CN102907317A - 一种诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基磺酸乙酯诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：续随子种子经甲基磺酸乙酯诱变与模拟基质定向筛选相结合获得续随子耐盐突变体。利用甲基磺酸乙酯对续随子种子进行诱变处理，再利用模拟基质进行种子萌发和生长期间的耐盐筛选鉴定，选择最佳的甲基磺酸乙酯诱变浓度与时间以及定向选择压。最佳甲基磺酸乙酯诱变浓度和时间分别为0.2%（w/v）和12小时，模拟基质水溶液含0.9%（w/v）氯化钠、0.07%硫酸钠、0.12%氯化镁、0.08%硫酸钾、0.05%氯化钙、0.008%碳酸氢钠。本发明通过甲基磺酸乙酯诱变与模拟基质定向选择相结合选育出续随子耐盐突变体，为能源植物续随子耐盐育种提供了新的参考方法。

Description

一种诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法

 

一、           技术领域

本发明涉及一种诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，属于特产植物育种领域。

 

二、           背景技术

盐渍是限制植物生长和降低其产量最主要的非生物胁迫因素之一，大面积的盐渍化土地严重影响了农业生产和生态环境，通过培育和筛选新的耐盐经济植物，并对现有盐渍化土壤的生态环境进行改良是沿海滩涂开发的理想途径之一。培育和筛选耐盐的植物突变体是培育新品种的第一步。

作为能源植物的大戟科植物续随子是很有开发潜力的经济植物，其种子含油量高达43.3％～47.0％，且续随子油主要脂肪酸成分以C16、C18脂肪酸为主，与理想柴油替代品的分子组成相类似，因此续随子是生产生物柴油的优良种类。续随子虽然是甜土植物，但是其种子适宜在低于0.5％的 NaCl 溶液中萌发。因此，培育和筛选耐盐的续随子突变体是很有希望的。

培育和筛选耐盐突变体过程通常是先采用杂交、转基因、诱变等方法产生突变材料，再通过含NaCl的基质或盐渍化大田进行耐盐鉴定。然而，杂交和转基因操作过程较复杂，程序繁琐，工作量大，成本也较大。再加之，植物的耐盐性是一个复杂的数量遗传性状，仅仅依靠一个或两个耐盐基因的过量表达远远不能达到培育高耐盐品种的目的。相比较，人工诱变育种具有成本低、使用方便、诱变作用专一性较强等特点。其中尤以化学诱变剂甲基磺酸乙酯较为常用，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，而且后代较易稳定遗传，一般到F3代就可稳定。

产生的大量突变材料必须经过耐盐鉴定，才能得到耐盐突变体。通常采用的耐盐鉴定方法是利用NaCl基质或盐渍化大田进行耐盐定向筛选。但是NaCl基质盐分较单一，与实际的大田盐渍土壤盐分相差很大，因此利用NaCl基质筛选出的突变材料适应性较小。由于盐渍化大田土壤成分较复杂，为今后研究耐盐突变体的耐盐机理带来不便，因此利用盐渍化大田直接筛选耐盐突变体也存在一定缺陷。

为了改良盐渍化土壤的生态环境，进一步开发沿海滩涂，选择具有优势的经济植物，培育并筛选出具有耐盐适应性的新品种，就成了当下之需。然而，如何提高培育和筛选经济植物耐盐品种的效率尤其是解决快速产生耐盐突变体材料的问题就成了关键。本发明即着眼于此问题，选择具有生物能源利用价值的经济植物续随子作为材料，并将甲基磺酸乙酯诱变与模拟基质筛选相结合，创立了快速筛选续随子耐盐突变体的方法。

 

三、           发明内容

本发明提供了一种诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，解决了耐盐续随子诱变和筛选效率低的问题。

本发明的主要技术方案为：首先用甲基磺酸乙酯对续随子种子进行诱变处理，然后利用模拟基质水溶液对经过诱变处理的续随子种子进行种子萌发的耐盐筛选，最后利用模拟基质水溶液对筛选出的发芽的续随子进行生长期间的耐盐筛选，最终获得耐盐突变体。

具体包括如下几个步骤：

步骤一、用甲基磺酸乙酯对续随子种子进行诱变处理

将续随子种子用浓度为0.2-2.0%（w/v）的甲基磺酸乙酯溶液进行浸泡诱变处理12小时即获得了经过诱变处理的续随子种子。

步骤二、利用模拟基质水溶液进行续随子种子萌发期间的耐盐筛选鉴定

经过步骤一诱变处理获得的续随子种子在流水中冲洗5次，每次1小时。然后将冲洗后的种子播种于装有蛭石的盆钵里，播种深度为1厘米。盆钵里浇灌霍格兰氏营养液，室温条件下暗培养3天，然后再浇灌含有以下成分的模拟基质水溶液：0.9%（w/v）氯化钠、0.07%（w/v）硫酸钠、0.12%（w/v）氯化镁、0.08%（w/v）硫酸钾、0.05%（w/v）氯化钙、0.008%（w/v）碳酸氢钠，继续暗培养。10天后观察出芽情况。

   步骤三、利用模拟基质水溶液进行生长期间的耐盐筛选鉴定

将步骤二得到的发芽的续随子转移至室温和自然光照条件下继续培养。以盆钵中的蛭石干燥为度，每浇两次霍格兰营养液，就要浇一次模拟基质水溶液：0.9%（w/v）氯化钠、0.07%（w/v）硫酸钠、0.12%（w/v）氯化镁、0.08%（w/v）硫酸钾、0.05%（w/v）氯化钙、0.008%（w/v）碳酸氢钠，共培养2个月。最终保持良好生长状态者（以茎粗和叶绿为标准）即为筛选到的耐盐突变体。

 

本发明的有益效果如下：

（1）诱变材料是能源植物续随子，而续随子是较有潜力的能源植物，创立筛选其耐盐突变体的方法为培育续随子耐盐新品种提供研究基础。

（2）模拟基质中添加的离子成分浓度固定且明确已知，因此具备与真实盐渍土壤相近的离子多样性。利用这种模拟基质作为筛选介质，不仅可以解决NaCl基质盐分较单一的缺点，而且由于其离子浓度和成分固定、明确，为后续的耐盐机理解析提供便利。

（3）本发明将两种优势方法相结合，即甲基磺酸乙酯诱变与模拟基质定向筛选相结合来筛选耐盐突变体，诱变频率高，目标明确，操作成本低廉，使用方便，筛选效率较高。

 

四、具体实施方式    

1、不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变续随子种子之后的自然发芽和活力情况

试验方法：

将甲基磺酸乙酯加入到0.1mol/L、pH=7.2的磷酸盐缓冲液中，配制成2.0%（w/v）的甲基磺酸乙酯溶液，并将此溶液依次稀释成1.5%（w/v）、1%（w/v）、0.5%（w/v）、0.2%（w/v）的甲基磺酸乙酯溶液。分别用上述不同浓度的甲基磺酸乙酯溶液浸泡续随子种子12小时，进行诱变处理。以不加甲基磺酸乙酯的磷酸缓冲液处理种作为对照。每个甲基磺酸乙酯浓度处理100粒种子。所有经过甲基磺酸乙酯溶液或者磷酸盐缓冲液处理的续随子种子在流水中冲洗5次，每次1小时。

（1）续随子种子经过甲基磺酸乙酯诱变处理之后，种子发芽率的确定：

       经诱变处理的种子，放在铺有用去离子水弄湿的湿滤纸的培养皿中，在温度25℃、光照条件为12h/12h光暗交替，进行种子萌发试验，每天记录并统计种子的萌发数，记录

15天内的结果。

种子活力指数：Va=（Ss×0.2+Sr×0.8）×Gi;                                                

上式中:Va表示活力指数; Ss为幼苗第15天的茎长，Sr为幼苗第15天的根长; Gn为第n天的发芽增殖数; Dn为相应的天数。第15天时，经过测量和计算，空白对照的平均茎长为21厘米，平均根长为12厘米。

    采用相对活力指数表示各诱变处理的活力指数值，相对活力指数：Vr = 

100%

（2）用Vr =Vm (即种子相对活力指数下降到50%时的剂量)衡量各个不同浓度甲基磺酸乙酯诱变处理的效果，从而确定和比较不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变续随子种子的效果。

 

试验结果：

    表1为不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变之后续随子种子在不同的天数的发芽数，表2为经过不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理之后的续随子种子的相对活力情况，由表1和表2可以获知不同浓度甲基磺酸乙酯诱变续随子种子对发芽率和活力的影响。

表1 不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变之后续随子种子在不同的天数的发芽数

注：发芽数后面扩号中的数字为上一个1天新增的发芽数

表2 经过不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理之后的续随子种子的相对活力指数值Vr

由表2可知甲基磺酸乙酯的最佳剂量为1%，即种子相对活力指数下降到50%时的剂量。

 

2、利用模拟基质进行续随子种子萌发期间的耐盐筛选鉴定

    试验方法：

       将经过不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变12小时的各10000粒续随子种子在流水中冲洗5次，每次1小时。然后将不同浓度的甲基磺酸乙酯处理的10000粒种子播种于装有蛭石的盆钵里，播种深度为1厘米。向盆钵里浇灌霍格兰氏营养液，在室温条件下暗培养3天，3天之后再浇灌含有以下成分的模拟基质水溶液：0.9%（w/v）氯化钠、0.07%（w/v）硫酸钠、0.12%（w/v）氯化镁、0.08%（w/v）硫酸钾、0.05%（w/v）氯化钙、0.008%（w/v）碳酸氢钠，继续暗培养10天。10天后调查各浓度处理的10000粒种子的出芽情况。

 

试验结果：

如表3所示，不同浓度的甲基磺酸乙酯浓度各处理10000粒续随子种子之后，经过模拟基质耐盐筛选之后，发芽数目在8160到853范围内， 1%甲基磺酸乙酯处理后的发芽数目为3889，种子相对活力适中。

 

3、利用模拟基质进行续随子生长期间的耐盐筛选鉴定

    试验方法：

将上述经过不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理之后的10000粒续随子种子在模拟基质水溶液条件下所出芽之后的续随子置于室温和光照条件下继续培养。以盆钵中的蛭石干燥为度，每浇两次霍格兰营养液，浇一次模拟基质水溶液：0.9%（w/v）氯化钠、0.07%（w/v）硫酸钠、0.12%（w/v）氯化镁、0.08%（w/v）硫酸钾、0.05%（w/v）氯化钙、0.008%（w/v）碳酸氢钠，共2个月。2个月后观察最终能够保持良好生长状态的续随子数目，以茎粗和叶绿为良好生长状态的判断依据，这些良好生长状态的续随子即为筛选到的耐盐突变体。    

试验结果：如表3所示，不同浓度的甲基磺酸乙酯浓度各处理10000粒续随子种子之后，经过模拟基质耐盐筛选之后发芽的续随子再经过模拟基质耐盐筛选其生长状态，可见在1%（w/v）浓度处理之后具有良好生长状态的续随子数目最多。

 

表3 经过不同浓度的甲基磺酸乙酯诱变处理之后的10000粒续随子种子在模拟基质水溶液条件下的出芽情况和生长状态情况

Claims (5)

1.一种诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：续随子种子经过甲基磺酸乙酯诱变处理之后再用模拟基质水溶液对经过诱变处理的续随子种子进行种子萌发的耐盐筛选，最后利用模拟基质水溶液对筛选出的发芽的续随子进行生长期间的耐盐筛选，最终获得耐盐突变体。

2.如权利要求1所述的诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：用于诱变处理的甲基磺酸乙酯的浓度为0.2-2.0%（w/v），用于甲基磺酸乙酯诱变处理的时间为12小时。

3.如权利要求1或2所述的诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：所述的经过甲基磺酸乙酯诱变处理之后的续随子种子经过流水5次、每次1小时冲洗去除残留的甲基磺酸乙酯之后播种于装有蛭石的盆钵里，播种深度为1厘米；盆钵里浇灌霍格兰氏营养液，室温条件下暗培养3天，然后再浇灌含有氯化钠、硫酸钠、氯化镁、硫酸钾、氯化钙和碳酸氢钠的模拟基质水溶液，继续暗培养，10天后调查出芽情况；将出芽的续随子转移至室温光照条件下继续培养；以播种容器内的蛭石干燥为度，每浇两次霍格兰营养液，浇一次含有氯化钠、硫酸钠、氯化镁、硫酸钾、氯化钙和碳酸氢钠的模拟基质水溶液，共2个月；最终保持良好生长状态者（以茎粗和叶绿为标准）即为筛选到的耐盐突变体。

4.如权利要求3所述的诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：所述的模拟基质水溶液包含：0.9%（w/v）氯化钠、0.07%（w/v）硫酸钠、0.12%（w/v）氯化镁、0.08%（w/v）硫酸钾、0.05%（w/v）氯化钙和0.008%（w/v）碳酸氢钠。

5.如权利要求4所述的诱变续随子种子并筛选耐盐突变体的方法，其特征在于：用于诱变处理的甲基磺酸乙酯的浓度为1%（w/v）。