CN102935996B - 血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，步骤为：（1）采用MEMS工艺在玻璃基片上制作微型化磁通门传感器；（2）在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面；（3）Au膜上生物敏感膜的制备；（4）肿瘤标志物单克隆抗体的固定；（5）抗原点样；（6）生物素化抗体固定；（7）磁性标签固定。本发明将微型化磁通门传感器用于血清肿瘤标志物检测，检测速度快，易于批量生产，可以满足现有临床应用的需求。

Description

血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法

技术领域

本发明涉及医学检测方法与磁性传感技术领域，具体地，涉及血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法。

背景技术

恶性肿瘤是当今威胁人类健康和生命的主要疾病之一，且发病率有逐年上升的趋势。目前临床主要的肿瘤检测手段包括：

[1]实验室检查：主要包括血、尿、大便的常规检查、生化及免疫检查、病理学检查等。

[2]放射学检查：主要包括X光透视、X光摄片、X光造影检查、CT扫描、核磁共振成像等。

[3]放射性核素检查：即同位素检查，包括功能测定检查、扫描及伽玛照射检查、放射免疫分析等。

[4]超声波检查：包括A型、B型超声波检查。

[5]内窥镜检查：包括各种硬性或光学纤维镜。

在肿瘤的研究和临床实践中，早期发现、早期诊断、早期治疗是关键。目前常规的影像方法如X线、CT、核磁共振、B超等仅能发现0.5cm以上的肿块，这时部分肿瘤已经处于中晚期，有的肿瘤已经发生了转移，多数病人已经丧失了最佳的治疗时机。血清肿瘤标志物在肿瘤普查、诊断、判断预后和转归、评价治疗疗效等方面都具有较大的实用价值。血清肿瘤标志物检测已经成为早期发现肿瘤的方法之一，目前已经发展了多种血清肿瘤标志物检测技术并不断地应用于临床如免疫放射分析法、酶标记免疫分析技术、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、液体芯片检测技术等，这些方法各有其优点，如液体芯片一次能检查出多种肿瘤标志物，和多次检测相比降低了成本。但这些方法的不足之处在于缺乏灵活性，单项指标敏感性低、特异性较差。在检测速度、准确率和检测费用方面均存在缺陷，因此利用多学科交叉的优势研制新型肿瘤标志物检测的生物传感器技术显得尤为重要。

生物传感器是利用生物活性材料(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜等)与物理化学换能器(如电化学、光学、机械、电、磁等)有机结合构成的一种生物信息检测分析工具。由于生物传感器在医疗保健、疾病诊断、食品安全检测等具有广泛的用途，受到了世界各国科学家的深入研究和大力研发；然而仍存在一些因素限制了生物传感器的大规模应用和推广，如传统生物传感器的分析操作步骤太多、分析周期长、价格昂贵、体积大、昂贵的光学检测设备及需要训练有素的专业人员才能完成等。近年来，由于免疫磁珠技术的不断进展和传感器技术的发展，科学家们提出了将磁传感器并结合磁性标签研制用于生物学、医学、遗传学、毒物学等生物信息探测的新一代生物传感器。利用磁传感器并结合磁性标签用于探测生物分子的理念最早是由美国海军实验室的Baselt等[Baselt D.R.,Lee G.U.,Natesan M.,Metzger S.W.,Sheehan P.E.,Colton R.,A biosensor based on magnetoresistancetechnology,Biosens.Bioelectr.17(1998)731.]于1998年提出的，由此开启了磁生物传感器研究的热潮。目前已报道的用于磁性纳米粒子(磁珠)检测的磁传感器，主要有电磁感应式传感器、超导量子干涉器、磁通门传感器、磁阻传感器、霍尔传感器、巨磁电阻传感器和巨磁阻抗传感器等。磁通门传感器作为一种弱磁场检测器件，近年来在卫星发射、运载火箭、航天器等更是作为姿态敏感器而被广泛使用，然而传统的磁通门传感器具有体积大、高重量、功耗大及长期稳定性差等缺点。90年代以来，微机电系统(MEMS)技术的飞速发展，为微型化磁通门传感器的研制提供了一条有效可靠的途径。采用MEMS技术研制微型化、集成化的磁通门传感器成为国内外研究开发的热点。与传统的磁通门传感器相比较，MEMS磁通门传感器结构紧凑，体积小、质量轻，安装调试简单，不怕震动撞击，受环境温度变化影响小，在磁场检测与生物医学检测方面展示出广阔的应用前景。

经对现有技术的文献检索发现，Dieckhoff等(Diechhoff J.,Schilling M.,LudwigF.)在《Appl.Phys.Lett.》(美国应用物理快报)《Vol.99，pp.112501，2011》提出使用磁通门传感器来探测磁性纳米粒子，证明了磁通门传感器在生物医学检测领域的可行性，但该研究工作只是得到了磁通门传感器对Fe3O4磁性纳米粒子的响应，没有实现对生物标志物的检测。

随着微机电系统(MEMS)技术的发展，利用MEMS技术制备的微流控芯片已应用于生物与医学检测领域，而MEMS技术同样可用来制造微型化、集成化的磁通门传感器。将生物信息的固定与微型化磁通门传感器相结合构建新型血清肿瘤标志物检测系统，利用磁性纳米粒子标签对血清肿瘤标志物进行检测，具有重要的研究意义和临床价值。通过文献和专利检索，没有发现关于将微型化磁通门传感器用于血清肿瘤标志物检测的相关研究成果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有血清肿瘤标志物检测技术的不足以及临床的实际需求，提供一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法。

为实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，包括如下步骤：

(1)采用MEMS工艺制作微型化磁通门传感器；

优选地，所述微型化磁通门传感器位于玻璃基片上，可以采用现有技术实现，比如专利申请号为200910046099.8的中国专利中记载的传感器，当然也可以采用其他能实现本发明功能的微型化磁通门传感器。磁芯可以为NiFe薄膜、非晶和纳米晶软磁带材材料，并采用MEMS工艺进行加工。

(2)在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面。

优选地，所述Cr/Au薄膜，其厚度为100-500nm。

(3)Au膜上生物敏感膜的制备：生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的。

优选地，所述Au膜上生物敏感膜的制备，具体如下：

●Au清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，1M HCI水溶液清洗10分钟，水、无水乙醇清洗2次，干燥，臭氧紫外杀菌。

●用10-30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡，室温3小时。无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液(pH＝7.4)清洗样品2-5次，室温干燥。

(4)肿瘤标志物单克隆抗体的固定：将肿瘤标志物单克隆抗体溶液滴入Au膜上面，进行培育；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭，最后用PBS溶液清洗、室温干燥。

优选地，所述肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在0.5-1mg/ml，用量为一次5-10μl。滴入Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜；或在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)清洗2-5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)2-5次，室温干燥。

(5)抗原点样：将抗原溶液滴入Au膜上面，培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥。

优选地，所述抗原点样，具体如下：

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1-1000ng/ml，用量每次5-10μl，然后滴入Au膜上面，室温下22℃培育1小时，或在蒸汽浴37℃下培育40分钟，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(6)生物素化抗体固定：将生物素化抗体溶液滴入Au膜上面，室温培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥。

优选地，所述生物素化抗体固定，具体如下：

生物素化抗体浓度为0.5-1mg/ml的PBS溶液，每次取5-10μl，然后滴入Au膜上面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS清洗5次，室温下干燥。

(7)磁性标签固定：将磁性标签滴入Au膜上面，室温下培育，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

优选地，所述磁性标签固定，具体如下：

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签20-40μl，滴入Au膜上面，室温下培育20-40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)磁传感器的制备技术可与半导体的CMOS技术兼容，从而可实现集成磁传感器阵列，成本低、价格便宜，易于批量生产；

(2)信号可通过集成的CMOS电路得到处理，直接将生物信息转换为电信号，可实现即时分析，并具有很高的检测灵敏度；

(3)生物样品本身不带磁性，能提供一个很低噪声的磁测量环境，相对于荧光分子、放射性同位元素、酶等标签，磁性标签非常稳定；

(4)在单一化验中，阵列传感器可实现对多目标分析物的同时检测，具有快速、高灵敏探测的优势。

(5)本发明制备得到的血清肿瘤标志物检测系统具有检测速度快、可重复使用、无特殊环境和存放要求、体积小、灵敏度高等优点；不需要依赖于操作人员的生物学医学经验以及庞杂、昂贵的荧光检测设备，就可实现特定的生化分析或疾病诊断，这将有利于实现便携式、成本低廉、快速诊断的生物医学疾病检测系统。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1：

整个制备过程分如下几步：

(1)微型化磁通门传感器具体制作可以采用现有技术实现，如专利号为200910046101.1中的记载方法，在此不再赘述。

本实施例中，微型化磁通门感器包括玻璃基片、激励线圈、接收线圈、磁芯、引脚、聚酰亚胺绝缘材料，闭合的矩形磁芯上对称绕制两组相连的三维螺线管激励线圈，与激励线圈垂直绕制一组三维螺线管接收线圈；激励线圈位于玻璃基片上，由底层线圈、顶层线圈通过连接导体连接形成，激励线圈的两端连接引脚；接收线圈位于玻璃基片上，由底层线圈、顶层线圈通过连接导体连接形成，接收线圈的两端连接引脚，激励线圈和接收线圈均通过聚酰亚胺绝缘材料与磁芯绝缘隔离。磁芯、激励线圈和接收线圈均由聚酰亚胺绝缘、支撑并完全包覆固定为一个整体，与空气隔离，传感器表面仅露出引脚。

(2)在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，其厚度为300nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面。

(3)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡室温3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液(pH＝7.4)清洗样品5次，室温干燥。

(4)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在0.5mg/ml，用量为一次10μl。滴入Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(5)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1000ng/ml，用量每次5μl,然后滴入Au膜上面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(6)生物素化抗体的固定

取浓度为0.5mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入Au膜上面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(7)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签20μl，滴入Au膜上面，室温下培育20分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

实施例2：

(1)本发明的微型化磁通门传感器具体制作可以采用现有技术实现，如专利号为200910046101.1中的记载方法，在此不再赘述。

(2)在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，其厚度为500nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面。

(3)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用20mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡室温3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液清洗样品(pH＝7.4)4次，室温干燥。

(4)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度在1mg/ml，用量为一次5μl。滴入Au膜上面，然在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(5)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为10ng/ml，用量每次10μl,然后滴入Au膜上面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(6)生物素化抗体的固定

取浓度为1mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入Au膜上面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(7)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签30μl，滴入Au膜上面，室温下培育40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

实施例3：

(1)微型化磁通门传感器具体制作可以采用现有技术实现，如专利号为200910046101.1中的记载方法，在此不再赘述。

(2)在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，其厚度为100nm。甩光刻胶、烘干、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面。

(3)Au膜上生物敏感膜的制备。生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC和NHS混合液活化形成的。具体如下：

●Au膜清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，然后用1M HCI水溶液清洗10分钟，最后用水、无水乙醇各清洗2次，室温干燥，臭氧紫外杀菌。

●用25mM11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液室温修饰3小时，然后用无水乙醇清洗2次，N₂气干燥。

●EDC+NHS活化

用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟。

●用PBS溶液清洗样品(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(4)肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于PBS(pH＝7.4)溶液中，浓度1mg/ml，用量为一次10μl。滴入Au膜上面，在蒸汽浴37℃下培育30分钟，然后用PBS(pH＝7.4，含重量为1％的BSA)溶液清洗5次。

●封闭，用100μl BSA溶液(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)封闭，冰箱4℃放置2小时。

●用PBS溶液清洗(pH＝7.4)5次，室温干燥。

(5)抗原点样

抗原用PBS溶液稀释(pH＝7.4)，浓度为1ng/ml，用量每次10μl,然后滴入Au膜上面，室温下22℃培育1小时，然后用PBS(含重量为1％的BSA,体积为0.2％的Tween 20BSA溶液)溶液清洗2次，室温下干燥。

(6)生物素化抗体的固定

取浓度为1mg/ml生物素化抗体溶液，每次取10μl，然后滴入Au膜上面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

(7)磁性标签固定

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠。取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子标签30μl，滴入Au膜上面，室温下培育30分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

以上实施例制备得到的一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，该生物传感器包括位于玻璃基片上的微型化磁通门传感器、生物芯片，其中：所述生物芯片位于微型化磁通门传感器的敏感轴上，由位于玻璃基片上的Au膜、Au膜上的生物敏感膜、生物敏感膜上的磁性标签组成。这些部件配合施加轴向磁场的螺线管线圈以及与微型化磁通门传感器连接的信号采集系统，实现生物检测。该生物传感器检测抗原的原理是采用双抗夹心法。采用自组装膜技术固定单克隆抗体，单克隆抗体与抗原结合，带有链酶亲和素的磁性标签与生物素化的多克隆抗体结合，由于抗原-抗体的免疫反应，磁性标签被标记到Au膜的表面上。一旦有极微量的被检测生物分子(抗原)存在时，在外磁场作用下，磁性标签产生的弥散磁场将导致传感器的电压信号变化，从而实现对相应生物分子的高灵敏度检测。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用MEMS工艺在玻璃基片上制作微型化磁通门传感器；

(2)在玻璃基片上溅射Cr/Au薄膜，然后甩光刻胶、曝光、显影、刻蚀Cr/Au膜、去胶，使Au膜暴露在外面；

(3)Au膜上生物敏感膜的制备：生物敏感膜为一层纳米级厚度的自组装膜，自组装膜为11-巯基十一烷酸，然后经EDC+NHS活化形成的；

(4)肿瘤标志物单克隆抗体的固定：将肿瘤标志物单克隆抗体溶液滴入Au膜上面，放入冰箱过夜；然后用PBS溶液清洗、BSA溶液封闭，最后用PBS溶液清洗、室温干燥；

(5)抗原点样：将抗原溶液滴入Au膜上面，培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥；

(6)生物素化抗体固定：将生物素化抗体溶液滴入Au膜上面，室温培育，然后用PBS溶液清洗，室温下干燥；

(7)磁性标签固定：将磁性标签滴入Au膜上面，室温下培育，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。

2.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(1)中，所述微型化磁通门传感器的磁芯为NiFe薄膜、非晶或纳米晶软磁带材材料，并采用MEMS工艺进行加工。

3.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Cr/Au薄膜，其厚度为100-500nm。

4.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Au膜上生物敏感膜的制备，具体如下：

●Au清洗，用1M NaOH水溶液清洗10分钟，1M HCI水溶液清洗10分钟，水、无水乙醇各清洗2次，干燥，臭氧紫外杀菌；

●用10-30mM 11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液浸泡，室温3小时，无水乙醇清洗2次，N₂气干燥；

●EDC+NHS活化，用pH＝7.4的PBS溶液溶解EDC和NHS，其浓度分别为0.2M和50mM，然后取等体积的EDC和NHS溶液混合，室温下活化40分钟；

●用pH＝7.4的PBS溶液清洗样品2-5次，室温干燥。

5.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(4)，所述肿瘤标志物单克隆抗体的固定，具体如下

●肿瘤标志物单克隆抗体溶于pH＝7.4的PBS溶液中，浓度在0.5-1mg/ml，用量为一次5-10μl，滴入Au膜上面，然后放入冰箱4℃过夜；或在蒸汽浴37℃下修饰30分钟，然后用PBS溶液清洗2-5次，此处PBS溶液的pH＝7.4且含重量为1％的BSA；

●封闭，用100μl BSA溶液封闭，冰箱4℃放置2小时，所述BSA溶液含重量为1％的BSA、体积为0.2％的tween 20；

●用pH＝7.4的PBS溶液清洗2-5次，室温干燥。

6.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(5)中，所述抗原点样，具体如下：

抗原用pH＝7.4的PBS溶液稀释，浓度为1-1000ng/ml，用量每次5-10μl，然后滴入Au膜上面，室温下22℃培育1小时，或在蒸汽浴37℃下培育40分钟，然后用含有重量为1％的BSA、体积为0.2％的tween 20的PBS溶液清洗2次，室温下干燥。

7.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(6)中，所述生物素化抗体固定，具体如下：

生物素化抗体浓度为0.5-1mg/ml的PBS溶液，每次取5-10μl，然后滴入Au膜上面，室温22℃下培育1小时，然后用PBS溶液清洗5次，室温下干燥。

8.根据权利要求1所述的血清肿瘤标志物检测的微型化磁通门生物传感器制作方法，其特征在于，步骤(7)中，所述磁性标签固定，具体如下：

磁性标签为链酶亲和素修饰的磁性纳米粒子或由磁性纳米粒子构成的磁珠，取浓度为10μg/ml磁性纳米粒子或磁珠标签20-40μl，滴入Au膜上面，室温下培育20-40分钟，然后用PBS溶液清洗，室温干燥。