CN102936620B - 利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法及产物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，属于功能高分子领域。该方法的过程包括将聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯荧光共聚物经卤代烷质子化制成带有正电荷的聚电解质，并将这种聚电解质与直链或者发卡结构的DNA作用形成新型荧光探针来检测目标DNA的方法。该方法的优点在于：是一种制备简单、操作简易、行之有效的新型荧光探针，将为稳定、高效、特异性识别核酸分子开辟一种新途径并在揭示疾病与基因变异等方面具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，特别是涉及一种利用非共轭荧光共聚物与直链或者发卡结构的DNA通过静电作用形成新型的分子探针来检测目标DNA的方法，属于功能高分子技术领域。
背景技术
功能高分子在生物医学领域中的应用，特别是荧光高分子在分析、检测生物大分子方面的研究已引起国内外科学工作者的密切关注，此研究方向也是国际上前沿科学的研究热点。一些小分子荧光染料如吖啶、菲啶类染料、菁类染料、荧光素和罗丹明类染料、噻嗪和噁嗪类染料等是目前应用较广的核酸荧光探针，这些简单的荧光染料对核酸分子的序列不能特异识别，属于非特异性的小分子探针。为了克服上述不足，科学工作者将荧光基团通过共价键连结到单链寡聚核酸分子上，例如：Saito、Hrdlicka等人分别设计了一种芘标记到核酸上的线性荧光探针，发现这种荧光标记的分子探针与碱基序列互补的核酸分子通过Watson-Crick碱基配对法则形成杂化复链，靶向杂化前后的荧光性能发生重大变化，从而实现了荧光探针特异性识别核酸分子（J.Am.Chem.Soc.,2004,126,4820；Chem.Commun.,2010,46,4929）。Wang等人也设计了一种芘标记HNA及RNA线性探针，发现靶向杂化后芘单体的荧光强度增加而激基复合物的荧光强度剧烈下降，从而实现对目标分子的检测（ChemBioChem.,2009,10,1175）。然而相对于线性的分子探针，它是一种茎端有一对荧光基团和淬灭集团修饰的发卡结构的分子探针，也称为分子信标，具有一些关键的优点：提高错配目标的热识别及降低假阳性信号的风险。因而在生物研究领域受到更为广泛的关注。Tan等人在分子信标的设计及应用方面做出了很多杰出的成果，包括生物传感器的设计、核酸的检测及生命系统的监测等等（J.Am.Chem.Soc.,2008,130,8351.；Angew.Chem.,2001,113,416;Angew.Chem.Int.Ed.,2001,40,402.；Anal.Chem.,2005,77,4713）。然而，研究结果表明：标记型荧光探针检测核酸分子的缺点在于：荧光基团的引入会降低荧光探针与靶向分子杂化双链的热稳定性，从而会降低荧光探针的检测精度；标记型荧光探针需要将荧光基团通过共价键连结到寡聚核酸分子链上以实现特异性识别核酸分子，而其中的合成与操作较繁杂。
近几年，水溶性的荧光共轭聚电解质作为非标记性的荧光探针荧光在生物传感应用领域上得到越来越多的研究者的亲睐。He等人报道了一种用共轭聚电解质制备的非标记型的多路复用的DNA探针来检测DNA杂交时信号的转输（J.Am.Chem.Soc.,2009,131,3432）。Bazan等人通过用一种水溶性的阳离子共轭聚电解质设计均质的荧光探针（Chem.Mater.,2004,16,4467）。王树等人也报道了一种充分利用分子信标在错配识别的优势及共轭聚电解质较高的量子产率的性质而制备的检测DNA的分子探针，以及还报道了用包含有共轭聚电解质的荧光胶束检测DNA和酶等等（Langmuir.,2008,24,12138；Langmuir.,2009,25,13737；Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48,5316）。这些荧光共轭聚电解质可通过静电作用与生物大分子结合，通过荧光共振能量转移FRET或电子转移、分析物诱导荧光高分子聚集态结构变化、分析物诱导荧光高分子构象变化等可导致这种荧光高分子的光学性能改变，进而对生物大分子进行检测。虽然共轭聚电解质有广泛地应用为生物传感器的材料，但非共轭荧光聚电解质作为生物传感器材料尚未见报道。本专利发明了一种新的非标记的荧光聚电解质，将其通过静电作用与DNA形成一种新型的非标记的荧光探针，这种荧光聚合物克服了小分子荧光探针的非特异性识别及标记性荧光探针的制备繁杂等缺点，为生物大分子的检测开辟了一种新的测试方法。
申请人申请的专利名称为一种利用丙烯酸芘甲酯制备水溶性共聚物的方法，申请号：201110430560.7的专利申请，公开了未质子化之前的聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的合成方法，本申请在此全文引用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成方法简单，且含有荧光量子产率较高的芘荧光基团的非共轭聚电解质，通过静电作用结合直链或者发卡结构的DNA形成新型的分子探针来检测目标DNA的方法。
本发明特点在于利用非共轭聚电解质与DNA结合，形成新型的分子探针，该非共轭聚电解质合成路线简单易行，所合成的聚合物的侧链上引入了荧光量子产率较高的且对周围环境有很强的敏感性的芘荧光基团和亲水性的胺基基团，使该聚电解质能很好地应用于生物等方面的检测。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明利用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物经卤代烷质子化制成带正电荷的含芘荧光基团的聚电解质，并将这种聚电解质与直链或者发卡结构的单链DNA作用形成新型荧光探针来检测目标DNA。
一种用聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，按照下述步骤进行：
（1）共聚物质子化的反应：
将聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物和适量的碘甲烷按物质的量为1:3溶于有机溶剂四氢呋喃中，在常温下反应24小时。反应结束后，将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将最终的荧光聚电解质在真空干燥箱中以70℃温度干燥12小时，合成路线如图1所示。
（2）新型荧光分子探针的配制：
用缓冲溶液PBS（10Mm,pH=7.4）将（1）中制得聚电解质稀释制成原溶液，同样，分别用缓冲溶液PBS（10Mm,pH=7.4）将直链结构的单链DNA1或者发卡结构的单链DNA2溶解，最后，再取适当的聚电解质溶液与DNA1或者DNA2溶液混合，通过静电作用行成新型的直链或者发卡结构的荧光分子探针。
（3）DNA杂交样品的配制：
用缓冲溶液PBS（10Mm,pH=7.4）稀释不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt。其中DNA3与DNA1完全互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补；DNA1与DNA2部分互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补。分别取一定量溶解好的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt加入（2）中配好的荧光探针样品溶液中，最后将配好的所有溶液经过5min的90℃的热处理，再在40℃下保温半小时。
所述的步骤（1）所合成的聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯聚电解质结构为：
其中x/y=1:10~1:400。R=CH3,CH2CH3,CH2CH2CH3,CH2CH2CH2CH3；X=I,Br。
所述的步骤（1）所合成的聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯聚电解质中含有荧光基团芘，并且除了荧光基团芘外，其他荧光基团如：葱、蒽、萘等荧光基团也可以。
所述的步骤（1）聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物与碘甲烷溶于有机溶剂四氢呋喃，将共聚物质子化，其中荧光共聚物与碘甲烷的物质量之比1:1~1:10。
所述的步骤（2）和（3）所用的缓冲溶液为PBS（10Mm,pH=7.4），所用的DNA分别为：DNA1：5′-GCA CAT ACA TTC TAC TTG-3′;DNA2：5'-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3′；DNA3：5′-CGTGTA TGT AAG ATG AAC-3′；DNAa：5′-AAA AAA AAA AAAAAAAAA-3′；DNAc：5′-CCC CCC CCC CCC CCC CCC-3′；DNAt：5′-TTTTTT TTT TTT TTT TTT-3′，其中DNA2是发卡结构的，DNA1、DNA3、DNAa、DNAc和DNAt是直链结构。
所述的步骤（3）配好的样品溶液，其中，在DNA浓度是10-6M时，聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的浓度在10-6~10-8M都能实现对目标DNA的检测。
本发明的方法具有如下特点：
（1）所制的荧光聚电解质与直链或者发卡结构的DNA通过静电作用结合形成分子探针，此时由于碱基淬灭作用，使芘的荧光强度较大地降低。
（2）所制的荧光聚电解质与直链或者发卡结构的DNA通过静电作用结合形成分子探针，当向探针溶液中加入互补DNA单链时，荧光强度进一步明显降低，而加入不互补DNAa、DNAc和DNAt单链时，荧光强度相对变化不大，从而迅速地检测到目标DNA。
本发明的利用非共轭荧光聚电解质检测DNA的方法简单，具有较好的选择性和灵敏性，为生物传感检测领域打开新的研究方向。
附图说明
图1为本发明实例1聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的合成路线；
图2为聚丙烯酸芘甲酯-聚（甲基）丙烯酸二甲胺乙酯共聚物的1HNMR；
图3为本发明实例2所制备的样品P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAc，
P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAt，对应着图3（a）（b）的1、2、3、4、5、6荧光性能图；样品P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAt，对应着3（c）（d）的1、2、3、4、5、6荧光谱图。
图4为本发明检测目标DNA原理说明图。
图5为本发明实例3样品DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3对应着图5（a）的1、2圆二色谱图；样品DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1对应着图5（b）的1、2圆二色谱图。
图6为本发明实例4所制备的样品P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAc，
P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAt，对应着图6（a）（b）的1、2、3、4、5、6KI淬灭图；样品P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAc，
P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAt，对应着图6（c）（d）的1、2、3、4、5、6KI淬灭图。
具体实施方式
实例1
向25ml的洁净单口圆底烧瓶中加入2ml干燥处理后的四氢呋喃溶剂,再分别加入0.3mmol共聚物，0.9mmol碘甲烷，在室温下反应24小时，反应结束后，将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将最终的荧光聚电解质(P(DMAEMA+-co-Py))在真空干燥箱中以70℃温度干燥12小时。
实例2
（1）样品的配制：称取适量的荧光聚电解质P(DMAEMA+-co-Py)溶于缓冲液PBS中，使其原始浓度为1×10-5M，用1ml的缓冲液分别去稀释每管装有1od的DNA1，DNA2，DNA3，DNAa，DNAc，DNAt，其中DNA2是发卡结构的，DNA1、DNA3、DNAa、DNAc和DNAt是直链结构，并且DNA2与DNA1部分互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补，DNA1与DNA3完全互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补。再分别取适量的荧光聚电解质缓冲液和DNA的缓冲液，最终配成P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAa ，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAt，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAt 11个样品溶液，其中每个样品溶液中，荧光聚电解质的浓度保持6.0×10-8M,DNA的浓度保持1×10-6M。
（2）样品热处理：将（1）中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理5分钟，然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理半小时。
最后对（2）中所有样品进行荧光检测。荧光结果如图3所示。从荧光图中，可以看出，所制的荧光聚电解质与直链结构的DNA1或者发卡结构的DNA2通过静电作用结合形成分子探针，此时由于碱基淬灭作用，使芘的荧光强度较大地降低。当向探针溶液P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1中加入完全互补DNA3单链或者向探针溶液P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2中加入部分互补DNA1单链时，荧光强度进一步明显降低，而加入不互补DNAa、DNAc和DNAt单链时，荧光强度相对变化不大，这是由于加入互补的单链时，形成双螺旋结构，使得荧光基团芘嵌插进入双链中，如图4所示，使得芘处于疏水环境，加强了对芘荧光的淬灭，而且，由于嵌插进入双链，使得碱基淬灭得到进一步加强，所以加入互补链时，芘的荧光强度进一步明显淬灭，从而迅速地检测到目标DNA。
实例3
（1）样品的配制：称取适量的荧光聚电解质P(DMAEMA+-co-Py)溶于缓冲液PBS中，使其原始浓度为1×10-5M，用1ml的缓冲液分别去稀释每管装有1od的DNA1，DNA2，DNA3，其中DNA2是发卡结构的，DNA1、DNA3是直链结构，并且DNA2与DNA1部分互补，DNA1与DNA3完全互补。再分别取适量的荧光聚电解质缓冲液和DNA的缓冲液，最终配成P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，DNA2+DNA14个样品溶液，其中每个样品溶液中，荧光聚电解质的浓度保持4.0×10-6M,DNA的浓度保持1×10-4M。
（2）样品热处理：将（1）中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理5分钟，然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理半小时。
最后对（2）中所有样品进行圆二色谱检测，检测结果如图5所示，从圆二色谱图上可以看出，相对于只含有杂化双链的DNA1+DNA3，DNA2+DNA1圆二色谱图，加入荧光聚电解质即样品P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1的圆二色谱图发生明显的变化，若荧光聚电解质与DNA发生静电或沟壑作用时，不足以影响DNA双链的圆二色谱图，只有嵌插作用才足以使双链结构发生揉动，从而改变DNA双链结构本身的圆二色谱图。所以，由圆二色谱图进一步证实荧光基团芘嵌插进入DNA双链结构中，从而检测出互补DNA。
实例4
（1）样品的配制：称取适量的荧光聚电解质P(DMAEMA+-co-Py)溶于缓冲液PBS中，使其原始浓度为1×10-5M，用1ml的缓冲液分别去稀释每管装有1od的DNA1，DNA2，DNA3，DNAa，DNAc，DNAt，其中DNA2是发卡结构的，DNA1、DNA3、DNAa、DNAc和DNAt是直链结构，并且DNA2与DNA1部分互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补，DNA1与DNA3完全互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补。再分别取适量的荧光聚电解质缓冲液和DNA的缓冲液，最终配成P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAt，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAt11个样品溶液，其中每个样品溶液中，荧光聚电解质的浓度保持6.0×10-8M,DNA的浓度保持1×10-6M。
（2）样品热处理：将（1）中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理5分钟，然后迅速移至到40℃的烘干箱热处理半小时。
（3）KI淬灭实验：在（2）中所配好的样品中滴加事先用去离子水配好的浓度为0.06M的KI溶液，每次滴加5μL，每滴加一次，测一次荧光，每个样品重复滴加10次，从而计算出每个样品的淬灭常数，其中淬灭常数的计算公式如下：
I0/I=1+KSV[I-]
由图6可以得出，样品P(DMAEMA+-co-Py)，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNAt的淬灭常数分别为1.76×103,0.77×103,0.55×103,0.83×103,0.93×103,and 0.76×103M-1,显然样品P(DMAEMA+-co-Py)+DNA1+DNA3的淬灭常数是最小的，同样，样品P(DMAEMA+-co-Py)+，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAa，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAc，P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNAt淬灭常数中，样品P(DMAEMA+-co-Py)+DNA2+DNA1的淬灭常数最小，这是由于荧光基团嵌插到双链DNA中，使荧光基团芘得到较好的保护，避免周围I-对芘的淬灭，此现象进一步证实了荧光基团芘通过嵌插到双链DNA中。
Claims (4)
1.一种利用聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物检测核酸序列的方法，所述的方法步骤包括：
(1)共聚物的质子化：
将聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯和碘甲烷溶于有机溶剂四氢呋喃中，在常温下反应24小时；反应结束后，将溶剂四氢呋喃过滤掉，然后再用索氏提取器提取产物，其中提取剂为四氢呋喃，提取时间为12小时，最后再将荧光聚电解质P(DMAEMA+-co-Py)在真空干燥箱中以70℃温度干燥12小时；
(2)新型荧光分子探针的配制：
用缓冲溶液PBS：10Mm，pH＝7.4，将(1)中制得聚电解质稀释制成原溶液，同样，分别用缓冲溶液PBS：10Mm,pH＝7.4，将直链结构的单链DNA1或者发卡结构的单链DNA2溶解，最后，再取适当的聚电解质溶液与DNA1或者DNA2溶液混合，通过静电作用行成新型的直链或者发卡结构的荧光分子探针；
(3)DNA杂交样品的配制，采用荧光光谱法及圆二色谱法对相关核酸序列进行检测：
用缓冲溶液PBS：10Mm,pH＝7.4，稀释不同序列的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt；其中DNA3与DNA1完全互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补；DNA1与DNA2部分互补配对，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补；分别取一定量溶解好的DNA3，DNAa，DNAc，DNAt加入(2)中配好的荧光探针样品溶液中，最后将配好的所有溶液经过5分钟的90℃的热处理，再在40℃下保温半小时；
所述的步骤(3)所用的缓冲溶液为PBS：10Mm,pH＝7.4，所用的DNA为直链结构或者发夹结构：DNA1：5′-GCA CAT ACATTCTACTTG-3′；DNA2：5'-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3′；DNA3：5′-CGT GTATGT AAG ATG AAC-3′；DNAa：5′-AAA AAA AAA AAAAAA AAA-3′；DNAc：5′-CCC CCC CCC CCC CCC CCC-3′；DNAt：5′-TTT TTT TTTTTT TTT TTT-3′，其中DNA2是发卡结构的，DNA1、DNA3、DNAa、DNAc和DNAt是直链结构，并且DNA2与DNA1部分互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补，DNA1与DNA3完全互补，与DNAa，DNAc，DNAt完全不互补。
2.按照权利要求1所述的的方法，其特征在于：所述的步骤(1)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物含有芘荧光基团，使合成的聚电解质具有荧光性。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物含有水溶性的胺基基团。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(1)聚丙烯酸芘甲酯-聚(甲基)丙烯酸二甲胺乙酯共聚物与卤代烷BrCH3,或ICH3,或BrCH2CH3,或ICH2CH3,或BrCH2CH2CH3,或ICH2CH2CH3,或BrCH2CH2CH2CH3,或ICH2CH2CH2CH3，溶于有机溶剂四氢呋喃，将共聚物质子化，增强了共聚物的水溶性，其中荧光共聚物与卤代烷的物质量之比1:1～1:10。
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| On the binding of Cationic Water-Soluble Conjugated Polymers to DNA: Electrostatic and Hydrophobic Interactions;Fan Xia et al;《NIH Public Access》;20100203;第132卷(第4期);第1－3页 * |
| 荧光聚合物研究进展;武照强等;《化学进展》;20070930;第19卷(第9期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102936620A (zh) | 2013-02-20 |
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