CN102933717A - 在固态发酵中采用棒状链霉菌mtcc 1142制备棒酸的方法 - Google Patents

在固态发酵中采用棒状链霉菌mtcc 1142制备棒酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了利用农业工业残余物和固态发酵技术的棒酸的发酵生产。该方法涉及在非严格酸性或碱性且接近中性的介质条件下需氧培养棒状链霉菌MTCC 1142的选择菌株，其中初始水分含量为60-75％，并利用农业工业残余物作为碳和支持物。该方法利用复合的以及简单的氮源连同少量的矿物盐补充物。该方法在25-30℃的温度范围进行长达120小时时间。该方法操作简单，提供的主要优点是，它需要较便宜的基质用于生产棒酸。

Description

在固态发酵中采用棒状链霉菌MTCC 1142制备棒酸的方法
技术领域
本发明涉及用于制备棒酸的固态发酵方法。更具体地，本发明涉及在固态发酵条件下利用农业工业残余物成本有效的生产棒酸。抗生素抗性，尤其是针对β-内酰胺的抗生素抗性的出现，已经成为最近关注的主要目标。过去作为我们的第一防线的药物由于β-内酰胺酶的出现而变得无效。棒酸是细菌的β-内酰胺酶的一种新型有效的抑制剂，其通过发酵而生产。
背景技术
链霉菌是多种次级代谢物的生产者，其用于制备药物。这些药物的实例例如是聚酮化合物、大环内酯、蒽环类抗生素、四环素、脂肽和β-内酰胺(Strohl W.R.，Biotechnology of Industrial Antibiotics，Marcel Dekker Inc.，page 1-48，1997)。棒酸(3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-氧杂-1-氮杂二-环[3.2.0]庚烷-2-羧酸)具有弱抗菌活性(图1)。然而，它是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的许多菌株产生的β-内酰胺酶的有效抑制剂。棒酸在与抗生素如阿莫西林、氨比西林、羧苄青霉素、替卡西林、苄青霉素或头孢利定联合时表现出针对产生β-内酰胺酶的有机体的良好的协同活性。存在多种产生棒酸的微生物，即，棒状链霉菌ATCC 27064(US专利4110165，比利时专利827926)、S.jumonjinensis(GB专利1563103)、桂滨链霉菌(S.katsurahamanus)IFO 13716FERM 3944(JP专利83009679B)和链霉菌P6621FERM2804(JP专利55162993A)。
棒酸是主要的β-内酰胺抗生素，独立地由Brown et al.，(Journalof Antibiotics，29：668-669，1976)和Napier et al.，(Br.Pat.1585661，1981)发现。它也是细菌β-内酰胺酶的有效抑制剂(Mayer&Deckwer，Applied Microbiology and Biotechnology，20：41-46，1996)。其针对广谱的Gram+(革兰氏阳性)和Gram-(革兰氏阴性)细菌表现出活性；然而观察到的活性的水平非常低，因此，它最好与其他对于β-内酰胺酶敏感的广谱抗生素共同配制(Brown，Journal ofAntimicrobials and Chemotherapy，1：15-48，1981)。例如，体外研究表明，在针对产生内酰胺酶的金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureus)菌株进行测量时，单独的氨比西林的最小抑制浓度(MIC)超过500μg/ml。在补充5μg/ml的棒酸后，对于组合添加的MIC减少到0.1μg/ml(Brown，Journal of Antimicrobials and Chemotherapy，1：15-48，1981)。在此发现后，棒酸的化学结构被Howarth等(Journal ofChemical Society and Chemical Commun，266-267，1976)鉴定。
棒酸不可逆地与酶β-内酰胺酶结合以产生稳定的复合体(Liras&Rodriguez-Garcia，Applied Microbiology and B iotechnology54：467-475，2000)，从而使它失活。棒酸的β-内酰胺酶抑制活性与其3R，5R立体化学相关。β-内酰胺酶抑制和抗菌活性的组合有效作用使得棒酸在临床上和经济上非常重要。目前，Glaxo SmithKlineBeecham Ltd生产商标名为“Augmentin”的棒酸。
在SSF中，两种类型的方法可以根据固相的性质而区别：在第一种以及最常用的方法中，固体基质不仅向在其中生长的微生物培养物提供营养素，而且用作细胞的锚地(anchorage)。这些基质是来自农业或食品工业副产品的异质水不溶性物质，其具有淀粉或木质纤维性质，如谷类和谷粒副产品、木薯、马铃薯、豆和甜菜浆。因此提供在其中生长的微生物所需的全部营养素的基质将是理想的基质。固体介质中的某些营养素可能以次于最佳的浓度获得，或者甚至可能是缺乏的。在这样的情况下，有必要外部对其进行补充。第二种方法中，如甘蔗渣、大麻、惰性纤维、树脂、聚氨酯泡沫体和蛭石的惰性支持物用液体培养基浸渍，其包含所有的必需营养素。虽然，这种策略不常使用，但是据报道其具有一些优点。确定的液体培养基和具有均质物理结构的惰性支持物的使用改善了对该方法的控制和检测、以及发酵的再现性(或重复性)。
考虑到棒酸的潜在药物应用，期望可以导致成本有效发酵生产的技术得以发展的任何方法的开发。迄今为止，用于棒酸的发酵生产的方法依赖于需要昂贵的介质投入以及处理大量液体发酵原汤的深层发酵，其基本上导致生产的高成本。本文所描述的本发明方法采用固态发酵方法。该方法还应用更廉价的农工业残余物，并清楚地表明该方法是目前采用的方法的成本有效的替换方法。产品以浓缩形式生产，因此需要较少的液体处理。考虑到利用固态发酵方法的发酵生产需要相当简单的生产设施这一事实，这种方法优于现存的生产方法。
用于棒酸生产的棒状链霉菌的固态培养物的营养需求和环境条件没有得到明确的阐述。仅存在一项由Sircar等人(ProcessBiochemistry，1998，33(3)，283-289)进行的研究，指明利用固态发酵的棒酸生产。然而，该研究并没有评价实际的棒酸生产，也没有清楚地限定培养基组成。由该研究不能明了，多少棒酸存在于发酵介质中以及棒酸生产方法有效程度如何。SSF中采用的固体培养基的组成包括麦麸(wheat rawa)、大豆粉、磷酸氢二钾和向日葵油饼。基于以上所述，本发明人决定继续开发这种固态发酵方法，这种方法基于利用农业工业残余物进行棒酸或其盐的发酵生产。该方法导致高生产率的良好产量，使其成为现有技术的替换方式。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种利用棒状链霉菌MTCC 1142制备棒酸的发酵方法。
本发明的另一目的是提供一种利用容易获得的碳和氮源连同矿物盐在固态培养条件下生产棒酸的方法。
本发明的又一目的是提供一种介质组合物(或组成)和环境条件，其可以在发酵实验室机构中容易地实现，以容易且有效地生产棒酸。
本发明的又一目的是利用棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)在深层固态培养条件下制备棒酸，其中本文限定的固态发酵方法提供了较好的产量。
发明内容
根据本发明提供了用于制备棒酸或其盐的固态发酵方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备具有碳、氮和矿物盐成分连同表面活性剂和水分(moisture contents)的培养基，随后通过已知方法灭菌，
b)在上述培养基中接种棒状链霉菌MTCC 1142，在需氧条件下，在25-30℃温度范围下，在6.0-7.5pH范围下，使有机体生长5-6天时间，
c)终止上述发酵过程，通过已知的提取方法提取希望的棒酸。
在本发明的一个实施方式中，所用的发酵培养基为：
碳源                           1.0-10.0g
氮源(无机/复合)                0.05-1.0％(w/w)
矿物盐                         0.5-10g/L以0.1-1％(v/w)
初始水分                       65-75％(v/w)
在另一实施方式中，用于碳的来源是选自咖啡壳、米糠、麦麸、花生油饼、芝麻油饼、橄榄油饼、椰子油饼、罗望子种子粉、大豆麸片(大豆薄片)、大豆碎粒及其组合所构成的组的农业工业残余物。
在另一实施方式中，所用的氮源为复合有机氮和无机氮源。
在另一实施方式中，所用的有机氮复合来源选自由酵母抽提物、牛肉膏、胨、麦芽浸膏、脲、玉米浆、胰胨及其组合构成的组。
在另一实施方式中，所用的无机氮源选自由碳酸氢铵、硫酸铵、正磷酸氢二铵、过硫酸铵、硝酸铵、氯化铵及其组合构成的组。
在另一实施方式中，所用的矿物盐选自由KH2PO4、NaCl、MgSO4及其组合构成的组。
在另一实施方式中，所用的表面活性剂选自由蓖麻油、TritonX-100(或称“曲拉通X-100”)、吐温40、吐温60、吐温80和硅油及其组合构成的组。
在另一实施方式中，所用的棒酸的产率在1900μg/gds至4700μg/gds(克干燥基质)的范围内。
附图说明
结合附图，通过阅读以下的详细描述，本发明的这些和其他目的、特征以及优点将变得更显而易见。
图1：示出了棒酸的结构式。
图2：示出了不同基质对棒状链霉菌MTCC1142的棒酸生产的影响。
图3：示出了发酵时间对棒酸生产的影响。
图4：示出了初始水分对棒酸生产的影响。
图5：示出了接种量对固体介质中棒酸生产的影响。
图6：示出了无机氮源的影响。
图7：示出了有机氮源的影响。
图8：示出了附加碳源的影响。
图9：示出了表面活性剂对固体介质中棒酸生产的影响。
具体实施方式
应当理解，披露的实施方式仅仅是本发明的示例，其可以以各种形式实施。因此，本文披露的细节不能解释为进行限制，其仅仅是作为权利要求的基础以及作为用于教导本领域技术人员如何利用本发明的基础。
A)该方法在相对简单的生产条件下实施，其包括培养棒状链霉菌的菌株5-7天并从培养基回收棒酸或其盐，随后获得游离酸。有机体优选为棒状链霉菌MTCC 1142或其高产率突变体，其用在这种方法中。
B)在碳、氮和矿物盐补充物的可同化源(assimilable sources)的存在下，有机体的培养发生在固体、半固体或液体培养基中。培养可以发生在由复合营养素组成的需氧固体培养基上。农业工业残余物形式的复合营养素源为用于生产的合适来源。
C)适用于棒状链霉菌的培养和棒酸生产的营养素介质包含传统的农业工业残余物如麦麸(WB)、米糠(RB)、大豆麸片(SF)、大豆碎粒(SG)、咖啡壳(CH)、罗望子种子粉(TSP)、椰子油饼(COC)、芝麻油饼(SOC)、花生油饼(GOC)、橄榄油饼(OOC)等作为单一基质或以一限定组合用于棒酸生产。
D)矿物盐如KH2PO4、K2HPO4、NaCl、MgSO4或MgCl2等的储液以0.2-0.5％(v/w)加入到发酵介质中(除非另外说明，所有的w/w或v/w值均参比于碳源)，并且通常在0.5g/L-10g/L的范围内，优选在0.5-7.5g/L的范围内，最优选在1-5g/L的范围内。
E)棒状链霉菌的培养通常在20℃到35℃的温度范围内进行，优选22℃到30℃，更优选24℃-28℃。用于培养的pH通常可以在5.0到8.5的范围内，优选在6.0到7.5的范围内，最优选在pH 6.5到7.2的范围内。棒状链霉菌在限定介质中，在所述的pH和温度下，在玻璃锥形烧瓶中培养，伴随或不伴随摇动。起始pH在7.0±0.2的范围内，发酵进行直至144小时。然而，最大棒酸产率优选直至120小时获得。
F)盐溶液中浓度为0.01-0.2M，更优选在0.02-0.1M的范围内，最优选浓度为0.04-0.07M的如碳酸氢铵或硫酸铵或正磷酸氢二铵(ammonium hydrogen orthophosphate)或过硫酸铵或硝酸铵或氯化铵的无机氮源补充提高了产量。
G)补充有优选浓度为0.01％到0.1％w/w的有机氮源如胨或麦芽浸膏或牛肉膏或酵母抽提物或脲或玉米浆或玉米浸渍固体(cornsteep solid)的发酵培养基提供了提高的产量。
H)表面活性剂如蓖麻油或Triton X-100或吐温40或吐温60或吐温80或硅油优选以0.01％-0.5％的范围加入到介质中用于提高产量(或生产)。
I)棒状链霉菌的菌株(MTCC 1142)优选维持在包含酵母抽提物、麦芽浸膏、葡萄糖和琼脂并且pH调整到7.2±0.2的限定介质的斜面上，优选在25℃-28℃培养斜面最优选达5天，随后合适地储存在4℃。
J)用于发酵的接种物优选在包含0.1％吐温-80的10ml蒸馏水中，由形成孢子的斜面培养物，优选5-10天之久的培养物制备。
K)发酵液中的棒酸优选利用Foulstone和Reading(Antimicrob.Agents.Chemother.22(1982)753)描述的程序通过HPLC进行评估。Waters Spherisorb 5μODS2柱(4.6mmx250mm)可优选使用。移动相优选为甲醇/(50mM)KH2PO4(40∶60)，具有调整到pH 3.08的pH值。流速优选维持在0.6-1.0ml/min之间，通过UV检测仪进行检测。
L)生物量评估优选按照Sakurai等(Agriculture and BiologicalChemistry，1977，41，619-24)进行。0.5g发酵物质优选与浓硫酸(2ml)混合，反应混合物可以优选维持在室温(25-30℃)达24h。这种混合物可以用蒸馏水稀释以制备1N溶液、高压灭菌(15psi达1h)、用1N NaOH中和，用蒸馏水加到100ml。溶液(1ml)与1ml乙酰丙酮(acetyl acetone)试剂混合，在沸水浴中孵育20分钟。冷却后，加入乙醇(6ml)，随后加入1ml Ehrlich试剂(埃尔利希试剂)，优选在65℃孵育10分钟。冷却后，反应混合物的光密度记录为在530nm针对试剂空白。结果优选以每克干燥基质(gds)的mg葡糖胺表示。
M)水分(含湿量)是强烈影响SSF(固态发酵)中微生物生长和活性的关键因素(Pandey A，Process Biochemistry，27，109-17，1992；Pandey et al.，Process Biochemistry，35，1153-1169，2000)。丝状真菌或链霉菌在SSF期间在农业工业残余物上被培养时，在基质水分(含量)通常为50和75％之间时生长最佳(Pandey et al.，In：Solid-statefermentation in biotechnology.Asiatech Publishers New Delhi：pp.221，2001)。水分(含量)优选保持在45-80％的范围，更优选在55-75％，最优选66-73％。
N)1-5ml(包含8x106孢子/ml)的接种量优选用于最佳的棒酸生产。
棒状链霉菌MTCC1142
该培养物等同于棒状链霉菌NRRL3585。它在25℃的温度下需氧生长。生长培养基包含酵母抽提物、麦芽浸膏、葡萄糖、琼脂和蒸馏水。该培养物是用于生产棒酸、头孢菌素和青霉素N的模式株。该菌株是获得专利的菌株。
  MTCC号   1142
  类型   A
  属名   链霉菌属
  种   棒状链霉菌
  菌株标号   NRRLB-3585
  生长培养基号和生长条件   1，需氧
  生长培养基组成   酵母抽提物  4.0g麦芽浸膏    10.0g葡萄糖      4.0g琼脂        20.0g蒸馏水      1.0L
  生长温度   25℃
  特殊特征/应用   用于生产棒酸、头孢菌素、青霉素N的模式株
以下实施例是通过示例方式给出，因此不应视为限制本发明的范围。
用于棒酸的发酵生产的培养基如本文所述进行制备。并且，除非另外说明，所有的w/w或v/w值均参比于碳。
实验1
椰子油饼：            5g
KH2PO4：              0.08％(w/w)
NH4NO3：              0.1％(w/w)
NaCl：                0.04％(w/w)
MgSO4：               0.04％(w/w)
培养基的pH            7.00±0.2
发酵温度：            25℃-28℃
初始水分：            70％(液体体积/总重量)
发酵时间              120h
棒酸产率                   1919μg/gds
实验2
大豆油饼                   5.0g
KH2PO4                     0.08％(w/w)
NH4NO3                     0.2％(w/w)
NaCl                       0.04％(w/w)
MgSO4                      0.04％(w/w)
培养基的pH                 7.00±0.2
发酵温度：                 25℃
初始水分：                 70％(液体的体积/总重量)
发酵时间：                 120h
棒酸的产率                 2586μg/gds
实验3
SOC+大豆麸片               5.0g(1∶1w/w)
酵母抽提物                 0.2％(w/w)
KH2PO4：                   0.08％(w/w)
NaCl：                     0.04％(w/w)
MgSO4：                    0.04％(w/w)
培养基的pH：               7.00±0.2
发酵温度                   25℃
初始水分：                 70.58％(液体的体积/总重量)
发酵时间：                 120h
棒酸的产率                 3139μg/gds
实验4
SOC                        5.0g
酵母抽提物                 0.2％(w/w)
KH2PO4：                   0.08％(w/w)
NaCl：                     0.04％(w/w)
MgSO4：                    0.04％(w/w)
培养基的pH：               7.00±0.2
发酵温度                   25℃
初始水分：                 70.58％(液体的体积/总重量)
发酵时间：                 120h
棒酸的产率                 4695μg/gds
本发明对于工业，更具体地，对于药物工业具有潜在的重要性。迄今为止，由GlaxoSmithcline Beecham开发和获得专利的方法用于棒酸的生产。该方法是获得专利权的方法，因此对于任何其他制造商而言其不能用于生产。2002年，棒酸专利期满后，两家公司开始棒酸的一般型式的营销。然而，生产成本仍然高昂，需要更多的改进。本发明的方法是不同于已经存在方法的一种新方法，其利用简单的工艺和介质投入。该方法可以容易地扩大规模用于工业生产目的，并将导致价格显著降低的棒酸生产。
提供上述对优选实施方式的描述以便使本领域的任何技术人员能够实现或应用本发明。这些实施方式的各种改变对于本领域技术人员来说显而易见，并且本文限定的一般原则可适用于其他实施方式而无需利用创造性能力。本发明并不是要限于本文所示的实施方式，而是将赋予其与本文披露的原则和新特征相一致的最宽广的范围。可以在此进行各种改变和修改而不偏离本发明的精神。这样的改变和修改应理解为包括在由所附权利要求限定的本发明的范围内，除非它们偏离该范围。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于制备棒酸或其盐的固态发酵方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备由碳、氮、矿物盐成分连同表面活性剂和水分组成的培养基，随后通过已知方法进行灭菌，
b)在上述培养基中接种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)MTCC1142，在需氧条件下，在25-30℃温度范围下，在pH6.0-7.5范围下，培养有机体5-6天时间，
c)终止上述发酵过程并通过已知提取方法提取希望的棒酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用的发酵培养基为：
碳源                1.0-10.0g
氮源(无机/复合)     0.05-1.0％(w/w)
矿物盐              0.5-10g/L以0.1-1％(v/w)
初始水分            65-75％(v/w)
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于碳的来源是选自咖啡壳、米糠、麦麸、花生油饼、芝麻油饼、橄榄油饼、椰子油饼、罗望子种子粉、大豆麸片、大豆碎粒及其组合构成的组的农业工业残余物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述氮源为复合有机氮和无机氮源。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所用的有机氮复合来源选自酵母抽提物、牛肉膏、胨、麦芽浸膏、脲、玉米浆、胰胨及其组合构成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述无机氮源选自碳酸氢铵、硫酸铵、正磷酸氢二铵、过硫酸铵、硝酸铵、氯化铵及其组合构成的组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述矿物盐选自KH2PO4、NaCl、MgSO4及其组合构成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述表面活性剂选自蓖麻油、Triton X-100、吐温40、吐温60、吐温80和硅油及其组合构成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中棒酸的产率在1900μg/gds至4700μg/gds(克干燥基质)的范围内。

Claims (10)

1.一种用于制备棒酸或其盐的固态发酵方法，所述方法包括以下步骤：
a)制备由碳、氮、矿物盐成分连同表面活性剂和水分组成的培养基，随后通过已知方法进行灭菌，
b)在上述培养基中接种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)MTCC1142，在需氧条件下，在25-30℃温度范围下，在pH6.0-7.5范围下，培养有机体5-6天时间，
c)终止上述发酵过程并通过已知提取方法提取希望的棒酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用的发酵培养基为：
碳源             1.0-10.0g
氮源(无机/复合)  0.05-1.0％(w/w)
矿物盐           0.5-10g/L以0.1-1％(v/w)
初始水分         65-75％(v/w)
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于碳的来源是选自咖啡壳、米糠、麦麸、花生油饼、芝麻油饼、橄榄油饼、椰子油饼、罗望子种子粉、大豆麸片、大豆碎粒及其组合构成的组的农业工业残余物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述氮源为复合有机氮和无机氮源。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所用的有机氮复合来源选自酵母抽提物、牛肉膏、胨、麦芽浸膏、脲、玉米浆、胰胨及其组合构成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述无机氮源选自碳酸氢铵、硫酸铵、正磷酸氢二铵、过硫酸铵、硝酸铵、氯化铵及其组合构成的组。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述矿物盐选自KH2PO4、NaCl、MgSO4及其组合构成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所用的所述表面活性剂选自蓖麻油、Triton X-100、吐温40、吐温60、吐温80和硅油及其组合构成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所用的棒酸的产率在1900μg/gds至4700μg/gds(克干燥基质)的范围内。
10.一种用于制备棒酸或其盐的固态发酵方法，基本上如本文参照实施例和附图所描述的。
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