫用50μg重组蛋白和等体积的福氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后采用50μg重组蛋白和福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后再用50μg重组蛋白腹腔注射一次，7天后，取血，分离血清。通过ELISA方法，用合成的(His)6多肽检测血清效价。
用包被液稀释(His)6多肽至0.5μg/ml，包被96孔酶标板，50μl/孔，4℃冰箱中包被过夜。次日，用1％的牛血清白蛋白进行封闭，37℃封闭1小时，用0.1％Tween 20的Tris盐缓冲液(TBST溶液)洗涤5次，然后加入10000倍稀释的免疫血清和相应的免疫前血清，37℃温育1小时，然后，用TBST溶液洗涤5次，之后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，37℃温育1小时，再用TBST溶液洗涤5次，之后，加入辣根过氧化物酶底物四甲基联苯胺二盐酸(TMB)避光显色10min，然后，每孔加入终止液(2mol/L硫酸)50μl/孔，终止反应，测CD450。
如附图4所示，测定结果表明，小鼠免疫血清稀释10000倍后，ELISA检测结果仍为阳性，而作为对照的免疫前血清则为阴性，这说明，用基于骆驼单域抗体骨架展示的(His)6表位表现出了较好的免疫原性。而采用合成的(His)6多肽直接免疫动物则免疫原性很弱，几乎不能诱导动物产生针对(His)6多肽的抗体，(His)6多肽必须与载体蛋白偶联后，才能用于免疫动物。
实施例2人源单域抗体骨架展示c-myc表位及其应用
从GenBank数据库和文献(J Exp Med 2011，208(1)：181-193)中获得一种人抗体重链可变区氨基酸序列，如SEQ ID NO：4所示，将此序列作为单域抗体基础序列。(如附图5所示，其中双划线部分为框架区2(FR2)；单下划线部分为CDR3区)。
将附图5中所示的单域抗体序列的FR2中的第9、第10及第12位的氨基酸，分别替换为谷氨酸(E)、精氨酸(R)和甘氨酸(G)，同时，将其CDR3区替换为c-myc表位序列，即“EQKLISEEDL”，构建得到c-myc表位展示蛋白如SEQ ID NO：5所示，(见附图6所示)。
然后，按照大肠杆菌密码子使用偏性将上述序列转换为其编码基因序列，同时在其两端添加BamH I和Xho I酶切位点得到全长序列如SEQ IDNO：6所示，(见附图7)。此全长序列由北京英茂盛业生物科技有限公司进行全基因合成并连接到pUCE载体中，命名为pUCE-Myc。
将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000111
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收目的基因片段。
同样地，将pET24a载体用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000121
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pET24a载体的大片段。
将回收的目的基因片段和回收的pET24a表达载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：
Figure BDA0000126857480000122
将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却5分钟，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基700μl，37℃震荡培养50分钟；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃温箱中培养过夜，次日挑取3～5个克隆进行测序鉴定。
与SEQ ID NO：6相对比，取序列正确的克隆提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，次日，挑取3～5个克隆至Kan抗性的的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD600达到0.5～0.6时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，电泳分析表达情况，保留表达量大的重组克隆，该克隆表达的重组蛋白即展示有c-myc表位。
由于表达的目的蛋白以包涵体形式存在，所以，工程菌破碎后，通过离心法分离包涵体。
将工程菌置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，收集沉淀即包涵体。将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/LNaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别进行洗涤，然后，4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。
将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml 8mol/L尿素(溶解于20mM Tris-HCl中)的比例将包涵体裂解。次日，将裂解液在室温下10000r/min离心15分钟，收集裂解上清。
由于表达的重组蛋白的C末端带有载体编码的(His)6标签，可在变性状态下，通过Ni2+亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：
将Ni2+亲和层析柱用pH8.0的20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样品，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，然后，再用溶解于平衡缓冲液中的100-200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。
将纯化的样品，通过稀释和透析进行复性。具体步骤为，首先，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液将纯化蛋白进行16倍稀释，使蛋白浓度维持100～150ug/ml，尿素浓度维持在0.5mol/L，在4℃冰箱中放置过24小时，然后，对20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液充分透析。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。
用复性后的纯化的重组蛋白免疫家兔2只，免疫程序为，第一次免疫用800ug重组蛋白和等体积的福氏完全佐剂充分乳化后，采用常规的背部皮内多点注射法进行初次免疫，20天后采用500ug重组蛋白和福氏不完全佐剂充分乳化后于腹部皮下进行多点注射以加强免疫，10天后，用500μg重组蛋白在同样的部位再加强免疫一次，7天后，取血，分离血清。
采用合成的c-myc多肽，通过ELISA方法测定免疫血清的抗体效价。用包被液稀释c-myc多肽至0.5μg/ml，包被96孔酶标板，经过封闭后，加入100倍稀释的免疫小鼠血清和相应的免疫前血清进行检测。二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG(1∶4000)，显色底物为TMB，测定波长450nm处的OD值。
如附图8所示，测定结果表明，两只家兔免疫血清的ELISA检测结果为强阳性，而免疫前的血清则为阴性，这表明，用基于人源单域抗体骨架展示的c-myc表位对家兔表现出了很好的免疫原性。而采用合成的c-myc表位多肽直接免疫动物则免疫原性很弱，很难产生针对c-myc表位的抗体，c-myc多肽必须与载体蛋白偶联后，才能用于免疫动物。
实施例3用基于鲨鱼类重链抗体的单域抗体骨架展示人血管内皮生长因子抗原表位
从文献(Molecular Immunology 2007；44：656-665)中查到一种鲨鱼的单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，(见图9所示，下划线部分为CDR3区)。
将图9中所示的CDR3区的氨基酸序列替换为人血管内皮生长因子(VEGF)抗原表位“YPDEIEYIFKP”表位，替换后的序列如SEQ ID NO：8所示，(见附图10，其中下划线部分为人血管内皮生长因子抗原表位)。
然后，按照大肠杆菌密码子使用偏性将上述SEQ ID NO：X所示的序列转换为其编码基因序列(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)，同时在其上游添加BamH I酶切位点，在其下游添加Xho I酶切位点序列得到全长序列如SEQID NO：9所示，(见附图11，下划线部分为酶切位点)。此全长序列由北京英茂盛业生物科技有限公司进行全基因合成并连接到pUCE载体中，命名为pUCE-VEp。
将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000141
Figure BDA0000126857480000151
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收目的基因片段。
将pET24a载体(购自Novagen公司)同样用BamH I(Takara)和XhoI(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000152
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pET24a载体的大片段。
将回收的目的基因片段和回收的pET24a表达载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：
将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30分钟，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却5分钟，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基700μl，37℃震荡培养50分钟；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜，次日挑取3～5个克隆进行测序鉴定。
将测序结果与SEQ ID NO：9的序列对比，取测序正确的克隆提取重组质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，次日，挑取3～5个克隆至Kan抗性的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD600达到0.5～0.6时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，电泳分析表达情况，保留表达量大的重组克隆，该克隆表达的重组蛋白即展示有“YPDEIEYIFKP”表位。
将工程菌置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，收集上清和沉淀，并进行15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果表明，表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在。
将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别进行洗涤，然后，4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。
将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml 8mol/L尿素(溶解于20mM Tris-HCl中)的比例将包涵体裂解。次日，将裂解液在室温下10000r/min离心15分钟，收集裂解上清。
由于表达的重组蛋白C-末端带有载体序列编码的(His)6标签，可在变性状态下，通过Ni2+亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：
将Ni2+亲和层析柱用pH8.0的20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，之后，再用溶解于平衡缓冲液中的100-200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。
将纯化的样品，通过稀释和透析进行复性。首先，用20mmol/L Tris-HCl、8mol/L尿素(pH8.0)溶液将纯化的目的蛋白的浓度调整为400～500μg/ml，然后，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释4倍，4℃放置过12小时，然后，对20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液充分透析，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。
用纯化后的复性重组蛋白免疫Balb/c小鼠4只，免疫程序为，第一次免疫用50μg重组蛋白和等体积的福氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后采用50μg重组蛋白和福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后再用50μg重组蛋白腹腔注射一次，7天后，取血，分离血清。通过ELISA方法检测血清抗体效价。
用包被液稀释人VEGF至0.2μg/ml，包被96孔酶标板，经过封闭后，加入1∶10000稀释的各免疫小鼠血清进行检测。二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶4000)，显色底物为TMB，测定波长450nm处的OD值。
如附图12所示，测定结果表明，小鼠免疫血清稀释10000倍后，ELISA检测结果仍为阳性，而作为对照的免疫前血清则为阴性，这说明，基于鲨鱼单域抗体骨架展示的人VEGF抗原表位在小鼠中表现出了良好的免疫原性，此蛋白可作为一种人VEGF表位疫苗，用于清除肿瘤患者体内的VEGF，抑制肿瘤新生血管的形成，减缓肿瘤的生长和转移。
实施例4用构建自小鼠抗体的单域抗体骨架展示人白蛋白抗原表位
从GenBank中找到一种小鼠抗体可变区序列(GenBank：AAA51164.1如SEQ ID NO：10所示，(如图13，其中单下划线部分为FR2区，双下划线部分为CDR3区)。
将附图13中序列中的FR2的第9、10和12位氨基酸(斜体部分所示)分别替换成谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，用人白蛋白的抗原表位序列“ATLRETYGE”置换CDR3区的“DYYDYDGYY”序列，形成一种新蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，(见如图14，其中斜体部分为FR2改造后的氨基酸残基，双划线部分为人白蛋白表位序列)。
按照大肠杆菌密码子使用偏性(http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html)将上述序列转换为其编码基因序列，同时在其两端添加BamH I和Xho I酶切位点得到全长序列如如SEQ ID NO：12所示见附图15)。此全长序列由北京英茂盛业生物科技有限公司进行全基因合成，并连接到pUCE载体中，命名为pUCE-HSAEp。
将合成后的全长序列用BamH I(Takara)和Xho I(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000181
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收目的基因片段。
将pET24a载体(购自Novagen公司)同样用BamH I(Takara)和XhoI(Takara)进行双酶切，酶切体系为：
Figure BDA0000126857480000182
37℃条件下，酶切6小时。然后，通过电泳回收pET24a载体的大片段。
将回收的目的基因片段和回收的pET24a表达载体大片段在16℃水浴连接过夜，体系如下：
Figure BDA0000126857480000183
将10μl连接产物加到100μl新鲜制备的感受态大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟，然后，将离心管放入42℃水浴中，热激90s后，快速将离心管转移到冰浴中，使之冷却5分钟，之后，向每管加入无抗生素的LB培养基700μl，37℃震荡培养50分钟；之后，将菌液涂布到含有Kan抗性的LB琼脂平皿上，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜，次日挑取3～5个克隆进行测序鉴定。
与SEQ ID NO：12的序列进行对比，取测序正确的克隆诱导表达。
取序列正确的克隆接种到Kan抗性的LB培养基中培养，37℃振荡培养到OD600达到0.5～0.6时，加入1mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导表达4小时后，收集菌体，进行电泳。
由于表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在，所以，工程菌破碎后，通过离心法分离包涵体。
将工程菌置于冰浴中超声处理，条件为电流350mA，脉冲5秒间隔4秒，共超声30分钟，然后将超声后的菌体于12000r/min，4℃离心15分钟，收集沉淀即包涵体。
将包涵体分别用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mol/L NaCl、1mmol/L EDTA、0.1％Triton X-100、2mol/L尿素分别洗涤30min，然后，4℃条件下12000r/min、离心15分钟，收集沉淀即包涵体。
将洗涤好的包涵体称重，按每克包涵体加入20ml 8mol/L尿素(溶解于20mM Tris-HCl中)的比例将包涵体裂解。次日，将裂解液在室温下10000r/min离心15分钟，收集裂解上清。
由于表达的重组蛋白带有载体编码的(His)6标签，可在变性状态下，通过Ni2+亲和层析柱进行纯化，具体纯化步骤为：
将Ni2+亲和层析柱用pH8.0的20mM Tris-HCl、8mol/L尿素溶液(平衡缓冲液)平衡后，将包涵体裂解上清上样，上样完毕用平衡缓冲液洗去不结合的杂蛋白，然后，用溶解于平衡缓冲液中的10mmol/L咪唑进行充分洗脱，之后，再用溶解于平衡缓冲液中的100-200mmol/L咪唑洗脱目的蛋白。
将纯化的样品，通过稀释和透析进行复性。首先，用20mmol/L Tris-HCl、8mol/L尿素(pH8.0)溶液将纯化的目的蛋白的浓度调整为400～500μg/ml，然后，用20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液稀释4倍，4℃放置过12小时，然后，对20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液充分透析，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白质浓度。
用纯化后的复性重组蛋白免疫Balb/c小鼠3只，免疫程序为，第一次免疫用50μg重组蛋白和等体积的福氏完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后采用50μg重组蛋白和福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射，两周后再用50μg重组蛋白腹腔注射一次，7天后，取血，分离血清。
通过ELISA方法检测血清效价。
用包被液稀释人白蛋白至2μg/ml，包被96孔酶标板，用5％的脱脂奶粉进行封闭后，加入1∶10000稀释的各免疫小鼠血清进行检测。二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶4000)，显色底物为TMB，测定波长450nm处的OD值。
如附图16所示，测定结果表明，小鼠免疫血清稀释10000倍后，ELISA检测结果仍为阳性，而作为对照的免疫前血清则为阴性，这说明，基于小鼠单域抗体骨架展示的人白蛋白表位在小鼠中表现出了较好的免疫原性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Figure IDA0000126857540000011
Figure IDA0000126857540000021
Figure IDA0000126857540000041
Figure IDA0000126857540000051
Figure IDA0000126857540000061

Claims (13)

1.一种基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：以单域抗体为分子骨架，利用单域抗体的CDR3区为外源目标抗原表位展示部位。
2.根据权利要求1所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体的CDR3区被外源目标抗原表位序列替换。
3.根据权利要求1或2所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体构建自重链抗体的重链可变区。
4.根据权利要求3所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体构建自骆驼类或鲨鱼类重链抗体的重链可变区。
5.根据权利要求4所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7所示的单域抗体骨架序列。
6.根据权利要求1或2所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体构建自含轻链和重链的常规抗体的重链可变区。
7.根据权利要求6所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体构建自人或鼠抗体的重链可变区。
8.根据权利要求7所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述单域抗体包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的单域抗体骨架序列。
9.根据权利要求1-8任一所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述外源抗原表位为肽类表位。
10.根据权利要求9所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于：所述外源抗原表位为包含“HHHHHH”或“EQKLISEEDL”或“YPDEIEYIFKP”或“ATLRETYGE”氨基酸序列的肽类表位。
11.根据权利要求3-5任一所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；
(2)用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒；
(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。
12.根据权利要求6-8任一所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2(FR2)和CDR3区的序列；
(2)将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸，并用外源抗原表位氨基酸序列替换单域抗体的CDR3区氨基酸序列，将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将其克隆到表达载体中，得到重组质粒；
(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有外源抗原表位。
13.根据权利要求1-12任一所述的基于单域抗体的抗原表位展示方法得到的包含有外源抗原表位的蛋白。
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