CN102947705A - 通过确定焦谷氨酸修饰的mcp-1诊断炎性疾病的方法和谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用生物学样品中的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1(MCP-1N1pE)∶MCP-1总浓度的比率作为生物标记监测炎性疾病或炎性相关疾病的治疗的方法，进一步涉及确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的新方法。本发明还提供了诊断试剂盒和筛选谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂或测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂效力的方法。
Description
发明领域
本发明涉及使用生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1(MCP-1N1pE):MCP-1总浓度的比率作为生物标记监测炎性疾病或炎性相关疾病的治疗的方法，进一步涉及确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相关于MCP-1总浓度的比例的新方法。本发明还提供了用于筛选谷氨酰胺酰基环化酶（glutaminyl cyclase）(QC)抑制剂或者测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的效力的诊断试剂盒及方法。
发明背景
趋化性细胞因子（趋化因子）是吸引和激活白细胞的蛋白质并且被认为在炎症中起重要作用。趋化因子通过N-末端半胱氨酸残基的表观被分为4个家族(C-、CC-、CXC-和CX3C-趋化因子)。CC-趋化因子(又名β-趋化因子)优先吸引单核细胞至炎症部位。单核细胞浸润被认为是一些疾病病症中的关键事件(Gerard,C.and Rollins,B.J.(2001)Nat.Immunol 2,108-115;Bhatia,M.,et al.,(2005)Pancreatology.5,132-144;Kitamoto,S.,Egashira,K.,and Takeshita,A.(2003)J Pharmacol Sci.91,192-196)。
MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1，CCL2)是趋化因子CC家族成员。在这个家族中，距氨基末端最近的2个半胱氨酸彼此相邻（因此称作C-C蛋白）。与许多其它CC趋化因子一样，MCP-1基因位于人类17号染色体上。结合MCP-1的细胞表面受体是CCR2和CCR5。
已发现4种不同的人类MCP：MCP-1(CCL2)、MCP-2(CCL8)、MCP-3(CCL7)和MCP-4(CCL13)。MCP被认为是CC趋化因子的亚家族。所有MCP均展示优先吸引单核细胞但是在它们的表达水平及趋化潜力中显示差异(Luini,W.,et al.,(1994)Cytokine 6,28-31;Uguccioni,M.,et al.,(1995)EurJ Immunol 25,64-68)Berkhout,et al.,(1997)JBC。
以下示出人类MCP-1的氨基酸序列：
人类MCP-1(CCL2)(UniProtKB/Swiss-Prot P13500)
蛋白质(信号序列黑体:23aa;成熟MCP-1:76aa)
SEQ ID NO:1
MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT
与其是趋化因子β家族成员一致，MCP-1已示出在体外以亚纳摩尔浓度化学吸引及激活单核细胞。升高的MCP-1表达已在各种涉及单核细胞积累和激活的病理学病症中检测到，包括一些炎性和非炎性疾病状态，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、哮喘、肥胖和迟发型超敏反应。
一些研究已经特别揭示MCP-1在如下疾病发展中的关键作用：动脉粥样硬化(Gu,L.,et al.,(1998)Mol.Cell 2,275-281;Gosling,J.,et al.,(1999)JClin.Invest 103,773-778);类风湿性关节炎(Gong,J.H.,et al.,(1997)J Exp.Med 186,131-137;Ogata,H.,et al.,(1997)J Pathol.182,106-114);胰腺炎(Bhatia,M.,et al.,(2005)Am.J Physiol Gastrointest.Liver Physiol 288,G1259-G1265);阿尔茨海默病(Yamamoto,M.,et al.,(2005)Am.J Pathol.166,1475-1485);肺纤维化(Inoshima,I.,et al.,(2004)Am.J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 286,L1038-L1044);肾纤维化(Wada,T.,et al.,(2004)J Am.Soc.Nephrol.15,940-948)以及移植物排斥(Saiura,A.,et al.,(2004)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24,1886-1890)。另外，MCP-1可能也在妊娠中毒中起作用(Katabuchi,H.,et al.,(2003)Med Electron Microsc.36,253-262)，有助于与高胰岛素血症和肥胖相关的病理，包括II型糖尿病(Sartipy，P.and Loskutoff，P.J.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100,7265-70)，作为肿瘤发展(Ohta,M.,et al.,(2003)Int.J Oncol.22,773-778;Li,S.,et al.,(2005)J Exp.Med 202,617-624)、神经性疼痛(White,F.A.,et al.,(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A102,14092-7,Jung et al.J Neurochem.104,254-63)和艾滋病(Park,I.W.,Wang,J.F.,and Groopman,J.E.(2001)Blood 97,352-358;Coll,B.,et al.,(2006)Cytokine 34,51-55)中的旁分泌因子。
MCP-1的成熟形式由谷氨酰胺酰基环化酶(QC)翻译后修饰以具有N-末端焦谷氨酰(pGlu)残基(Proost,P.et al.(1996)J Leukocyte Biol.59,67-74)。
谷氨酰胺酰基环化酶(QC,EC 2.3.2.5)催化N-末端谷氨酰胺酰残基的分子内环化成为焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu，pE)，释放氨，以及催化N-末端谷氨酰残基的分子内环化成为焦谷氨酸，释放水(Fischer,W.H.andSpiess,J.(1987).Proc Natl Acad Sci U S A 84:3628-32,Golololov，M.Y.,et al.(1994)Arch.Biochem.Biophys.309,300-7)。
N-末端pGlu修饰使得蛋白质抗氨基肽酶的N-末端降解，这非常重要，因为MCP-1的趋化能力由其N-末端介导(Van Damme,J.,et al.,(1999)ChemImmunol 72,42-56)。MCP-1 N-末端（残基1-9）的人工延伸或降解导致功能的急剧降低或丧失，尽管MCP-1仍然与其受体（CCR2）结合(Proost,P.,etal.,(1998),J Immunol 160,4034-4041;Zhang,Y.J.,et al.,1994,J Biol.Chem269,15918-15924;Masure,S.,et al.,1995,J Interferon Cytokine Res.15,955-963;Hemmerich,S.,et al.,(1999)Biochemistry 38,13013-13025,Gongand Clark-Lewis(1995)J.Exp.Med.181,631-40)。
由于MCP-1在一些疾病病症中的显著作用，抗MCP-1策略的开发和应用需要强有力工具，以用于诊断、预后和靶调节生物标记用途。
如上所述，引人注目的证据指向MCP-1在阿尔茨海默病（AD）中的作用(Xia,M.Q.and Hyman,B.T.(1999)J Neurovirol.5,32-41)。MCP-1在衰老斑和在反应性小神经胶质、CNS的定居巨噬细胞中的存在已经在患有AD的患者脑中观测到(Ishizuka,K.,et al.,(1997)Psychiatry Clin.Neurosci.51,135-138.Stimulation of monocytes and microglia with Amyloid-βprotein(Aβ)induces chemokine secretion in vitro(Meda,L.,et al.,(1996)J Immunol 157,1213-1218;Szczepanik,A.M.,et al.,(2001)J Neuroimmunol.113,49-62)并且Aβ(1-42)脑室内浸润到小鼠海马中显著增加体内MCP-1。另外，Aβ沉积吸引和激活小神经胶质细胞并且使它们产生炎性介质如MCP-1，MCP-1接着导致反馈以诱导进一步的趋化、激活和组织损伤。在Aβ沉积部位，激活的小神经胶质也吞噬Aβ肽，导致放大的激活(Rogers,J.and Lue,L.F.(2001)Neurochem.Int.39,333-340)。
在AD的3xTg小鼠模型中检查趋化因子表达揭示了神经元炎症在斑形成之前，以及MCP-1被上调11倍。另外，MCP-1的上调似乎与第一个细胞内Aβ沉积的发生相关(Janelsins,M.C.,et al.,(2005)J Neuroinflammation.2,23)。AD的Tg2575小鼠模型与过表达MCP-1的小鼠模型的杂交育种显示与单转基因Tg2576同窝出生仔畜相比，示出在Aβ沉积周围的增加的小神经胶质积累，并且这个积累伴有增加量的扩散斑(Yamamoto,M.,et al.(2005)Am.J Pathol.166,1475-1485)。
MCP-1水平在AD患者及显示轻度认知损害（MCI）患者的CSF中增加(Galimberti,D.,et al.,(2006)Arch.Neurol.63,538-543)。另外，MCP-1显示在具有MCI和早期AD的患者血清中水平增加(Clerici,F.,et al.,(2006)Neurobiol.Aging 27,1763-1768)。
粥样硬化病变限制或阻碍冠状动脉血流，是缺血性心脏病相关死亡率的主要原因，导致每年500,000-600,000例死亡。在1996年在美国有超过550,000个患者及在世界范围内有超过945,000个患者进行了经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）以打开阻塞的动脉(Lemaitre et al.,1996)。这项技术的一个主要限制是PTCA后血管闭塞问题，在PTCA后立即发生（急性闭塞）和长期（再狭窄）：30%的具有次全部损害（subtotal lesions）的患者和50%的具有慢性全部损害的患者在成形术后会发生再狭窄。另外，再狭窄是经历隐静脉旁路移植术的患者中的显著问题。急性闭塞的机理似乎涉及若干因素并且可能来自血管回弹（vascular recoil），导致动脉闭塞和/或血小板沿新打开的血管的损伤长度沉积，随后形成纤维蛋白/红细胞血栓。
血管成形术后再狭窄是一种更逐渐的过程并且涉及亚临界血栓的初始形成，伴有从粘附的血小板释放细胞衍生生长因子，随后内膜平滑肌细胞增殖及炎性细胞局部浸润，促使血管增生。重要的是注意到血栓、细胞增殖、细胞迁移和炎症之中的多个过程每个均看起来促使所述再狭窄过程。
在美国，30-50%再狭窄率意味着120,000-200,000个美国患者处于再狭窄风险中。如果仅80%的这些患者选择重复血管成形术（剩余20%选择冠状动脉旁路移植术），这增加了剩余20%的冠状动脉旁路移植术的费用，再狭窄的总费用很容易达到几十亿美元。因此，成功预防再狭窄不仅可以带来显著治疗益处而且显著节约卫生保健成本。
尽管不清楚升高的MCP-1表达是否是上述疾病的原因或结果，但是在一些动物模型中获得了应用MCP-1中和抗体或MCP-1受体（CCR2）拮抗剂的治疗益处。
在这种情况中，重要的是注意到缺失N-末端区域的氨基酸1-8完全消除了MCP-1激动剂受体活性，清楚表明氨基末端区域对于受体激活是关键的(Gong,J.-H.and Clark-Lewis,I.(1995)J Exp.Med.161 631-40,Van Damme,J.,et al.,(1999)Chem Immunol72,42-56)。
另外，直至残基9的任何N-末端MCP-1截短均产生具有MCP-1受体拮抗活性的分子。
所有现有监测MCP-1水平的测定不能区分N1pE MCP-1、N1Q MCP-1和相继N-末端截短的分子。因此它们不反映由全长MCP-1对合适受体（CCL2、CCL5）的实际激动剂刺激程度与拮抗性有效的N-末端截短的或完全失活的MCP-1分子的水平的关系。
在体液内，仅可检测到全长MCP-1的N-末端焦谷氨酰修饰的种类。原因是N-末端未修饰分子被定居遍在的氨基肽酶二肽基氨基肽酶4(DP4、DPP4、DPPIV、CD26)和氨基肽酶P(APP、X-脯氨酰氨基肽酶)快速N-末端降解，分别释放N-末端二肽Gln-Pro或者氨基酸谷氨酰胺。
因此其结论是，建立展示活性CCR2受体激动性MCP-1分子的真实水平的测定提供了益处，能改善诊断应用，监测治疗方法及开发与可能涉及MCP-1的疾病或者干扰有关的QC抑制剂。
谷氨酰胺酰基环化酶(QC,EC 2.3.2.5)催化N-末端谷氨酰胺残基的分子内环化成为焦谷氨酸(pyroglutamate，pGlu，pE)，释放氨。QC首先由Messer在1963年从热带植物番木瓜（Carica papaya）的胶乳中分离(Messer,M.1963Nature 4874,1299)。24年后，相应的酶活性在动物脑垂体中发现(Busby，W.H.J.et al.1987 J Biol Chem 262,8532-8536;Fischer,W.H.and Spiess,J.1987Proc Natl Acad Sci U S A 84,3628-3632)。对于哺乳动物QC，由QC将Gln转化为pGlu可以在TRH和GnRH前体中示出(Busby，W.H.J.et al.1987 JBiol Chem 262,8532-8536;Fischer,W.H.and Spiess,J.1987 Proc Natl AcadSci USA 84,3628-3632)。另外，QC的初始定位实验揭示与其在牛脑垂体中的推测的催化产物的共定位，进一步改善在肽激素合成中的推测功能(Bockers,T.M.et al.1995 J Neuroendocrinol 7,445-453)。相反。植物QC的生理学功能不太清楚。在来自番木瓜的酶的情况中，推测了在抗病原微生物的植物防御中的作用(El Moussaoui,A.et al.2001 Cell Mol Life Sci 58,556-570)。来自其它植物的推测的QC最近通过序列比较而鉴别(Dahl,S.W.et al.2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。但是这些酶的生理学功能尚不明确。
植物和动物中已知的QC显示显示出对底物的N-末端位置的L-谷氨酰胺的严格特异性并且发现它们的动力学行为遵守Michaelis-Menten方程(Pohl,T.et al.1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88,10059-10063;Consalvo,A.P.et al.1988 Anal Biochem 175,131-138;Gololobov，M.Y.et al.1996 Biol ChemHoppe Seyler 377,395-398)。但是，将来自番木瓜的QC和来自哺乳动物的高度保守的QC的一级结构相比并不揭示任何序列同源性(Dahl,S.W.et al.2000 Protein Expr Purif 20,27-36)。尽管植物QC似乎属于新的酶家族(Dahl,S.W.et al.2000 Protein Expr Purif 20,27-36)，但是发现哺乳动物QC与细菌氨基肽酶具有显著序列同源性(Bateman,R.C.et al.2001 Biochemistry 40,11246-11250)，导致来自植物和动物的QC具有不同的进化起源的结论。
最近，已示出重组人类QC以及来自脑提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰基及谷氨酸环化。最惊人的发现是环化酶催化的Glu1-转化在大约pH6.0是有利的，而Gln1-转化为pGlu衍生物发生在大约8.0的pH最佳值。因为pGlu-Aβ-相关肽的形成可以通过重组人类QC和来自猪脑垂体提取物的QC活性的抑制而抑制，酶QC是用于治疗阿尔茨海默病的药物开发中的靶。
QC的抑制剂也可以用作QC同工酶的抑制剂，它们在WO2004/098625、WO 2004/098591、WO 2005/039548和WO 2005/075436中描述，这些文献全文援引加入本文，特别是关于抑制剂的结构、它们的用途及它们的生产。用于检测和定量N-末端焦谷氨酸修饰的趋化因子的MCP-1N1pE特异性抗体在国际专利申请PCT/EP2009/060757中描述。
本发明人现在发现测量样品中与MCP-1总浓度相关的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的比例提供了一种有效方法，用于诊断或监测炎性疾病或者炎性相关疾病。
发明概述
根据本发明的第一个方面，提供了诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病的方法，其包括确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
根据本发明的第二个方面，提供了确定谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂在生物学样品内以及作为应用QC抑制剂的治疗中谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制的替代标记（surrogate marker）的效力的方法。
根据本发明的第三个方面，提供了确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的方法，其包括下述步骤：
(a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的第一浓度(ca)；
(b)确定所述生物学样品中总MCP-1的第二浓度(cd)；和
(c)确定ca/cd的比率，其中第一浓度(ca)值除以第二浓度(cd)值。
附图简述
图1：来自不同物种的成熟MCP-1(CCL2)蛋白的序列对比。序列对比是用http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html提供的CLUSTAL W(1.83)多序列对比算法进行。这些序列是：人类：人类MCP-1 SEQ ID NO:1，chimp：黑猩猩MCP-1 SEQ ID NO:2，oran：苏门答腊猩猩（Sumatranorang-utan）MCP-1 SEQ ID NO:3，macac：Macaca fascicularis(食蟹猴)MCP-1 SEQ ID NO:4，犬：Canis familiaris MCP-1 SEQ ID NO:5，猪：Susscrofa MCP-1，SEQ ID NO:6，牛：Bos taurus MCP-1，SEQ ID NO:7，马：Equus caballus MCP-1，SEQ ID NO:8，小鼠：Mus musculus MCP-1，SEQ IDNO:9，大鼠：Rattus norvegicus MCP-1，SEQ ID NO:10。
图2：四种人类MCP的对比。序列对比用http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html提供的CLUSTAL W(1.83)多序列对比算法进行。这些序列是：MCP-1:人类MCP-1(CCL2,SCYA2,MCAF,SMC-CF,GDCF-2,HC11 SEQ ID NO:1，MCP-2:人类MCP-2(CCL8,SCYA8,HC14)，SEQ IDNO:11；MCP-3:人类MCP-3(CCL7,SCYA7,NC28,FIC,MARC)，SEQ IDNO:12；MCP-4:人类MCP-4(CCL13,SCYA13,NCC-1,CKb10)，SEQ ID NO:13。黑体N-末端残基表示信号序列，其在成熟趋化因子中被去除。箭头标记由谷氨酰胺酰基环化酶催化形成焦谷氨酰衍生物的新生N-末端谷氨酰胺残基。
图3：显示携带N-末端谷氨酰胺酰残基的MCP-1(1-76)与重组人类DP4保温24小时。DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图4：显示携带N-末端焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基的MCP-1(1-76)与重组人类DP4保温24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-1在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。裂解在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图5：示出携带N-末端谷氨酰胺酰残基的人类MCP-1(1-76)被重组人类氨基肽酶P裂解24小时。APP裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图6：示出携带N-末端焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基的人类MCP-1(1-76)被重组人类氨基肽酶P裂解24小时。N-末端焦谷氨酸形成通过在测定前将MCP-1与重组人类QC保温3小时实现。APP裂解在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图7：示出携带N-末端谷氨酰胺酰残基（A）或者焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基（B）的人类MCP-1(1-76)在人类血清中分别降解7和24小时。为了将N-末端谷氨酰胺残基环化成焦谷氨酸，MCP-1在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。另外，Gln1-MCP-1在人类血清中在9.6μM DP4抑制剂异亮氨酰-Thiazolidide(P32/98)存在下保温24小时(C)。对于Gln1-MCP-1，裂解产物在0分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时和7小时后分析，对于pGlu1-MCP-1，裂解产物在0分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、7小时和24小时后分析，对于Gln1-MCP-1与异亮氨酰-Thiazolidide组合，裂解产物在0分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、7小时和24小时后分析，分析使用Maldi-TOF质谱进行。
图8：示出携带N-末端谷氨酰胺酰（A）或焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基（B）的人类MCP-2(1-76)由重组人类DP4降解24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-2在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图9：示出携带N-末端谷氨酰胺酰（A）或焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基（B）的人类MCP-3(1-76)由重组人类DP4降解24小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-3在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图10：示出携带N-末端谷氨酰胺酰（A）或焦谷氨酰（5-氧代-L-脯氨酰）残基（B）的人类MCP-4(1-75)由重组人类DP4裂解4小时。为了将N-末端谷氨酰胺环化成焦谷氨酸，MCP-4在测定开始之前与重组人类QC保温3小时。DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时后用Maldi-TOF质谱分析。
图11：示出起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-1(Gln1-MCP-1)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-1(pGlu1-MCP-1)对人类THP-1单核细胞的趋化能力(A)，起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-2(Gln1-MCP-2)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-2(pGlu1-MCP-2)对人类THP-1单核细胞的趋化能力(B)，起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-3(Gln1-MCP-3)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-3(pGlu1-MCP-3)对人类THP-1单核细胞的趋化能力(C)，以及起自N-末端谷氨酰胺的人类N-末端MCP-4(Gln1-MCP-4)相比于具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-4(pGlu1-MCP-4)对人类THP-1单核细胞的趋化能力(D)。
图12：显示人类MCP-1对人类THP-1单核细胞的趋化能力的分析，其是与人类重组DP4在存在(Gln1-MCP-1+QC+DP4)和不存在(Gln1-MCP-1+DP4)QC介导的pGlu形成的情况下保温。另外，示出了QC抑制剂-1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)硫脲盐酸盐(QCI)(10μM)对N-末端pGlu残基形成的影响，及随后的DP4裂解(Gln1-MCP-1+QC+QCI+DP4)。
图13：显示起自N-末端谷氨酰胺的全长人类MCP-1(A)、MCP-3(B)、MCP-2(C)和MCP-4(D)相比于它们各自DP4裂解产物对人类THP-1单核细胞的趋化能力。
图14：用于基于在450nm/540nm测量的吸收值确定A：总hMCP-1和B：hMCP-1 N1pE浓度的标准曲线。对于两个标准曲线，使用在大肠杆菌中产生的重组hMCP-1 N1pE。标准曲线是通过4-Parameter-Logistic-Fit:y=(A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)从测量的吸收数据计算的。
图15：在总hMCP-1夹心ELISA中hMCP-1N1pE和hMCP-1的检测比较。
图16：在用OSM和IL1β刺激后由NHDF对总hMCP-1和hMCP-1N1pE的时间依赖性表达。
图17：在用OSM+IL1β刺激及施加QCI后由NHDF对A：总hMCP-1和B：hMCP-1N1pE的时间依赖性表达。C：hMCP-1N1pE/hMCP-1的比率。
图18：A：在用TNFα+IL1β刺激及施加不同QCI浓度后由A549细胞表达的总hMCP-1和hMCP-1N1pE。B：hMCP-1N1pE/hMCP-1的比率。
图19：用于确定小鼠MCP-1的标准曲线；基于在450nm/540nm测量的吸收值的A：总mMCP1浓度和B：mMCP-1N1pE浓度。对于两个标准曲线，使用在大肠杆菌中产生的重组小鼠MCP-1N1pE。标准曲线是通过4-Parameter-Logistic-Fit:y=(A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)从测量的吸收数据计算的。
图20：在总mMCP-1夹心ELISA中mMCP-1N1pE和mMCP-1的检测比较。
图21：A：在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI浓度后由RAW 264.7细胞表达的总mMCP-1和mMCP-1N1pE。B：mMCP-1N1pE/mMCP-1的比率。
图22：在用10ng/ml LPS刺激及施加不同QCI后在RAW 264.7细胞的细胞培养上清中如下的Western印迹信号：A：mMCP-1N1pE和B：总mMCP-1。C：由ELISA确定的mMCP-1N1pE浓度。
图23：A：在用硫代乙醇酸盐刺激和施加不同QCI浓度后在小鼠腹腔灌洗液中总mMCP-1和mMCP-1N1pE的量。B：FACS分析：在用抗7/4和Ly6G抗体在腹腔灌洗液中进行双重单核细胞染色后的荧光事件。
图24：用于确定小鼠MCP-1N1pE的标准曲线；A：由MCP-1N1pE抗体克隆348/2C9对mMCP-1N1pE的检测，B：由生物素化MCP-1N1pE抗体克隆348/2C9对mMCP-1N1pE的检测。对于两个标准曲线，使用在大肠杆菌中产生的重组小鼠MCP-1N1pE。标准曲线是通过4-Parameter-Logistic-Fit:y=(A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)从测量的吸收数据计算的。
图25：等温滴定量热法测定针对抗原hMCP-1(1-38)的抗MCP-1N1pE抗体(A：MCP-1 N1pE抗体348/2C9及B：生物素化MCP-1N1pE抗体348/2C9)。
图26：经ELISA测量来自10个健康志愿者的CSF和血清样品中人类MCP-1和人类MCP-1N1pE。
序列表简述
表1：序列表
| 序列号 | 描述 |
| 1 | 人类MCP-1 |
| 2 | Pan troglodytes(黑猩猩)MCP-1 |
| 3 | Pongo abelii(苏门答腊猩猩)MCP-1 |
| 4 | 成束猴（Macaca fascicularis）(食蟹猴)MCP-1 |
| 5 | 家犬（Canis familiaris）MCP-1 |
| 6 | 猪（Sus scrofa）MCP-1 |
| 7 | 欧洲牛（Bos taurus）MCP-1 |
| 8 | 马（Equus caballus）MCP-1 |
| 9 | 小家鼠（Mus musculus）MCP-1 |
| 10 | 褐家鼠（Rattus norvegicus）MCP-1 |
| 11 | 人类MCP-2 |
| 12 | 人类MCP-3 |
| 13 | 人类MCP-4 |
定义
“检测抗体”在本发明中包括结合MCP-1或者N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1肽的那些抗体。
合适地检测抗体高亲和性结合MCP-1或者N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1肽。在本发明中，高亲和性意味着具有KD值为10-7M或更好的亲和性，如KD值为10-8M或更好，或者甚至更特别是KD值为10-9M至10-12M。
术语“抗体”以最广义使用，特别包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两个完整抗体形成的多特异性抗体（例如双特异性抗体）以及抗体片段，只要它们展现希望的生物学活性。抗体可以是例如IgM、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgD、IgA或者IgE。但是合适地，抗体不是IgM抗体。“希望的生物学活性”是结合MCP-1或者N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1肽。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段：双抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自基本上同质抗体群的抗体，即包含所述抗体群的各个抗体除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。另外，与典型包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的“多克隆抗体”制备物不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体还可以经常是有利的，在于它们通过杂交瘤培养合成，不被其他免疫球蛋白污染。“单克隆”表示得自基本上同质抗体群的抗体性质，不应被理解为要求抗体通过任何特定方法产生。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过首先由
et al.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过通常熟知的重组DNA方法制备。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术分离自噬菌体抗体文库。
本文的单克隆抗体特别包括嵌合抗体（免疫球蛋白），其中重链和/或轻链的一部分与衍生自一特定物种的或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种的或者属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或者同源，以及包括这种抗体的片段，只要它们展示希望的生物学活性。
非人（例如小鼠）抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段（如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列），其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数部分，人源化抗体是人类免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的互补决定区（CDR）的残基被来自非人物种如小鼠、大鼠或兔的具有希望的特异性、亲和性和能力的CDR（供体抗体）置换。在一些情况中，人类免疫球蛋白的Fv框架区（FR）残基被相应的非人类残基置换。另外，人源化抗体可以包含在受体抗体或输入的CDR或框架序列中均未发现的残基。
这些修饰进一步微调和优化抗体性能。通常，人源化抗体包含基本上全部的至少一个、典型两个可变区，其中全部或者基本上全部的CDR区域相应于非人类免疫球蛋白的那些，以及全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳还包含免疫球蛋白恒定区（Fc）、典型人类免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。对于进一步细节，见Jones et al.,Nature,321:522-525(1986),Reichmann et al,Nature.332:323-329(1988):和Presta,Curr.Op.Struct.Biel.,2:593-596(1992)。人源化抗体包括PrimatizedTM抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过用感兴趣的抗原免疫猕猴产生的抗体或者“骆驼源化（camelized）”抗体。
“单链Fv”或者"sFv"抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽进一步包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其能使sFv形成希望的结构用于抗原结合。sFv综述见ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语"双抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含重链可变结构域(VH)连接轻链可变结构域(VD)于同一多肽链上(VH–VD)。通过使用接头，该接头太短而不能使相同链上的两个结构域之间配对，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点。双抗体更充分描述于Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sol.USA,90:6444-6448(1993)。
“分离的”抗体是已从其天然环境组分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染物成分是会干扰抗体诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在合适的实施方案中，抗体被纯化(1)至大于95%（重量）抗体，如由Lowry方法确定，最特别大于99%（重量），(2)至足以通过转杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或者(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下用考马斯蓝或合适地银染至均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分不存在。但是普遍地，分离的抗体通过至少一个纯化步骤制备。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，所有这些名称包括后代。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代对象细胞和其衍生的培养物，而不考虑转移次数。还理解所有后代可能在DNA含量上不精确相同，由于故意或非故意突变所致。在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变体后代包括在本发明内。当想要清楚名称时，这可以从上下文清楚。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是可互换的，是指由肽键连接的氨基酸组成的生物分子。
两个序列之间的“同源性”通过序列相同性确定。如果被比较的两个序列在长度上彼此不同，序列相同性优选涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分比。序列相同性可以常规用计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science DriveMadison,WI 53711)确定。Bestfit使用Smith and Waterman,Advances inApplied Mathematics 2(1981),482-489的局部同源性算法，以发现两个序列之间具有最高序列相同性的节段。当使用Bestfit或另一种序列对比程序确定一特定序列是否与本发明参考序列具有例如95%相同性时，优选调整参数以便相同性百分比在参考序列的整个长度上计算，直至参考序列核苷酸总数的5%的同源性缺口是允许的。当使用Bestfit时，所谓的任选参数优选留在它们的预设（“默认”）值。给定序列与本发明上述序列之间的比较中出现的偏差可能由例如添加、缺失、取代、插入或重组导致。这种序列比较也可以优选用"fasta20u66"程序(version 2.0u66,September 1998 by WilliamR.Pearson and the University of Virginia;也见W.R.Pearson(1990),Methodsin Enzymology 183,63-98,appended examples和http://workbench.sdsc.edu/)进行。为此，可以使用“默认”参数设定。
如本文所用，“保守变化”是指基本上构象或抗原性中性的改变，与天然蛋白质相比，其分别在突变多肽的三级结构上产生的变化最小，或者其在突变多肽的抗原决定簇中产生的变化最小。当指本发明的抗体及抗体片段时，保守变化是指不使抗体不能结合对象受体的氨基酸取代。本领域技术人员能够预测可以进行哪些氨基酸取代同时维持高概率的构象和抗原性中性。这种指南在例如Berzofsky，(1985)Science 229:932-940和Bowie et al.(1990)Science 247:1306-1310中提供。影响维持构象和抗原性中性的要考虑的因素包括但不限于(a)疏水氨基酸的取代不太可能影响抗原性，因为疏水残基更可能位于蛋白质的内部；(b)物理化学相似的氨基酸的取代不太可能影响构象，因为取代的氨基酸结构上模拟天然氨基酸；及(c)进化保守的序列的改变可能负面影响构象，因为这种保守性提示氨基酸序列可能具有功能重要性。本领域技术人员能用公知测定以及通过使用构象依赖性单克隆抗体的结合研究(参见例如Lewis et al.(1983)Biochem.22:948-954)评估蛋白质构象中的改变，所述公知测定例如但不限于微量补体结合法(参见例如Wasserman et al.(1961)J.Immunol.87:290-295;Levine et al.(1967)Meth.Enzymol.11:928-936)。
如本文所用，术语“一个”和“所述”是指“一或多个”并且包括复数，除非上下文不合适。
炎性疾病
如本文所用，术语“炎性疾病”及“炎性相关疾病”包括：
(a)神经变性疾病，例如轻度认知损害（MCI），阿尔茨海默病，唐氏综合症中的神经变性，家族性英国痴呆，家族性丹麦痴呆，多发性硬化；
(b)慢性及急性炎症，例如类风湿性关节炎，动脉粥样硬化，再狭窄，胰腺炎；
(c)纤维化，例如肺纤维化，肝纤维化，肾纤维化；
(d)癌症，例如癌症/血管内皮瘤增殖，胃癌；
(e)代谢疾病，例如高血压；
(f)其它炎性疾病，例如神经性疼痛，移植物排斥/移植失败/移植血管病，HIV感染/艾滋病，妊娠中毒，结节性脑硬化；以及
(g)与高胰岛素血症和肥胖相关的病理。
QC
如本文所用，术语“QC”包括谷氨酰胺酰基环化酶(QC)和QC样酶。QC和QC样酶具有相同或相似的酶活性，进一步定义为QC活性。因此，QC样酶可以在它们的分子结构中与QC根本上不同。
如本文所用，术语“QC活性”定义为在氨释放下将N-末端谷氨酰胺酰残基分子内环化为焦谷氨酸(pGlu*)或者N-末端L-高谷氨酰胺酰（L-homoglutaminyl）或L-β-高谷氨酰胺酰分子内环化为环状焦高谷氨酰胺衍生物（cyclic pyro-homoglutamine derivative）。参见方案1和2。
方案1：QC对谷氨酰胺的环化
方案2：QC对L-高谷氨酰胺的环化
如本文所用，术语“EC”包括QC和QC样酶作为谷氨酸环化酶（EC）的副活性，进一步被定义为EC活性。
如本文所用，术语“EC活性”定义为N-末端谷氨酰残基被QC分子内环化为焦谷氨酸(pGlu*)。参见方案3。
方案3：QC(EC)对不带电谷氨酰肽的N-末端环化
术语“QC抑制剂”及“谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂”对于本领域技术人员是已知的，是指上述一般定义的酶抑制剂，其抑制谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的催化活性或其谷氨酰环化酶(EC)活性。
QC抑制能力（potency）
鉴于与QC抑制的相关性，在优选实施方案中，本发明方法和医药用途利用一种物质，其对于QC抑制的Ki为10μM或更低，更优选1μM或更低，还更优选0.1μM或更低或者0.01μM或更低，或者最优选0.001μM或更低。事实上，具有更低微摩尔、优选纳摩尔和还更优选皮摩尔范围Ki值的抑制剂包括在本发明内。因此，尽管本文上述活性物质为方便描述为“QC抑制剂”，应理解这种命名法不是以任何方式限制本发明的主题。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的例子描述于WO 2005/075436中，特别是31-40页的实施例1-141。实施例1-141的合成示于WO 2005/075436的40-48页。WO 2005/075436关于实施例1-141、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/055945，特别是46-155页的实施例1-473。实施例1-473的合成示于WO 2008/055945的156-192页。WO 2008/055945关于实施例1-473、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/055947，特别是53-118页的实施例1-345。实施例1-345的合成示于WO 2008/055947的119-133页。WO 2008/055947关于实施例1-345、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/055950，特别是57-120页的实施例1-212。实施例1-212的合成示于WO 2008/055950的121-128页。WO 2008/055950关于实施例1-212、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/065141，特别是56-59页的实施例1-25。实施例1-25的合成示于WO 2008/065141的60-67页。WO 2008/065141关于实施例1-25、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/110523，特别是55-59页的实施例1-27。实施例1-27的合成示于WO 2008/110523的59-71页。WO 2008/110523关于实施例1-27、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128981，特别是62-65页的实施例1-18。实施例1-18的合成示于WO 2008/128981的65-74页。WO 2008/128981关于实施例1-18、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128982，特别是61-67页的实施例1-44。实施例1-44的合成示于WO 2008/128982的68-83页。WO 2008/128982关于实施例1-44、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128983，特别是64-68页的实施例1-30。实施例1-30的合成示于WO 2008/128983的68-80页。WO 2008/128983关于实施例1-30、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128984，特别是63-69页的实施例1-36。实施例1-36的合成示于WO 2008/128984的69-81页。WO 2008/128984关于实施例1-36、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128985，特别是66-76页的实施例1-71。实施例1-71的合成示于WO 2008/128985的76-98页。WO 2008/128985关于实施例1-71、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的进一步例子描述于WO 2008/128986，特别是65-66页的实施例1-7。实施例1-7的合成示于WO 2008/128986的66-73页。WO 2008/128986关于实施例1-7、它们的合成及它们作为谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂的用途的公开援引加入本文。
Western印迹
Western印迹分析，也已知为免疫印迹或蛋白质印迹，用于从异质样品检测特异性蛋白质。方案首先由Harry Towbin,et al.(1979)开发，使用硝基纤维素膜。
所述方法由4个主要步骤组成，
第一：蛋白质样品的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)。
第二：电泳转移（印迹）至膜。为了转移，后来的研究人员引入了不同的膜，最著名的是PVDF尼龙样膜，其使得可以测序分离的蛋白质。
第三：用特异性一抗和二抗标记靶蛋白。非特异性抗体结合通过将膜在封闭溶液中在室温保温1小时或者在4℃振荡保温过夜而防止。封闭溶液正常由在TBS-T中的5%脱脂奶组成，但是一些抗体需要BSA替换乳。这在用于测试抗体的厂商指导中通常是清楚的。保温一抗过夜或者在室温2小时。膜与合适的二抗（例如过氧化物酶缀合的）在室温保温1小时。
第四：靶蛋白的检测和成像。有许多化学发光试剂可商业获得(Amersham,Pierce,Invitrogen)，每个厂商销售一系列检测水平灵敏性。这些典型采取两种溶液的形式，它们被组合然后立即在膜上保温1-5分钟。根据蛋白信号和化学发光方法将膜暴露于X射线胶片1分钟至1小时。二抗可以与其它酶（碱性磷酸酶）缀合，因此用相应底物用替代方案观测。
ELISA
ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种最广泛使用的定量工具，用于灵敏及可再现的分析物测定。该技术组合抗体-抗原相互作用的高特异性及酶联信号检测系统。
间接ELISA
在间接ELISA中，抗原固定于表面，检测通过特异性抗体酶缀合物复合物及随后染色而提供。
在第一步中，被研究的抗原以一些已知浓度固定在表面上以获得标准曲线。在相同浓度，固定具有未知量抗原的样品。抗原特异性抗体识别抗原。如果这个抗体连接酶（或者第二种酶缀合抗体识别一抗），使用生色或荧光底物的合适酶反应信号与抗原量相关，可以通过标准曲线计算。
“夹心”ELISA
“夹心”ELISA是一项抗原夹心在两个不同抗体之间的技术。这种ELISA技术的操作原理如下：
-捕获抗体固定在合适底物上
-抗原与固定化抗体结合
-连接于酶的二抗与结合的抗原结合（形成免疫复合物）
-用合适酶底物检测免疫复合物
竞争性ELISA
这种ELISA的步骤是：
-未标记的抗体在其抗原存在下保温。
-这些抗体/抗原复合物然后被加入到抗原包被的孔。
-洗涤平板，从而除去未结合的抗体（样品中抗原越多，越少的抗体能结合孔中的抗原，因此是“竞争”）
-加入特异于一抗的二抗。这个二抗与酶偶联。
-加入底物，剩余的酶引起生色或荧光信号。
对于竞争性ELISA，原始抗原浓度越高，最终信号越弱。竞争性ELISA的主要优势是能够使用粗样品或不纯样品以及仍然选择性结合任何可能存在的抗原的能力。
一些竞争性ELISA试剂盒包括酶联抗原而非酶联抗体。标记的抗原与样品抗原（未标记的）竞争一抗结合位点。样品中抗原越多，孔中保留的标记抗原越少，信号越弱。
反向ELISA
这个技术使用由具有4-12个突出尖顶拱（ogive）的免疫吸附聚苯乙烯棒组成的固相。整个装置浸没在含有收集的样品的测试管中，通过将尖顶拱浸在预先填充试剂的标准微板的微孔中而进行下述步骤（洗涤，在缀合物中保温及在生色（chromogenous）中保温）。
酶联免疫吸附斑点测定
酶联免疫吸附斑点（ELISPOT）测定是用于监测人类和动物中免疫应答的常用方法。其使得个体激活或响应细胞的分泌产物可见。
捕获抗体无菌包被在PVDF衬底微板上。通常用与测定中任何抗体均不反应的血清蛋白封闭平板。之后，感兴趣的细胞以变化的密度与抗原或促细胞分裂原铺板，然后置于湿润的37℃、CO2温箱中一段规定时间。
由激活的细胞分泌的细胞因子（或其它感兴趣的细胞产物）由高表面积PVDF膜上的包被抗体局部捕获。洗涤孔除去细胞、碎片和培养基成分后，向孔中加入特异于所选分析物的生物素化多克隆抗体。这个抗体与靶细胞因子的独特表位反应，因此被用于检测捕获的细胞因子。在洗涤除去任何未结合的生物素化抗体之后，检测的细胞因子然后用亲和素-HRP和沉淀底物（例如AEC，BCIP/NBT）显现。有色终产物（斑点，通常黑蓝色）典型代表个体产细胞因子细胞。斑点可以手工计数（例如用解剖显微镜）或者用自动化读板器捕获微孔图像及分析斑点数和大小。
FluoroSpot测定是ELISPOT测定的修改，基于使用多个荧光抗细胞因子，其使得可以在同一测定中斑点两个细胞因子。
流式细胞术
细胞内流式细胞术(ICFC)
与用ELISA检测分泌的细胞因子不同，为检测细胞内细胞因子，需要在刺激的最后几小时用蛋白质转运抑制剂如莫能菌素或Brefeldin A阻断细胞因子分泌。建议研究人员在他们特异测定系统中评估不同蛋白质转运抑制剂的应用和功效。
基本免疫荧光染色和流式细胞术分析方案的修改可以用于同时在单细胞水平分析表面分子和细胞内抗原。在这个方案中，细胞首先在体外激活，染色表面抗原，如在表面抗原方案中一样，然后用低聚甲醛固定以稳定细胞膜，及用去污剂皂苷透化以允许抗细胞因子抗体细胞内染色。体外刺激细胞通常是经流式细胞术检测细胞因子所需的，因为细胞因子水平典型在静息细胞中太低。用合适试剂刺激细胞取决于细胞类型和实验条件。
使用多重测定技术的流式细胞术
Luminex xMAP技术
xMAP技术使用5.6微米聚苯乙烯微球，微球用红色和红外荧光团内部染色。使用不同量的两种染料用于不同批次的微球，可以产生多达100种不同微球系列。每个珠均是独特的，具有由红色和红外染料混合物确定的光谱特征。珠用特异已知比率的两种染料填充。因为每个微球携带独特特征，xMAP检测系统可以鉴别它属于哪个系列。因此，将多达100个测试多元化（multiplex）在单个反应体积中是可能的。
Luminex测定
Luminex系统是基于流式细胞术原理的灵活分析仪。该系统可以使用非常小样品体积在单个微板孔中将多达100个分析物多元化（同时测量）。在一个单孔中分析多达40个不同分析物的多元化溶液是可能的。该系统输送生物测定，包括基因表达、转录因子谱分析、细胞因子谱分析等。
Bio-Plex测定
Bio-Plex细胞因子测定采用液体悬浮阵列用于定量组织培养物上清或血清中的细胞因子。使用这种96孔微滴定板形式的测定，可以在单个孔中分析多个细胞因子水平的谱。Bio-Plex细胞因子测定的原理与捕获夹心免疫测定相似。抗每个希望的细胞因子的抗体共价偶联于不同的颜色编码的聚苯乙烯珠。使缀合的珠与含有已知（标准）或未知量的细胞因子的样品反应。除去未结合细胞因子之后，抗每个细胞因子上一不同表位的生物素化检测抗体被加入反应。结果是在每个细胞因子周围形成抗体夹心。复合物通过加入具有不同于珠的荧光特征的链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白（链霉抗生物素蛋白-PE）检测。专门的微滴定板读板器进行定量，其能分析在单个微滴定孔中的多重珠-捕获免疫测定。通过逐个读取混合物中的珠，该系统可以独立检测每个细胞因子。Bio-Plex软件从标准曲线自动化计算细胞因子浓度，标准曲线衍生自已知量的细胞因子标准物的混合物。
免疫组织化学(IHC)
免疫组织化学或IHC是指定位组织切片细胞中抗原（例如蛋白质）的方法。IHC也广泛用于基础研究以了解生物标记和差异表达的蛋白质在生物学组织不同部分中的分布和定位。可以通过许多方式实现抗体-抗原相互作用的显现。在最常见的情况中，抗体缀合于催化产色反应的酶如过氧化物酶。或者，抗体也可以用荧光团标记，如荧光素、罗丹明、DyLight Fluor或Alexa Fluor。
抗体可以分类为一级或二级试剂。一抗针对感兴趣抗原产生并且典型是未缀合的（未标记的），而二抗是针对一抗产生。因此，二抗识别特定物种的免疫球蛋白并且缀合于生物素或者报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶（HRP）。一些二抗缀合于荧光剂。在这个方法中，根据目的和实验样品的厚度，从感兴趣组织取薄（大约4-40μm）片，或者如果组织不是很厚且可穿透则其全体被使用。切片通常用切片机完成，切片固定在玻片上。“自由漂浮IHC（Free-floating IHC）”使用未固定的切片，这些切片用振动切片机正常产生。
直接方法是一步染色方法，涉及标记的抗体直接与组织切片中的抗原反应。
间接方法涉及未标记的一抗（第一层）与组织抗原反应，标记的二抗（第二层）与一抗反应。
免疫沉淀(IP)
免疫沉淀涉及使用特异于已知蛋白质的抗体以从含有许多不同蛋白质的溶液中分离特定蛋白质。这些溶液通常是植物或动物组织粗裂解物形式。其它样品类型可以是体液或者其他生物学来源样品。
发明详述
根据本发明的第一方面，提供了诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病的方法，其包括确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
根据本发明的第二方面，提供了确定谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂在生物学样品内以及作为应用QC抑制剂的治疗中谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制的替代标记（surrogate marker）的效力的方法。
本文提供的数据令人惊奇地证实N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1(MCP-1N1pE):MCP-1总浓度的比率降低导致浸润到腹膜的单核细胞数降低。这种单核细胞的募集是一些炎性疾病的一般特征。这个数据因此证实通过监测MCP-1的单核细胞募集能力，MCP-1 N1pE/MCP-1比率作为炎性疾病或炎性相关疾病的生物标记的实用性。
本文“MCP-1”适用于与SEQ ID NO 1-10任一序列具有大于50%序列相同性（如55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）的MCP-1肽。在一个实施方案中，MCP-1是MCP-1(1-76)。在进一步的实施方案中，MCP-1是人类或小鼠MCP-1。在进一步的实施方案中，MCP-1是人类MCP-1。
“N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1(MCP-1 N1pE)”是指本文之前定义的MCP-1肽，其中N-末端谷氨酰胺残基已被谷氨酰胺酰基环化酶(QC)修饰为N-末端焦谷酰胺酰(pGlu；pE或5-氧代-脯氨酸)残基，如Proost,P et al.(1996)J Leukocyte Biol.59,67-74)所述。
在一个实施方案中，所述确定包括如下步骤：
(a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的第一浓度(ca)；
(b)确定所述生物学样品中总MCP-1的第二浓度(cd)；及
(c)确定ca/cd的比率，其中第一浓度(ca)值除以第二浓度(cd)值。
优选地，ca/cd的比率表示为百分比(%)。
当诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病的治疗时，在一个实施方案中，ca/cd比率的合适范围是50%、70%、85%(即降低50%、30%、15%)。
当确定QC抑制剂在治疗炎性疾病或炎性相关疾病中的效力时，在一个实施方案中，ca/cd比率的合适范围是30%、50%和70%(即降低70%、50%、30%)。
当评估哺乳动物细胞系中QC抑制剂的谱时，在一个实施方案中，ca/cd比率的合适范围是10%30%和50%(即降低90%、70%、50%)。
本发明进一步方面提供了配体，如天然存在或化学合成的化合物，能够特异性结合MCP-1 N1pE生物标记和MCP-1。本发明的配体可以包括能特异性结合MCP-1 N1pE生物标记和MCP-1的肽、抗体或其片段或者适体或寡核苷酸。
在一个实施方案中，步骤(a)包括：
i)将生物学样品与特异于MCP-1的捕获抗体接触，
ii)施加特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体，
iii)检测所得的免疫复合物，及
iv)定量检测的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1复合物。
在一个实施方案中，捕获抗体是能特异性结合MCP-1的单克隆抗体或其片段。在一个实施方案中，检测抗体是能特异性结合MCP-1 N1pE生物标记的单克隆抗体或其片段。在进一步的实施方案中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体包括国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的抗体，该申请中的MCP-1 N1pE检测抗体援引加入本文。
更优选地，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体是单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:33、37和41的核苷酸序列，或者具有选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:34、38和42的氨基酸序列。
或者，本发明优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，其中所述抗体的重链的可变部分具有选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:35、39和43的核苷酸序列，或者具有选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:36、40和44的氨基酸序列。
本发明进一步优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:33的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:34的氨基酸序列，及其中所述抗体的重链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:35的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
本发明还优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:37的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:38的氨基酸序列，及其中所述抗体的重链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQID NO:39的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
本发明还更优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，其中所述抗体的轻链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:41的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:42的氨基酸序列，及其中所述抗体的重链的可变部分具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQID NO:43的核苷酸序列，或者具有国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
在特别优选的实施方案中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体由选自下组的杂交瘤细胞系产生：
348/1D4 (保藏号DSM ACC 2905);
348/2C9 (保藏号DSM ACC 2906);
332/4B8 (保藏号DSM ACC 2907);及
332/4F8 (保藏号DSM ACC 2908)。
在特殊优选的实施方案中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体由选自348/2C9的杂交瘤细胞系(保藏号DSM ACC 2906)产生。
根据进一步优选的实施方案，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体可以是人源化抗体或者是嵌合抗体或者是人类抗体。
进一步，选自上述组的特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体也可以是所述组的功能变体。
在本发明上下文中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体的“功能变体”是保持结合能力、特别是高亲和性结合MCP-1N1pE-38或其功能变体的能力的抗体。这种功能变体是本领域已知的并且包含上述可能性，其在抗体及其片段定义下示出。
在优选的实施方案中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体是如上定义的抗体片段。
在进一步优选的实施方案中，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体是具有上述定义抗体的互补决定区（CDR）的抗体。优选地，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体可以被标记；可能的标记是上述的那些及特别是抗体诊断应用领域技术人员已知的那些。
本发明进一步优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，包括任何功能等价抗体或其功能部分，所述抗体包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含与选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:34、38和42的序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
本发明还更优选的是特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体，包括任何功能等价抗体或其功能部分，所述抗体包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含与选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:36、40和44的序列85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
另外，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的单克隆抗体包括任何功能等价抗体或其功能部分，其中所述抗体的轻链的可变部分包含选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:34、38和42的氨基酸序列，和/或其中所述抗体的重链的可变部分包含选自国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:36、40和44的氨基酸序列，其中抗体已通过将至少一个、至少二个或至少3个或更多个保守取代引入国际专利申请PCT/EP2009/60757中所述的SEQ ID NO:34、36、38、40、42和44的至少一个序列中而改变，其中所述抗体基本上保持其完全功能性。
优选地，特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的抗体固定化在固相上。
在一个实施方案中，步骤(b)包括：
i)将生物学样品与特异于MCP-1的捕获抗体接触，
ii)施加特异于MCP-1的检测抗体，
iii)检测所得的免疫复合物，及
iv)定量捕获的MCP-1复合物。
在一个实施方案中，步骤i)中使用的捕获抗体是能特异结合MCP-1的单克隆抗体或其片段。在进一步的实施方案中，步骤i)中使用的特异于MCP-1的捕获抗体选自：
多克隆抗血清山羊抗hMCP1-AF(R&D Systems,Minneapolis,USA);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab18072(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab9669(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab18072(Abcam,Cambridge,UK);
山羊MCP-1抗体(C-17):sc-1304(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,USA);
多克隆抗血清兔抗mJE(Peprotech,Hamburg,Germany);
兔多克隆抗mMCP-1抗体ab9899(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab7202(Abcam,Cambridge,UK);和
大鼠单克隆MCP-1抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,USA)。
在进一步的实施方案中，步骤i)中使用的特异于MCP-1的捕获抗体选自多克隆抗血清山羊抗hMCP1-AF(R&D Systems,Minneapolis,USA)。
在一个实施方案中，步骤ii)中使用的特异于MCP-1的检测抗体包括：
小鼠抗hMCP-1(Peprotech,Hamburg,Germany);
小鼠单克隆抗MCP-1抗体ab17715(Abcam,Cambridge,UK);
小鼠单克隆抗MCP-1抗体sc-32819(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,USA);
抗小鼠MCP-1(R&D Systems,Minneapolis,MN USA);
仓鼠单克隆抗MCP-1抗体ab21397(Abcam,Cambridge,UK);
大鼠单克隆MCP-1抗体ab8101(Abcam,Cambridge,UK);和
大鼠单克隆MCP-1抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz,USA)。
在一个实施方案中，复合物的检测用二抗、特别是与每种检测抗体反应的二抗进行。
在一个实施方案中，二抗是抗小鼠抗体或者抗兔抗体，如抗小鼠抗体。
在一个实施方案中，二抗是标记的。为诊断应用，二抗典型用可检测部分标记。有许多标记可利用，通常分为以下类别：
(a)放射性同位素，如35S、14C、125I、3H和131I。抗体可以用例如CurrentProtocols in Immunology，Volumes 1 and 2,Gütigen et al.,Ed.,Wiley-Interscience.New York,New York.Pubs.,(1991)中所述的技术用放射性同位素标记，放射性可以用闪烁计数测量。
(b)荧光标记，如稀土螯合物（铕螯合物）或者荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺（Lissamine）、藻红蛋白和Texas Red是可利用的。荧光标记可以用例如上述Current Protocols in Immunology所述的技术与抗体缀合。荧光可以用荧光计量化。
(c)各种酶-底物标记是可利用的。酶通常催化生色底物的化学改变，其可以用各种技术测量。例如，酶可以催化底物中的颜色变化，其可以用分光光度法测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。定量荧光变化的技术在以上描述。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的并且然后可以发光，光可以测量（用例如化学发光计）或者贡献能量给荧光受体。酶标记的例子包括萤光素酶（例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利4,737,456）、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶（HRPO）、碱性磷酸酶、O-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶（如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶缀合于抗体的技术在O'Sullivan et al.,Methods for thePreparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(ed Langone & H.Van Vunakis),Academic Press,NewYork,73:147-166(1981)中描述。
酶-底物组合的例子包括例如：
(i)以过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶（HRPO），其中过氧化氢酶氧化染料前体（例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；
(ii)以对硝基苯基磷酸酯作为生色底物的碱性磷酸酶（AP）；及
(iii)具有生色底物（例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
许多其它酶-底物组合是本领域技术人员可获得的。
(d)用于检测抗体的另一种可能的标记是短核苷酸序列。浓度然后通过RT-PCR系统(ImperacerTM,Chimera Biotech)确定。
有时，标记与检测抗体间接缀合。本领域技术人员了解实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，上述任意3大类标记可以与抗生物素蛋白缀合，反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，因此标记可以以这种间接方式与抗体缀合。或者，为实现标记与抗体的间接缀合，抗体与小的半抗原（例如地高辛）缀合并且上述不同类型标记的一种与抗半抗原抗体（例如抗地高辛抗体）缀合。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
本发明中使用的抗体可以任何已知测定方法采用，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定和免疫沉淀测定。Zola,Monoclonal Antibodies AManual of Techniques,pp.147-158(CRC Press.Inc.,1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准物与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的靶肽的量与结合抗体的标准物的量成反比。为促进确定结合的标准物的量，通常在竞争之前或之后使抗体不溶解，从而结合抗体的标准物和分析物可以方便地与未结合的标准物和分析物分离。
在进一步的实施方案中，二抗用辣根过氧化物酶（HRP）标记。
在一个实施方案中，检测的免疫复合物被定量。
在一个实施方案中，捕获的复合物通过选自如下一组的定量手段定量：ELISA，如间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、反向ELISA、酶联免疫吸附斑点测定；流式细胞术；多重测定系统；免疫组织化学；免疫沉淀；及Western印迹分析。在进一步的实施方案中，捕获的复合物经夹心ELISA作为定量手段定量。本发明可以使用的夹心ELISA方法的一个合适例子见实施例5和11。
在一个实施方案中，生物学样品选自血液、血清、尿、脑脊液（CSF）、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、眼泪、胆汁和胰腺分泌物。在进一步的实施方案中，生物学样品是血清。根据另一优选的实施方案，所述样品是液体，脑脊液（CSF）或滑液样品。生物学样品可以本领域技术人员熟知方式得自患者。特别地，血液样品可以得自对象，血液样品可以通过常规方法分成血清和血浆。获得生物学样品的对象怀疑受累于炎性疾病或炎性相关疾病和/或处于发生炎性疾病或炎性相关疾病的风险中。
本发明进一步的方面包括生物传感器，其包括MCP-1N1pE生物标记或者其结构/形状模拟物，能够特异性结合抗MCP-1N1pE生物标记的抗体。还提供了一种阵列，包括本文所述的配体或模拟物。术语“生物传感器”是指能检测MCP-1N1pE生物标记存在的任何事物。
本发明的生物传感器可以包含如本文所述的一个或多个配体，其能够特异性结合MCP-1N1pE生物标记。这种生物传感器可用于检测和/或定量本发明的MCP-1N1pE生物标记。
根据本发明第三个方面，提供了确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的方法，其包括如下步骤：
(a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的第一浓度(ca)；
(b)确定所述生物学样品中总MCP-1的第二浓度(cd)；及
(c)确定ca/cd比率，其中第一浓度(ca)值除以第二浓度(cd)值。
应理解本发明提供了有效而灵敏的测量N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的方法。鉴于谷氨酰胺酰基环化酶(QC)翻译后修饰MCP-1以具有N-末端焦谷氨酰胺酰残基，本发明方法因此也可用作有效筛选方法以评估测试物质影响QC活性的能力。因此，根据本发明进一步的方面，提供了筛选谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的方法，其包括步骤：
(a)保温包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶（QC）的对照样品以及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例；
(b)将具有包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶（QC）的混合物的对照样品与谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂一起保温及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例；
从而步骤(b)中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1:总MCP-1的比率相对于步骤(a)中的降低指示谷氨酰胺酰基环化酶抑制。
根据本发明进一步的方面，提供了通过上述筛选方法可获得的谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂。
根据本发明进一步的方面，提供了测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的效力的方法，其包括将谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂与包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的混合物保温，及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。本发明的这个方面提供了评估已经鉴别的QC抑制剂的效力的优势，例如MCP-1转化为N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的速率的降低可以在给定时间内评估。
诊断试剂盒
为方便，本发明方法中使用的抗体可以提供在试剂盒中，即预定量的试剂与进行诊断测定的指导的包装组合。
根据本发明进一步的方面，提供了用于诊断炎性疾病或炎性相关疾病的试剂盒，其包括特异于MCP-1的捕获抗体、特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体、特异于MCP-1的检测抗体及任选地根据上述方法使用所述试剂盒的指导。
当抗体用酶标记时，试剂盒包括酶需要的底物和辅因子（例如提供可检测生色团或荧光团的底物前体）。另外，可以包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲液（例如阻断缓冲液或裂解缓冲液）等。各种试剂的相对量可以广泛变化以提供实质上优化测定灵敏性的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以提供为干粉，通常是冻干的，包括赋形剂，当溶解时赋形剂提供具有合适浓度的试剂溶液。
本发明方法还具有工业实用性，用于监测炎性疾病或炎性相关疾病给定治疗的功效。根据本发明进一步的方面，提供了监测在患有、怀疑患有或有倾向患有炎性疾病或炎性相关疾病的对象中治疗的功效的方法，包括确定在来自测试对象的生物学样品中如上述定义的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
根据本发明进一步方面，提供了上述诊断或监测方法，其包括确定在两或多种场合从测试对象取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
根据本发明进一步方面，提供了上述诊断或监测方法，其包括比较在两或多种场合取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
在一个实施方案中，炎性疾病或炎性相关疾病是MCP-1相关疾病，例如动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、胰腺炎、阿尔茨海默病、高胰岛素血症和肥胖，包括II型糖尿病、糖尿病肾病、结肠炎、肺纤维化、肾纤维化、妊娠中毒、移植物排斥、神经性疼痛、中风、AIDS和肿瘤。
最优选地，炎性疾病或炎性相关疾病是阿尔茨海默病或者也最优选是选自动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、再狭窄和胰腺炎、糖尿病肾病特别的疾病，特别是阿尔茨海默病或类风湿性关节炎。
本发明进一步通过下述实施例描述，其不应理解为以任何方式限制本发明，本发明范围仅由权利要求书限定。
本发明实施例
实施例1：MALDI-TOF质谱
基质辅助激光解吸/电离质谱使用配有线性飞行时间分析仪的VoyagerDe-Pro(Applied Biosystems,Darmstadt)进行。该仪器配有337nm氮激光、潜在加速源和1.4m飞行试管。检测仪操作是阳离子模式。样品(5μl)与等体积基质溶液混合。对于基质溶液，使用芥子酸，其是通过将20mg芥子酸(Sigma-Aldrich)溶于1ml乙腈/0.1%TFA于水中(1/1,v/v)而制备。将小体积(≈1μl)基质-分析物混合物转移到探针尖端。
为长时期测试Glu1环化，将MCP-1肽在100μl 0.1M乙酸钠缓冲液、pH 5.2或者0.1M Bis-Tris缓冲液、pH 6.5中在30℃保温。肽以0.15mM至0.5mM浓度施用，并加入0.2U QC。在不同时间，从测定试管中取出样品，用ZipTips(Millipore)根据厂商推荐提取肽，与基质溶液混合(1:1v/v)，随后记录质谱。阴性对照不含QC或者含有加热失活的酶。对于抑制剂研究，样品组成与上述相同，不同是加入的抑制化合物。
实施例2：由二肽基肽酶4（DP4）、氨基肽酶P及由人类血清中存在的蛋白酶对人类MCP-1(1-76)的蛋白酶解
在QC特异性抑制剂的存在和不存在下由重组人类DP4对MCP-1的N-末
端降解
将起始为N-末端谷氨酰胺的重组人类MCP-1(1-76)(SEQ ID NO:1)(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl pH 7.6中，浓度为10μg/ml。所述MCP-1溶液在30℃与重组人类QC(0.0006mg/ml)预保温3小时，随后与重组人类DP4(0.0012mg/ml)在30℃保温，或者不事先加入QC而与DP4保温。另外，Gln1-MCP-1与重组人类QC的保温在1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)硫脲盐酸盐存在下进行。所得DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时后用Maldi-TOF质谱分析。
由重组人氨基肽酶P进行的N-末端降解
携带N-末端谷氨酰胺酰酰而非焦谷氨酰残基的人类重组MCP-1(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl、pH 7.6中，浓度为10μg/ml。
MCP-1与30μg/ml氨基肽酶P(R&D Systems)在30℃保温。Gln1-MCP-1不经pGlu修饰而使用或者与重组人类QC(6μg/ml)在30℃预保温3小时以产生pGlu。所得氨基肽酶P裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
在人类血清中人类MCP-1的N-末端降解
携带N-末端谷氨酰胺酰残基的人类重组MCP-1(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl、pH 7.6中，浓度为100μg/ml。MCP-1在30℃与重组人类QC(0.006mg/ml)预保温3小时，随后与人类血清在30℃保温或者不加入QC而与人类血清保温。对于Gln1-MCP-1，裂解产物在0分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时和7小时后用Maldi-TOF质谱分析，对于pGlu1-MCP-1，裂解产物在0分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、7小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
实施例3：人类MCP-2、MCP-3和MCP-4的降解
由DP4对人类MCP-2的N-末端降解
携带N-末端谷氨酰胺酰而非焦谷氨酰残基的人类重组MCP-2(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl、pH 7.6中，浓度为10μg/ml。MCP-2在30℃与重组人类QC(0.0006mg/ml)预保温3小时，随后与重组人类DP4(0.0012mg/ml)在30℃保温或者不与QC预保温而与重组人类DP4(0.0012mg/ml)保温。所得DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
由DP4对人类MCP-3的N-末端降解
携带N-末端谷氨酰胺酰而非焦谷氨酰残基的人类重组MCP-3(SEQ IDNO:12)(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl、pH 7.6中，浓度为10μg/ml。MCP-3在30℃与重组人类QC(0.0006mg/ml)预保温3小时，随后与重组人类DP4(0.00012mg/ml)在30℃保温或者不事先加入QC而与重组人类DP4(0.00012mg/ml)保温。所得DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
由DP4对人类MCP-4的N-末端降解
携带N-末端谷氨酰胺酰而非焦谷氨酰残基的人类重组MCP-4(SEQ IDNO:13)(Peprotech)溶解在25mM Tris/HCl、pH 7.6中，浓度为10μg/ml。MCP-4在30℃与重组人类QC(0.0006mg/ml)预保温3小时，随后与重组人类DP4(0.00006mg/ml)在30℃保温或者不事先加入QC而与重组人类DP4(0.00006mg/ml)保温。所得DP4裂解产物在0分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时后用Maldi-TOF质谱分析。
实施例4：人类MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4的不同N-末端变体的趋化能力
TransWell趋化性测定
趋化性测定使用孔径为5μm的24孔TransWell平板(Corning)进行。THP-1细胞悬浮于RPMI1640中，浓度为1*106细胞/100μl并以100μl等份加入到上层室内。使细胞在37℃朝着化学引诱剂迁移2小时。随后，来自上层室的细胞被弃去，下层室与50μl于PBS中的70mM EDTA混合并在37℃保温15分钟以释放附着于膜的细胞。之后，用细胞计数器系统(System)计数迁移到下层室的细胞。趋化指数通过将迁移至刺激物的细胞除以迁移至阴性对照的细胞而计算。
人类MCP-1的N-末端变体的趋化能力
以谷氨酰胺1起始的MCP-1(Gln1-MCP-1)(Peprotech)与重组人类QC保温以产生pGlu1-MCP-1，或者与人类重组DP4保温以产生Asp3-MCP-1。用THP-1趋化性测定测试浓度为1、5、10、50、100、500和1000ng/ml的所产生的MCP-1变体(n=3)。
在不存在或存在QC抑制剂时人类MCP-1的趋化能力
具有N-末端谷氨酰胺的MCP-1(Gln1-MCP-1)(Peprotech)与重组人类QC和DP4保温(Gln1-MCP-1+QC+DP4)、单独与人类重组DP4保温(Gln1-MCP+DP4)以及与重组人类QC组合10μM QC抑制剂1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)硫脲盐酸盐和DP4保温(Gln1-MCP-1+QC+QCI+DP4)。用趋化性测定测试浓度为1、5、10、50、100、500和1000ng/ml的所产生的MCP-1变体(n=3)。
具有N-末端谷氨酰胺酰或焦谷氨酰残基的人类MCP-1、MCP-2、MCP-3和
MCP-4的变体的趋化能力的比较
测试了具有N-末端谷氨酰胺的人类MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4(Peprotech)或具有焦谷氨酰残基的人类MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4（将Gln1-MCP与人类重组QC在1:100稀释度于30℃保温2小时）的趋化能力。用趋化性测定测试浓度为1、5、10、50、100、500和1000ng/ml的特定MCP(n=3)。
具有N-末端谷氨酰胺酰残基的人类MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4的
变体与各自DP4裂解产物的趋化能力的比较
以N-末端谷氨酰胺起始的人类MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4(Peprotech)直接施加于趋化性测定并与MCP-1、MCP-2、MCP-3和MCP-4的DP4裂解产物的趋化能力进行比较。为产生DP4裂解产物，在测定之前，各自MCP与人类重组DP4在1:100稀释度于30℃保温2小时。用趋化性测定测试浓度为1、5、10、50、100、500和1000ng/ml的特定MCP(n=3)。
实施例5：建立间接夹心ELISA用于定量检测总人类MCP-1（hMCP-1）和具有N-末端焦谷氨酸的人类MCP-1(hMCP-1N1pE)
为了捕获人类MCP-1，作为捕获抗体的特异性结合人类MCP-1的商业可获得的多克隆抗血清山羊抗hMCP1-AF(R&D Systems,Minneapolis,USA)在PBS中稀释至250ng/ml并在聚苯乙烯96孔微滴板中于4℃过夜固定化。之后，在室温用ELISA阻断剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)阻断2小时。为制备标准曲线，重组hMCP-1与重组人类谷氨酰胺酰基环化酶(QC)保温以获得hMCP-1N1pE。重组hMCP-1N1pE标准肽用ELISA阻断剂系列稀释，从1000pg/ml降至15.63pg/ml，并一式二份加入到孔中。填充有ELISA阻断剂的两个孔代表标准曲线值0pg/ml。在室温保温2小时后，用TBS-T洗平板至少3次。为检测hMCP-1N1pE，MCP-1N1pE抗体克隆348-2C9与HRP缀合的抗小鼠抗体均在阻断缓冲液中稀释至终浓度为500ng/ml。为检测hMCP-1，抗体小鼠抗hMCP-1(Peprotech,Hamburg,Germany)与HRP-缀合的抗小鼠抗体均在阻断缓冲液中稀释至终浓度为500ng/ml。检测抗体/缀合物溶液在室温保温2小时。用TBS-T洗涤若干次后，用商业可获得的HRP底物TMB(SureBlue Reserve TMB MicrowellPeroxidase Substrate(1-component),KPL,Gaithersburg,USA)进行颜色反应(在室温黑暗下保温30分钟)，随后加入1.2N H2SO4终止。用Tecan Sunrise平板阅读器确定在450/540nm的吸收值。
实施例6：评价标准肽环化状态对总hMCP-1ELISA的影响
为了排除标准肽环化状态对总hMCP-1ELISA的影响，对环化的和未环化的重组人类MCP-1的检测进行比较。
ELISA方案相应于实施例5，为制备标准曲线，hMCP-1与或不与QC保温。
实施例7：经ELISA确定刺激的NHDF细胞的细胞培养上清中hMCP-1N1pE/hMCP-1比率
在炎性刺激物之后，hMCP1的表达在人类正常皮肤成纤维细胞（HumanNormal Dermal Fibroblasts(NHDF)）中增强。因此，在施加制癌蛋白M(OSM)和白介素1β(IL1β)至NHDF之后，hMCP-1以及MCP-1N1pE的量应该增加。为证实此点，OSM和IL1β刺激的NHDF细胞培养物上清进行两个ELISA分析。分析hMCP-1的量以及hMCP-1N1pE的比例。
根据实施例5的方案定量检测存在的hMCP-1和hMCP-1N1pE。NHDF细胞培养物上清在阻断缓冲液中稀释，之后加入孔中。NHDF用10ng/mlOSM和IL1β刺激14天，在7天后重新施加存在的细胞因子。在不同时间点分析细胞培养物上清以检测hMCP-1和hMCP-1N1pE分泌的时间依赖性。
实施例8：确定用谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂(QCI)处理的正常人类皮肤成纤维细胞中hMCP-1N1pE/hMCP-1比率
实施例7显示经炎性刺激后，hMCP-1以及hMCP-1N1pE表达在NHDF中增强。因为谷氨酰胺酰基环化酶(QC)催化形成N-末端焦谷氨酸残基，对QC的抑制应导致降低的hMCP-1N1pE水平。为证明这点，NHDF用OSM和IL1β刺激并同时用或不用QCI处理。
NHDF用10ng/ml OSM、IL1β刺激，同时用或不用10μM QCI处理6天。细胞因子和抑制剂在第0天施用一次。为了检查QCI对hMCP-1和hMCP-1N1pE水平的影响，细胞培养物上清在不同时间点根据实施例7的ELISA方案进行分析。
实施例9：确定在用不同浓度QCI处理的人类肺癌细胞系(A549)中hMCP-1N1pE/hMCP-1比率
实施例8显示QCI的施用降低NHDF中hMCP-1N1pE水平。为了分析hMCP-1N1pE的QCI浓度依赖性降低，癌人类肺泡基底上皮细胞系A549用不同浓度QCI处理。
A549细胞用10ng/ml TNFα和IL1β刺激24小时。此外，QCI以不同浓度施用于细胞。24小时后，细胞培养物上清根据实施例7方案分析。
实施例10：hMCP1和hMCP1N1pE在人类血清中的掺加（spike）和恢复（recovery）
为了验证hMCP-1和hMCP-1N1pE在人类血清中的定量检测，进行掺加和恢复实验。
ELISA方案相应于实施例5，除了使用FBS、0.05%Tween、10%FBS用于阻断和稀释步骤。为了验证掺加和恢复，各种水平的重组hMCP-1和hMCP-1N1pE掺加到人类血清中。恢复通过从掺加样品中减去未掺加血清样品中测量的值而计算。
实施例11：建立间接夹心ELISA用于定量检测总小鼠MCP-1(mMCP-1)和具有N-末端焦谷氨酸的小鼠MCP-1(mMCP-1N1pE)
实施例5-10描述重组和天然人类MCP-1/MCP-1N1pE的定量检测。为了分析小鼠样品中的mMCP-1和mMCP-1N1pE水平，需要开发用于定量小鼠MCP-1/MCP-1N1pE的测定。因为MCP-1N1pE抗体克隆348-2C9与小鼠MCP-1N1pE交叉反应，这个抗体用于建立间接夹心ELISA用于检测mMCP1N1pE。为了区分两种形式的细胞因子，开发了可比较间接夹心ELISA用于检测总mMCP-1。
为了捕获小鼠MCP-1，作为捕获抗体的特异性结合小鼠MCP-1的商业可获得的多克隆抗血清兔抗mJE(Peprotech,Hamburg,Germany)在PBS中稀释至500ng/ml并在聚苯乙烯96孔微滴板中于4℃固定4-7夜。之后，在室温用ELISA阻断剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)阻断2小时。为制备标准曲线，重组mMCP-1与小鼠谷氨酰胺酰基环化酶(QC)保温以获得mMCP-1N1pE。重组mMCP-1N1pE标准肽用ELISA阻断剂系列稀释，从1950pg/ml降至19.5pg/ml，并一式二份加入到孔中。填充有ELISA阻断剂的两个孔代表标准曲线值0pg/ml。在室温保温2小时后，用TBS-T洗平板至少3次。为检测mMCP-1N1pE，MCP-1N1pE抗体克隆348-2C9与HRP缀合的抗小鼠抗体均在ELISA阻断剂中稀释至终浓度为500ng/ml。为检测mMCP-1，抗体大鼠抗小鼠MCP-1(R&D Systems,Minneapolis,MN USA)山羊多克隆MCP-1(MCP-1(M-18):sc-1784(Santa Cruz)与HRP-缀合的抗大鼠抗体抗山羊IgG过氧化物酶缀合物（R&D Systems,Minneapolis,MN USA）也均在阻断缓冲液中稀释至终浓度250ng/ml(200ng/ml分别1μg/ml)。检测抗体/缀合物溶液在室温保温2小时。用TBS-T洗涤若干次后，用商业可获得的HRP底物TMB (SureBlue Reserve TMB Microwell Peroxidase Substrate(1-component),KPL,Gaithersburg,USA)进行颜色反应(在室温黑暗下保温30分钟)，随后加入1.2N H2SO4终止。用Tecan Sunrise平板阅读器确定在450/540nm的吸收值。
实施例12：评价标准肽环化状态对总mMCP-1ELISA的影响
实施例6证实人类标准肽hMCP-1环化状态对总hMCP-1ELISA没有影响。为了对小鼠总MCP-1ELISA证实这点，进行在总mMCP-1ELISA中的环化的和未环化的重组小鼠MCP-1的定量的比较。
ELISA方案相应于实施例6，为制备标准曲线，mMCP1与或不与QC保温。
实施例13：确定在用不同浓度QCI处理的LPS刺激的小鼠巨噬细胞系264.7中的mMCP-1N1pE/mMCP-1比率
实施例9显示在刺激的A549中施用QCI以浓度依赖性方式降低人类MCP1N1pE/人类MCP-1的比率。为了分析QCI对小鼠MCP-1N1pE/小鼠MCP-1比率的作用，小鼠巨噬细胞系RAW 264.7在不存在或存在增加浓度的QC抑制剂QCI的情况下用LPS刺激。
RAW 264.7用10ng/ml LPS刺激24小时并用不同QCI浓度处理。24小时后，细胞培养物上清根据实施例9的方案分析。细胞培养物上清在加入孔之前在阻断缓冲液中1:1000稀释。
实施例14：通过Western印迹分析交叉验证RAW 264.7细胞培养物上清中的mMCP-1N1pE水平
RAW 264.7的刺激和抑制剂施用根据实施例9进行。为进行Western印迹分析，细胞培养物上清的蛋白质通过SDS凝胶电泳分离。分离的蛋白质电转移到硝基纤维素膜。膜在室温用TBST-M(=TBST+5%脱脂乳)温和振荡下阻断1小时。用在等体积TBST-M中稀释至1μg/ml的针对总mMCP-1的检测抗体（大鼠抗小鼠MCP-1，R&D Systems）或者针对mMCP-1N1pE的检测抗体（克隆332-4B8）在摇床上在4℃抗体保温过夜。用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠和抗大鼠二抗根据标准程序用于信号检测。
实施例15：确定用硫代乙醇酸盐和不同浓度QCI处理的小鼠中mMCP-1N1pE/mMCP-1比率
实施例13显示施用QCI降低小鼠细胞培养物模型中的mMCP-1N1pE/mMCP-1的比率。为在体内证实这个结果，在施用QCI之后在急性炎性小鼠模型中测量mMCP-1N1pE/mMCP-1的比率。除了确定mMCP-1N1pE/mMCP-1比率，还研究了降低的mMCP-1N1pE浓度对单核细胞浸润的作用。
将硫代乙醇酸盐腹膜内注射进小鼠。在施用硫代乙醇酸盐之前30分钟施用不同浓度的QCI。在4小时后，通过用8ml PBS缓冲液冲洗腹膜进行腹膜灌洗液。将腹膜灌洗液根据实施例11方案进行ELISA分析以确定腹膜中的mMCP1和mMCP1N1pE水平。样品在阻断缓冲液中1:5稀释，之后加入到孔中。经7/4和Ly6G抗原复染通过FACS分析计数浸润的单核细胞。
实施例16：确定液体小鼠样品中mMCP-1N1pE/mMCP-1比率
实施例11描述了重组和天然mMCP-1/MCP-1N1pE的定量检测。为了分析没有潜在的抗小鼠IgG-HRP-缀合物的交叉反应性的液体小鼠样品中的mMCP-1N1pE水平，进行MCP-1N1pE抗体克隆348-2C9的生物素化。
实施例17：等温滴定量热法测量抗MCP-1N1pE抗体的结合亲和性
抗MCP-1N1pE抗体(MCP-1N1pE抗体2C9和生物素化MCP-1N1pE抗体348/2C9)针对抗原hMCP-1(1-38)的结合亲和性用VP-ITC微量热计(MicroCal)确定。两个抗体克隆和MCP-1(1-38)肽对2升150mM NaCl、25mMNa2HPO4、25mM KH2PO4、2mM EDTA pH 7.4在4℃透析过夜以保证相同缓冲液条件及避免由质子化事件导致的背景热。之后，抗体及肽的浓度和各自消光系数从280nm的吸收值计算。为滴定实验，使用浓度分别为1.87μM和29.19μM的MCP-1N1pE抗体2C9和MCP-1(1-38)。通过滴定29个10μlMCP-1(1-38)注射进入抗MCP-1N1pE抗体溶液而在20℃记录结合热。使用所述条件和仪器设置，通过滴定进透析缓冲液确定MCP-1(1-38)肽的稀释液的热发生。之后，通过MicroCal ORIGIN软件分析数据。计算的结合热通过肽稀释液的热量校正。所得曲线通过“One Set of Sites”结合模型拟合，计算化学计量、解离常数、反应焓、反应熵。
实施例18：测量在CSF和血清样品中的人类MCP-1和人类MCP-1N1pE
为测量CSF和血清样品中的hMCP-1和hMCP-1N1pE，使用下述方案：
-在PBS中将山羊抗hMCP-1抗体(R&D systems)稀释至250ng/ml
-在Maxisorp 96孔平板(Nunc)上每孔加入100μl稀释的抗体
-密封平板并在4℃保温过夜
-除去抗体溶液
-通过每孔加入200μl PBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20封闭表面，密封平板并在室温保温2小时
-标准肽的环化:
16.5μl PBS
2μl hCCL2(100mg/ml)
1μl 22%BSA
0.5μl hQC
->在37℃保温1小时
-在PBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20中稀释环化的标准肽(10μg/ml)至10ng/ml及最终至1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml...15.6pg/ml
-在PBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20中1:4稀释血清或CSF样品并转移进深孔平板
-用TBS/0.05%(v/v)Tween-20洗涤平板3次，除去洗涤缓冲液
-将样品和标准肽溶液从深孔平板转移到ELISA平板，每孔100μl
-密封平板并在室温保温2小时
-抗体348/2C9与抗小鼠IgG-HRP(KPL)在室温预保温15分钟，之后在PBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20中稀释预混合物至500ng/ml348/2C9和1μg/ml抗小鼠IgG-HRP
-总hMCP-1抗体(Biolegends)与抗小鼠IgG-HRP(KPL)在室温预保温15分钟，之后在PBS/10%(v/v)FBS/0.05%(v/v)Tween-20中稀释预混合物至500ng/ml 2C9和1μg/ml抗小鼠IgG-HRP
-用TBS/0.05%(v/v)Tween-20洗涤平板3次，除去洗涤缓冲液
-将抗体溶液加入平板，每孔100μl
-密封平板并在室温保温2小时
-用TBS/0.05%(v/v)Tween-20洗涤平板3次，除去洗涤缓冲液
-将色原溶液(SureBlue)加入平板，每孔100μl
-室温黑暗下保温平板30分钟
-每孔加入50μl 1.2N H2SO4终止反应
-在TECAN Sunrise测量450nm/540nm的吸收值
结果和讨论
目前，MCP-1水平的测量是通过一些主要基于ELISA测定的不同方法实现的。
因此已开发一些不同的MCP-1抗体用于检测来自生物学来源的总MCP1。它们已被证明在Western印迹中是有功能的，用于ELISA中的捕获和检测应用，用于细胞内流式细胞术（ICFC），酶联免疫斑点测定（ELISPOT），Bio-Plex细胞因子测定(xMAP技术)，用于免疫组织化学（IHC），用于免疫沉淀（IP）中和受体结合以及其它方法。结果来自不同厂商的抗体和ELISA试剂盒是可以获得的，例如：Abcam,RnD systems,Bio-Rad Laboratories,Bio Source Int.,IBL America,santa cruz biotechnologyinc,.LINCO Research Inc.,Upstate,RayBiotech Inc.,Enzo Biochem Inc.,PeproTech,Lifespan Biosciences及其它。
所有这些抗体及方法有一共同缺点：
它们不能检测MCP-1趋化因子的完整性及因此的受体激活功能性。
第一个N-末端氨基酸残基或者N-末端Gln-Pro二肽的截短降低MCP1趋化因子的受体活性（CCR2）至少两个数量级。
高浓度脯氨酸特异性外肽酶二肽基肽酶4(DP4,DPP4,CD26)的存在快速降低循环中N-末端未修饰的CCL2的水平。如果谷氨酰胺酰残基被翻译后转化为焦谷氨酸，由DP4介导的N-末端截短导致的这个细胞因子失活完全被消除。
另外，通常不被现有MCP-1测定监测的N-末端降解导致MCP-1种类具有相反特征：
残基7-10对于受体脱敏是关键的，但是对于功能是不足够的，功能活性需要残基1-6的完整性。相应于MCP-1,1-10的肽缺乏可检测的受体结合活性，说明残基1-10对于MCP-1功能是关键的，但是也涉及其它残基。一些截短的类似物，包括8-76、9-76和10-76，脱敏MCP-1诱导的Ca2+诱导，但是不是显著活性的。这些类似物是MCP-1活性的拮抗剂，最强的是9-76类似物(ICs0=20nM)。9-76特异结合MCP-1受体，Ka为8.3μM，其是MCP-1的3倍(Kd 2.8nM)。9-76类似物脱敏对MCP-1和MCP-3的Ca2+应答，但是对其它CC趋化因子不是，提示其是MCP受体特异性的(Gong,J.-H.andClark-Lewis,I.(1995)J Exp.Med.161 631-40)。
MCP序列对比
来自8钟哺乳动物物种的成熟MCP-1的序列对比（图1）证实在前76个氨基酸残基中的整体相同性为46%，相似性为79%。特别是前4个N-末端氨基酸残基是绝对保守的，保证受体激动/拮抗作用。不同人类MCP蛋白的比较（图2）揭示在每种成熟蛋白质中均存在N-末端谷氨酰胺。由于不同的受体特异性，相邻的氨基酸残基不是保守的。但是QC可对其发挥作用的N-末端谷氨酰胺残基以及可被DP4裂解的谷氨酰胺-脯氨酸基序这一基本原则（basic principle）仍是保守的。
人类MCP-1(1-76)的蛋白酶解降解研究
在循环中，MCP-1被N-末端pGlu残基保护，其赋予对氨基肽酶例如DP4的N-末端裂解的抗性（图3至6）。作为施用QC抑制剂的结果，未保护的N-末端容易被DP4裂解（图7）。N-末端截短导致人类MCP-1的失活（图12和13）。总之，结果暗示N-末端pGlu形成代表一种保护机制，赋予对后脯氨酸裂解酶（post-proline cleaving enzymes）例如DP4和氨基肽酶P的N-末端降解的抗性（图5）。
组合DP4特异性抑制剂的人类血清对人类MCP-1(1-76)的蛋白酶降解
为进一步研究人MCP-1的蛋白酶解稳定性，由MCP-1与纯化蛋白酶保温获得的数据通过人MCP-1与人血清的保温而证实。人Gln1-MCP-1与人血清的保温显示底物的N-末端截短及前2个氨基酸(Gln1Pro2)的释放。另外，血浆中的QC活性与N-末端蛋白酶解竞争并稳定化MCP-1，最终比率为大约60%截短的Asp3-MCP-1和40%的全长pGlu1-MCP-1（图7A）。另外，人类MCP-1与人类QC的预保温导致形成N-末端pGlu残基，因此导致人类MCP-1的稳定化。至少在选择的时间框架和血清稀释度中，未观测到pGlu1-MCP-1的降解（图7B）。另外，在9.6μM DP4抑制剂异亮氨酰-Thiyzolidide的存在下在血清中保温MCP-1也防止N-末端降解，证实MCP-1被人类血清中的DP4或DP4样活性降解（图7C）。
人类MCP-2、MCP-3和MCP-4的蛋白酶降解
与人类MCP-1的N-末端降解类似，也研究了其它人类MCP即MCP-2、MCP-3和MCP-4对DP4导致的N-末端截短的易感性（图8-10）。如以前针对MCP-1观测到的，N-末端pGlu残基保护MCP-2（图8B）、MCP-3（图9B）和MCP-4（图10B）抗DP4的蛋白酶解降解。但是，以N-末端谷氨酰胺起始的未环化变体易被DP4截短，如对Gln1-MCP-2(图8A)、Gln1-MCP-3(图9A)和Gln1-MCP-4(图10A)所示。因此，N-末端pGlu残基稳定化所有MCP抗氨基肽酶如DP4的截短。因此，提出的概念，降低体内QC活性以引起加速周转及消除化学趋化性和受体激活，适用于MCP家族所有成员。
人类MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4不同N-末端变体的趋化能力
为了研究MCP-1的不同N-末端变体对吸引人类THP-1单核细胞的能力的影响，Gln1-MCP-1、pGlu1-MCP-1和DP4裂解产物Asp3-MCP-1在体外趋化性测定中测试。发现具有N-末端谷氨酰胺酰或焦谷氨酰残基的全长MCP-1在吸引THP-1单核细胞中是相等强度的，最大应答在50ng/ml和100ng/ml之间（图11A）。另外，研究了具有N-末端谷氨酰胺或焦谷氨酸的MCP-2、MCP-3和MCP-4的吸引人类THP-1单核细胞的能力。与MCP-1类似，与各自谷氨酰胺前体相比，在MCP-2和MCP-3的N-末端的pGlu形成对能力无影响（图11B和C11）。但是，对于MCP-4，pGlu形成略微增加肽的能力（图11D）。
为进一步研究QC在稳定化MCP-1中的作用及其对THP-1单核细胞迁移的影响，Gln1-MCP-1与人类DP4保温。在平行样品中，在施加DP4之前MCP-1与人类QC预保温。如所预期，所获得的剂量-应答曲线暗示在50–100ng/ml的最大应答反映的pGlu1-MCP-1的蛋白酶解稳定性。相反，在不存在QC时，Gln1-MCP-1被DP4截短，导致剂量-应答曲线移动到需要更高MCP-1浓度(500-1000ng/ml)引起最大应答。另外，Gln1-MCP-1与QC和QC抑制剂1-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)硫脲盐酸盐的预保温防止pGlu形成，因此使肽易于DP4裂解，观测到与pGlu1-MCP-1相比剂量-应答曲线移动到更高MCP-1浓度（图12）。因此，QC的抑制导致MCP-1通过DP4降解而N-末端去稳定化，因此导致其单核细胞趋化活性失活。
但是，因为谷氨酰胺酰前体被DP4裂解（图8A、9A、10A），也用趋化性测定研究了MCP-2、MCP-3和MCP-4的N-截短的DP4裂解产物的能力。对于所有三种变体，截短2个氨基酸导致趋化因子的部分失活（图13）。因此，在所有已知MCP的N-末端的pGlu形成不仅保护抗N-末端截短，而且保护抗趋化能力的丧失。因此所提出的通过抑制N-末端成熟而减低MCP-1活性的方法适用于人类MCP家族中的所有成员。
用于定量检测总人类MCP-1(hMCP-1)和具有N-末端焦谷氨酸的人类
MCP-1(hMCP-1N1pE)的间接夹心ELISA
为了区分两种形式及确定生物学样品中总hMCP-1和hMCP-1N1pE的定量，我们需要建立两个间接夹心ELISA。图14显示两个特征标准曲线用于检测总hMCP-1(图14A)及hMCP-1N1pE(图14B)。
评价标准肽环化状态对总hMCP-1ELISA的影响
为了排除标准肽环化状态对总hMCP-1ELISA的影响，我们在同一测定中比较了环化的和未环化的重组人类MCP-1的检测（图15）。实验揭示hMCP-1肽环化状态对其在总hMCP-1ELISA中的检测没有影响或者仅微小影响。这证实两个ELISA的捕获抗体以及总hMCP-1ELISA的检测抗体不与hMCP-1的N-末端氨基酸相互作用。这个发现对于验证hMCP-1和hMCP-1N1pE ELISA确定具有变化的hMCP-1N1pE水平的样品中两种肽的比率的能力是重要的。
用ELISA确定刺激的NHDF细胞的细胞培养物上清中的hMCP-1N1pE
/hMCP-1比率
在炎性刺激之后，hMCP-1的表达在人类正常皮肤成纤维细胞（NHDF）中增加。因此，hMCP-1以及MCP-1N1pE的量在将制癌蛋白M（OSM）和白介素1β(IL1β)施用于NHDF之后应该增加。为证明这点，将OSM和IL1β刺激的NHDF细胞培养物上清进行两个ELISA分析。第一个分析hMCP-1的量，第二个分析hMCP-1N1pE部分。获得的数据显示（图16）hMCP-1及hMCP-1N1pE的量在通过施用OSM和IL1β进行炎性刺激后以时间依赖性方式在NHDF细胞培养物中增加。hMCP-1N1pE相对于总hMCP-1水平的比例范围在70%-95%之间，表示成熟MCP-1的接近完全的N-末端焦谷氨酸修饰。
确定用谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂(QCI)处理的正常人类皮肤成纤维细
胞中的hMCP-1N1pE/hMCP-1比率
因为谷氨酰胺酰基环化酶(QC)催化形成N-末端焦谷氨酸残基，QC的抑制应导致降低的hMCP-1N1pE水平。为证明这点，NHDF用OSM和IL1β刺激并同时用或不用QCI处理。
如实施例7所示（图16），总hMCP-1及hMCP-1N1pE的量在施用炎性细胞因子后以时间依赖性方式增加。加入QCI导致降低的hMCP-1N1pE水平。然而hMCP-1N1pE/hMCP-1的比率在未处理的NHDF中是大约1，QCI处理的细胞显示比例大约为0.35。在OSM+IL1β刺激1-2天后，hMCP-1N1pE水平甚至低于hMCP-1N1pE ELISA的定量极限(LOQ)（见图17）。
确定用不同浓度QCI处理的人类肺癌细胞系（A549）中的hMCP1N1pE
/hMCP1比率
癌症人类肺泡基底上皮细胞系A549用不同浓度QCI处理以分析hMCP-1N1pE的QCI浓度依赖性降低。MCP-1N1pE的量由QCI以浓度依赖性方式降低，而总hMCP-1的量几乎不受影响（图18）。因此，hMCP-1N1pE/hMCP-1比率随着抑制剂浓度增加而降低（图18B）。
hMCP-1和hMCP-1N1pE在人类血清中的掺加和恢复
表2示出针对添加到人类血清中的hMCP-1所获得的掺加和恢复数据。发现了掺加的重组hMCP-1肽的66%-81%的恢复。
表2：人类血清中hMCP-1的掺加和恢复
表2示出与观测的hMCP-1浓度相比的预期掺加水平。
表3示出针对添加到人类血清中的hMCP-1N1pE所获得的掺加和恢复数据。发现掺加的hMCP-1N1pE肽的66%-79.4%的恢复。
表3:人类血清中hMCP-1N1pE的掺加和恢复
表3示出与观测的hMCP-1N1pE浓度相比的预期掺加水平。
这些数据证实，实施例5所述的ELISA（图14）可以用于定量检测人类血清中的hMCP-1和hMCP-1N1pE。掺加的肽的恢复对于两个ELISA是相当的并且拟合在可接受范围。
建立间接夹心ELISA用于定量检测总小鼠MCP-1(mMCP-1)和具有N-
末端焦谷氨酸的小鼠MCP-1(mMCP-1N1pE)
为了分析小鼠样品中的mMCP-1和mMCP-1N1pE水平，需要开发测定用于定量小鼠MCP-1和小鼠MCP-1N-1pE。因为MCP-1N1pE抗体克隆348-2C9与小鼠MCP-1N1pE交叉反应，这个抗体用于建立间接夹心ELISA用于检测mMCP-1N1pE。另外，开发了可比的间接夹心ELISA用于检测总mMCP-1和区分两种形式的细胞因子。图19显示两个特征标准曲线用于检测mMCP-1N1pE和总mMCP-1。
评价标准肽环化状态对总mMCP-1ELISA的影响
图20证实mMCP-1肽环化状态不干扰总mMCP-1的ELISA检测。这保证总小鼠MCP-1和小鼠MCP-1N-1pE ELISA测量的独立性并证明确定的mMCP-1N1pE/mMCP-1比率的正确性。
确定用不同浓度QCI处理的LPS刺激的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7中
的mMCP-1N1pE/mMCP-1比率
为了分析QCI对小鼠MCP-1N1pE/小鼠MCP-1比率的作用，小鼠巨噬细胞系RAW 264.7在不存在或存在增加浓度的QC抑制剂QCI下用LPS刺激。mMCP-1N1pE的量由QCI以浓度依赖性方式降低，而总mMCP-1的量保持不受影响。因此，与实施例9的结果类似，mMCP-1N1pE/mMCP-1的比率随着抑制剂浓度增加而降低（见图21）。
通过Western印迹分析交叉验证RAW 264.7细胞培养物上清中的
mMCP-1N1pE水平
进行了Western印迹分析以证实在施用QCI之后在ELISA实验中见到的降低的mMCP-1N1pE水平。实验使用用不同QCI处理的RAW 264.7细胞培养物上清进行。在由检测总mMCP-1的抗体大鼠抗小鼠MCP-1产生的Western印迹信号强度中无变化（图22B）。但是，mMCP-1N1pE的Western印迹信号是浓度依赖性的（图22A）并且与相应的ELISA数据相关（图22C），显示不同量的mMCP-1N1pE。这个实验使用另一测定证实ELISA数据的正确性。
测量抗MCP-1N1pE抗体348/2C9与生物素化MCP-1N1pE抗体克隆348/2C9相比的结合亲和性
MCP-1N1pE抗体348/2C9与抗原hMCP-1(1-38)的结合获得:
化学计量: 1.83
解离常数: 151nM
反应焓: -7.679kcal/mol
反应熵: 5.01cal/mol·K。
在生物素化反应之后，衍生的抗体的性质已经变为：
化学计量: 1.41
解离常数: 444nM
反应焓: -11.44kcal/mol
反应熵: -9.96cal/mol·K
活性抗体蛋白的丧失及亲和性降低通过用于ELISA实验的抗体浓度增加而补偿（实施例16）。
确定液体小鼠样品中的mMCP-1N1pE/mMCP-1比率
施用生物素化MCP-1-N1pE抗体降低抗小鼠IgG-HRP缀合物对液体小鼠样品中未知抗原的潜在交叉反应性。生物素化MCP-1N1pE抗体导致30%活性丧失（图25）。这可以通过增加标准肽浓度至3000pg/ml补偿（图24）。
确定用硫代乙醇酸盐和不同浓度QCI处理的小鼠中的mMCP-1N1pE/
mMCP-1比率
为进一步研究QC抑制剂施用对体内mMCP-1N1pE/mMCP-1比率的作用，施用QCI于硫代乙醇酸盐诱导的腹膜炎。
除了确定mMCP-1N1pE/mMCP-1比率，还确定了腹腔灌洗液的细胞组成，特殊重点在浸润单核细胞（Moma2-阳性单核细胞/巨噬细胞）。
实验导致在QCI施用后mMCP-1N1pE/mMCP-1比率的剂量依赖性降低（图23所示）。另外，证实了mMCP-1N1pE水平和侵袭进腹膜的单核细胞的关系（图23B）。降低的mMCP-1N1pE/mMCP-1比率导致降低数目的单核细胞浸润进腹膜。
这种单核细胞的募集是一些炎性疾病的一般特征，例如但不限于胰腺炎、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和再狭窄。
实验证明MCP-1N1pE/MCP-1比率作为生物标记监测MCP-1的单核细胞募集能力的实用性。另外，MCP-1N1pE/MCP-1比率的测量提供了鉴定QC抑制剂在各种炎性疾病中应用的能力的方法。
ELISA测量来自10个健康志愿者的人类CSF和血清样品中的MCP-1和MCP-1N1pE
MCP-1和MCP-1N1pE的浓度在一个平板上确定，测定内差异为1.8%，以及在两个不同平板上确定，测定内差异为2.8%，表明用于分析人类CSF和血清样品的大的鲁棒性（great robustness）。获得的ELISA信号分别高于总hMCP-1和hMCP-1N1pE ELISA的LOQ的12倍和6倍，提供了在QC抑制剂存在和不存在下基线MCP-1水平的测量以观测治疗疾病相关作用。
Claims (32)
1.诊断或监测炎性疾病或炎性相关疾病或其对治疗的应答的方法，包括确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
2.权利要求1的方法，其中所述确定包括如下步骤：
(a)确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的第一浓度(ca)；
(b)确定所述生物学样品中总MCP-1的第二浓度(cd)；及
(c)确定ca/cd的比率，其中第一浓度(ca)的值除以第二浓度(cd)的值。
3.权利要求2的方法，其中ca/cd比率是50%、70%或85%。
4.权利要求2的方法，其中步骤(a)包括：
i) 将生物学样品与特异于MCP-1的捕获抗体接触，
ii) 施加特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体，
iii) 检测所得的免疫复合物，及
iv) 定量捕获的N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1复合物。
5.权利要求4的方法，其中特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体包括由选自下组的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体：
348/1D4 (保藏号DSM ACC 2905);
348/2C9 (保藏号DSM ACC 2906);
332/4B8 (保藏号DSM ACC 2907);和
332/4F8 (保藏号DSM ACC 2908)。
6.权利要求5的方法，其中特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的检测抗体包括由选自348/2C9(保藏号DSM ACC 2906)的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。
7.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括：
i) 将生物学样品与特异于MCP-1的捕获抗体接触，
ii) 施加特异于MCP-1的检测抗体，
iii) 检测所得的免疫复合物，及
iv) 定量捕获的MCP-1复合物。
8.权利要求7的方法，其中特异于MCP-1的捕获抗体包括：
多克隆抗血清山羊抗hMCP1-AF(R&D Systems,Minneapolis,USA)
兔多克隆抗MCP-1抗体ab18072(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab9669(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab18072(Abcam,Cambridge,UK);
山羊MCP-1抗体(C-17):sc-1304(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,USA);
多克隆抗血清兔抗mJE(Peprotech,Hamburg,Germany);
兔多克隆抗mMCP-1抗体ab9899(Abcam,Cambridge,UK);
兔多克隆抗MCP-1抗体ab7202(Abcam,Cambridge,UK);和
大鼠单克隆MCP-1抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,USA)。
9.权利要求8的方法，其中特异于MCP-1的捕获抗体包括多克隆抗血清山羊抗hMCP1-AF。
10.权利要求7的方法，其中特异于MCP-1的检测抗体包括：
小鼠抗hMCP-1(Peprotech,Hamburg,Germany);
小鼠单克隆抗MCP-1抗体ab17715(Abcam,Cambridge,UK);
小鼠单克隆MCP-1抗体sc-32819(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,USA);
抗小鼠MCP-1(R&D Systems,Minneapolis,MN USA);
仓鼠单克隆MCP-1抗体ab21397(Abcam,Cambridge,UK);
大鼠单克隆MCP-1抗体ab8101(Abcam,Cambridge,UK);和
大鼠单克隆MCP-1抗体(JJ5):sc-74215(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,USA)。
11.权利要求4-10任一项的方法，其中复合物的检测通过使用与每个检测抗体特异性反应的二抗进行。
12.权利要求11的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗体或抗兔抗体。
13.权利要求12的方法，其中所述二抗是抗小鼠抗体。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述二抗是被标记的。
15.权利要求14的方法，其中所述二抗是用辣根过氧化物酶（HRP）标记的。
16.权利要求4-15任一项的方法，其中定量检测的免疫复合物。
17.权利要求4-16任一项的方法，其中捕获的复合物用选自下组的定量手段定量：ELISA，如间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、反向ELISA、酶联免疫吸附斑点测定；流式细胞术；多重测定系统；免疫组织化学；免疫沉淀；及Western印迹分析。
18.权利要求17的方法，其中用夹心ELISA作为定量手段定量捕获的复合物。
19.权利要求1-18任一项的用途或方法，其中生物学样品选自血液、血清、尿、脑脊液（CSF）、血浆、淋巴、唾液、汗液、胸膜液、滑液、眼泪、胆汁和胰腺分泌物。
20.权利要求19的方法，其中生物学样品是血清。
21.确定谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂在生物学样品内的效力以及作为应用QC抑制剂的治疗中谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制的替代标记的效力的方法。
22.确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例的方法，包括如下步骤：
（a）确定生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的第一浓度(ca)；
（b）确定所述生物学样品中总MCP-1的第二浓度(cd)；及
（c）确定ca/cd的比率，其中第一浓度(ca)的值除以第二浓度(cd)的值。
23.筛选谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的方法，包括如下步骤：
(a)保温包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶（QC）的对照样品以及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例；
(b)将具有包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶（QC）的混合物的对照样品与谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂一起保温及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例；
从而步骤(b)中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1:总MCP-1的比率相对于步骤(a)中的降低指示谷氨酰胺酰基环化酶抑制。
24.测量谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂的效力的方法，包括将谷氨酰胺酰基环化酶(QC)抑制剂与包含MCP-1和谷氨酰胺酰基环化酶(QC)的混合物保温，及确定N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
25.用于诊断炎性疾病或炎性相关疾病的试剂盒，其包括特异于N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1的捕获抗体，特异于MCP-1的捕获抗体，以及根据权利要求1-20任一项的方法使用所述试剂盒的说明。
26.一种在患有、怀疑患有或有倾向患有炎性疾病或炎性相关疾病的对象中监测治疗的效力的方法，包括根据权利要求1-20任一项所述确定在来自测试对象的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
27.权利要求1-20或26任一项所述的诊断或监测方法，其包括确定在两或多种场合从测试对象取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
28.权利要求27所述的诊断或监测方法，其包括比较在两或多种场合取出的生物学样品中N-末端焦谷氨酸修饰的MCP-1相对于MCP-1总浓度的比例。
29.前述任一项权利要求的用途、方法或试剂盒，其中炎性疾病或炎性相关疾病选自神经变性疾病、慢性和急性炎症、纤维化、癌症、代谢疾病、与高胰岛素血症和肥胖相关的其它炎性疾病或病理。
30.权利要求29的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、哮喘、迟发型超敏反应、胰腺炎、阿尔茨海默病、肺纤维化、肾纤维化、妊娠中毒、移植物排斥、神经性疼痛、糖尿病肾病、结肠炎、中风、AIDS和肿瘤。
31.权利要求29或30的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、再狭窄和胰腺炎。
32.权利要求29-31任一项的用途、方法或试剂盒，用于检测和诊断阿尔茨海默病或类风湿性关节炎。
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