CN102895661A - 靶向CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。经研究发现，与健康野生型小鼠相比，在EAE小鼠中，CysLT1在免疫组织及脊髓中表达上调，在血和脑脊液中，半胱氨酸-白三烯水平明显增加。CysLT1的两个拮抗剂，扎鲁司特和孟鲁司特，给药EAE小鼠后，EAE小鼠发病时间推迟，发病症状减轻，发病率降低，CNS炎症细胞浸润减少。

Description

靶向CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。 

背景技术

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是人类常见的中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)自身免疫性炎症，病理表现为免疫炎症致中枢神经系统脱髓鞘及神经退行性病变。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是CD4⁺T细胞介导的脱髓鞘疾病，病理特征与MS相似，是研究MS的发病机理、治疗和预防的理想动物模型(1-2)。完全弗氏佐剂与髓磷蛋白、蛋白脂质蛋白(Proteolipid Protein)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)乳化后免疫相关易感鼠，或将自激活T细胞继承转移至正常受体鼠即可诱导产生EAE(5-8)。在EAE动物模型中，血脑屏障的完整性受到破坏，外周CD4⁺T细胞浸润进CNS，导致巨噬细胞和树突状细胞在CNS的浸润和聚集，激活小胶质细胞，最终导致神经脱髓鞘，轴突受损，影响神经冲动传递并可致瘫痪(3-5)。目前引起EAE和MS发病的介质并不是很清楚。 

白三烯(leukotrienes)作为一重要的炎症介质，与多种炎症疾病(如哮喘、过敏性鼻炎及心血管疾病、炎性肠病等)有关(6-10)。在各种致病因子刺激作用下，磷酸甘油被磷酸酯酶A2(Phospholipase A2，PLA2)水解生成游离的花生四烯酸(Arachidonic Acid)。花生四烯酸由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)催化生成白三烯A₄(Leukotriene A₄，LTA₄)并由LTA4水解酶(leukotriene A4 hydrolase，LTA4H)水解生成白三烯B₄(Leukotriene B₄，LTB₄)，或在白三烯C4合成酶(Leukotriene C4 synthase，LTC4S)催化下，生成半胱氨酸-白三烯C₄(Leukotriene C₄，LTC₄)并直至生成半胱氨酸-白三烯D₄(Leukotriene D₄，LTD₄)及半胱氨酸-白三烯E4(Leukotriene E₄，LTE₄)(11)。LTB₄的生物活性是通过两个G蛋白偶联受体(GPCR)白三烯B4受体 1和2(Leukotriene B4receptor 1和2，BLT1和BLT2)(12)来实现的；半胱氨酸-白三烯(Cysteinyl leukotriene，CysLTs)也是通过两个GPCR，即半胱氨酸-白三烯受体1和2(CysLT1和CysLT2)来介导生物活性的(13)。白三烯信号通路的调节剂包括5-LO抑制剂(例如，齐留通(zileuton))和CysLT1拮抗剂(例如，孟鲁司特(montelukast)、扎鲁司特(zafirlukast)和普仑司特(pranlukast))，其位列3类最广泛用于治疗哮喘药物之中，并为唯一的口服药(14-17)。 

微阵列分析显示，作为合成白三烯的关键酶，5-LO在MS病灶部位及EAE动物的CNS中是表达上调的(18)。Zileuton抑制5-LO后，EAE发病推迟，严重程度减轻(19)。一些研究也显示基因或药物阻断BLT1信号能抑制炎症细胞被招募入CNS从而抑制EAE的诱导(12，20)。但半胱氨酸-白三烯和他们的受体是否参与EAE的发病从未见报道。 

发明内容

针对现有技术中的不足，发明人致力于研究EAE发病的介质和机理，半胱氨酸-白三烯及其受体在EAE发病中的作用，以及半胱氨酸-白三烯受体能否作为自身免疫病的治疗靶点，并且完成了本发明。在本发明的研究中，发明人发现在EAE动物模型中，白三烯合成关键酶5-LO及半胱氨酸-白三烯受体CysLT1表达水平明显上调，半胱氨酸-白三烯水平也升高。孟鲁司特和扎鲁司特阻断CysLT1后能减少CNS的炎症细胞浸润，减轻EAE的临床症状。本发明的研究表明，半胱氨酸-白三烯及其受体在EAE发病中扮演了重要角色，主要通过增加MOG特异性T细胞的白介素-17a(IL-17a)的分泌，调节血脑屏障的通透性及诱导致敏T细胞的趋化，引起EAE发病。同时，炎症细胞的过度激活及对组织的浸润是许多自身免疫病(包括多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病等)的共同特征。 

因此，本发明的一个目的是提供靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。 

本发明中，优选地，所述靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物包括CysLT1拮抗剂，更优选地，所述CysLT1拮抗剂包括孟鲁司特(montelukast)、扎鲁司特(zafirlukast)和普仑司特(pranlukast)。 

本发明中，优选地，所述自身免疫性疾病包括多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮、炎症性肠病(inflammatory bowel disease)。 

经研究发现，在EAE小鼠中，CysLT1在免疫组织及脊髓中表达上调，在血和脑脊液中，CysLTs水平明显增加。CysLT1的两个拮抗剂(扎鲁司特和孟鲁司特)给药EAE小鼠后，EAE小鼠发病时间推迟，发病症状减轻，发病率降低，CNS炎症细胞浸润减少。近一步研究发现，CysLT1信号并不影响致敏T细胞的分化，很可能是通过增加MOG特异性T细胞分泌IL-17a，血脑屏障的通透性和诱导T细胞的趋化导致EAE的发病，而给予CysLT1拮抗剂后，可以阻断T细胞的趋化及降低血脑屏障的通透性。也就是说，抗哮喘的CysLT1拮抗剂可以用于临床治疗多发性硬化等疾病，本发明不仅揭示了MS发病的部分机制，同时也为疾病的临床干预提供了新的治疗靶点。 

附图说明

图1为显示EAE发病过程中CysLT受体及合成酶的基因表达变化的图。分别提取免疫后第5天、第9天、第12天、第15天、第18天、第21天EAE小鼠及对照小鼠的脾、淋巴结、脑及脊髓的mRNA，采用实时定量PCR分析基因表达。将同一组织样品中特定基因表达与β-actin(β-肌动蛋白)表达的比值再与对照相比。其中，A-D：在脾(A)，淋巴结(B)，脑(C)和脊髓(D)中CysLT1和CysLT2基因表达变化；E-H：在脾(E)，淋巴结(F)，脑(G)和脊髓(H)中5-LO、LTA4H和LTC4S基因表达变化；I：竞争性酶免疫法检测脑、脊髓、血清、脑脊液中CysLTs浓度(免疫后第10天)。数据表示为mean±SEM(每组有6只小鼠)，结果为两次独立实验中一次代表性数据，与对照比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01和^***p＜0.001，(Sttudent’s t-test)。 

图2为显示CysLT1受体拮抗剂减轻EAE的病情的图。MOG_35-55免疫雌性C57/B6小鼠诱导EAE，从免疫后第3天(A和B)、第10天(C)或第14天(D)起每天一次腹腔给药(孟鲁司特(10mg/kg)、孟鲁司特(30mg/kg)、扎鲁司特(30mg/kg))至实验结束，记录临床评分，对照给予0.9％生理盐水。数据表示为mean±SEM，与对照相比较，^###p＜0.001(双方向方差检验(two-way ANOVA test))，^*p＜0.05，^**p＜0.01，(曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test))。E和F为正常或免疫后给生理盐水及孟鲁司特(10mg/kg，第3天给药，第17天取组织)的小鼠腰髓组织石蜡切片的H&E染色(E)及快蓝染 色(F)图片。G为正常或免疫后给生理盐水及孟鲁司特(10mg/kg，第3天给药，第17天取组织)的小鼠腰髓组织冰冻切片的CD4⁺T免疫荧光染色图片。E-G左侧方框中的图片放大后置于右侧。H-J为对E-G中细胞浸润总数、CD4⁺T细胞浸染数及脱髓鞘面积进行的定量分析，数据以mean±SEM表示。每组取3只小鼠，每只小鼠脊髓取20块切片进行分析，与正常组比较， ^***p＜0.001；与生理盐水对照组比较，^###p＜0.001(Student’s t-test)。 

图3为显示孟鲁司特治疗减少CNS中的致病性T细胞浸润的图。A：用37-70％硅石胶态悬浮液(Percoll)分离出MOG-EAE免疫后第17天小鼠的CNS浸润细胞总数并用流式仪分析；B：在正常及EAE对照或给药组(10mg/kg)小鼠CNS中CD4⁺T细胞浸润的流式分析图；C：CNS中CD4⁺T细胞绝对数的流式分析统计图；D：在正常及EAE对照或给药组(孟鲁司特，10mg/kg)小鼠CNS中T_H1(IFN-γ阳性)和T_H-17(IL-17阳性)细胞浸润的流式分析图；E和F为流式分析统计图，表示为CNS浸润的T_H1和T_H-17的百分比和绝对值。数据来自三次独立实验(mean±SEM)，与正常组比较，^*p＜0.05；与生理盐水对照比较，^#p＜0.05，(Student’s t-test)。 

图4为显示孟鲁司特给药不影响T细胞分化但减少MOG-特异性T细胞中IL-17a生成的图。用流式细胞仪分析免疫后第10天EAE给药组(孟鲁司特，10mg/kg)或生理盐水组小鼠白细胞的亚型。A和C：总体白细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞的比例；B和D：在CD4⁺T细胞亚群内T_H1、T_H-17和T_reg细胞的比例。E-G：在分化因子及各种浓度LTD₄或孟鲁司特存在下，来源于8-9周龄小鼠脾内的幼稚型CD4⁺T细胞在体向T_H1(E)、T_H-17(F)或T_reg(G)分化的状况，数据来自三次独立实验，表示为mean±SEM。H-K：来自正常及EAE给予生理盐水或孟鲁司特的小鼠的脾细胞用MOG_35-55重刺激48小时后收集上清，用ELISA检测IL-17a、IFN-γ、IL-4和TGF-β等细胞因子的含量。数据表示为mean±SEM(每组为5只小鼠)，与正常组对照，^*p＜0.05，^***p＜0.001；与生理盐水对照组比较，^##p＜0.01，(Student’s t-test)。 

图5为显示CysLT1拮抗剂阻断LTD₄导致的血脑屏障通透性的增加的图。A：孟鲁司特减少MOG-EAE小鼠的血脑屏障的渗漏。如试验方法所述，利用荧光素钠进入CNS量检测血脑屏障的通透性。小鼠为正常组或MOG-EAE免疫后第14天给予孟鲁司特(10mg/kg)或生理盐水组。数据表示 为mean±SEM(每组为3只小鼠)。与正常组比较，^***p＜0.001；与生理盐水对照组比较，^##p＜0.01。B：在体外共培养血脑屏障模型中，孟鲁司特阻断LTD₄导致的血脑屏障通透性的增加，其中，bEnd.3细胞培养在Transwell穿膜小室夹层培养体系的上层小室的膜上，大鼠胶质瘤C6细胞培养在下层多孔板内4-5天。用LTD₄(100nM)或LTD₄(100nM)+孟鲁司特(1μM)处理24小时后再把荧光素钠加入上层小室内，检测各时间点渗漏入下层孔内的荧光素钠，数据表示为mean±SEM，数据来源于三次独立实验，每次三复孔。C：LTD₄减少bEnd.3细胞中致密连接蛋白ZO-1的蛋白水平，数据表示为mean±SEM，数据来源于三次独立实验，与对照组比较，^*p＜0.05。D，孟鲁司特抑制LTD₄引起的bEnd.3细胞ZO-1的蛋白水平减少，数据表示为mean±SEM，数据来源于三次独立实验，与对照组比较，^*p＜0.05；与LTD₄处理组比较， ^#p＜0.05(Student’s t-test)。 

图6为显示孟鲁司特抑制LTD₄对免疫细胞的趋化作用的图。A：免疫后第10天小鼠脾细胞加入到Transwell穿膜小室夹层培养体系的上层小室内，上下层小室以带微孔的膜隔开，各种浓度的LTD₄加入到下层小室内。在阻断实验中，1μM孟鲁司特加入到上层及下层小室，而100nM LTD₄只加到下层小室内；1.5小时后，从上层小室迁移到下层小室的细胞通过流式细胞仪计数。B，迁移至下层小室的细胞经表面CD4染色后流式分析，表述为CD4⁺T细胞的迁移指数。数据来源三次独立实验(mean±SEM)，与空白对照组比较，^***p＜0.001；与LTD₄(10^-7M)处理组比较，^##p＜0.01，^###p＜0.001(Student’s t-test)。 

具体实施方式

下面的实施例和附图用于清楚、详细地描述本发明的技术方案，但不以任何形式限制本发明。 

实施例 

材料与方法 

试验动物： 

C57BL/6雌鼠购自上海实验动物中心(上海，中国)并饲养于同济大学实验动物中心SPF级实验室，至8-9周开始实验并维持光-暗12小时循环交 替，给以充足的食料和洁净饮水。所有实验均获得批准，并按照同济大学的动物保健委员会的指引进行。 

试剂： 

1.MOG_35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购自吉泰生化(上海，中国)，纯度＞95％。孟鲁司特购自Merck，扎鲁司特购自3B Scientific(武汉，中国)，M-MLV逆转录酶和Rnasin核糖核酸酶抑制剂购自Promega(Fitchburg，WI)。SYBR Green JumpStart^TM Taq ReadyMix^TM试剂盒和荧光素钠购自Sigma(St.Louis，MO)。Percoll^TM购自GE healthcare。异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)抗小鼠CD45，FITC抗小鼠CD8a，phycoerythrin(PE)抗小鼠CD45R(B220)和别藻蓝素(Allophycocyanin，APC)抗小鼠/大鼠Foxp3staining set购自eBioscience(San Diego，CA)。PE-Cy7抗小鼠CD4，PE抗小鼠IL17a，APC抗小鼠IFN-γ，PE抗小鼠Foxp3和BD Cytofix/Cytoperm试剂盒购自BD bioscience(Franklin Lakes，NJ)。Dynal

小鼠CD4细胞负分选试剂盒购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。IL-17a、IFN-γ(γ干扰素)、TGF-β(转化生长因子-β1)和IL-4(白介素-4)的ELISA试剂盒购自达科为(深圳，中国)。 

试验方法： 

EAE诱导及小鼠给药 

8-9周龄雌性C57BL/6小鼠皮下注射200μg MOG_35-55辅以完全弗氏佐剂及热灭活结核杆菌(H37Ra菌株，5mg/ml，BD Biosciences。免疫当天为第0天。第0天及第2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素200ng(Calbiochem)。采取“双盲法”(双盲法是指建模和给药是第一个人操作，而评价的是第二个人，双方在实验未结束前不交流实验结果)每天为小鼠评分，评分按“5分制”标准如下：0分，无临床症状；1分，尾部瘫痪；2分，轻度瘫痪(单侧或双侧后肢无力，不完全瘫痪)；3分，截瘫(双侧后肢完全瘫痪)；4分，截瘫并前肢无力或瘫痪；5分，濒死状态或死亡。 

小鼠给药：从免疫后第3天、第10天或第14天起经腹腔注射给予孟鲁司特和扎鲁司特(10-30mg/kg，溶于生理盐水中)，直至研究结束。生理盐水为阴性对照(每只100μl)。 

组织病理与免疫荧光分析 

为分析CNS浸润，小鼠麻醉后经PBS灌流及4％多聚甲醛灌流固定。脊髓组织样品在4％多聚甲醛中固定过夜。石蜡包埋后用H&E染色分析炎症细胞浸润，用快蓝染色分析脊髓脱髓鞘现象。冰冻切片用抗小鼠CD4一抗及相应荧光二抗染色。 

实时-定量PCR 

根据产品说明，利用TRIzol(Invitrogen)提取脊髓、大脑皮质、脾细胞和淋巴结细胞总RNA，用六碱基随机引物和M-MLV逆转录酶(Progema)逆转录至cDNA。利用SYBR Green JumpStart^TM Taq ReadyMix^TM试剂盒(Sigma)及各基因引物序列在LightCycler定量PCR仪(Stratagene)上进行实时-定量PCR检测各基因表达情况。引物序列如下： 

CysLT1上游引物：5’-CTCCAAGGCACCAAGCAGAC-3’， 

CysLT1下游引物：5’-TGCCAAAGAAACCCACAACAG-3’； 

CysLT2上游引物：5’-CGAAGGCAGAGGCACAGATT-3’， 

CysLT2下游引物：5’-GAACCAAATCACTGAAGTATGCCT-3’； 

5-LO上游引物：5’-CACGCATCTGGTGTCTGAGG-3’， 

5-LO下游引物：5’-CCTTAGTGTTGATAGCAATGGTGA-3’； 

LTA4H上游引物：5’-CCTATGAGAAGGGCTTTGCG-3’， 

LTA4H下游引物：5’-CGTAGAGCCAGGTGTTCCAAT-3’； 

LTC4S上游引物：5’-CCTGTGCGGACTGTTCTACCT-3’， 

LTC4S下游引物：5’-GCCATCGCCACCAGCA-3’； 

β-actin上游引物：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’， 

β-actin下游引物：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGTT-3’。 

半胱氨酸-白三烯酶免疫分析法 

使用竞争性酶免疫分析法(EIA，Cayman chemical)，根据产品说明检测脑、脊髓、血清及脑脊液中的半胱氨酸-白三烯含量。对于脑及脊髓样品，组织在甲醇中匀浆后离心去除沉淀蛋白，上清真空干燥后用于检测。血样采自眼眶，取血后在4℃静置30分钟，4500g离心10分钟后收集上清即为血清。毛细管自枕骨大孔收集脑脊液。脑及脊髓样品中，半胱氨酸-白三烯含量表述为每毫克(mg)组织样品中的匹克(pg)数，然后与正常对照小鼠的数值相比；血清和脑脊液样品中，半胱氨酸-白三烯含量表述为每毫升(ml)液体中的匹克(pg)数，并与正常小鼠数值相比。 

CNS浸润白细胞分离及分析 

用组织匀浆器在冰上将脊髓及脑组织匀浆后用70μm细胞过滤器滤过，细胞悬液在4℃500g离心10分钟后，用8ml 37％Percoll试剂重悬，小心加入到4ml 70％Percoll试剂中，在25℃780g条件下离心25分钟。收集位于37％～70％Percoll中间层细胞并进行流式检测。 

CD4⁺T细胞分离和体外分化 

用磁珠分离8-9周龄C57BL/6小鼠脾中幼稚型CD4⁺T细胞，分离后的CD4⁺T细胞加入抗CD3(2μg/ml；145-2C11；BD Pharmingen)和抗CD28(2μg/ml；37.51；BD Pharmingen)抗体激活后分别加入IL-12(10ng/ml；Peprotech)和抗-IL-4(10μg/ml；11B11；BD Pharmingen)诱导分化为T_H1细胞，及加入TGF-β1(5ng/ml；Peprotech)、IL-2(50U/ml；Peprotech)和抗-IFN-γ(10μg/ml；XMG1.2；BD Pharmingen)诱导分化为T_reg细胞，或加入抗-IL-4、抗-IFN-γ及含TGF-β1(3ng/ml)、IL-6(30ng/ml；eBioscience)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor)(10ng/ml；Peprotech)和IL-1β(10ng/ml；Peprotech)的T_H-17“分化因子组合”来诱导分化为T_H-17细胞。各种浓度的LTD4及孟鲁司特同时加入以评估其对T细胞分化的影响。 

流式细胞检测 

脾细胞或CNS浸润细胞与12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(phorbol 12-myristate 13-acetate)(50ng/ml；Sigma)，伊屋诺霉素(ionomycin)(750ng/ml；Sigma)和布雷菲德菌素A(brefeldin A)(1.0μg/ml；Sigma)混合后在37℃孵育5小时，用相应抗体染细胞表面标记物。表面染色后细胞重悬于固定/通透液(Cytofix/Cytoperm试剂盒；BD Pharmingen)中，胞内染色按产品说明操作。对于Foxp3染色，细胞不用phorbol 12-myristate 13-acetate和ionomycin刺激，而是使用Foxp3染色试剂盒并按产品说明操作。结果用Guava easyCyte^TM 8HT流式细胞仪和GuavaSoft软件进行分析。 

MOG-特异性细胞因子ELISA检测 

正常对照小鼠或EAE给生理盐水或孟鲁司特的小鼠在免疫后第10天处死，脾取出后用红细胞裂解液处理，然后1000g离心3分钟收集白细胞。白细胞在含10％FBS的DMEM培养基中重悬，以2×10⁵/孔/100μl铺在96孔板中，用MOG_35-55(20μg/ml)重刺激细胞48小时，收集上清后根据特定的 ELISA试剂盒，按照产品说明，分别检测其中的细胞因子IL-17a、IFN-γ、IL-4和TGF-β的含量。 

在体血脑屏障通透性检测 

按照文献描述的方法，以荧光素钠为示踪分子在体内检测血脑屏障通透性(21)。简言之，小鼠腹腔注射100μl 10％的荧光素钠，45分钟后，心脏抽血，PBS灌流。脑与脊髓称重后在1.5ml冷7.5％三氯乙酸匀浆后10,000g离心10分钟去除可溶性沉淀。上清再用7.5％三氯乙酸中以1∶10稀释。加入0.25ml 5N NaOH后，100μl上清样品荧光值由Flexstation多孔板酶标仪(Molecular Devices)测定，激发波长为485nm，发射波长为530nm。荧光素纳标准品(0.064-100μg/ml)用于绘制标准曲线以计算样品中荧光素钠的含量。CNS的荧光值先与同只动物中的血清荧光值相比后再与正常对照鼠进行比较。 

体外血脑屏障实验 

体外共培养血脑屏障实验采用0.4μm孔径，12mm大小的穿膜小室(Transwells，Corning)(22-23)。小室隔膜用层粘连蛋白(laminin)(sigma)包被30分钟后，将鼠脑微毛细管内皮细胞bEnd.3以6.0×10⁴个细胞/cm²的密度铺入每个小室内，大鼠胶质瘤C6细胞(2.0×10⁴)铺于下层12孔板内。每两天培养液换液，4-5天后移去培养液，上层小室用PBS洗后加入0.5ml含1％BSA的缓冲液，并分别加入LTD₄(100nM)或LTD₄(100nM)+孟鲁司特(1μM)。甲醇(0.1％)为阴性溶剂对照。下层孔内液体与上层小室内液体一样。孵育24小时后，上层小室内加入20μl 10mg/ml荧光素钠，按固定时间点从下层孔内取出100μl液体进行荧光检测后再放回孔内。样品荧光值由Flexstation多孔板酶标仪(Molecular Devices)测定，激发波长为485nm，发射波长为530nm。 

Western blot 

培养48小时后，bEnd.3细胞用阴性溶剂对照(0.1％甲醇)，LTD₄(100nM)，或LTD₄(100nM)+孟鲁司特(1μM)处理后，细胞用PBS洗后在裂解液(50mM Tris pH 7.4，150mM NaCl，0.1％Chaps，1mM EDTA，1mM NaF，1mMNa₃VO₄和蛋白酶抑制剂)中裂解，冰上超声30秒，用二辛可宁酸蛋白定量法(BCA法)定蛋白浓度。等量蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳分离后电转到PVDF膜。Western blot采用鼠抗ZO-1抗体及相关HRP-标记的二抗。 

趋化实验 

体外趋化实验采用5μm孔径穿膜小室(Transwells，Corning)，免疫后第9天EAE小鼠脾细胞分离后用含1％BSA的RPMI-1640培养液预孵0.5小时，细胞洗后用含20mM HEPES和0.5％BSA的RPMI-1640培养液稀释成密度为1×10⁷细胞/ml悬液。各浓度LTD₄加入到下层孔内而100μl细胞悬液加入到上层小室内。对于趋化阻滞实验，1μM孟鲁司特分别加入到下层孔及上层小室内，100nM LTD₄则加入至下层孔内。正常培养1.5小时后迁移至下层孔内的脾细胞用流式细胞仪计数。 

数据统计 

数据表示为mean±SEM，EAE小鼠处理组间统计学差异用two-way ANOVA test分析，时间点内EAE评分统计学差异用Mann-Whitney test分析。其他数据分析如基因表达，细胞因子生成后病理学统计分析用Student’s t-test分析。p＜0.05为有统计学意义。 

结果： 

EAE发病过程中CysLT信号通路的关键蛋白表达上调 

本发明用MOG_35-55免疫C57BL/6小鼠诱导EAE。为阐明CysLTs是否与EAE发病有关，本发明检测了与CysLTs生成及信号转导有关的几个蛋白质的基因表达情况，包括2个受体(CysLT1和CysLT2)和3个酶(5-LO，LTA4H和LTC4S)在EAE免疫后第5、9、12、15、18和21天的表达水平。在脾和淋巴结(图1A和1B)，CysLT1从免疫后第5天，也就是发病临床前期就出现了明显上调。在脾内，CysLT1在EAE开始发病(免疫后第12天)时表达致最高点，然后慢慢下降(图1A)。在淋巴结，CysLT1表达上调并维持在一个平台。而在脑组织CysLT1的表达只在EAE发病后(第15天，图1C)出现一轻微但有明显差异的上调。在脊髓组织中，CysLT1随着EAE发病开始表达上调，并在整个发病过程中持续升高(图1D)。相反，CysLT2只在脑中第5天及第9天有过轻微但有明显差异的上调，而在其他时间点及其他组织中均未见表达变化(图1A-D)。由于CysLTs是由游离花生四烯酸经5-LO和LTC4S水解而来，接着发明人分析了5-LO和LTC4S的表达情况。在脾内，5-LO mRNA水平从免疫后第5天开始增加，到第9天达到平台(图1E)。在淋巴，5-LO从第9天开始表达上调，免疫第12天后表达上调到一个相对稳定的水平(图1F)。在脊髓，5-LO随着病情进展表达平行升高(图 1H)。与之相反，LTA4H只在脾内有明显上调(图1E)，而LTC4S在所有组织中均未见有明显改变。而在脑内，所有酶均未见有明显改变(图1G) 

接下来发明人用竞争性酶免疫检测法检测了CysLTs的水平，与对照鼠比较，EAE鼠免疫后第10天CysLTs在血清及脑脊液中的水平有明显升高。在脑及脊髓组织中CysLTs的浓度变化虽未见明显差异，但也有增高的趋势(图1I)。MOG免疫后受体及配体均升高表明CysLTs与其受体CysLT1可能在EAE发病过程中扮演某种角色。 

CysLT1拮抗剂减轻EAE的临床症状及CNS浸润 

为进一步评价CysLTs信号通路在EAE发病过程中的作用，我们利用CysLT1受体的两个拮抗剂(孟鲁司特和扎鲁司特，目前主要用于哮喘临床治疗)来治疗MOG诱导的EAE小鼠。腹腔注射给药从免疫后第3天(图2A和2B)、第10天(图2C)或第14天(图2D)开始直至实验结束，对照组注射0.9％生理盐水。免疫后第3天或第10天开始给予孟鲁司特可剂量依赖性地抑制EAE的病情并出现(图2A和2C)。扎鲁司特(30mg/kg)也显著减轻EAE的病情(图2B和2C)。并且即使在发病后给药，孟鲁司特(30mg/kg)仍能减轻EAE的病情，显示该药具有预防及治疗EAE的作用。 

在免疫第17天的脊髓组织中，与对照组相比，孟鲁司特可明显减少白细胞对脊髓的浸润。快蓝染色显示生理盐水对照组的EAE小鼠脊髓白质出现广泛的脱髓鞘现象，而给予孟鲁司特后脱髓鞘现象明显减少(图2F和2I)。原位免疫荧光染色的结果显示，孟鲁司特给药后能明显减少EAE小鼠脊髓中CD4⁺T细胞的数量。 

发明人利用流式分析技术对免疫后第17天CNS白细胞浸润情况进行了进一步验证。孟鲁司特给药后总的CNS浸润数(图3A)和CD4⁺T细胞在CNS的聚集都减少了(图3B和3C)。T_H-17和T_H1是EAE主要的致病CD4⁺T细胞(24)。孟鲁司特给药后，T_H1的绝对数及百分比均明显下降(图3D和3E)。虽然T_H-17在浸润的CD4⁺T细胞的百分比没变，但T_H-17细胞的绝对数明显减少(图3D和3F)。综上所述，给予CysLT1拮抗剂阻断CysLT1信号通路后，能明显减少CNS的炎症细胞浸润及脱髓鞘现象，从而显著减轻EAE的病情。 

CysLT1信号不影响体内及体外T细胞的分化 

接着发明人检测CysLT1信号转导是否影响T细胞的分化。在EAE小鼠中，孟鲁司特并不明显改变脾及血中白细胞(CD45⁺细胞)、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和B细胞的比例(图4A和4C)。EAE小鼠给予孟鲁司特或生理盐水后，T_H1、T_H-17或T_reg细胞在CD4⁺细胞中的比率也无差异(图4B和4D)。利用体外分化实验发明人进一步检测CysLTs或孟鲁司特是否直接影响T_H1、T_H-17或T_reg分化。从8-9周龄雌性C57BL/6小鼠脾细胞中用免疫磁珠分选出幼稚型CD4⁺T细胞，用抗-CD3和抗-CD28抗体激活后加入不同分化因子及各种浓度的LTD₄(0.1，0.3和1μM)和孟鲁司特(1，3和10μM)，将细胞诱导分化为T_H1、T_H-17或T_reg细胞。三天后收集细胞进行胞内IFN-γ、IL-17a或Foxp3的染色。流式分析后发现LTD₄和孟鲁司特并不影响T_H1(图4E)、T_H-17(图4F)或T_reg细胞(图4G)的体外分化。 

接着发明人想检测孟鲁司特是否影响MOG重刺激时脾细胞的细胞因子分泌能力。给予孟鲁司特或生理盐水的EAE鼠在免疫后第10天处死，脾细胞分离后用MOG_35-55(20μg/ml)在37℃重刺激48小时。上清收集后用ELISA测定IL-17a、IFN-γ、IL-4和TGF-β含量(25-26)。如图4H所示，孟鲁司特可明显减少IL-17a的分泌，而IFN-γ、IL-4和TGF-β等因子的水平无明显影响。综上所述，CysLT1信号不影响炎症T细胞或调节T细胞的增殖或分化，但能减少MOG特异性T_H-17细胞因子生成。 

孟鲁司特减轻LTD₄诱导的血脑屏障损伤 

发明人的实验结果显示孟鲁司特可以抑制白细胞浸润，但同时发明人并未发现外周免疫组织中T细胞数量有明显变化，基于以上观察，发明人推测孟鲁司特可能影响白细胞的浸润过程。由于血脑屏障的通透性的改变与EAE临床症状的严重程度有相关性(3)，且已有报道CysLTs能增加微血管的通透性(27-28)，发明人推测是否CysLT1受体激活后会导致EAE血脑屏障的通透性增加。发明人采用荧光素钠作为一种示踪分子用于检测血脑屏障的完整性(3)。与正常小鼠相比，荧光素钠可以明显从外周血渗漏入到免疫后第14天EAE小鼠的脊髓(9.3倍)和脑(1.95倍)，而孟鲁司特可明显减少荧光素钠从外周血至脊髓的渗漏(图5A)。 

随后发明人用bEnd.3和C6体外共培养的血脑屏障模型检测CysLTs对血脑屏障的影响(22-23)。与对照组相比，LTD₄明显增加荧光素钠的通透性，即增加体外血脑屏障模型的通透性。与体内观察一致，通透性的增加可以被 孟鲁司特抑制(图5B)。CNS毛细血管内皮细胞形成致密连接，有助于维持血脑屏障的低通透性(29)。致密连接的完整性直接决定了血脑屏障的通透性(30)。根据western blot分析发现，LTD₄处理24-36小时后，bEnd.3细胞上致密连接蛋白ZO-1的水平明显减少(图5C)。给予孟鲁司特后，减少的ZO-1水平几乎完全恢复(图5D)。这些结果表明LTD₄可以通过减少致密连接蛋白ZO-1，从而增加血管通透性。而孟鲁司特可阻断LTD₄导致的体内或体外血脑屏障渗漏。 

孟鲁司特阻断LTD₄诱导的白细胞趋化 

血脑屏障通透性是影响白细胞浸润的一个重要因素，而趋化也有可能在白细胞浸润中扮演重要角色。已有报道阻断白细胞趋化可以减轻EAE病情(31-32)。而有报道CysLTs对嗜酸性粒细胞(33)及单核细胞(34)具有趋化活性，发明人想知道是否它也能诱导EAE中的致敏T细胞的趋化活性。利用穿膜小室实验，发明人发现LTD₄对免疫第10天EAE小鼠的脾细胞具有明显的剂量依赖的趋化活性。而LTD₄在100nM浓度具有最高趋化活性(图6A)，这种钟形的剂量反应曲线在许多趋化剂中可见。正如预期，孟鲁司特给药可以减少LTD₄诱导的脾细胞趋化活性(图6A)。而且，对趋化入下层孔板的脾细胞进行表面染色分析，发现与全脾细胞相比，LTD₄对CD4⁺T细胞有更强的趋化活性(2.7倍对1.6倍)。孟鲁司特给药几乎完全抑制了LTD₄对CD4⁺T细胞的趋化。这些结果与发明人观察到CysLT1受体在EAE小鼠脾及血中上调，CysLTs在脑脊液中明显增加是相吻合的。结果表明LTD₄对白细胞，尤其是CD4⁺T细胞的趋化，有助于CNS浸润及最终参与EAE的发病。 

讨论 

作为一种器官特异性自身免疫性疾病，MS主要表现为CNS慢性炎性脱髓鞘病变，是目前年轻人中非创伤致神经功能障碍的最主要原因(35)。由于MS病因不明，治疗仍存在很多困难，急需确定新的治疗靶点(36)。G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的受体超家族，成员超过1000，它们广泛参与各种生物活动并与许多人类疾病相关(37)。由于其重要的生理作用及定位于细胞表面，GPCRs是目前市场上最重要的药物作用靶点(38)。最近，芬戈莫德(FTY720)，一种1-磷酸-鞘氨醇受体激动剂，已被美国FDA批准为第一种口服、治疗复发性MS的一线药物。在一个一年期的三期临床研究中，其疗 效好于一线药物IFN-β1a(39)。也有报道其他许多GPCRs参与了MS的发病，包括前列腺素E2受体EP2和EP4(40)，血管紧张素II型-1a受体(AT1aR)(41)和激肽受体B1(Bdkrb1)(31)及许多趋化因子受体(42-43)。 

在此，本发明人发现，在EAE小鼠中，CysLTs信号转导的关键蛋白，包括受体及配体生成关键酶均表达上调，两个CysLT1受体拮抗剂(孟鲁司特和扎鲁司特)可有效减轻EAE病情。 

CysLTs主要由肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞产生。CysLTs在哮喘、过敏性鼻炎及其他呼吸道疾病中扮演重要角色。有少量报道显示，抑制白三烯合成的相关酶(例如cPLA2α或5-LO)并不会减少IFN-γ或IL-17a的生成(19)，这些研究正与发明人的研究结果是一致的，即阻断CysLT1能减轻EAE的病情，但不影响T_H1或T_H-17的细胞分化。相反，BLT1、LTB₄的受体可能对T_H1/T_H-17的生成是必须的，因为BLT1^-/-鼠显示EAE发病延迟，EAE症状减轻，T_H1和T_H-17细胞因子水平减少(12)。 

虽然孟鲁司特阻断CysLT1并不影响T细胞的分化，而发明人确实发现该药能明显减少T_H1和T_H-17浸润入EAE小鼠CNS中，因此推测CysLT1信号应该影响T细胞浸润过程，而在炎症反应中趋化作用对T细胞聚集起关键作用(44)。在EAE小鼠中，效应T细胞起源于外周淋巴结中，必须迁移进CNS激发炎症，而趋化因子及其受体参与T细胞的浸润及EAE的发病是已知的。如TAK-779、CCR5的拮抗剂并不影响T细胞功能，而是通过减少炎症细胞迁移入CNS而减轻EAE病情(45)。特定抗体阻断CXCR3也抑制T细胞迁移，从而抑制EAE继承转移模型的发病(42)。也有报道称CCR6对于T_H-17进入CNS及EAE发病是需要的(46)。在研究中，发明人发现LTD₄对MOG-EAE小鼠脾细胞显示出剂量依赖的趋化活性，而且与全脾细胞相比，LTD₄对CD4⁺T细胞的趋化活性更强。这些结果与CysLT1受体在免疫组织中表达上调及CysLTs在EAE小鼠脑脊液中明显升高吻合。也就是说，孟鲁司特能阻断LTD₄诱导的T细胞迁移，有助于治疗EAE。 

另一个影响浸润过程的是血脑屏障的通透性。血脑屏障通透性与EAE的临床表现之间有明显关联(21)。已有报道表明高浓度的CysLTs在酵母多糖引起腹膜炎发病初期可增加血管通透性(47)。其他研究也显示CysLT1拮抗剂，包括孟鲁司特，可能通过抑制毛细血管的通透性从而抑制肿瘤代谢(27)。因此发明人设想CysLT1信号可能在EAE发病时有助于血脑屏障的 破坏，这种破坏可被孟鲁司特所阻断。确实，发明人发现EAE小鼠血脑屏障的通透性明显增加，特别是在脊髓，这与前人报道是一致的(3)，而孟鲁司特给药可以抑制EAE小鼠血脑屏障通透性的增加。利用体外血脑屏障模型实验，发明人直接证明LTD₄可以增加血脑屏障的通透性，并且这种现象可以被孟鲁司特阻断。 

CNS毛细血管内皮细胞间的致密连接是血脑屏障重要的结构组分(48)。致密连接是由密封链组成的分支网络，密封链是由纤维状蛋白质结构植入脂质双分子层构成的。致密连接相邻细胞膜并消除胞间隙，避免物质自由扩散。完速描膜蛋白如claudins，和细胞质斑块蛋白ZO-1/ZO-2之间的相互作用，对于致密连接的稳定是至关重要的(49)。鼠内皮细胞ZO-1基因靶向破坏及ZO-2蛋白RNAi敲除可导致致密连接形成缺失(50)。发明人也发现LTD₄处理导致bEnd.3鼠大脑内皮细胞ZO-1蛋白的明显减少，这可能导致EAE小鼠血脑屏障通透性的增加，而且在EAE小鼠的血清及脑脊液中CysLTs水平升高。孟鲁司特治疗能阻断ZO-1蛋白的丢失，保证血脑屏障的完整性，但是LTD₄如何介导ZO-1蛋白的丢失还有待研究。前人研究显示PKC和p38信号通路激活能导致ZO-1蛋白的丢失，增加血脑屏障的通透性(51-52)。其他人也报道内源性CysLTs能增加胞内钙流，激活PKC、p38和PI3K(53)，因此CysLTs可能是通过激活PKC和p38导致ZO-1蛋白的减少。 

迄今，累见CysLTs涉及呼吸性和炎症性疾病，但很少提及其在自身免疫性疾病中的作用，在此，发明人发现了CysLTs在EAE发病时调节T细胞趋化及血脑屏障的通透性，同时也证明了两个目前用于治疗哮喘的CysLT1拮抗剂能减少CNS炎症细胞浸润，减轻EAE临床症状，并且发现即使在疾病进程中给药，孟鲁司特也表现出明显的治疗疗效。目前老药新用是创新药物发现的重要来源，本发明不仅揭示了MS发病的部分机制，同时也为疾病的临床干预提供了新的治疗靶点及新的药物。 

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Claims (4)

1.靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶向半胱氨酸-白三烯受体CysLT1的药物包括CysLT1拮抗剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述CysLT1拮抗剂包括孟鲁司特、扎鲁司特和普仑司特。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述自身免疫性疾病为多发性硬化、类风湿关节炎、红斑狼疮或炎症性肠病。

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