CN102892778A - 用于治疗甲型流感病毒诱发的疾病、编码经修饰的Mx蛋白的多核苷酸、所述经修饰的Mx蛋白和表达编码经修饰的Mx蛋白的基因的转基因动物 - Google Patents

用于治疗甲型流感病毒诱发的疾病、编码经修饰的Mx蛋白的多核苷酸、所述经修饰的Mx蛋白和表达编码经修饰的Mx蛋白的基因的转基因动物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物的甲型流感病毒诱发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域的Mx蛋白的基因。本发明还提供了转基因动物，其具有减弱的对甲型流感病毒的易感性，表达编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域；条件是所述动物不属于灵长目、牛科(牛属、印度水牛、Ovis)、鳍脚目或啮齿目的分类组。

Description

用于治疗甲型流感病毒诱发的疾病、编码经修饰的Mx蛋白的多核苷酸、所述经修饰的Mx蛋白和表达编码经修饰的Mx蛋白的基因的转基因动物
技术领域
本发明总体上涉及突变的Mx发动蛋白(dynamin)，更具体地涉及利用此类Mx发动蛋白突变体预防或治疗与病毒感染相关的疾病的组合物和方法。具体地，本发明涉及用于治疗甲型流感病毒诱发的疾病、编码经修饰的Mx蛋白的多核苷酸、所述经修饰的Mx蛋白以及表达编码经修饰的Mx蛋白的基因的转基因动物。
背景
产生了许多疫苗，并且验证了所述疫苗预防与人和动物的病毒感染相关的症状和死亡率。由于被靶向的病毒的持续遗传进化，这些疫苗中的一些疫苗必须经常更新，特别是目的在于预防可归因于甲型流感病毒的症状和死亡率的那些疫苗。用于制备更新的疫苗的病毒株系的这样的反复更新阻碍了大量疫苗的及时产生。此外，此类反复更新和确保此类疫苗的快速和广泛分配及施用所必需的供应链的生产成本通常阻止了猪、鸡、火鸡或马工业及时充足地接种所有被靶向的动物。
在人中，仅金刚烷(金刚烷胺,金刚乙胺)和神经氨酸酶的抑制剂(奥司他韦,扎那米韦)可用于治疗与甲型流感病毒相关的疾病。此类分子的大规模使用迅速导致抗性病毒株的出现。例如，大部分循环甲型流感病毒株目前抗金刚烷并且抗神经氨酸酶的抑制剂的H5N1株的流行持续增加。因此，能够缓和人的甲型流感病毒相关疾病的化学治疗分子是非常缺乏的。
在人中，提出了使用单克隆抗体来抵抗病毒疾病的。然而，由于此类分子包含非人区段，因此它们通常引起过敏反应。此外，由于许多病毒被赋予用于逃避新型治疗分子的非常有效的遗传进化能力，因此预期的来自开发新型抗病毒单克隆抗体的方法的成本/效益比明显阻碍了新型分子的发现。
在人中，基因疗法是抵抗疾病的替代性方法，如过去对于遗传疾病、癌症或病毒疾病所显示的方法(参见PCT公布号WO91/02805、EP 0 415731和WO 90/07936)。由于基因疗法中使用的载体仅转化一部分可用于病毒扩增的宿主细胞，因此可靠的抗病毒转基因必须编码非常强的抗病毒蛋白以给基因疗法提供降低被靶向的疾病的严重度的任何机会。此类可靠的转基因仍未存在。
在动物中，经济破坏性或兽传人兽互通性病毒性接触传染病的传播的预防包括大规模屠杀。今天，该卫生政策面临重大经济和伦理考量。在动物中，理论上仍然可能使用遗传抗性亲代(genitor)来在后代之间散播抗性性状并且，因此，逐渐增强农场动物群体的流行病抗性。然而，该方法基于对编码抗被靶向的疾病的先天抗性的基因座上的等位基因变异的先前鉴定。就成本/效益比而言这样的项目是不现实的，特别地因为许多疾病抗性性状是多基因的。
在1962年，Lindenmann小组偶然发现近交小鼠品系A2G自发地抗利用对于其它品系是系统性致命的甲型流感病毒的实验感染。新型抗性性状被记录为Mx，代表粘病毒抗性(myxovirus resistance)。数年后发现，Mx+性状在干扰素α/β(IFNα/β)治疗后与约78kDa的蛋白质(此后命名为Mx蛋白)的表达共分离。自那以来，分子遗传学研究导致首先在小鼠中，然后在人中以及随后在所有研究的脊椎动物物种中鉴定了引起Mx蛋白表达的基因。根据序列同源性，已显示脊椎动物Mx蛋白为大的发动蛋白样GTP酶。发动蛋白组成了在许多细胞过程(其中有迁移、膜重塑、胞吞、小泡运输以及细胞和细胞器的分裂)中起着至关重要的作用的高分子量GTP酶的亚家族。在发动蛋白分子中，有一些不存在典型的普列克底物蛋白(pleckstrin)和富含脯氨酸/精氨酸的结构域并且其表达受I型干扰素控制；此类蛋白称为“Mx”发动蛋白。每一个脊椎动物物种具有2个或3个Mx基因，已在体外显示其少数等位基因形式编码被赋予抗病毒活性(最常见地是抗甲型流感病毒)的Mx发动蛋白。其它研究显示Mx发动蛋白的一些形式被赋予抗病毒性质以及靶向不同的病毒(取决于研究的Mx同种型)。定向诱变研究后来显示Mx发动蛋白的C末端GTP酶效应子结构域(GED)支持抗病毒活性和抗病毒谱。
为了努力研究抗病毒活性，已获得牛(Bos taurus)Mx1发动蛋白序列。利用表达牛Mx1基因的培养的细胞进行的体外测试显示人和牛副流感-3、人和牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻/粘膜疾病、仙台、麻疹和脑心肌炎病毒不被牛Mx1抑制，而水泡性口炎和狂犬病病毒被其抑制。与其它Mx发动蛋白相比较，特定的抗病毒谱因而与牛Mx1发动蛋白相关，但由于现有技术已显示其它Mx发动蛋白展示特定的抗病毒谱，这并非是意料之外的。
除由小鼠Mx1+等位基因编码的是个明显的例外外，现有技术缺乏能够在体内抑制甲型流感病毒感染相关疾病的Mx发动蛋白。由于甲型流感病毒在人、猪和家禽群体中持续地循环，所以人、猪或鸡Mx蛋白不分别保护人、猪和鸡免受严重的、甚至致命的流感疾病的侵害并不令人惊奇。因此将人、猪或鸡抗病毒Mx1发动蛋白用于基因疗法并不可行。类似地，选择被赋予最佳等位基因(如体外测定的)的亲代来逐渐产生更具抗性的鸡或猪群体也不可行。相反地，将小鼠Mx1发动蛋白用于基因疗法或用于产生转基因抗流感食用动物(food animal)在理论上是可行的。然而，由于小鼠Mx1发动蛋白在系统发育上远离人Mx蛋白，因此免疫病理学(过敏)问题可能因基于小鼠Mx1的基因疗法或因含小鼠Mx1的食品的摄入而产生。此外，将鼠源化(murinized)鸡肉、鼠源化火鸡肉或鼠源化猪肉摆上市场无疑将引起消费者的反感。因此，高度期望将具有增强的抗病毒活性的突变型人Mx发动蛋白用于基因治疗组合物。类似地，高度期望产生具有等于或优于由小鼠Mx1在体内产生的抗病毒活性的突变型食用动物Mx发动蛋白，以产生转基因抗流感食用动物。迄今已知的所有抗流感Mx发动蛋白的抗病毒功能都是通过它们的C末端GTP酶效应子结构域(GED)产生的。
TNF-受体相关因子(TRAF)形成许多衔接分子(adapter molecule)，在TNF-、IL-1β、TLR和RANK受体通过它们各自的同源配体衔接后，所述衔接分子首先与激活的受体接触，用作激酶和被招募至激活的受体的其它效应蛋白的停靠分子。TRAF随后调节受体-配体复合物的亚细胞再定位并且通过控制途径中的关键蛋白的降解来调节应答的性质和程度。通过这样的作用，TRAF控制蛋白激酶级联以及NF-kB和AP-1家族的转录因子的激活，从而调谐参与增殖、分化和细胞凋亡的众多基因的转录。
现有技术缺乏抑制病毒增殖和/或消除或减弱病毒疾病相关的细胞因子应答和器官功能障碍的方法。
因此本发明的目的是提供动物，优选转基因动物，所述动物具有减弱的对甲型流感病毒的易感性。目的还在于提供用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的药物。
此外，本发明的目的因而也在于提供用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒，特别是用于人用途的药物。
发明概述
在根据本发明的研究中，令人惊讶地已发现在体外，与其它Mx发动蛋白相比较，牛Mx1发动蛋白展示出曾经鉴定的最强的抗甲型流感病毒活性。此外，由该特定Mx发动蛋白产生的特别强的抗甲型流感病毒活性在体内得到了确认，从而提供了用于预防或治疗甲型流感病毒相关疾病的最可靠的分子。如根据现有技术所预期的，有人假设该前所未有的抗病毒活性由蛋白质的C末端区段、所谓的GED支持。然而，本发明人惊讶地发现，用被赋予弱抗甲型流感病毒活性的任何Mx发动蛋白的GED置换牛Mx1中的GED导致仍然被赋予上述罕见抗病毒活性的嵌合Mx发动蛋白。相反地，将牛GED移植在弱抗流感Mx发动蛋白的骨架上导致仍然弱抗流感嵌合Mx发动蛋白。本发明人发现了未被插入在C末端GED区段中的Mx抗病毒活性增强子，从而提供了不依赖于GED的抗病毒基序。
该不依赖于GED的抗病毒基序由经鉴定存在于牛、绵羊(Ovis aries)和印度水牛(Bubalus bubalis)的Mx1骨架中的TRAF2和TRAF6结合基序(其不存在于迄今已测试的所有脊椎动物Mx发动蛋白中)代表。本发明人还发现具有该新型TRAF2/TRAF6结合基序的Mx发动蛋白有效地结合TRAF2和TRAF6，然而不存在该新型TRAF2/TRAF6结合基序的Mx发动蛋白则不结合。此外，在本发明的研究过程中，还发现该新型TRAF2/TRAF6结合基序在Mx骨架中的存在足以驱动上述前所未有的抗甲型流感活性。支持这些发现的是，TRAF2/TRAF6结合基序缺陷型突变牛Mx1显示极弱的抗甲型流感病毒活性。因此，本发明显示TRAF2结合结构域和/或TRAF6结合结构域在Mx发动蛋白中的插入足以增强其抗甲型流感活性。
本发明人进行了牛Mx1蛋白的序列与其在例如鸡、火鸡、鸭、猪、马和人中的对应蛋白的序列比较，该比较显示这类Mx1蛋白不具有上述基序。本发明因而提供了基于这些发现的用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒的新型药物。
本发明从而提供了用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物的甲型流感病毒引发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域的Mx蛋白的基因。
在优选实施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于N末端GTP酶结构域与N末端GTP酶效应子结构域(GED)之间的中间结构域中。
更优选，所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位点300与450之间。
更优选的所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE(SEQ ID NO：9)在牛Mx1蛋白中的位置的位置，或位于所述相应位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置。
在优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、1个氨基酸残基。然而，最优选地，TRAF2和/或TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白的位置的位置。
在优选实施方案中，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由Mx1蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
在本发明的另一个优选实施方案中，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由人Mx1(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
在其它优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W(SEQ ID NO：1)或P-X-Q/E-E(SEQID NO：2)，优选P-X-Q/E-X-X-E/D(SEQ ID NO：3)代表。
在其它优选实施方案中，TRAF2结合结构域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D(SEQ ID NO：4)代表并且TRAF6结合结构域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W(SEQ ID NO：5)代表。
在其它优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由P-X-E-X-X-E(SEQ ID NO：6)，优选由P-X-E-E-X-E(SEQ ID NO：7)，更优选由P-E-E-E-X-E(SEQ ID NO：8)，最优选由P-E-E-E-S-E(SEQ IDNO：9)代表。
在可选择的实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列SEQ ID NOs：26-77之任一项代表。
在另一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸用于预防性和/或治疗性治疗人的甲型流感病毒诱发的疾病；为了该目的，优选地使用包含编码具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域的Mx蛋白的基因的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由人Mx1(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。在特别优选的实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域在人Mx1蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置。例如，人MxA蛋白的氨基酸序列PEDENE(SEQ ID NO：10)(其在人MxA蛋白中位于相应于六肽PEEESE(SEQ ID NO：9)在牛Mx1蛋白中的位置的位置)可经修饰来提供TRAF2和/或TRAF6结合结构域，例如P-E-E-E-N-E(SEQ ID NO：11)或P-E-E-E-S-E(SEQ ID NO：9)。
更优选地，多核苷酸编码具有图15中显示的氨基酸序列(SEQ IDNO：17)的蛋白质，其代表人MxA，其中序列PEDENE被PEEESE替代。
可通过下文中进一步描述的序列比对确定给定的Mx蛋白中相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置。
在可选择的优选实施方案中，将药物进行改造以适用于动物用途，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由Mx蛋白(优选除牛Mx1以外的)代表，更优选地，由待治疗的相同动物的天然存在的Mx1或Mx2蛋白代表。优选地，为了用于预防性和/或治疗性治疗原鸡属(鸡)、火鸡属(火鸡)、鸭科(鸭、鹅)、猪属(猪)和马属(马)的甲型流感病毒诱发的疾病，本发明还提供了多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码Mx蛋白的基因，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域，所述结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置，或位于所述相应位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置，并且其中取决于待治疗的动物，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由相应的原鸡属(鸡)、火鸡属(火鸡)、鸭科(鸭、鹅)、猪属(猪)和马属(马)Mx蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
本发明还提供了用于预防性和/或治疗性治疗斑鳟属(鲑鱼)的感染性鲑鱼贫血病毒(正粘病毒)诱发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码Mx蛋白的基因，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域，所述结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置或位于所述相应位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置，并且其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由斑鳟属Mx蛋白，优选斑鳟属Mx1或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
本发明还提供了用于动物用途的药物的可选择的实施方案：用于预防性和/或治疗性治疗包含编码牛、绵羊或非洲羚羊属(bubaline)的Mx1蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物的基因的原鸡属(鸡)、火鸡属(火鸡)、鸭科(鸭、鹅)、猪属(猪)和马属(马)中的甲型流感病毒诱发的疾病的多核苷酸。
本发明还提供了用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有6至50个氨基酸残基的长度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，优选P-X-Q/E-X-X-E/D的肽。在优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。
在更优选的实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，更优选为P-X-E-E-X-E，更优选为P-E-E-E-X-E和最优选为P-E-E-E-S-E。
通过基因疗法将用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的本发明的多核苷酸递送入需要这样的治疗的个体。因此，本发明还提供了作为基因疗法的工具的包含本发明的多核苷酸的载体，所述基因疗法用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病。
本发明还提供了由上述本发明的多核苷酸编码的用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的多肽或肽。优选地，本发明提供了用于预防必和/或治疗性治疗人的甲型流感病毒诱发的疾病的多肽，其中所述多肽为Mx蛋白，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域，所述结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置或位于所述相应的位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置，并且其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由人Mx1(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。多肽的更优选实施方案为上文中概括的实施方案。
本发明还提供了用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的肽，其中所述肽具有6至50个氨基酸残基的长度，并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，优选P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E。在优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，更优选是P-X-E-E-X-E，更优选是P-E-E-E-X-E，最优选是P-E-E-E-S-E。在另一个优选实施方案中，肽具有10至40个氨基酸残基的长度。
本发明还提供了非人转基因动物，其具有减弱的对甲型流感病毒的易感性，包含编码具有6至50个氨基酸残基的长度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，优选P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E的肽的多核苷酸作为表达的转基因。
在优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。
在更优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，更优选是P-X-E-E-X-E，更优选是P-E-E-E-X-E，最优选是P-E-E-E-S-E。
本发明还提供了非人转基因动物，其具有减弱的对甲型流感病毒的易感性，其表达编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域；其中任选地条件是所述动物不属于灵长目、牛科(牛属、印度水牛、Ovis)、鳍脚目或啮齿目的分类组。
在转基因动物的优选实施方案中，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列不为牛Mx1蛋白并且优选与牛Mx1蛋白具有低于95%的同一性，更优选低于90%的同一性。
在优选实施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于N末端GTP酶结构域与N末端GTP酶效应子结构域(GED)之间的中间结构域中。
更优选地，所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位点300与450之间。
更优选的所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置或位于所述相应位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置。
在优选实施方案中，所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、1个氨基酸残基。然而，最优选TRAF2和/或TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置。
本发明还提供了用于产生具有减弱的对甲型流感病毒的易感性的非人转基因动物的方法，包括如下步骤：
引入编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域；或
将TRAF2和/或TRAF6结合结构域引入编码Mx蛋白的内源基因；
其中所得的动物表达编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域;
其中任选地条件是所述动物不属于灵长目、牛科(牛属、印度水牛、Ovis)、鳍脚目或啮齿目的分类组。
在优选方法中，所得的动物表达编码Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于N末端GTP酶结构域与N末端GTP酶效应子结构域(GED)之间的中间结构域中。
在更优选方法中，所得的动物表达编码Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域位于所述Mx蛋白的氨基酸序列的氨基酸位点300与450之间。
在更优选方法中，所得的动物表达编码Mx蛋白的基因，其中所述TRAF2和/或所述TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置或位于所述相应的位置的上游或下游至多20个氨基酸残基的位置。
在优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域位于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的上游或下游至多15、10、5、4、3、2、1个氨基酸残基。然而，最优选地，TRAF2和/或TRAF6结合结构域在Mx蛋白中位于相应于六肽PEEESE在牛Mx1蛋白中的位置的位置。
在动物或用于其产生的方法的优选实施方案中，编码所述Mx蛋白的基因为内源Mx基因或引入的转基因。在动物的内源Mx基因被修饰的情况下，该基因仍然存在于其在染色体的原始位置上。优选地，仅在相应于牛Mx1基因的P-E-E-E-S-E基序的位置上对内源Mx基因进行修饰，以这样的方式修饰该位置：提供TRAF2和/或TRAF6结合结构域。更优选，待修饰的内源基因是各动物的Mx1基因。可通过下文中进一步描述的序列比对确定不同Mx蛋白中相应于牛Mx1蛋白的六肽PEEESE的位置。
或者，为了产生具有减弱的对甲型流感病毒的易感性的转基因动物，可引入编码Mx蛋白的转基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域。适当的基因为牛或绵羊(绵羊)的天然存在的Mx1基因，其具有TRAF2/TRAF6结合结构域P-E-E-E-S-E。然而，其它Mx基因可用作来自待修饰的物种或来自其它物种的Mx骨架(Mx1、Mx2或Mx3)，以构建待在动物中表达的人工Mx转基因，只要Mx转基因具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域(优选在相应于牛Mx1基因的P-E-E-E-S-E基序的位置)。可通过如下文中进一步描述的序列比对确定不同Mx蛋白中相应于牛Mx1蛋白的六肽PEEESE的位置。
在可选择的实施方案中，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列不是牛Mx1蛋白并且优选地与牛Mx1蛋白具有低于95%的同一性，更优选低于90%的同一性。
更优选地，动物选自原鸡属(鸡)、火鸡属(火鸡)、鸭科(鸭、鹅)、猪属(猪)、马属(马)和斑鳟属(鲑鱼)。
在动物或用于其产生的方法的另一个优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，优选P-X-Q/E-X-X-E/D代表。
此外，优选地TRAF2结合结构域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6结合结构域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。更优选地，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由P-X-E-X-X-E，优选由P-X-E-E-X-E，更优选由P-E-E-E-X-E，最优选由P-E-E-E-S-E代表。
在动物或用于其产生的方法的可选择的实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列SEQ ID NOs：26-77之任一项代表。
更优选地，除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白的序列由Mx1蛋白代表。除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx1蛋白的这些序列可由来自转基因动物的动物物种或待修饰的动物物种的现有Mx1的各自序列代表，或可由来自另一物种例如牛或绵羊的Mx1蛋白代表，或可以是不同物种的嵌合Mx1蛋白。
本发明还提供了将非肽测试化合物鉴定为用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的候选化合物的方法，包括在所述测试化合物存在或不存在的情况下检查TRAF2和/或TRAF6对权利要求11中定义的多肽或肽的结合的步骤，其中在所述测试化合物存在的情况下减少的结合表示所述测试化合物能够抑制甲型流感病毒的生命周期，从而适合作为用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的候选化合物。
在优选方法中，多肽用于检查其对TRAF2和/或TRAF6的结合，所述多肽由Mx蛋白代表，其中所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域。在更优选实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域由P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，优选P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E代表。在优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，更优选是P-X-E-E-X-E，更优选是P-E-E-E-X-E，最优选是P-E-E-E-S-E。
在方法的另一个优选实施方案中，肽用于检查其对TRAF2和/或TRAF6的结合，所述肽具有6至50个氨基酸残基的长度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W，优选P-X-Q/E-X-X-E/D或P-X-Q/E-E。在优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。在更优选实施方案中，序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，更优选是P-X-E-E-X-E，更优选是P-E-E-E-X-E，最优选是P-E-E-E-S-E。在另一个优选实施方案中，肽具有10至40个氨基酸残基的长度。
定义
术语“Mx发动蛋白”与术语“Mx蛋白”可等同使用。术语“MxA”等同于人Mx1。
氨基酸序列中例如P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W中的术语“X”是指任何天然存在的氨基酸残基甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸。符号“/”表示相同位置上可选择的氨基酸残基。例如，“Q/E”表示TRAF2/6结合基序的P0中的氨基酸位置可以是“Q”(Gln，谷氨酰胺)或“E”(Glu，谷氨酸)。这些结合基序和它们的位置的定义示于图9中。
现有技术缺乏被赋予不依赖于GED的抗病毒基序的抗病毒Mx发动蛋白。这样的不依赖于GED的抗病毒基序的提供被认为是非常有用的，因为可产生组合两个结构域，从而显示增强的抗病毒活性的突变型Mx发动蛋白。本发明实现了本领域的该长期需要和期望。可将本文公开的活性增强子插入任何Mx发动蛋白骨架中以增强其抗病毒活性。
本文公开的肽类Mx抗病毒活性增强子以对于甲型流感病毒有害的方式改变TRAF的生物学，这样，本发明将用作人或动物的病毒性疾病的新型预防剂或治疗剂。
Mx发动蛋白是在脊椎动物物种中用于许多病毒的先天抑制的至关重要的效应蛋白。本发明开发了新型多肽：在插入至Mx发动蛋白骨架中之后可显著地增强其抗病毒功能。下文中显示的结果表明只有具有插入的新肽的突变型Mx发动蛋白结合TNF受体相关因子2和6(TRAF2和TRAF6)。这些数据表明突变型Mx发动蛋白对TRAF2和/或TRAF6的结合可证明作为人或动物的病毒性疾病的预防剂或治疗剂是有用的。
本发明提供了增强由Mx发动蛋白介导的抗病毒活性的肽，其中所述肽包含功能性TRAF2和/或TRAF6结合结构域并且被插入在Mx发动蛋白骨架中。本发明还涉及使用本文中公开的肽抑制病毒的方法。此外，本发明还涉及使用本文中公开的肽或使用模拟由本文中公开的突变型Mx发动蛋白赋予的抗病毒活性的非肽类似物改变TRAF2和/或TRAF6的功能的方法。
在本发明的另一个方面，提供了鉴定能够抑制TRAF2和/或TRAF6-依赖性机制的肽或非肽抗病毒分子的方法，包括步骤：制备包含TRAF2和/或TRAF6结合结构域的肽，或制备包含TRAF2和/或TRAF6结合结构域的突变型Mx发动蛋白，和在肽或非肽分子存在或不存在的情况下检查TRAF2和/或TRAF6对所述肽或突变型Mx发动蛋白的结合，其中在所述非肽分子存在的情况下减少的结合表示所述非肽分子能够抑制病毒。
根据下列本发明的目前优选的实施方案的描述，本发明的大多数方面、特征和有利方面将变得显而易见。
发明详述
附图概述
图1显示流感病毒A/H7/N7/鸡的繁殖被牛Mx1蛋白(boMx1)抑制。用流感病毒A/H7N7感染诱导的(黑框)和非诱导的(白框)双转基因Vero细胞(V103)的汇合物，进行48小时。将培养物上清液中的病毒滴度作图。TCID50：50%的组织培养物感染剂量。值为3个独立实验的平均值+/-SD。
图2显示流感病毒H5N1的繁殖被牛Mx1(boMx1)、猪Mx1(poMx1)和人MxA(huMxA)蛋白抑制。用流感病毒A/H5N1感染诱导的(黑框)和非诱导的(白框)双转基因Vero细胞(V103)的汇合物，进行48小时。将培养物上清液中的病毒滴度作图。TCID50：50%的组织培养物感染剂量。值为3个独立实验的平均值+/-SD。
图3显示在分别来源于表达同基因型(congenic)moMx1的纯合BALB/c-A2G和表达boMx1的转基因ML555和ML549小鼠品系的胚胎成纤维细胞培养物中流感病毒H5N1的繁殖被小鼠Mx1(moMx1)和牛Mx1(boMx1)抑制。FVB/J具有基因型Mx1-/-，BALB/c-A2G具有Mx1+/+。FVB/J-ML555为表达低水平的boMx1的小鼠细胞系，FVB/J-ML549为表达高水平的boMx1的小鼠细胞系。用流感病毒A/H5N1感染诱导的(黑框)和非诱导的(白框)细胞的汇合物，进行48小时。将培养物上清液中的病毒滴度作图。TCID50：50%的组织培养感染剂量。值为3个独立实验的平均值+/-SD。
图4显示了牛Mx1的表达在体内抑制实验室小鼠(野生型：FVB/J或表达牛Mx1的ML-549品系的转基因小鼠)的由甲型流感病毒H5N1感染引起的组织学改变。该图显示了多聚甲醛固定、石蜡包埋的各个小鼠的肺。用苏木精和伊红对5微米切片染色。野生型FVB/J小鼠的尸体解剖显示硕大的、无捻发音的(noncrepitant)和扩散的梅灰色(pink-grayish)的肺，这表示具有大规模肺水肿的充血的诊断。相反地，来自表达boMx1的小鼠的肺与在无特定病原体的FVB/J健康小鼠中取样的肺相比较未显示任何改变。在组织学上，来自转基因小鼠的肺与来自健康小鼠的肺相似。
图5显示了Kaplan-Meyer存活分析。在第0天用40 000 TCID50的甲型流感病毒H5N1株鼻内接种小鼠。BALB/c-A2G的基因型为Mx1+/+。小鼠品系FVB/J具有基因型Mx1-/-。小鼠FVB/J-ML555、FVB/J-ML549分别以低和高水平表达牛Mx1。
图6显示了在用H5N1鼻内接种后不同小鼠品系的体重减轻或体重增长的百分比。
图7显示了表达牛Mx1的小鼠(FVB/J-ML555和FVB/J-ML549)在用H5N1病毒株进行鼻内接种后具有比表达鼠Mx1的小鼠(BALB/c-A2G)低的肺病毒载量。
图8显示了牛Mx1的N末端区段产生人和牛Mx GED的抗流感活性。产生了具有人Mx1的N端和牛C端(GED结构域)的嵌合Mx1蛋白：huN/GEDbo；具有牛Mx1的N端和人C端(GED结构域)的嵌合Mx1蛋白：boN/GEDhu。boN/GEDbo定义野生型牛Mx1，huN/GEDhu定义野生型人Mx1(MxA)。用编码各个构建体的DNA转染Vero细胞，检查细胞的Mx蛋白和流感核蛋白(NP)。该图显示了NP(流感核蛋白)-阳性细胞的百分比。Dox-是指不表达各Mx-构建体的非诱导细胞，而Dox+是指表达各Mx构建体的诱导的细胞。结果显示牛Mx1的N末端区段显著增强GED依赖性抗流感活性。
图9总结了具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域的不同蛋白质的序列比较。存在于牛、绵羊和印度水牛的Mx1发动蛋白的N末端区段中的独特六肽“PEEESE”(Pro-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu；SEQ ID NO：9)不存在于迄今已测序的所有其它Mx发动蛋白中。由于该反刍动物特异性六肽同时具有共有TRAF2结合基序pX(Q/E)E(SEQ ID NO：2)和共有TRAF6结合基序pXEXX(Ar/Ac)(SEQ ID NO：12)，因此假定该六肽具有TRAF2和-TRAF6结合结构域的功能。
图9A：P-2、P0和P1位置上的序列和结构保守界定了大TRAF2结合基序。这些位置被共有序列px(Q/E)E(SEQ ID NO：2)占据，其中p(Pro，脯氨酸)以小写体显示，因为其可被其它中等大小非极性残基(Ser、Thr、Cys、Ile)置换，x表示任意残基。P-2、P0和P3位置上的序列和结构保守界定了小TRAF2结合基序。这些位置被共有序列px(Q/E)xxD(SEQ ID NO：4)占据，其中Pro以小写体显示，因为其可被其它中等大小非极性残基(Ser、Thr、Cys、Ile)置换，x表示任意残基。
图9B：显示了TRAF6结合基序的共有序列。TRAF6结合基序的共有序列从位置-2(P-2)延伸至P3并且由pxExx(Ar/Ac)(SEQ ID NO：12)组成，其中p(Pro，脯氨酸)以小写体书写以表示对其它小至中等大小的残基(例如，Ala、Ser、Thr、Ile)的耐受性，x可以为任意残基，Ar表示任何芳香残基，Ac表示任何酸性残基。
图10显示了牛Mx1发动蛋白(boMx1)结合TRAF2，而缺乏PEEESE的Mx发动蛋白不结合。将野生型、表达huMxA的VA8、表达poMx1的VSK6和表达boMx1的V103细胞系与媒介物或与IFN-α/多西环素接触。向细胞裂解物中添加抗-TRAF2 mAB以进行内源免疫沉淀。利用SDS-PAGE分离免疫沉淀的复合物，利用多克隆兔抗-huMxA和抗-boMx1抗血清的混合物进行印迹。利用缀合有HRP的猪抗-兔IgGF(ab′)2片段显示免疫复合物，利用CN/DAB Substrate试剂盒进行过氧化物酶检测。已重现性地从诱导的V103细胞(表达boMx1)、但未从诱导的表达人MxA-(VA8)、猪Mx1-(VSK6)或黑长尾猴Mx(野生型Vero细胞)的Vero细胞系回收到对应于boMx1的具有75kDa表观分子量的条带。这显示TRAF2有效地结合boMx1但不结合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。
图11显示了boMx1发动蛋白结合TRAF6而缺乏PEEESE的Mx发动蛋白不结合。产生了抑制TRAF2和TRAF6结合基序的boMx1发动蛋白DNA构建体，该构建体具有两个单点突变(E356D和S358N：分别在TRAF2/TRAF6共有序列的位置P0和P2上)。产生在与多西环素接触后稳定地表达该构建体的Vero细胞克隆以产生携带PEEESE缺陷基序的表达Mx的克隆(V103mut)。培养表达黑长尾猴Mx的、表达人MxA的VA8、表达猪Mx1、表达牛Mx1的V103以及表达新的PEEESE缺陷突变型boMx1的V103mut Vero细胞系，随后将其与媒介物或IFN-α或多西环素接触。除了为了免疫沉淀用抗-TRAF6mAb替代抗-TRAF2mAb外，如实施例13中所述处理细胞，只不过对于免疫沉淀，以抗-TRAF6mAb替代抗-TRAF2mAb。可重现地从诱导的表达boMx1的细胞(克隆V103)、但未从诱导的表达人MxA-(克隆VA8)、猪Mx1-(克隆VSK6)、黑长尾猴Mx-(野生型Vero细胞)或PEEESE缺陷牛Mx1(克隆V103mut)的Vero细胞系回收到与boMx1一致的具有75kDa表观分子量的条带，这显示TRAF6有效地结合boMx1但不结合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。
图12显示了Mx表达抑制高致病性甲型禽流感病毒的复制。抗流感活性在表达缺乏PEEESE的boMx1的Vero细胞中显著降低。用H5N1甲型流感病毒原液的适当稀释物感染诱导的(黑框，多西环素1μg/mL)和非诱导的(白框，媒介物)V103(boMx1)、V103mut(boMx1mut)和VA8(huMxA)细胞的汇合物，进行48小时。将培养物上清液的病毒滴度作图，如利用标准半数组织培养感染剂量测定法按一式三份对鸡成纤维细胞所测定的。TCID50：50%的组织培养感染剂量；0,1和1(下方)：感染复数。标绘值为2-3个独立实验的平均值±SD。
图13显示了牛Mx1蛋白(SEQ ID NO：14)与人MxA蛋白(SEQ IDNO：15)的序列比对。该比对显示在626个氨基酸残基重叠中存在77%的同一性。比对清楚地显示牛Mx1蛋白中的基序PEEESE相应于人MxA蛋白中的PEDENE。符号“+”表示嵌合Mx构建体：i)人N-末端/牛GED(huN/GEDbo)和ii)牛N-末端/人GED(boN/GEDhu)的C末端GED部分的第一个氨基酸残基。
图14显示了牛Mx1蛋白(SEQ ID NO：14)与野猪(Sus scrofa)Mx1蛋白(SEQ ID NO：16)的序列比对。该比对显示在635个氨基酸残基重叠中存在81.4%的同一性。该比对清楚地显示牛Mx1蛋白中的基序PEEESE相应于猪Mx1蛋白中的PEDESG。
图15显示了人MxA蛋白的经修饰的序列，其中基序PEDENE被牛TRAF2/TRAF6结合结构域PEEESE替代；新序列被命名为SEQ IDNO：17。
本发明的蛋白质的功能和活性
已令人惊讶地发现，在体外，与其它Mx发动蛋白相比较，牛Mx1发动蛋白显示最强的曾经鉴定的抗甲型流感病毒活性。此外，在体内确认了由该特定Mx发动蛋白产生的特别强的抗甲型流感病毒活性，从而提供了用于预防或治疗甲型流感病毒相关疾病的最可靠的分子。如从现有技术所预期的，假定该前所未有的抗病毒活性由蛋白质的C末端区段(所谓的GED)支持。
令人惊讶地发现用被赋予弱抗甲型流感病毒活性的任何Mx发动蛋白的GED替代牛Mx1中的GED导致仍被赋予上述罕见抗病毒活性的嵌合Mx发动蛋白。相反地，将牛GED移植在弱抗流感Mx发动蛋白的骨架上导致仍然弱的抗流感嵌合Mx发动蛋白。因此本发明提供了未被插入C末端GED区段的Mx抗病毒活性增强子，其是本领域技术人员不能预测的。
本发明人鉴定了牛、绵羊和印度水牛Mx1骨架中的新型TRAF2和TRAF6结合基序，所述结合基序不存在于迄今测试的所有脊椎动物Mx发动蛋白中。还发现具有该新型TRAF2/TRAF6结合基序的Mx发动蛋白有效地结合TRAF2和TRAF6，而缺乏该新型TRAF2/TRAF6结合基序的Mx发动蛋白不结合。此外，还发现该新型TRAF2/TRAF6结合基序在Mx骨架中的存在足以驱动上述前所未有的抗甲型流感活性。支持这些发现的是，TRAF2/TRAF6结合基序缺陷突变型牛Mx1显示极弱的抗甲型流感病毒活性。因此，本发明显示TRAF2结合结构域和/或TRAF6结合基序在Mx发动蛋白中的插入足以增强其抗甲型流感活性。
本发明利用包含功能性TRAF2和/或TRAF6结合基序的野生型和突变型Mx发动蛋白，所述发动蛋白显示优于由缺乏本文公开的活性增强子的相应Mx发动蛋白骨架显示的抗甲型流感活性的抗甲型流感活性。许多方法可被本领域技术人员用来搜索本文公开的Mx发动蛋白增强子。例如，两个代表性方法是肽文库的筛选或从被赋予TRAF2和/或TRAF6结合能力的任何已知或仍然未鉴定的蛋白质合成重叠肽。在本发明的一个实施方案中，Mx发动蛋白活性增强子包含由SEQ ID NO：69组成的完全或部分序列。
本发明还利用包含TRAF2和/或TRAF6结合基序的野生型和突变型Mx发动蛋白，所述发动蛋白显示优于由缺乏本文公开的活性增强子的相应Mx发动蛋白骨架显示的抗病毒活性的任何抗病毒活性。
本文中公开的Mx抗病毒活性增强子可包含来源于肿瘤坏死因子受体1型和2型(TNFR1和TNFR2)、CD27、CD30、CD40、Ox40、LTβR、另一种TRAF相关受体(ATAR)、4-1BB、NF-κB-诱导激酶(NIK)、潜伏膜蛋白(latent membrane protein)-1(LMP1)和来源于牛、绵羊或印度水牛的Mx1的TRAF2结合基序。本文中公开的Mx抗病毒活性增强子还可包含来源于牛Mx1、绵羊Mx1、印度水牛Mx1、CD40、NF-κ-B的受体激活物(RANK)、IL-1受体相关激酶1(IRAK1)、IL-1受体相关激酶2(IRAK2)、IRAKM、受体相互作用蛋白-2(RIP2)、MALT1、MyD88适体样蛋白(MAL)、含Toll/IL-1R结构域适体诱导IFN-β(TRIF)、人HSV1和HSV2疱疹病毒、猕猴HSV1疱疹病毒、人巨细胞病毒或人卡波氏疱疹病毒的TRAF6结合结构域。优选地，TRAF2和/或TRAF6结合结构域包含选自SEQ ID No.26-77的完全或部分序列。
其中可天然或人工插入本文中公开的抗病毒活性增强子的Mx发动蛋白可来源于许多不同的物种。代表性发动蛋白包括人MxA、人MxB、小鼠Mx1、小鼠Mx2、大鼠Mx1、Mx2和Mx3、豚鼠Mx、猪Mx1和Mx2、马Mx1和Mx2、鸡Mx、火鸡Mx、鸭Mx、虹鳟鱼Mx、鲑鱼Mx等。
本发明还提供了使用本文中公开的Mx抗病毒活性增强子抑制甲型流感病毒的复制的方法。因此使用包含本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白导致降低的致死率、减轻的疾病严重度、降低的细胞因子产量、减少的次级感染率和减少的病毒排出(在人或动物被甲型流感病毒感染的情况下)。使用包含本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白因而还可导致减少的甲型流感病毒的遗传偏差或减少的甲型流感病毒株之间的遗传再分布(genetic reassortment)。因此，使用包含本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白还可导致减少的甲型流感病毒感染的传播性以及减小的交叉物种污染的风险。
本发明还提供了使用本文中公开的抗病毒活性增强子产生免疫学上可接受的(非变应原的)和市场可接受的(消费者友好的)能够抗甲型流感病毒相关疾病的转基因食用动物的方法。本发明还提供了使用本文中公开的抗病毒活性增强子产生免疫学上可接受的(非变应原的)和市场可接受的转基因食用动物，其中甲型流感病毒对其它动物或对人的传播性显著减弱。短语“免疫学上可接受的”是指存在于数千年来被人类食用的肉和其它动物产品中，从而众所周知不存在对人的变应原性或类似的不期望的潜能的抗原性分子实体。短语“市场可接受的”和“消费者友好的”是指存在于肉和其它动物产品中的外源分子实体，所述外源分子实体不太引起消费者的反对，因为这些分子实体一直以来被人食用。
本发明还提供了抑制甲型流感病毒相关症状、损伤和功能障碍的方法，包括给个体施用本发明的组合物或编码本发明的组合物的任何多核苷酸的步骤。籍以将组合物递送至所述个体的代表性方法包括脂质体、病毒或任何基因递送载体。
本发明还提供了鉴定新型抗甲型流感病毒分子的方法，包括通过本发明的组合物或编码本发明的组合物的任何多核苷酸的遗传插入产生能够抗甲型流感病毒的转基因细胞系或转基因动物的步骤。
本发明还提供了鉴定能够抑制甲型流感病毒的肽或非肽分子的方法，包括步骤：制备包含TRAF2和/或TRAF6结合基序的Mx发动蛋白或多肽，在肽或非肽分子存在或不存在的情况下检查TRAF2或TRAF6对所述Mx发动蛋白或多肽的结合，其中在所述肽或非肽分子存在的情况下减少的结合表明所述肽或非肽分子能够抑制甲型流感病毒。优选地，TRAF6结合基序来源于选自牛Mx1、绵羊Mx1、印度水牛Mx1、CD40、RANK、IRAK1、IRAK2、IRAKM、RIP2、hMALT1、MAL、TRIF、hHSV1UL-37、hHSV2UL-37、猕猴HSV1UL-37、hCMVUL-37和人卡波氏疱疹病毒ORF-63的蛋白质。优选地，TRAF2结合结构域来源于选自TNFR1、TNFR2、CD27、CD30、CD40、Ox40、LTbR、ATAR、4-1BB、NIK、LMP1，以及来源于牛、绵羊或印度水牛Mx1的蛋白质。在一个实施方案中，TRAF2和/或TRAF6结合结构域包含选自SEQ ID No.26-77的序列。
本发明还提供了包含药物载体和含有本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白的可接受的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物包含其中活性增强子具有选自SEQ ID No.26-77的序列的Mx发动蛋白或其片段。短语“可接受的药物组合物”是指当给受试者施用时不产生过敏或类似的不期望的反应的分子实体和成分。
本发明还提供了包含基因治疗载体和编码包含本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白的多核苷酸的可接受的药物组合物。在一个实施方案中，该药物组合物编码其中活性增强子具有选自SEQ ID No.26-77的序列的Mx发动蛋白或其片段。短语“可接受的药物组合物”是指当给受试者施用时不产生过敏或类似的不期望的反应的分子实体和成分。
本发明还涉及本文中公开的肽活性增强子或包含本文中公开的活性增强子的Mx发动蛋白的肽、多肽、蛋白质或非肽和非蛋白质类似物，其模拟所述肽增强子和Mx发动蛋白的增强的抗流感功能。这些类似物可用作建立TRAF2和/或TRAF6-介导的抗病毒效应在病毒性疾病的体外和体内模型中的作用的强有力工具，以及本身用作预防剂和/或治疗剂。
本发明还涉及使用肽、多肽、蛋白质或非蛋白质分子抑制甲型流感病毒的方法，其中所述分子对甲型流感病毒的抑制遵从于TRAF2和/或TRAF6与所述分子之间的分子相互作用。
本发明的蛋白质的产生
可以例如合成，从纯化的全长蛋白质制备，或使用本领域已知的重组方法和技术产生本发明的肽。虽然本文中描述了用于其制备的具体技术，但应当理解所有适用于产生此类肽的适当技术意欲在本发明的范围内。
通常，此类技术包括DNA和蛋白质测序、克隆、表达以及允许编码和表达本发明的每一种肽的原核和真核载体的构建的其它重组工程技术。
可按照Biotechnology and Applied Biochem.,12:436(1990)中描述的方法通过肽合成或通过Current Protocols in Molecular Biology,Eds.Ausubel,F.M.,等人,John Wiley & Sons,N.Y.(1987)中描述的方法制备蛋白质。
可通过表达编码目标蛋白质的核酸或通过从由核酸编码的较长长度的多肽切割来产生本发明的蛋白质。可利用本领域公知的技术在细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物宿主中进行编码的多肽的表达。
在一个实施方案中，可通过如下方式获得本发明的蛋白质：将DNA序列克隆入载体，所述载体始于在期望的蛋白质序列的第一个DNA密码子的5'上游插入的甲硫氨酸的DNA密码子，以及利用本领域已知的诱变技术将相应于期望的蛋白质的最后一个氨基酸的DNA密码子修饰为终止密码子。用经修饰的核酸转化宿主细胞以使编码的蛋白质表达。
诱变技术的实例包括例如Promega Protocols and ApplicationsGWde，Promega Corp,Madison,WI,p.98(1891)中描述的或根据Current Protocols in Molecular Biology(同上)的方法。
如果要通过原核载体合成蛋白质，则编码蛋白质的DNA序列优选不包含信号肽序列。此外，通常在编码序列的第一个DNA密码子的5’上游插入甲硫氨酸(Met)的DNA密码子。
用于将DNA克隆入载体和用于插入、缺失和修饰多核苷酸以及用于定点诱变的方法描述于例如Promega Protocols and ApplicationsGuide(同上)中。可通过已知的技术、包括热激、电穿孔、磷酸钙沉淀和脂转染等用具有与其连接的期望的DNA序列的载体、优选表达载体转染细胞或细菌。随后可提取蛋白质，利用例如高压液相色谱(HPLC)、离子交换层析或凝胶渗透层析进行纯化。然而，本领域已知的获得本发明的肽所必需的不同步骤或这些步骤的组合或等同步骤的其它方法和技术预期也在本发明的范围内。
下列术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系："参照序列"、"比较窗口(comparison window)"、"序列同一性"、"序列同一性的百分比"和"实质同一性"。"参照序列"为用作序列比较的基础的确定的序列；参照序列可以是较大序列的子集，例如作为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的区段，或可包含完整cDNA或基因序列。
用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可以例如利用Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，利用Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，利用Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的相似性搜索法或利用这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0中的GAP、BE STFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,WI)来进行。
当用于多肽时，术语"实质同一性"或"实质序列同一性"意指两个多肽序列，当例如利用程序GAP或BESTFIT，使用缺省缺口权重(gapweights)最佳对齐时，共有至少80%的序列同一性，优选至少90%的序列同一性或更大的序列一性。"百分比氨基酸同一性"或"百分比氨基酸序列同一性"是指当最佳地对齐时大约具有指定的相同氨基酸的百分比的两个多肽的氨基酸的比较。例如，"95%的氨基酸同一性"是指当最佳地对齐时具有95%的氨基酸同一性的两个多肽的氨基酸的比较。优选地，不相同的残基位置相异在于保守氨基酸置换。例如，具有相似化学性质例如电荷或极性的氨基酸的置换可能不影响蛋白质的性质。实例包括谷氨酰胺对于天冬酰胺或谷氨酸对于天冬氨酸。
短语"实质上纯化的"或"分离的"，当指肽或蛋白质时，意指基本上不含其它细胞组分的化学成分。其优选以均一状态存在，虽然其可以以干燥形式存在或存在于含水溶液中。通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱测定纯度和均一性。作为存在于制剂中的优势种类的蛋白质是实质上纯的。通常，实质上纯的或分离的蛋白质包含超过80%的存在于制剂中的所有大分子种类。优选地，纯化蛋白质以代表大于90%的存在的所有大分子种类。更优选将蛋白质纯化至大于95%，最优选将蛋白质纯化至基本上同质，其中利用常规技术不能检测到其它大分子种类。
本发明的核酸
本文中还提供了包含编码本发明的肽的DNA或RNA序列(多核苷酸)的分离的核酸。本发明的核酸还可包含用于表达本发明的肽的载体。在一些实施方案中，DNA可包括编码Mx蛋白的cDNA序列。本领域技术人员理解，由于遗传密码的简并性，可在核苷酸序列中产生不导致编码的氨基酸序列的改变的置换。因此本文中定义的"实质上同一的"序列包括本发明的范围内。本领域技术人员还理解，本文中描述的任何DNA分的两条互补链包括在本发明的范围内。
术语"实质同一性"或"实质序列同一性"，当用于核酸序列时和如本文中所用，是指多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列在至少20个核苷酸位置的比较窗口上，常见地在至少25-50个核苷酸位置的比较窗口上与参照序列相比较具有至少85%的序列同一性，优选至少90-95%的序列同一性，更优选至少99%的序列同一性，其中序列同一性的百分比通过在比较窗口上将参照序列与可包括总共20%或更少的参照序列的缺失或添加的多核苷酸序列相比较来进行计算。参照序列可以是较大序列的子集。
治疗方案
用于治疗甲型流感病毒诱发的疾病的方法包括给患者施用甲型流感病毒抑制量的本发明的Mx蛋白。如本文中所用,术语"治疗"意指甲型流感病毒引发的疾病的症状的预防、缓和或严重度的减轻。类似地，本发明的Mx蛋白的甲型流感病毒抑制有效剂量为足以预防、缓和或减轻流感症状的严重度的剂量。
可以单独地或与彼此组合地或与其它病毒特别地甲型流感病毒抑制剂组合地施用本发明的蛋白质。通常，以约8微克至3,000μg/kg/天，更优选约20至1,500μg/kg/天的量，优选每天施用本发明的蛋白质一次或两次。然而，也可施用其它量，包括显著更低或更高的量。通过肌内、皮下、静脉内、瘤内、通过任何其它可接受的施用途径给需要治疗的人受试者施用本发明的蛋白质。
基因疗法
利用重组DNA技术将编码包含根据本发明的TRAF2/6结合结构域的Mx蛋白或肽的核酸(多核苷酸)递送入患者细胞或在体内给患者提供基因产物的载体的基因疗法也被考虑在本发明的范围内。
基因治疗技术具有通过将治疗性基因的表达靶向目标组织例如骨骼肌、心肌、血管内皮或平滑肌或实体瘤或循环肿瘤细胞来限制受试者与基因产物例如多肽的接触的潜能。例如，PCT专利申请公布号WO93/15609公开了通过使用导管系统将干扰素基因施用至血管壁损伤的区域进行的干扰素基因至血管组织的递送。在另一个实施方案中，可将编码能够酶促转化前体药物的蛋白质的腺病毒载体、“自杀基因”和编码细胞因子的基因直接施用至实体瘤中。
将治疗性基因靶向目标组织的其它方法包括三个一般类型：转导靶向(transductional targeting)、位置靶向(positional targeting)和转录靶向(transcriptional targeting)(关于综述，参见，例如，Miller等人FASEBJ.9:190-199(1995))。转导靶向是指选择性进入特定细胞，主要通过选择受体配体来实现。基因组内的位置靶向是指至期望的基因座(例如染色质的活性区域)中的整合，或通过与内源核苷酸序列例如靶基因同源重组。转录靶向是指通过整合具有针对目标细胞定制的基因表达的高度特异性调控的转录启动子获得的选择性表达。
组织特异性启动子的实例包括肝特异性启动子(Zou等人,Endocrinology 138:1771-1774(1997))；小肠特异性启动子(Oliveira等人,J.Biol.Chem.271:31831-31838(1996))；肌酸激酶的启动子，其已被用于在肌肉和心脏组织中指导肌营养不良蛋白的cDNA表达(Cox等人,Nature 364:725-729(1993))；和用于在B细胞中表达自杀基因的免疫球蛋白重链或轻链的启动子(Maxwell等人,Cancer Res.51:4299-4304(1991))。还已表征了内皮细胞特异性调控区(Jahroudi等人,Mol.Cell,Biol.14:999-1008(1994))。兼嗜性逆转录病毒载体已被构建，其携带处于白蛋白或α-甲胎蛋白启动子的控制之下的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Huber等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:8039-8043(1991))以分别靶向肝谱系的靶细胞和肝细胞瘤细胞。此类组织特异性启动子可用于逆转录毒载体(Hartzoglou等人,J.Biol.Chem.265:17285-17293(1990))和腺病毒载体(Friedman等人,Mol.Cell.Biol.6:3791-3797(1986))并且仍然保持它们的组织特异性。
有助于在目标组织中的表达特异性的其它元件可包括分泌前导序列、增强子、核定位信号、内吞体裂解肽等。优选地，这类元件来源于目标组织以有助于特异性。
用于实施本发明的病毒载体系统包括但不限于腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒、鼠微小病毒(MVM)、HIV、辛德比斯病毒和逆转录病毒例如劳斯肉瘤病毒和MoMLV。通常，将编码目标治疗性多肽或肽的核酸插入这类载体以使得能够包装核酸，通常通过伴随病毒DNA、敏感性宿主细胞的感染和目标多肽的表达。
类似地，可通过添加允许受体介导的至特定细胞内的胞吞的受体的受体配体或抗体来修饰用于包装本发明的重组构建体的病毒包膜(例如，WO 93/20221、WO 93/14188；WO 94/06923)。在本发明的一些实施方案中，将本发明的DNA构建体连接于病毒蛋白质例如腺病毒颗粒，以促进胞吞作用(Curiel等人,Proc.Natl.Acad.Scl.U.S.A.88:8850-8854(1991))。在其它实施方案中，本发明的分子缀合物可包括微管抑制剂(WO 94/06922)；模拟流感病毒血凝素的合成肽(Plank等人,J.Biol.Chem.269:12918-12924(1994))；和核定位信号，例如SV40T抗原(WO 93/19768)。
可利用多种方法在体内或离体地将核酸引入目标组织。在本发明的一些实施方案中，通过这样的方法如显微注射、磷酸钙沉淀、脂质体融合或微粒轰击(biolistics)将核酸引入细胞。在其它实施方案中，核酸被目标组织直接吸收。在其它实施方案中，将核酸包装在病毒载体系统中以帮助向细胞内的引入。
在本发明的一些实施方案中，将本发明的组合物离体地施用至从患者外植的细胞或组织，随后将其返回患者。基因治疗构建体的离体施用的实例包括Axteaga等人,Cancer Research 56(5):1098-1103(1996)；Nolta等人,Proc Nad.Acad.Sci.USA 93(6):2414-9(1996)；Koc等人,Seminars in Oncology 23(1):46-65(1996)；Raper等人,Annals of Surgery223(2):116-26(1996)；Dalesandro等人,J Thorac.Cardi.Surg.11(2):416-22(1996)；和Makarov等人,Proc.Nad.Acad.Sci.USA93(1):402-6(1996)。
施用方法
被引入宿主或宿主细胞的载体的形式可改变，这部分取决于载体被体外引入还是被体内引入。例如，核酸可以是闭环的、具有缺口的或线性化的，这取决于载体将被以基因组外形式(extragenomically)维持(即，作为自主复制载体)、以原病毒或原噬菌体的形式被包含、被瞬时转染、瞬时感染(与复制缺陷型或条件复制型病毒的使用一样)还是通过双交换或单交换重组事件被稳定地引入宿主基因组。在引入宿主之前，可将包含本发明的多核苷酸的载体配制成用于治疗性和预防性治疗方法的各种组合物。具体地，可通过与适当的药学上可接受的载体或稀释剂组合将载体制备为药物组合物，或可将其配制来适用于人或兽用应用。
因此，药物组合物可包含上述载体的一种或多种，优选与药学上可接受的载体组合。药学上可接受的载体对于本领域技术人员来说是公知的，适当的施用方法对于本领域技术人员来说也是公知的。载体的选择可部分地由具体的载体以及由用于施用组合物的具体方法来决定。本领域技术人员还应理解，不同的施用组合物的途径是可获得的，并且，虽然可使用超过一个途径来进行施用，但特定的途径可提供比另一种途径更直接和更有效的反应。因此，存在许多种适当的本发明的组合物的制剂。
可将由包含本发明的多核苷酸的载体单独或与其它抗病毒化合物组合组成的组合物配制为适用于胃肠外施用、优选腹膜内施用的制剂。这样的制剂可包括含水和无水等渗无菌注射液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质，和含水和无水无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可以以单位剂量或多剂量密封的容器例如安瓿和小瓶提供制剂，还可将制剂在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，只需在即将使用之前添加无菌液体载体例如水以用于注射。可从无菌粉剂、粒剂和片剂制备即时注射液(Extemporaneously injectable solution)和悬浮液，如本文中所描述的。
还可制备适用于通过吸入施用的气溶胶制剂。可将气溶胶制剂置于加压的可接受推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。
在本发明的说明书中，给动物特别是人施用的剂量应当足以在合理的时间范围内诱导被感染的个体的治疗反应。剂量将可通过用于治疗的具体载体的效能、疾病状态的严重度以及被感染的个体的体重和年龄来确定。剂量的大小也可通过可伴随所使用的具体载体的使用的任何有害副作用的程度来确定。总是期望使有害副作用尽可能降至最低。
剂量可以以单位剂量形式(例如片剂或胶囊)存在。如本文中所用，术语"单位剂量形式"是指适合用作用于人和动物受试者的单元化剂量的物理上分开的单位，每一个单位包含预定量的载体(单独的或与其它抗病毒剂组合的)，其经计算以足以与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物协作产生期望的作用的量存在。本发明的单位剂量形式的规范取决于在宿主中所使用的具体化合物和待达到的作用以及与每一种化合物相关的药效学。施用的剂量应当是“抗病毒有效量”或在个体患者中达到“有效水平”所必需的量。
由于“有效水平”用作给药的优选终点，因此取决于药代动力学、药物分布和代谢的个体间差异，实际剂量和时间安排可变化。可将“有效水平”定义为例如患者中期望的血液或组织水平，该水平对应于一种或多种包含根据本发明的多核苷酸的载体的浓度，所述浓度在预测化合物的临床抗病毒活性的测定中抑制病毒例如甲型流感病毒。当将本发明的组合物与已知的抗病毒化合物组合使用时，本发明的化合物的“有效水平”也可变化。
本领域技术人员可容易地测定待使用的组合物的确切制剂的适当剂量、时间安排和施用方法，以在个体患者中达到期望的“有效水平”。本领域技术人员还可通过直接(例如，分析化学分析法)或间接(例如，利用病毒感染的替代指示剂)分析适当的患者样品(例如，血液和/或组织)或使用报道蛋白来容易地确定和使用本发明的化合物的“有效水平”的适当指示剂。
药物组合物，当用于治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病时，可包含与根据本发明的载体结合的其它药物。这类其它药物可以以它们的常规方式进行使用。具体地，考虑到使用抗逆转录病毒剂。除了先前描述的药物外可使用的这些其它药物的其它代表性实例包括抗病毒化合物、免疫调节剂、免疫刺激剂、抗生素和可用于治疗流感病毒的其它试剂和治疗方案(包括被认为替代性药物的药物)。免疫调节剂和免疫刺激剂包括但不限于各种白细胞介素、CD4,细胞因子,抗体制剂、血液传输和细胞传输。抗生素包括但不限于抗真菌剂、抗细菌剂。
制剂和药物组合物
可配制本发明的组合物以通过本领域已知的可接受用于给哺乳动物受试者优选人施用的方式进行施用。在本发明的一些实施方案中，可通过注射将本发明的组合物直接施用至组织中或施用至供应目标组织的血管中。在本发明的其它实施方案中，可“局域地(locoregionally)”，即，膀胱内、伤口内和/或表面地施用本发明的组合物。在本发明的其它实施方案中，通过注射、吸入、栓剂、透皮递送等全身性施用本发明的组合物。在本发明的其它实施方案中，通过导管或其它装置施用组合物以使得能够到达远距离的目标组织，例如内脏器官。还可在在仓储类型装置(depot type device)、植入物或封装胶囊的制剂中施用本发明的组合物以使组合物缓慢或持续释放。
为了施用基于或来源于本发明的治疗剂，应理解可将适当的载体、赋形剂和其它试剂整合入制剂以提供改进的转移、递送、耐受性等。
多种适当的制剂可见于所有药物化学家已知的处方集：Remington's Pharmaceutical Sciences,(第15版,Mack PublishingCompany,Easton,Pennsylvania(1975))，特别地其中由Blaug,Seymour编著的第87章。此类制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、冻胶、蜡、油、液体、无水吸收性基质、水包油或油包水乳剂、乳状碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、包含碳蜡的半固体凝胶和半固体混合物。
前述制剂的任一种可适用于根据本发明的治疗和疗法，只要制剂中的活性剂未被制剂灭活并且制剂是生理上相容的。
有效治疗所必需的活性成分的量将取决于许多不同的因素，包括施用方法、靶位置、患者的生理状态以及施用的其它药剂。因此，应当滴定治疗剂量以最优化安全性和效力。通常，体外使用的剂量可在用于活性成分的原位施用的量上提供有用的指导。用于治疗特定病症的有效剂量的动物测试将提供人剂量的其它预测指征。在例如Goodman andGilman′s the Pharmacological Basis of Therapeutics，第7版(1985),MacMillan Publishing Company,New York和Remington′sPharmaceutical Sciences第18版，(1990)Mack Publishing Co,EastonPenn中描述了各种考虑。本文中论述了施用方法，包括口服、静脉内、腹膜内、肌内、经皮肤、经鼻、离子电渗施用(iontophoretic administration)等。
取决于施用方法，可以以多种单位剂量形式施用本发明的组合物。例如，适用于口服施用的单位剂量形式包括固体剂型例如粉剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂，和液体剂型例如酏剂、糖浆剂和悬浮剂。还可以以无菌液体剂型胃肠外施用活性成分。明胶胶囊包含活性成分和惰性成分粉末载体例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等。可被添加以提供期望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其它已知的期望特征的其它惰性成分的实例为红氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、食用白墨水(white ink)等。类似的稀释剂可用于制备压制片剂。可将片剂和胶囊剂制造为持续释放产品以在数小时的时段中提供药物的持续释放。压制片剂可以被糖包被或膜覆盖以掩盖任何令人厌恶的味道并保护片剂免受大气损害，或被肠溶衣包被以在胃肠道中进行选择性崩解。用于口服施用的液体剂型可包含着色剂和调味剂以增加患者的接受度。
本发明的组合物在药物制剂中的浓度可根据所选择的具体施用模式而广泛地变化，即从按重量计算低于约0.1%，通常2%或至少约2%至多达20%至50%或更多，并且将主要通过液体体积、粘度等来进行选择。
本发明的组合物还可通过脂质体来施用。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄片层等。在此类制剂中，将待递送的本发明的组合物单独地或与结合期望的靶的分子例如抗体或与其它治疗性或免疫原性组合物组合作为脂质体的部分掺入。因此，可全身性递送充满或布置有本发明的期望的组合物的脂质体，或可将其导向目标组织，在所述组织中脂质体随后递送选择的治疗性/免疫原性肽组合物。
从标准的囊泡形成脂质(其通常包含中性和带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的脂质体。通常通过考虑例如脂质体尺寸、酸不稳定性和脂质体在血流中的稳定性来指导脂质的选择。各种脂质描述于例如Szoka等人Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)，美国专利No.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(通过引用并入本文)中。
可以以根据，除其它以外，施用方式、待递送的本发明的组合物和待治疗的疾病的分期而变化的剂量通过静脉内、局域、表面等施用包含本发明的组合物的脂质体悬浮剂。
对于固体组合物，可使用常规无毒固体载体，包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服施用，通过掺入任何通常使用的赋形剂例如先前列出的那些载体和通常10-95%(更优选以25%-75%的浓度)的活性成分(即一种或多种本发明的组合物)来形成药学上可接受的无毒组合物。
对于气溶胶施用，优选以精细磨碎的形式连同表面活性剂和推进剂一起提供本发明的组合物。本发明的组合物的常见百分比为按重量计0.01%-20%，优选1%-10%。表面活性剂当然必须为无毒的，优选溶于推进剂。此类试剂的代表为包含6至22个碳原子的脂肪酸例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric acid和油酸与脂肪族多元醇或其环酐的酯或部分酯。可使用混合酯例如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可组成按重量计0.1%-20%，优选0.25-5%的组合物。组合物平衡为常用的推进剂。同样地，需要时还可包含载体例如卵磷脂以进行鼻内递送。
另外可利用本领域公知的技术于仓储类型系统、胶囊化形式或植入物中递送本发明的组合物。类似地，可通过泵将组合物递送至目标组织。
通常在症状发作后给患者施用本发明的组合物，虽然在一些实施方案中治疗也可以是预防性。通常，通过每天一次、每周一次或每月一次直接施用多肽进行治疗，进行足以减轻、阻止或缓解症状的一段时间。通常以数月的间隔进行利用本发明的核酸的治疗。在一些实施方案中，在子宫内进行本发明的组合物的施用。
还可在试剂盒中在上述包装材料(wrapping)或容器中将本发明的组合物作为缓释组合物(例如以海绵、皮肤贴片、皮下植入物提供的日单位、周单位、月单位)提供。在该情况下，患者可从容器释放一个单位的组合物并且如试剂盒说明书中所标明的来使用它。随后可在指定的时期结束时用新鲜单位替换组合物等等。
本发明的组合物还可通过注射施用，如上文中所述。通常，可将肽单独施用，或例如在糖尿病的情况下，将其在也包含胰岛素的组合物中施用。对于组合物的缓释形式也如此。类似地，可将本发明的肽在也包含另一种药物的组合物中进行施用。
下列实施例被提供用来举例说明本发明的不同实施方案并且无意以任何方式限定本发明。本领域技术人员将容易地理解，本发明能够产生上述对象和获得上述有利方面，以及其中固有的对象和有利方面。
实施例1(对照图1)：牛Mx1发动蛋白在用高致病性H7N7甲型流感病毒株感染的Vero细胞中显示出与先前对于其它Mx发动蛋白宣称的抗甲型流感活性相比较更强的抗甲型流感活性
在本实施例中，由牛Mx1同种型的条件表达赋予的对甲型流感病毒复制的抗性的程度通过测量由不表达或表达所述Mx1的Vero细胞单层产生的48小时的甲型流感病毒产量来确定。
编码所述Mx1的全长cDNA的产生—按照制造商的说明书利用TRIzol试剂从IFNα-刺激的(1.000U/ml重组IFNαA/D，进行24小时)Madin-Darby牛肾细胞提取总RNA，使用ImPromII技术对其进行逆转录。根据可在数据库中获得的cDNA序列设计成对的特异性寡核苷酸引物。如下进行PCR：在94°C进行5分钟，随后进行10个循环(在94°C进行30秒，在62°C进行30秒(每循环递增+0.1°C)，在68°C进行120秒)，随后进行25个循环(94°C进行30秒，64°C进行30秒，68°C进行140秒(每循环递增3秒))，最后在68°C进行10分钟。
编码所述Mx1的表达载体的构建—利用pCRII-TOPO载体TA-连接PCR产物，将其转化入大肠杆菌(E.coli)Top10。始于M13正向和反向引物，利用双脱氧链终止法(利用BigDye标记的)对几个克隆的cDNA的两条链进行测序。将终止产物溶解，使用自动化DNA测序仪检测。将来自pCRII-TOPO的HindIII/EcoRV片段(包含选择的Mx1同种型和正确推导的氨基酸序列的总跨度)在载体多克隆位点(MCS)的EcoRV位点定向亚克隆入哺乳动物表达载体pcDNA4/TO，以产生最终构建体。在对片段的悬突进行Klenow填充以使其成为平端后，可以进行pcDNA4MCS的EcoRV位点与片段的HindIII位点的连接。将重组质粒转化入大肠杆菌Top10，通过氨苄青霉素抗性进行选择，利用限制性图谱法进行鉴定，通过序列分析进行确认。这些pcDNA4-Mx1载体将Mx cDNA置于完全人巨细胞病毒增强子-启动子序列(包含来自细菌四环素抗性操纵子的元件)的直接转录控制之下，以有效地抑制/去抑制转录。进行相似的方法以构建eGFP的表达载体。
转基因Vero细胞克隆的产生—产生的所有Vero细胞克隆来源于从ATCC(Vero/CCL-81)购买的原始细胞(primordial cell)，并且将其在补充有10%胎牛血清(DMEM-10)的达尔伯克改良伊格尔培养基中于37°C、具有5%CO2-95%的空气湿度的培养箱中进行生长。使用T-Rex技术，目的在于产生双转基因Vero克隆系，从而允许在多西环素处理后进行所述Mx1蛋白的受到严密调控的条件表达。首先按照制造商的说明书，通过Lipofectamine 2000法，利用表达质粒pcDNA6-TetR(Invitrogen)转染Vero细胞。在2周的选择后回收杀稻瘟素抗性(10μg/ml)转染子，通过有限稀释克隆所述转染子一次。在另一轮持续4周的杀稻瘟素选择后获得所得的克隆，利用流式细胞术，在用pcDNA4-eGFP瞬时转染后通过检查eGFP的表达来筛选它们控制严密条件表达的能力。在利用多西环素(1μg/ml)的情况下，少数克隆兼有强荧光，在多西环素不存在的情况下荧光完全消失。随后利用pcDNA4-Mx1对这些克隆之一的细胞(Vero/TetR1)进行电穿孔。简而言之，在300μl MEM-0中制备包含~2.106个处于对数生长期的Vero/TetR1细胞和1.5μg利用ScaI线性化的pcDNA4-Mx1的等分试样。在电穿孔(0.25kV,950μF,33ms)后，将细胞接种在不含多西环素的DMEM-10培养基中，首先进行24小时不进行选择，随后用杀稻瘟素(10μg/ml)和zeocin(400μg/ml)进行选择。在4周的选择后回收杀稻瘟素/zeocin抗性转染子，通过有限稀释克隆2次。
Vero细胞克隆的表型分型—通过免疫印迹法和免疫荧光法确定外源Mx1表达的存在和特征。为了进行Western印迹分析，在4°C用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤非诱导的和诱导的MDBK(IFNα)和杀稻瘟素/zeocin抗性转染子(多西环素)单层，将其刮入PBS中，通过低速离心进行沉淀。通过在Laemmli's SDS-样品缓冲液中煮沸而裂解细胞沉淀，将代表10μg总细胞蛋白质的等分试样在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。随后将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride)膜上，如先前所述进行非特异性结合结构域封闭。在37°C利用于PBS/0.05%Tween-20中以1:2000稀释的兔抗-人MXA抗血清探测封闭的膜，进行1小时。随后将印迹于PBS/0.05%Tween-20中进行洗涤，将其与生物素化的山羊抗-兔IgG连接抗体在37°C一起温育10分钟。随后相继在PBS和蒸馏水中洗涤印迹，通过用辣根过氧化物酶-链霉抗生物素蛋白和底物3-氨基-9-乙基咔唑温育来使印迹显影。为了进行免疫荧光(在盖玻片上)和流式细胞术，用4%的PBS中的甲醛固定细胞，进行20分钟，将细胞在-20°C于无水甲醇中透化6分钟。在于洗涤缓冲液(PBS中的1%的BSA)中封闭1小时后，用特异性多克隆豚鼠和兔抗-人MxA抗血清的混合物探测细胞1小时，在3个洗涤步骤后，用1:1000稀释的缀合于Alexa 488的相关二抗的混合物再温育1小时。所有步骤均在室温下进行。通过表面荧光定性地或在荧光激活细胞扫描仪(fluorescence-activated cell scanner)中定量地分析克隆。
表达所述Mx1的Vero细胞的选择—使用下列标准通过免疫荧光筛选一系列约400个杀稻瘟素/zeocin抗性双转基因克隆的每一个中的Mx1表达模式：(i)当在不含多西环素的培养基中生长时表达Mx1的细胞的比例，(ii)在诱导后表达Mx1的细胞的比例，和(iii)Mx1染色的亚细胞强度。在多西环素不存在的情况下，少数克隆兼有0表达，在多西环素存在的情况下，超过99%的表达，并且显示强细胞质颗粒染色。使用Western印迹和流式细胞术进一步表征这些克隆。V103克隆在诱导后合成~75-kDa的蛋白质，该蛋白质被抗-人MxA抗血清识别并且与真正的牛Mx1共迁移，如从由IFNα-刺激的MDBK细胞(即从其提取相关cDNA来构建转基因的那些细胞)产生的条带判断的。在除去多西环素后，异位Mx1在随后48小时中仍可被检测，在除去后24小时(即，在掺入后48小时)达到峰值平均荧光水平。然而在除去后72小时，已发生显著衰减，非诱导和诱导的细胞开始不能被流式细胞术区分了。已显示异位Mx1表达的模式在30天的培养过程中保持稳定，需要时，每3至5天对V103细胞进行传代。将来自V103细胞提取物的转基因特异性RT-PCR的产物重新测序，产生真正的牛Mx1CDS。
本研究使用高致病性禽H7N7甲型流感病毒(A/物种/荷兰/x/2003)。繁殖病毒，将原液在胚化期鸡蛋中生长，利用标准半数组织培养感染剂量测定法测定其滴度。为了进行感染，首先将原液的等分试样稀释于具有0.2% BSA的DMEM中。即时制备系列稀释物以产生具有适当感染复数的体积匹配的接种物，将其掺入诱导的(多西环素)或非诱导的(媒介物)V103细胞单层，靶感染复数为0.05、0.01、0.5和1。感染后，使接种物在37°C吸附60分钟，然后通过用PBS充分洗涤将其除去。随后将培养物在37°C于不含多西环素的DMEM/2中进行温育。在于37°C温育48小时后，对培养物上清液进行取样，按一式三份利用标准半数组织培养感染剂量测定法在鸡成纤维细胞上测定病毒滴度。利用Reed-Muench法计算所有滴度。
根据现有技术，甲型流感病毒具有作为检测新的Mx发动蛋白同种型的假定的抗病毒活性的标准工具的作用。我们能够第一次证明牛Mx1被赋予抗流感活性，如通过图1中收集的结果判断的，这显示了病毒产量的下降和感染复数小于1的病毒复制的半消除(quasi-extinction)。因此牛Mx1自此以后可同人MxA、野生小鼠Mx1和Mx2、大鼠Mx1和鸡Mx一起包括在具有证实的抗流感活性的Mx蛋白的组内。
根据现有技术，通过人MxA同种型的转基因表达体外赋予的抗流感保护系数总计达101、5.102或5.103。无论何时在现有技术中体外测量小鼠Mx1抗流感活性，报告的保护系数总是总计达约103。虽然用于检查鸡Mx的抗流感活性的体外细胞制剂略有不同，但报告的保护系数大致为102。相反地，根据图1，可看到由根据本发明的牛Mx1同种型提供的保护系数在105与108之间变化（取决于感染复数）。因此牛Mx1被赋予比迄今测试的任何Mx蛋白的抗流感活性显著更强的抗流感活性。
实施例2(对照图2)：牛Mx1发动蛋白在被高致病性H5N1甲型流感病毒株感染的vero细胞中显示出比由猪和人Mx1发动蛋白显示的抗甲型流感病毒活性更强的抗甲型流感病毒活性
在本实施例中，由智人、野猪和牛Mx1同种型的条件表达赋予的对甲型流感病毒复制的抗性的程度通过测量由不表达或表达所述Mx1同种型的Vero细胞单层产生的48小时的甲型流感病毒产量来确定。用于人MxA(huMxA)和猪Mx1(poMx1)的表达载体的构建、允许所述Mx同种型的多西环素控制下的表达的Vero细胞克隆的产生以及这些克隆的表征与先前对于牛Mx1所描述的方法基本上相似。对于每一个Mx同种型获得一个克隆，即克隆VA8(huMxA)和VSK6(poMx1)。
高致病性禽H5N1甲型流感病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)用于本研究。繁殖病毒，将原液在胚化期鸡蛋中生长，利用标准半数组织培养感染剂量测定法测定其滴度。为了进行感染，首先将原液等分试样稀释于具有0.2%BSA的DMEM中。即时制备系列稀释物以产生具有适当感染复数的体积匹配的接种物，将其掺入诱导的(多西环素)或非诱导的(媒介物)V103、VA8和VSK6细胞单层，靶感染复数为0.1、1和10。感染后，使接种物在37°C吸附60分钟，然后通过用PBS充分洗涤将其除去。随后将培养物在37°C于不含多西环素的DMEM/2中进行温育。在于37°C温育48小时后，对培养物上清液进行取样，按一式三份利用标准半数组织培养感染剂量测定法在鸡成纤维细胞上测定病毒滴度。利用Reed-Muench法计算所有滴度。
在其中严格标准化实验条件的本实验设置中，由3种Mx同种型带来的抗流感活性明显不同(图2)。事实上，牛Mx1的表达对甲型流感病毒复制的抑制为其它两种的100至20000倍。因此牛Mx1被赋予比其它细胞质Mx同种型的抗流感活性显著更强的抗流感活性，这是本领域技术人员不能预测的。
实施例3：甲型流感病毒H1N1和H5N1肺炎的体内小鼠模型
病毒—使用2种用于实验室小鼠的低致病性甲型流感病毒进化枝(clade)1禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)和猪H1N1病毒(A/swine/Iowa/4/1976)。首先在10日龄胚化期鸡蛋的尿囊腔中繁殖两种病毒，随后通过肺对肺传代(lung-to-lung passaging)使其适合于小鼠。在每一次传代，用50μl含有甲型流感病毒的尿囊液或肺匀浆物鼻内接种一组小鼠。在接种后(pi)第5天，通过施用过量戊巴比妥，然后放血来对小鼠进行无痛致死，将肺组合，于PBS-青霉素-链霉素中匀浆，将匀浆物以3,000g离心10分钟，将上清液用于下一次传代。当小鼠在接种后第3-4天以及之后变得明显病态时，停止该方法。这在5次(H5N1)或31次(H1N1)传代后发生。将来自最后一次传代的肺匀浆物进行均质处理，然后将其等分以用于致病性分型研究，利用标准噬斑(standardplaque)(H1N1)或半数组织培养感染剂量测定法(H5N1)测定其滴度。随后在FVB/J小鼠中进行每一个适应的病毒原液的系列稀释物的接种，按照Reed和Muench的方法计算50%小鼠致死剂量(MLD50)。
致病性分型法—为了评估病毒诱导的致病性，通过滴注50μL稀释的原液，利用10MLD50的病毒鼻内接种两个系列的FVB/J小鼠。每天监测小鼠的体重变化以评估病毒诱发的致病。在选择的时间间隔，给一组小鼠过量服用戊巴比妥钠，然后通过切开肱动脉进行放血。将来自5只小鼠的肺和心脏、肝、脾、胰腺、肾、脑和脂肪组织的碎片于4%中性缓冲的冰冷多聚甲醛中进行固定，进行常规处理，包埋在石蜡中以进行组织病理学评估。用苏木精和伊红或用过碘酸-希夫对5微米切片进行染色以进行损伤检测。为了进行病毒检测，利用链霉抗生物素蛋白-生物素复合物免疫过氧化物酶法对切片进行染色。将针对重组流感病毒核蛋白本单位制备的IgG-纯化的多克隆兔抗血清用作一抗的来源，将缀合有HRP的抗-兔IgG用作二抗。利用过3-氨基-9-乙基-咔唑显示氧化物酶，从而导致鲜红色沉淀，用Mayer’s苏木素对切片进行复染色。为了进行病毒滴定，称取来自5只小鼠的肺的重量，将其在1ml PBS中匀浆，随后进行澄清。将上清液用于通过噬斑或半数组织培养感染剂量测定法进行的病毒滴定。由于已显示双相呼吸模式(biphasic expiratorypattern)的采用预告约24小时内发生死亡，因此由于人道原因选择该定性体征作为实验疾病的终点。在该终点日，对5只小鼠的肺取样，称重，将其匀浆物烘干以进行干重测定。
实验流感疾病的特征—分别从患病的猪(1976年于美国)和从2003年从泰国走私的大冠鹫分离用于本研究的H1N1和H5N1甲型流感病毒株。两个病毒株对于FVB/J小鼠都是非致病性的(MLD50>106PFU/TCID50)。在适应后，它们在FVB/J小鼠中显示相似的致病效果，即非常接近的MLD50值：3.2PFU(对于H1N1株)和6.4TCID50(对于H5N1株)。这使得能够进行它们各自的病理特征的相关比较。总之，除在H5N1接种后身体况和呼吸功能快得多的恶化外，通过接种10MLD50引起的病毒相关致病、体重减轻和大体损伤对于两种病毒是相似的，终点日对于H5N1-和H1N1-诱发的疾病分别是接种后第4天和第8天。病理过程在前2天(H5N1)或前4天(H1N1)总体上是无症状的，随后产生一般体征例如逐渐缓慢、不太频繁和更加不稳定的自发移位(spontaneous displacement)和皱皮(ruffled coat)。到接种后第3天(H5N1)或第5天(H1N1)，所有小鼠变得嗜眠并且突然展示呼吸性疾病的临床症状，包括呼吸窘迫、呼吸困难和用力呼吸。在H5N1接种后，小鼠在48小时内，从接种后第3天至终点日体重减轻10%。在H1N1后，体重减轻是急剧的并且还显示二相性特征：10%减轻发生在病毒接种与呼吸症状出现之间，另外20%在ARDS过程中发生。在H1N1疾病的终点日进行的尸体解剖也显示与大规模肺充血和实变的诊断一致的暗紫色硕大的无捻发音的肝样肺。在H5N1-接种的小鼠中，终点肺是硕大的无捻发音的和弥散性梅灰色的，这表示具有大规模肺水肿的充血的诊断。终点肺重量与对照值相比较几乎加倍，但该重量增长在H5N1接种后仅24小时(最后一天)获得，而肺重量在从H1N1接种后第4天至接种后终点日的96小时中逐渐增加(图2)。来自H5N1-感染的小鼠的肺的终点干重对湿重比率(17.6%±1.1%)比来自H1N1-感染的小鼠的所述比率(21.4%±1.4%)低约22%。在心脏、肝、脾、肾、脑或内脏周围脂肪中未观察到明显的大体损伤。达到峰值病毒滴度所需的时间在病毒株之间没有不同。然而对于H5N1，死亡在峰值肺病毒浓度时发生，H1N1相关疾病只有在4天后(病毒的清除已很明显的时候)才变得致命。
肺形态学的一些组织学改变对于两种病毒是相同的。第一，在感染的第一天至最后一天损伤的清晰地形学延伸是可感觉的：从终末细胞支气管或邻近气道的肺泡离心扩散。表征称为弥漫性肺泡损伤的组织病理学病况的渗出期(exsudative phase)的所有改变可定性地鉴定为肺泡毛细血管的强烈充血、具有边缘的毛细血管内中性粒细胞、肺泡上皮的坏死、间质和肺泡性水肿、透明膜以及(主要地)单核细胞对肺泡的侵入。在另一方面，我们既未观察到肺泡的立方化(cuboidalization)(II型肺泡壁细胞的增生)，也未观察到气道上皮的增生或鳞状化生。这表示极其快速的疾病进展和/或II型肺泡壁细胞的几乎完全消除。尽管存在这些相似性，当汇集在最后一天从H1N1-和H5N1-感染的小鼠采集的肺组织样品的切片时，不知晓他正在观察哪种感染的检查者很容易将一种病毒株与另一种病毒株区分。将肺损伤归因于H1N1株的标准为：(1)气道上皮的更早和多得多的广泛变性、坏死和脱屑，(2)支气管周围、细支气管周围、间质和肺泡内浸润的高得多的细胞密度，(3)围绕小动脉的单核细胞的致密套囊(dense cuff)的存在，(4)少得多的广泛肺泡性水肿，和(5)肺泡出血的稀少。相反地，由H5N1株引起的损伤可通过气道上皮的晚期和仅轻微的退化改变、肺泡性水肿的程度、炎性浸润的极低细胞密度、大量肺泡出血病灶和肺小动脉的异常出现(由于血管周水肿的硕大，其似乎已被从周围组织分割出来)来辨别。在另一方面，小动脉未显示浸润的单核细胞的任何套囊。一些血管壁也显示肌肉层内的出血。在H5N1感染的小鼠中，除了明显地肝外，未发现检查的其它器官具有任何组织病理学损伤。这些肝显示多病灶坏死，坏死病灶由与少数中性粒细胞和淋巴细胞混合的高嗜酸粒细胞固缩的和核破裂的肝细胞的聚集体组成。此类病灶也见于一些动物的脾中。令人惊讶地，在H5N1-感染的动物的整个肝中检测到大量PAS阳性小岛(islet)，每一个与坏死病灶重叠。还在所有H5N1-感染的动物的肝中观察到小叶中心水肿的和粒状的(接种后第2天)、小叶中心的(接种后第3天)和全小叶型的(接种后第4天)微泡脂肪变性模式。在它们的肾髓质中，可看见间质出血。
免疫组织化学的结果在用相同病毒株感染的小鼠间是均一性的。总体上，它们显示H1N1株在4至5天内离心地群集在整个肺中，始于细支气管，但仍然严格地限定在肺中。相反地，H5N1病毒在24-48小时内占领整个肺，之后仅感染一些细支气管，并且扩散至肺、胰腺、肾、脾、脑和内脏周围的脂肪。
H1N1病毒最初在接种后第3天可在支气管和细支气管的上皮中被检测到。到第5天，所述病毒株更明显并且也出现在邻近气道的区域的肺泡上皮中。到接种后第7天，可在几乎所有支气管和细支气管的上皮中和肺的广泛区域的肺泡上皮中检测到病毒。在肺泡结构中，染色显示病毒在I型和II型肺泡壁细胞中和在肺泡巨噬细胞中。
H5N1病毒从第2天开始可在细支气管周围肺泡中的一些2型肺泡壁细胞、一些间质/肺泡巨噬细胞和阳性肺泡附近的一些内皮细胞中被检测到。相反地，所检查的非呼吸器官都未显示任何阳性细胞。到第3天，气道上皮的染色仍然是极不连续的和有限的，然而肺泡上皮显示更明显的弥漫地分布在整个肺中的染色。在肝中，多个阳性肝细胞巢可被检测到，正与上述坏死PAS阳性病灶相对应。少数肾小管上皮细胞也是阳性的。在接种后第4天，肺泡上皮仍然被弥漫性染色，但远比接种后第3天明显。细支气管上皮的染色也是第一次可见，但并非所有细支气管-事实上远非所有-显示该染色。与I型肺泡壁细胞相比较，II型肺泡壁细胞和肺泡巨噬细胞更常见地为阳性。肾和肝的外观与第3天相同，具有更明显的染色。此外，还检测到病毒阳性胶质细胞、脾巨噬细胞、心肌细胞、郎格尔汉斯细胞的小岛和腹膜脂细胞。
实施例4：通过表达牛Mx1发动蛋白调节小鼠先天免疫
携带含有牛Mx1的BAC305L8的转基因小鼠的产生—通过组合来自一系列品系的可获得的SNP数据(http:∥www.informatics.jax.org/)的计算机比较、内含子10至外显子11连接的PCR扩增以及如Jin等人,1998；Vanlaere等人,2008中所述使用HhaI进行的外显子14的PCR-RFLV分析，第一次显示了FVB/J小鼠在Mx1基因座上的Mx1-/-等位基因状态。将纯化的BAC DNA以约2-4ng/μl的浓度溶解在显微注射缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 7.5],0.1mM EDTA,30μM精胺,70μM亚精胺,100mM NaCl)中，将其显微注射入FVB/J胚泡的原核。随后将这些胚泡植入假妊娠受体。通过用牛特异性Mx1引物进行PCR对DNA进行基因分型，来进行所得的后代中BAC305L8转基因的整合的筛选和进一步种系传递(在将选择的动物与野生型FVB/J杂交后)的测试。350个后代中有11个包含至少一个拷贝的转基因，其中9个被证明将其传递至下一代。通过进一步交配获得半合子和纯合子转基因动物。分析F6动物的插入的牛Mx基因的表达和功能研究。
boMx1 mRNA水平的分析—在标准化刺激(poly-I/C,15μg/kg，ip，24小时)后，比较野生型与转基因小鼠中的Mx1转录水平。将编码boMx1-蛋白的mRNA的量针对内源参照mRNA(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH)的量进行标准化。
cDNA样品的产生—从野生型和转基因7至8周龄雌性poly-I/C-刺激的小鼠获得脑、肺和脾组织(50-100mg)。在TRIzol中单独地对每一个组织样品进行匀浆以制备总mRNA。用TURBO DNA酶(Ambion)在37°C处理每一个匀浆物30分钟。随后，通过将单独的提取物汇合来产生品系和器官特异性总RNA提取物。在纯化后，利用分光光度计(OD260/280和OD260/230，分别地在1.9→2.0和1.8→2.2的范围内，NanoDrop-1000/Isogen)测定每一个提取物的纯度和浓度，通过琼脂糖凝胶电泳检查mRNA完整性。随后在50μg特异性18聚体寡核苷酸引物和Superscript III逆转录酶存在的情况下，在50°C逆转录每一个品系和器官特异性总RNA提取物的等分试样(2μg RNA)，进行60分钟。
DNA校准器(calibrator)的产生—为了估计每一个样品中每一个靶cDNA的拷贝数，必需产生包含已知靶拷贝数的校准器。为此目的，通过RT-PCR扩增每一个靶序列，纯化并将其克隆入pCRII载体。随后产生每一个靶的具有已知浓度的原液，通过将质粒浓度(μg/μl)除以质粒的质量(μg)来计算拷贝数(每ml)。为了进行该计算，利用分光光度计(260nm处的OD)测定质粒浓度，通过将质粒的长度(载体长度[bp]+插入物长度[bp])乘以核苷酸的质量(1.096 10-15[μg])来计算质粒质量。对于每一个靶，基于适当的原液的6个稀释度(对应于5x101、5x102、5x103、5x104、5x105和7.5x105拷贝)构建定量PCR的标准曲线。为了进行品系之间与器官之间的比较，将Mx转录物的数目针对GAPDH转录物的相应数目进行标准化。
实时PCR—PCR混合物由100ng/μl模板DNA(1μl)、70nM引物(每种0.7μl)和12.5μl ABsoluteTM Blue QPCR SYBR Green ROXMix(ABgene)组成，终体积为25μl。将混合物置于ABI7900HT热循环仪中，在下列条件进行扩增：在95°C初始变性15分钟，然后进行40个循环(在95°C变性15秒，在58°C退火延伸30秒)，随后在72°C进行终延伸30秒。按一式三份进行所有转录物的扩增，对每一个RNA提取物进行3个独立的时期(session)。通过摆回至50°C，然后使温度逐步升高至95°C来监测每一个扩增子的熔解曲线。熔解曲线分析总是显示单一产物的存在。为了检查假阳性，对每一个模板和引物对运行无逆转录和无模板的对照。
boMx1蛋白水平的分析/提取—对于每一个取样的小鼠品系和每一个组织(脑、心脏、肾、肝、肺和脾)，将来自5只poly-I/C-接触的(15μg/g体重，在处死前24小时)8周龄动物的冷冻(-80°C)器官汇合，在液氮浴中用研棒和研钵将其研磨成成粉末。将每一个器官的约500mg粗制冷冻匀浆物重悬浮于600μl提取缓冲液(LLB,Eurogentec)中，涡旋2分钟，然后保持在冰上。随后对样品进行超声处理(在冰上进行3次脉冰，每次30秒，间隔30秒)，在4°C以11,000xg离心10分钟。将上清液在蛋白质排斥剂涂覆的管(Protein LoBind Eppendorf
Figure BDA00002023587300432
)中于-80°C贮存，使用BCA Protein Assay试剂盒测量总蛋白质含量。
boMx1蛋白水平的分析/免疫印迹—将相应于50μg(脾)、70μg(肺)或250μg(脑)总蛋白质的所得上清液的等分试样加载至10%SDS-PAGE凝胶上，进行电泳。电转移至硝酸纤维素膜上后，用含有0.1% Tween和10%牛血清白蛋白的Tris-缓冲盐溶液封闭印迹30分钟，随后用小鼠抗血清(稀释度1:1,000)在室温下温育1小时。利用缀合有HRP的猪抗-兔IgG F(ab')2片段(稀释度1:1,000,Dakocytomation)显示免疫复合物，然后使用CN/DAB Substrate试剂盒(Pierce Biotechnology)检测过氧化物酶。利用Fluor S Multiimager CCD照相机系统和Quantity One软件(Bio-Rad)进行光密度测定。
boMx1蛋白水平的分析/ELISA—使用本单位制备的抗-牛Mx1兔抗血清(用于捕获)、小鼠抗血清，然后缀合有HRP的多克隆兔-抗-小鼠-Ig(用于检测)和最后TMB转换(作为酶活性的读出参数)开发了非竞争性间接夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)。首先，在4°C用100μl以1:1000稀释于碳酸盐缓冲液(100mM,pH 9.5)中的兔抗血清涂铺96孔孔Microlon 600板，进行过夜。随后在37°C用250μl酪蛋白溶液(1%，于PBS中)将其封闭1小时。为了进行boMx1含量测定，首先将孔在37°C用100μl校准器(参见下文)或于PBS中稀释的器官提取物温育1小时，随后在37°C用100μl于PBS-0.5%酪蛋白中以1:1000稀释的小鼠抗血清温育1小时。为了检测免疫复合物，将孔在37°C用100μl于PBS-0.5%酪蛋白中以1:1000稀释的兔抗-小鼠-Ig温育1小时，随后按照制造商的推荐，在室温下用100μl的具有H2O2的底物缓冲液中的TMB温育20分钟。通过添加100μl的1M HCl终止显色，将板在450nm处进行读数。测定相对于消减参照(subtractive reference)(相应于来自受激野生型FVB/J小鼠的器官的提取物)的OD。校准器来源于重组boMx1滴定的原液(100μg/ml)。使用的最高校准浓度为375ng/ml，并且将该溶液在PBS中经历9步骤系列稀释。所得的校准样品的浓度如下：375、250、200、150、100、80、60、40、20和10ng/ml。对于每一个时期的组织boMx1含量测量，从原液产生新的校准器。它们提供信号对浓度(ng boMx1/μg可溶性蛋白)的绝对关系。首先测定来自每一个器官的原始蛋白质提取物的连续稀释物以测定产生最高信号的浓度范围。稀释脾、肺和脑蛋白质提取物以分别掺入每孔~5、~50和~300μg总蛋白质。
boMx1蛋白水平的分析/免疫组织化学—按照标准方案进行组织取样。在于4%中性缓冲的冰冷多聚甲醛中固定和在石蜡中包埋后，使用兔抗血清，然后利用缀合有HRP的山羊-抗-兔免疫球蛋白二抗，通过间接免疫组织学方法对组织切片进行染色以检测boMx1。利用3-氨基-9-乙基-咔唑显示过氧化物酶，产生鲜红色沉淀。利用Mayer’s苏木精对组织进行复染色，将其包埋在甘油-明胶中。将兔免疫前血清、省略切片(omission section)和模拟物接触的MDBK细胞离心涂片器(cell cytospin)用作阴性对照，将与IFNα-接触的MDBK细胞离心涂片器用作阳性对照。检查了下列组织：肺、心脏、肠、肝、脾、肾、大脑、小脑和脑干。
boMx蛋白的功能分析—通过检查水疱性口炎病毒(VSV)、弹状病毒的生物学周期在转基因小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中是否被改变来探测转基因产物对小鼠抗RNA病毒的先天免疫的调节。从病毒感染的BHK-21细胞的上清液制备VSV血清型Indiana的原液和适当的稀释物。首先进行两个独立的体外实验，其中以0.1、1或10的感染复数将病毒悬浮液掺入(300μl/孔，24-孔板)非诱导的或诱导的(50μg/mlpoly-I/C进行24小时)MEF品系(其来源于野生型(WT)、转基因低表达和转基因高表达FVB/J小鼠)的接近汇合的(80%)培养物，进行1小时。在1小时的吸收期后，通过用PBS洗涤除去过量接种物，将培养物在37°C新鲜DMEM中再温育24小时。随后对培养上清液取样以用于病毒滴定。为了进行体内研究，通过在麻醉(30/5mg.kg-1赛拉嗪/氯胺酮，ip)下将50μl的病毒悬浮液(即，~107的半数细胞培养感染剂量[CCID50])缓慢地滴入鼻孔来用病毒接种15只WT、10只ML-555和15只ML-549FVB/J小鼠的组。在所有组中，监测体重和存活，进行14天。在接种后第4天，无痛致死5只WT和5只ML-549小鼠的亚组。取出它们的肺和脑，利用TissueLyser进行匀浆以进行随后的病毒滴定。首先按一式二份在Vero细胞上测定上清液和器官悬浮液的病毒滴度。如先前所述(Baise等人,2004：Conditional expression of type I interferon-inducedbovine Mx1 GTPase in a stable transgenic vero cell line interferes withreplication of vesicular stomatitis virus.J Interferon Cytokine Res.2004Sept.24(9),pp.513-521)，在接种后48小时，它们以CCID50单位表达。也通过实时PCR进行病毒载量的相对定量。按照制造商的说明书(Macherey-Nagel)，借助于商购可得的NucleoSpin基于二氧化硅的离心柱提取总RNA。在独立的逆转录(RT)步骤中，将2μg提取的RNA添加至补充有25pmol随机六聚体引物(Applied Biosystems)、5nmoldNTP、55nmol MgCl2、4IU RNA酶抑制剂和12.5IU Multiscribe逆转录酶(Applied Biosystems)的1×Multiscribe RT缓冲液(
Figure BDA00002023587300461
逆转录试剂,Applied Biosystems)中，总体积为10μl。RT条件如下：在25°C进行10分钟，然后在48°C进行30分钟以及在95°C进行5分钟。为了进行随后的实时PCR，将5μl模板cDNA添加至12.5μl的补充有5pmol正向和反应引物的2×SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)，总体积为25μl。将该混合物置于ABI 7900HT热循环仪中，在95°C进行10分钟，随后利用程序扩增被靶向的VSV-特异性cDNA区段，所述程序由40个如下的循环组成：在95°C进行15秒和在60°C进行60秒。通过摆回至50°C进行15秒，然后使温度逐步升高至95°C来监测所得的扩增子的熔解曲线。将VSV-阳性样品和阴性含水样品包括在内，作为RT和PCR步骤中的内部对照。按一式二份反应分析所有样品。
具有表达功能性牛Mx1的插入物的转基因小鼠品系的表征—染色体16上的位置97668642与97684514(Mx1基因)之间可获得的SNP数据未显示一方面的FVB/J品系与另一方面的BALB/c、C57BL/6、DBA/2和C3H/HeN品系之间的变异。此外通过PCR从BALB/c-A2G小鼠但未从BALB/c、FVB/J和ML-549品系回收到与内含子10和外显子11重叠的基因组片段。外显子14的PCR-RFLV分析显示HhaI限制酶切位点存在于所有测试的品系中，这反驳了FVB/J中存在CBA/J-样Mx1-/-等位基因的假设。结合起来，这些结果显示FVB/J品系具有大部分近交系共有的Mx1-阴性等位基因。11只通过显微注射的卵母细胞的输卵管转移出生的小鼠是转基因的。这些小鼠中的9只将转基因传递给它们的后代，如通过PCR分析显示的，但9个品系中的2个品系因极低的生殖率而快速灭绝。随后，利用标准PCR进行的更详细的分析使我们能够从7个剩余品系的DNA扩增相应于boMx1基因的5’和3’末端的特定区段。这表明在每一个品系中插入了至少一个牛Mx1基因的完整拷贝。通过逆转录，然后通过实时PCR在来自poly-I/C-注射的小鼠的肺组织中测量到最高水平的boMx1 mRNA。将它们针对GAPDHmRNA进行标准化。该分析显示插入的boMx1基因在所有品系的肺中高效转录。按照所产生的转录物的量，可将转基因品系容易地分类为高表达(ML-549、ML-556)、中等表达(ML-310、ML-375)或低表达品系(ML-312、ML-545和ML-555)。通过RT-PCR从poly-I/C-诱导的转基因小鼠回收的boMx1多核苷酸序列的计算机翻译产生了预期的氨基酸序列。肺、脾和脑提取物的Western印迹(免疫印迹)分析(数据未显示)显示boMx1 mRNA在所有三种组织中的确被翻译。从3只小鼠的肺获得的3个印迹的半定量密度计分析产生与通过实时RT-PCR测定的相同的按表达水平的分类：ML-549≈ML-556>ML-310≈ML-375>ML-312≈ML-545≈ML-555(图2B)。脑、心脏、肺、肠、肾、肝和脾组织的免疫组织化学分析确认了这些结果，并且进一步显示表达在器官间和器官内的差异。在除了一个品系(ML-545，其组织未显示染色)外的所有转基因品系的所有小鼠中，boMx1-特异性染色在肾和肠中比在其它器官中强。在脑和肝中，其在一些细胞类型(Kupffer细胞)或结构(脉络丛)中更强；在肺中，染色在肺泡的上皮中比在细支气管的上皮中更强。我们使用ELISA来测量boMx1蛋白在每一个品系的5只poly-I/C预处理的小鼠的不同器官中的浓度。对于品系ML-545，无论动物或器官是什么，结果与野生型小鼠的器官的结果相同。在6个产生boMx1的品系之间，未出现清晰的表达模式，虽然就浓度而言主导趋势是脾中的浓度约为肺中的15倍，肺中的浓度约为脑中的5倍。在肺中，4个品系显示200-300ng/mg可溶性蛋白的浓度，另外两个品系显示约100ng/mg可溶性蛋白的浓度。基于脑中的浓度，3对是可鉴定的：ML-549和ML-556具有约50ng/mg可溶性蛋白，ML-310和ML-375具有15-25ng/mg可溶性蛋白，ML-312和ML-375具有约5ng/mg可溶性蛋白。对于脾浓度，出现2个高表达(～5μg/mg可溶性蛋白)、2个低表达和2无表达品系。其中后者为品系ML-310，在肺中具有高boMx1水平但在脾中不存在。在利用poly-I/C进行最大刺激后，来自ML-549和ML-555小鼠的第5代胚胎成纤维细胞表达约1.4和0.2μg boMx1/mg可溶性蛋白。我们的稳定转染的Vero细胞系(其显示高度的VSV抗性(Baise等人，2004))包含约1μg/mg，牛BT和MDBK细胞系分别产生约1和约0.6μg/mg。为了进行比较，我们还进行了在当地屠宰场和尸检临床学院(Faculty necropsy clinic)收集的牛脾的boMx1含量的大规模筛选。这显示了其中未检测到病毒的被屠宰的动物之间和尸检动物之间的约0.15μg/mg可溶性蛋白的自发(从而次于最大的)浓度，然而boMx1浓度在10个病毒阳性案例之间总计达0.5至3μg/mg。总而言之，产生了转基因小鼠，所述转基因小鼠不存在内源抗病毒Mx蛋白(它们的遗传背景为FVB/J品系的遗传背景)，但在不同器官中并且在它们天然启动子的控制下条件化表达牛Mx1基因，达到可与牛细胞和组织中测量的蛋白质浓度相当的蛋白质浓度。
表达完整牛Mx1基因的转基因小鼠被保护免受致命VSV感染—通过使用体重减轻作为病状的量度，我们于是检查牛Mx1基因是否能够保护转基因小鼠免受致命VSV感染。我们观察到在~107CCID50的病毒下，转基因boMx+/- ML-549小鼠未经历任何显著的体重减轻，然而转基因boMx+/- ML-555和野生型小鼠在接种后体重显著下降。这些小鼠之间的存活随访显示：一方面的ML-549小鼠与另一方面的ML-555和野生型小鼠之间的高度显著的差异(Kaplan-Meier分析，p<0.01)；所有ML-549小鼠存活，然而在两个其它品系之间死亡率分别为100和70%。总而言之，表达两种牛Mx1的小鼠被保护而免受由VSV病毒引起的高死亡率和发病率。为了测试“该boMx1-诱导的临床严重度的降低与病毒本身的抑制相关”这一假设，我们通过qPCR和常规滴定定量VSV病毒载量。VSV感染后4天，VSV基因组载量在野生型小鼠的肺中显著高于ML-549小鼠，如从来自后者的样品的增加的循环阈值判断的。脑是鼻内感染后VSV的另一个靶器官。在感染后第4天，从100%的野生型小鼠，但仅从50%的ML-549小鼠中回收到VSV基因组，qPCR-阳性样品的比较显示在ML-549小鼠中存在较低的水平。我们还测量了接种后4天小鼠的肺和脑组织中VSV的复制。所有小鼠的脑中发现的病毒滴度在该时间点上低于我们的测定的检测限。在所有野生型小鼠的肺(4.17±0.65[-1]logTCID50)中，但未在转基因小鼠肺中检测到病毒。总地来说，牛Mx1基因在小鼠中的表达对于在VSV感染后减少肺中的病毒载量是至关重要的。在用VSV感染胚胎成纤维细胞单层后24小时，ML-549中的基因组拷贝数和感染性颗粒载量再次显著低于野生型来源的细胞。
实施例5：表达小家鼠和牛Mx1的胚胎小鼠成纤维细胞的产生
从交配后14天的胚胎收获来自同基因型的BALB/c-A2G和ML549、ML-555和ML556转基因小鼠的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。首先分割头、肝和肠，将余下的胎儿组织切碎，然后于PBS中进行漂洗。随后用胰蛋白酶(0.25%，于Dulbecco’s PBS中)处理胎儿匀浆物，在37°C温育30分钟，随后在培养基中进行离解。在除去可看见的组织团块后，将剩余的细胞涂铺在装有补充有10%热灭活的FCS、1%(v/v)青霉素-链霉素和0.5%两性霉素B的DMEM的25-cm2培养瓶中。在4小时的接种后，通过轻轻混合除去非粘附性细胞，然后直接更换培养基。原代培养物在约60小时后达到汇合，将其以1:2分传以用于在液氮中冷冻(第1代MEF)或用于涂铺在175-cm2培养瓶中。为了进行半连续培养，大约每4天以1:4分传MEF培养物。
实施例6(对照图3)：牛Mx1发动蛋白在用高致病性H5N1甲型流感病毒株感染的小鼠胚胎成纤维细胞中显示出比由moMx1发动蛋白显示的抗甲型流感病毒活性更强的抗甲型流感病毒活性
在用甲型流感病毒的A/crested_eagle/Belgium/1/2004 H5N1株以10-1的感染复数接种之前24小时，用poly-I/C刺激来源于纯合同基因型的BALB/c-A2G和表达转基因boMx1的ML555、ML549和ML556小鼠品系的原代胚胎成纤维细胞的单层。在接种后48小时，利用标准半数组织培养感染剂量测定法，将上清液用于病毒滴定。结果收集在图3中。与表达小鼠-Mx1的MEF相比较，表达生理水平的boMx1的小鼠(来源于转基因ML549品系)赋予了显著更好的保护作用，具有~19%的下降。此外，生理水平的小鼠Mx1赋予在数量上与来源于ML555品系(即，先前已显示表达在源物种中表达的Mx1的量的1/10的品系)的MEF赋予的相似程度的对病毒复制的抗性。这些结果显示boMx1对病毒生命周期的阻断比由小鼠Mx1赋予的要强得多。
根据现有技术，在体外通过表达人MxA赋予的抗流感保护系数总计达101、5.102或5.103，小鼠的Mx1达103，以及鸡Mx的达102。因此，由牛Mx1赋予的保护作用是前所未有的。
实施例7(对照图4)：牛Mx1的体内表达在实验室小鼠中抑制由甲型流感病毒H5N1感染引起的组织学改变
在10日龄胚化期鸡蛋的尿囊腔中繁殖进化枝1禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)，随后通过肺对肺传代使其适应小鼠。在每一代，用50μl含有甲型流感病毒的尿囊液或肺匀浆物鼻内接种一组小鼠。在接种后第5天，无痛致死小鼠，将它们的肺组合，于PBS-青霉素-链霉素中进行匀浆，将匀浆物离心，将上清液用于下一次传代。当小鼠在第5代后在接种后第3-4天以及之后变得明显病态时，停止该方法。将来自最后一代的肺匀浆物进行均质处理，然后将其等分以用于进一步致病性分型研究，并且利用标准半数细胞培养感染剂量测定法(CCD50)来测定它们的滴度。为了评估病毒相关损伤，通过在麻醉(30/5mg.kg-1赛拉嗪/氯胺酮，ip)下将50μl的每一种稀释物缓慢地滴入鼻孔来在野生型FVB/J小鼠中和ML-549品系的转基因小鼠中进行适应的病毒原液的标准稀释物的接种。在选择的时间间隔上，给5只小鼠过量施用戊巴比妥钠，然后通过切开肱动脉进行放血。将肺于4%中性缓冲的冰冷多聚甲醛中进行固定，进行常规处理，包埋在石蜡中以进行组织病理学评估。用苏木精和伊红对5微米切片进行染色。
在野生型FVB/J小鼠的H5N1疾病的终点日进行的尸体解剖始终显示硕大的无捻发音的和弥漫性梅灰色肺(表示大规模肺水肿充血的诊断)。相反地，来自表达boMx1的小鼠的肺与来自在健康的无特定病原体的FVB/J小鼠中取样的肺相比较未显示任何改变。在组织学上，来自转基因小鼠的肺与来自健康小鼠的肺相似(图4)。相反地，在野生型FVB/J小鼠中，看到许多改变，在感染的第一天至最后一天损伤的清晰地形学延伸是可觉察的：从终末细胞支气管或邻近气道的肺泡离心扩散(图4)。表征称为弥漫性肺泡损伤的组织病理学病况的渗出期的所有改变可定性地鉴定为肺泡毛细血管的强烈充血、具有边缘的毛细血管内中性粒细胞、肺泡上皮的坏死、间质和肺泡性水肿、透明膜以及(主要地)单核细胞对肺泡的侵入。在另一方面，我们既未观察到肺泡的立方化(II型肺泡壁细胞的增生)也未观察到气道上皮的增生或鳞状化生。这表示极其快速的疾病进展和/或II型肺泡壁细胞的几乎完全消除。由于血管周水肿的硕大，肺小动脉似乎已被从周围组织分割出来，一些血管壁还显示肌肉层内部的出血。
根据现有技术，在用高毒力甲型流感病毒感染后由Mx蛋白赋予的抗肺损伤的发展的保护作用从来不是完全的，包括在表达它们的内源抗病毒同种型的小鼠中。因此，在表达boMx1的小鼠中观察到的肺改变的不存在是前所未有的，这是本领域技术人员不能预测的。
实施例8(对照图5)：实验小鼠的甲型流感病毒H5N1感染在表达boMx1-发动蛋白的小鼠间导致比表达moMx1-发动蛋白的小鼠间更低的死亡率
在10日龄胚化期鸡蛋的尿囊腔中繁殖进化枝1禽H5N1病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)，随后通过肺对肺传代使其适应小鼠。在每一代，用50μl含有甲型流感病毒的尿囊液或肺匀浆物鼻内接种一组小鼠。在接种后第5天，无痛致死小鼠，将它们的肺组合，于PBS-青霉素-链霉素中进行匀浆，将匀浆物离心，将上清液用于下一次传代。当小鼠在第5代后在接种后第3-4天以及之后变得明显病态时，停止该方法。将来自最后一代的肺匀浆物进行均质处理，然后将其等分以用于进一步致病性分型研究，利用标准半数细胞培养感染剂量测定法(CCD50)测定它们的滴度。为了评估病毒相关致死率，通过在麻醉(30/5mg.kg-1赛拉嗪/氯胺酮，ip)下将50μl的每一种稀释物缓慢地滴入鼻孔而在野生型FVB/J小鼠中和BALB/c小鼠中，在同基因型的BALB/c-A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的转基因小鼠中进行适应的病毒原液的6个10倍系列稀释物的接种。在所有组中，监测存活，进行14天。根据Reed和Muench的方法计算半数小鼠致死剂量(MLD50)。
5个组群的小鼠的特征性LD50如下：对于FVB/J、BALB/c、BALB/c-A2G、FVB/J-ML555和FVB/J-ML549分别为6.4、20、12 649、27 252和>40 000 CCID50。4.104 CCID50的接种在表达不同Mx同种型/量的小鼠品系之间产生明确的差异(图5)。FVB/J和BALB/c存活曲线在统计上相似(时序检验,p>0.1)，但与3个表达Mx的品系的典型存活线明显不同(p<0.003)。尽管事实上同基因型的BALB/c-A2G和转基因FVB/J-ML549小鼠分别表达生理水平的小鼠和牛Mx1，但它们的存活曲线显著不同(p<0.002)，这显示了牛Mx1被赋予更强的抗流感活性。最后，低表达转基因FVB/J-ML-555和同基因型BALB/c-A2G的典型存活曲线在统计学上无差异(p>0.6)，因此显示了少量牛Mx1足以模拟由生理水平的小鼠Mx1产生的抗流感活性。
实施例9(参照图6)：实验室小鼠的甲型流感病毒H5N1感染导致表达boMx1-发动蛋白的小鼠间的死亡率低于表达moMx1-发动蛋白的小鼠间的死亡率
为了评估H5N1甲型流感病毒相关病状，在野生型FVB/J和BALB/c小鼠中，在同基因型BALB/c-A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的转基因小鼠中进行4.104 CCID50的适应的病毒原液的鼻内接种，每天监测它们的体重减轻或增长，进行1周(图6)。
身体状况在Mx-阴性品系(FVB/J和BALB/c)间恶化快得多，最终达到13至19%的体重减轻；Mx-阴性品系通常显示3天的中等存活持续时间。相反地，在转基因品系FVB/J-ML-549的小鼠间未发生明显的体重减轻。再次地，两个剩余的品系显示中间特征，同基因型BALB/c-A2G小鼠间的体重的连续减轻最终达到接种后7天约15%的减轻，并且对于低表达转基因小鼠为双峰特征，持续5天的连续减轻(-10%)和之后趋向恢复。这些病状特征与由各自Mx1同种型提供的身体状况的完全保护作用、部分保护作用和无保护作用是一致的。两个表达生理水平的小鼠和牛Mx的小鼠品系的比较确认了存活数据，并且强调了牛Mx1在抗-病毒活性方面的优越性。
实施例10(参照图7)：实验室小鼠的甲型流感病毒H5N1感染导致表达boMx1的小鼠间的肺病毒载量比表达moMx1的小鼠间的低
为了评估H5N1甲型流感病毒在小鼠肺中的复制速率，在野生型FVB/J和BALB/c小鼠中，在同基因型BALB/c-A2G小鼠中和在ML-555和ML-549品系的转基因小鼠中进行适应的病毒原液的4.104 CCID50的鼻内接种，从接种后(pi)3天直至接种后6天每天测定肺病毒滴度(图7)。为了进行滴定，将5只小鼠的肺在1ml PBS中进行匀浆，然后进行澄清。利用标准半数细胞培养感染剂量测定法将上清液用于病毒滴定。
为了测试“存活和病状的Mx-相关模式与病毒本身的抑制相关”这一假设，我们利用常规滴定来定量H5N1肺病毒载量。在接种后3天，FVB/J-ML549转基因小鼠中的肺H5N1感染性颗粒载量显著低于任何其它株系/品系。此外，在这些小鼠中到接种后5天(在该时间点上，BALB/c-A2G的肺仍然具有很重的载量)，病毒已被清除。总体上，牛Mx1的表达强劲地抑制了H5N1甲型流感病毒复制，从而允许在4天后消除感染，对于小鼠Mx1情况并非如此。
实施例11(参照图8)：牛Mx1的N末端区段增强人和牛Mx GED的抗流感活性
表达质粒
使用下列引物对：(i)5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQID NO：18)和5’-ACTGGAAAGCCCCAAAAT-3’(SEQ ID NO：19)(用于产生人MxA的N末端片段)，(ii)5’-CCTCGACTGTGCCTTCTA-3’(SEQ ID NO：20)和5’-AGAGAAGGAGCTGGAAGAAG-3’(SEQ ID NO：21)(用于产生人MxA的GED-编码片段)，(iii)5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID NO：22)和5’-GGATTGGAAGTAATGGTTTG-3’(SEQ ID NO：23)(用于产生牛Mx1的N末端片段)和(iv)5’-CCTCGACTGTGCCTTCTA-3’(SEQ IDNO：24)和5’-AGAGAAGGAGGCAGAAGAAG-3’(SEQ ID NO：25)(用于产生牛Mx1的GED-编码片段)，利用根据Wurch等人(1998)和Nagy等人(1996)(Wurch等人：A modified overlap extension PCR method tocreate chimeric genes in the absence of restriction enzymes.Biotechnology Techniques,12:653-657,1998.；Nagy等人：Assemblingand cloning genes for fusion proteins using reverse transcriptionone-step overlap extension PCR method.Anal Biochem 2006,351：311-313.)的重叠延伸PCR，从前述pcDNA4-boMx1和pcDNA4-huMxA构建编码嵌合牛/人(huN/GEDbo)和人/牛(boN/GEDhu)Mx蛋白的表达质粒。
Vero细胞的转导和感染
使用由50μl MEM、1μl Transfectin和50μl MEM组成的转染混合物，按照基本如制造商所描述的Transfectin技术进行转染，所述50μlMEM已包含各0.75μg的每一种质粒DNA(pcDNA4/TO-eGFP用作对照，pcDNA4-huMXA、pcDNA4-boMX1、pcDNA4-boN/GEDhu、pcDNA4-huN/GEDbo和pcDNA4/eGFP用作实验组)。简而言之，将Vero细胞接种在24孔板中，生长过夜至70%-80%的汇合。随后，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞3次，用200μl MEM/孔替换培养基，缓慢地将100μl转染混合物掺入每一个孔中。首先将猪H1N1甲型流感病毒株在Vero上生长以产生原液，将其等分，于–80°C贮存。通过将在补充有0.2%BSA和2μg/ml胰蛋白酶-TPCK的DMEM中稀释原液的等分试样来即时制备感染混合物。转染后24小时，用PBS充分洗涤细胞3次，将感染混合掺入每一个孔中，靶感染复数约为1。
Mx蛋白和甲型流感病毒的共检测
对转染-感染的Vero细胞进行双免疫标记以通过流式细胞术同时检测Mx蛋白和甲型流感病毒核蛋白(NP)。在感染后5小时，通过胰蛋白酶消化收获Vero细胞，将其以300g沉淀15分钟。将细胞在4°C用PBS中的4%(w/v)的多聚甲醛固定30分钟，在已向其中添加了0.2%(w/v)皂苷的PBS中进行透化，在室温下于PBS、0.2%皂苷和1%(w/v)BSA中封闭1小时。随后将细胞与一抗(即兔抗-huMXA和兔抗-boMx1抗血清以及抗-NP mAb)的混合物一起在37°C温育45分钟。在3个洗涤步骤后，将细胞与缀合有Alexa 467(NP)或488(Mx)的相关二抗一起在37°C温育。最后将免疫标记的细胞重悬浮于PBS中，利用BD-Canto流式细胞仪进行分析，对前向散射和侧向散射进行门控以排除碎片并且收集FL-1和FL-5中的荧光。获得最少104个事件，利用BDFACSDiva软件v4.1.1进行分析。
BoMx1 N末端区段增强人和牛GED的抗流感活性
鉴于在转染实验之间在非表达细胞间存在感染率的重现性(图8)，无论试验性掺入的质粒是什么，转染方法本身等同地影响转染的/感染的细胞群体。此外，由于表达eGFP的细胞的感染率倾向于高于非表达细胞的感染率，因此推断出转导方法本身不改变被研究的细胞制剂中的病毒生命周期。因此表达Mx的细胞群体间NP阳性细胞的系统性耗尽(p<0.05)可归因于Mx蛋白本身。在这些Mx蛋白当中，boMx1如所预期的引起最强的抑制。当将牛GED移植在人MxA的N末端区段上(嵌合huN/GEDbo)时，抗流感活性显著降低但未被抵制。相反地，当用牛Mx1的N末端区段置换人MxA的N末端区段(嵌合boN/GEDhu)时，抗流感活性得到显著增强。综合起来，收集的数据显示牛Mx1的N末端区段显著增强GED依赖性抗流感活性，这是本领域技术人员从现有技术绝对预料不到的。
实施例12(参照图9)：一窄亚组的Mx1发动蛋白的N末端区段包含独特的TRAF2/TRAF6结合基序
所有可获得的Mx序列的仔细的计算机检查导致在牛、绵羊和印度水牛Mx1发动蛋白的N末端区中插入的独特的六肽“PEEESE”(Pro-Glu-Glu-Glu-Ser-Glu；SEQ ID NO：9)的发现。该基序不存在于迄今已测序的所有其它Mx发动蛋白中。由于该反刍动物特异性六肽同时具有共有TRAF2结合基序pX(Q/E)E(SEQ ID NO：2)和共有TRAF6结合基序pXEXX(Ar/Ac)(SEQ ID NO：12)，因此其在理论上可用作TRAF2和TRAF6结合结构域。如果可在体内确认该计算机预测，则该六肽可赋予牛、绵羊和水牛Mx1一方面干扰连接TNF受体、白细胞介素-1受体(IL-1R)和Toll-样受体(TLR)超家族的转导级联，以及另一方面干扰存活/死亡途径和转录因子核因子-κB(NF-κB)和激活物蛋白-1(AP-1)的激活的能力。
TNF受体(TNFR)超家族由超过20个I型跨膜蛋白组成，所述跨膜蛋白被相应的TNF-样配体超家族特异性激活。TNFR的下游离细胞内调节剂是一组称为TNFR相关因子(TRAF)的蛋白质。在后者当中，TRAF 1、2、3和5识别TNFR并且通过不与TRAF6的基序重叠的保守序列基序与TNFR缔合(图9a)。从TNFR激活的存活和死亡途径的TRAF2依赖性调节包括许多分子级联，其中有细胞凋亡的细胞抑制剂(cIAP)、FLICE-抑制蛋白(FLIPs)和c-Jun N末端激酶(JNK)。
TRAF6是参与TNF受体超家族和IL-1R/TLR超家族的信号转导的唯一TRAF家族成员。IL-1R/TLR超家族的TRAF6信号转导途径包括一组在TRAF6上游的适体激酶，即IRAK1、IRAK2、IRAKM，其全都包含几个潜在的TRAF6结合结构域(图9b)。TRAF6还与TNFR家族成员RANK和CD40以及与激酶RIP2直接相互作用，这可激活NF-kB，从而诱导细胞死亡。
因此，TRAF2和TRAF6结合位点在前述小亚组Mx蛋白的N末端区段中的存在暗示着这类蛋白质可在介导一系列细胞过程(所述过程在存在任何其它Mx蛋白的情况下保持不变)中起着重要作用。
实施例13(参照图10)：牛Mx1发动蛋白结合TRAF2，然而PEEESE-缺陷Mx发动蛋白不结合
细胞培养和免疫沉淀—将野生型、表达huMxA的VA8、表达poMx1的VSK6和表达boMx1的V103细胞系培养在补充有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM中直至半汇合，随后将其与媒介物或多西环素(1μg/mL)接触，进行24小时。为了进行免疫沉淀，随后将细胞在4°C于改性RIPA缓冲液(包含0.5%(体积/体积)NP-40、0.1%(重量/体积)脱氧胆酸钠并且无SDS)中匀浆30分钟。在所有裂解物中都包含蛋白酶抑制剂混合物。为了进行TRAF2的内源免疫沉淀，将5×107个细胞与抗-TRAF2mAb一起温育4小时，然后用10μl蛋白G珠粒处理另外1小时。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀的复合物，用多克隆兔抗-huMxA和抗-boMx1抗血清的混合物来进行印迹。用缀合有HRP的猪抗-兔IgGF(ab′)2片段显示免疫复合物，用CN/DAB Substrate试剂盒检测过氧化物酶。
可重现性地从诱导的V103细胞，但未从诱导的表达人MxA(VA8)、猪Mx1(VSK6)或黑长尾猴Mx的(野生型Vero细胞)Vero细胞系回收到与boMx1一致的具有75kDa表观分子量的条带(图10)，这显示TRAF2有效地结合boMx1但不结合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。因此在一小亚组Mx蛋白中插入的独特TRAF2和TRAF6结合基序PEEESE能够在体内结合TRAF2，这产生了此类Mx蛋白与内源TRAF2分子的相互作用可在改变被感染性病毒破坏的细胞过程中起着重要作用的可能性。
实施例14(参照图11)：牛Mx1发动蛋白结合TRAF6，然而PEEESE缺陷Mx发动蛋白不结合
产生具有抑制TRAF2和TRAF6结合基序的两个单点突变(E356D和S358N)的boMx1发动蛋白DNA构建体。如先前对于表达Mx的克隆VA8、VSK6和V103的产生所描述的，产生当与多西环素接触时稳定地表达该构建体的Vero细胞克隆(V103mut)。
将表达黑长尾猴Mx、表达人MxA的VA8、表达猪Mx1的、表达牛Mx1的V103以及表达新的前述PEEESE缺陷突变型boMx1的V103mutVero细胞系培养在补充有胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM中直至半汇合，随后将其与媒介物或IFNα或多西环素(1μg/mL)接触，进行24小时。之后，除对于免疫沉淀用抗-TRAF6mAb替代抗-TRAF2mAb外，如实施例12中所述处理细胞。
可重现性地从诱导的表达boMx1的细胞(克隆V103)，但未从诱导的表达人MxA(克隆VA8)、猪Mx1(克隆VSK6)、黑长尾猴Mx的(野生型Vero细胞)或表达PEEESE缺陷牛Mx1(克隆V103mut)的Vero细胞系回收到与boMx1一致的具有75kDa表观分子量的条带(图11)，这显示TRAF6有效地结合boMx1但不结合缺乏PEEESE六肽的Mx蛋白。
因此在一小亚组Mx蛋白中插入的独特TRAF2和TRAF6结合基序PEEESE能够在体内结合TRAF6，这产生了此类Mx蛋白与内源TRAF6分子的相互作用可在改变被感染性病毒破坏的细胞过程中起着重要作用的可能性。
实施例15(参照图12)：缺乏其天然TRAF2/TRAF6结合结构域的突变型牛Mx1发动蛋白在用甲型流感病毒H5N1株感染的Vero细胞中显示出显著减小的抗甲型流感病毒活性
在本实施例中，由野生型智人和牛Mx1同种型的表达或由TRAF2和TRAF6结合位点缺陷型牛Mx1的表达赋予的对甲型流感病毒复制的抗性的程度，通过测量由不表达或表达所述Mx1同种型的Vero细胞单层产生的48小时的甲型流感病毒产量来确定。用于该组实验的Vero细胞克隆是前述细胞克隆，即克隆VA8（对于人Mx1）、克隆V103（对于牛Mx1）和克隆V103mut（对于突变型（PEEESE缺陷）boMx1）。
在本研究中使用高致病性禽H5N1甲型流感病毒(A/crested_eagle/Belgium/1/2004)。繁殖病毒，将原液在胚化期鸡蛋中生长，利用标准半数组织培养感染剂量测定法测定其滴度。为了进行感染，首先将原液等分试样在补充有0.2% BSA的DMEM中稀释。即时制备系列稀释物以产生具有适当感染复数的体积匹配的接种物，将其掺入诱导的(多西环素)或非诱导的(媒介物)V103、V103mut和VA8细胞单层，靶感染复数为0.1和1。感染后，使接种物在37°C吸附60分钟，然后通过用PBS充分洗涤将其除去。随后将培养物在37°C于不含多西环素的DMEM中进行温育。在于37°C温育48小时后，对培养物上清液进行取样，按一式三份利用标准半数组织培养感染剂量测定法在鸡成纤维细胞上测定病毒滴度。利用Reed-Muench法计算所有滴度。
在其中实验条件被严格标准化的本实验设置中，由3种Mx同种型带来的抗流感活性明显不同(图12)。野生型牛Mx1的表达对甲型流感病毒复制的抑制为突变型TRAF2和TRAF6结合位点缺陷牛Mx1的表达或野生型人MxA的表达对甲型流感病毒复制的抑制的约10000倍。因此TRAF2和TRAF6结合位点可用作GED依赖性抗流感活性的强增强子，这是本领域技术人员不能预测的。
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Claims (25)

1.用于预防性和/或治疗性治疗哺乳动物的甲型流感病毒诱发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域的Mx蛋白的基因。
2.权利要求1的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由Mx1蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
3.权利要求1的多核苷酸，其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列由人Mx1(MxA)蛋白或其具有至少95%的同一性的衍生物代表。
4.权利要求1至3的任一项的多核苷酸，用于预防性和/或治疗性治疗人类中由甲型流感病毒诱发的疾病。
5.权利要求1至4的任一项的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，优选P-X-Q/E-X-X-E/D代表。
6.权利要求1至5的任一项的多核苷酸，其中所述TRAF2结合结构域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6结合结构域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。
7.权利要求1至6的任一项的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由P-X-E-X-X-E，优选由P-X-E-E-X-E，更优选由P-E-E-E-X-E以及最优选由P-E-E-E-S-E代表。
8.权利要求1至7的任一项的多核苷酸，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列SEQ ID NOs：26-77之任一项代表。
9.权利要求1至8的任一项的多核苷酸，其编码图15中显示的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
10.用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有6至50个氨基酸残基的长度并且具有序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，优选P-X-Q/E-X-X-E/D的肽。
11.权利要求10的多核苷酸，其中所述序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-Q/E-X-X-D或P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W。
12.权利要求10或11的多核苷酸，其中所述序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W是P-X-E-X-X-E，优选是P-X-E-E-X-E，更优选是P-E-E-E-X-E以及最优选是P-E-E-E-S-E。
13.用于基因治疗的载体，包含权利要求1至12的任一项中定义的多核苷酸。
14.由权利要求1至12的任一项中定义的多核苷酸编码的多肽或肽，其用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病。
15.具有减弱的对甲型流感病毒的易感性的非人转基因动物，其包含权利要求10至12的任一项中定义的多核苷酸作为表达的转基因。
16.具有减弱的对甲型流感病毒的易感性的非人转基因动物，其表达编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域；条件是该动物不属于灵长目、牛科(牛属、印度水牛、Ovis)、鳍脚目或啮齿目的分类组。
17.用于产生具有减弱的对甲型流感病毒的易感性的非人转基因动物的方法，包括步骤：
引入编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域；或
将TRAF2和/或TRAF6结合结构域引入编码Mx蛋白的内源基因；
其中所得的动物表达编码Mx蛋白的基因，所述Mx蛋白具有TRAF2和/或TRAF6结合结构域;
条件是所述动物不属于灵长目、牛科(牛属、印度水牛、Ovis)、鳍脚目或啮齿目的分类组。
18.权利要求16或17的动物或方法，其中编码所述Mx蛋白的基因是内源Mx基因或引入的转基因。
19.权利要求16至18的任一项中的动物或方法，其中所述动物选自原鸡属(鸡)、火鸡属(火鸡)、鸭科(鸭、鹅)、猪属(猪)、马属(马)和斑鳟属(鲑鱼)。
20.权利要求16至19的任一项中的动物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列P/S/T/C/I/A-X-Q/E-X-X-E/D/Y/F/W或P-X-Q/E-E，优选P-X-Q/E-X-X-E/D代表。
21.权利要求16至20的任一项中的动物或方法，其中所述TRAF2结合结构域由氨基酸序列P-X-Q/E-E或P-X-Q/E-X-X-D代表并且TRAF6结合结构域由氨基酸序列P-X-E-X-X-D/E/Y/F/W代表。
22.权利要求16至21的任一项中的动物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由P-X-E-X-X-E，优选由P-X-E-E-X-E，更优选由P-E-E-E-X-E以及最优选由P-E-E-E-S-E代表。
23.权利要求16至22的任一项中的动物或方法，其中所述TRAF2和/或TRAF6结合结构域由序列SEQ ID NOs：26-77之任一项代表。
24.权利要求16至23的任一项的动物或方法，其中除TRAF2和/或TRAF6结合结构域外的Mx蛋白序列不是牛Mx1蛋白，并且优选与牛Mx1蛋白具有低于95%的同一性，更优选具有低于90%的同一性。
25.将非肽测试化合物鉴定为用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的候选化合物的方法，包括在所述测试化合物存在或不存在的情况下检查TRAF2和/或TRAF6对权利要求13中定义的多肽或肽的结合的步骤，其中在所述测试化合物存在的情况下减少的结合表示所述测试化合物能够抑制甲型流感病毒的生命周期，从而适合作为用于预防性和/或治疗性治疗甲型流感病毒诱发的疾病的候选化合物。
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