CN102890085B - 一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液及其在固相合成比伐芦定中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成，溶液的溶剂为水、乙醇、或水和乙醇的混合溶剂。该检测溶液应用在检测树脂上的游离氨基时，比传统的Kaiser检测溶液具有更高的灵敏度和准确度。该检测溶液避免使用剧毒的氰化钾和具有恶臭味的吡啶。在固相法合成抗凝药物比伐芦定的缩合反应中，应用本发明检测反应终点可以明显提高合成收率。
Description
技术领域
本发明涉及一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液及其用于固相合成多肽反应终点的检测方法，尤其是固相合成多肽药物比伐芦定的反应终点的检测。
背景技术
比伐芦定(Bivalirudin)是一种人工合成的由20个氨基酸组成的多肽，其氨基酸序列为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，化学名称为：D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-天冬酰胺酰-甘氨酰-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸，分子式C98H138N24O33，CAS号128270-60-0。它是水蛭素的衍生物，具有抑制凝血酶的活性。比伐芦定最早由Biogen公司研发，后由美国The MedicinesCompany公司开发作为经皮冠状动脉成形术(PCI)中的抗凝剂，美国上市产品商品名为
美国专利US5196404和中国专利申请CN200580043573.1、CN200610024611.5、CN200810008131.9、CN200910051311.X分别报道了利用固相多肽合成法制备比伐芦定的技术。
在固相合成法制备比伐芦定过程中，每一步各氨基酸缩合反应的完全转化对收率有重要的影响。因为多步的串联反应中，每步收率的微小下降会导致最终收率的大幅下降。但如果在反应终点后继续延长反应时间，有可能导致消旋等副反应的增加，同样影响最终的收率。因此，监控和判断缩合反应的终点是固相合成比伐芦定以及其他氨基酸较多的多肽的关键之一。
在判断固相多肽合成的缩合反应终点时，使用最广的是Kaiser检测溶液测试法(王德心编，化学工业出版社，《固相有机合成：原理及应用指南》，第三章第五节，2004年9月出版；田少雷等，多肽固相合成中茚三酮定量监测法的改进，化学通报，1991年04期，38-39；E.Kaiser等，Color test for detection of freeterminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides，Anal.Biochem.1970，34，595-598)。水合茚三酮可与游离氨基发生一系列反应，生成有颜色的化合物。该方法灵敏度较高，大多数情况下仅凭肉眼观察，就可以达到定量判断缩合反应终点的效果。
在利用显色反应检测氨基的文献中，实际上常使用的是水合茚三酮(ninhydrin)。在强化脱水的条件下，水合茚三酮可以转化为茚三酮(1，2，3-indantrione)。本发明所使用的化合物均是水合茚三酮(ninhydrin)。
茚三酮(1，2，3-indantrione) 水合茚三酮(ninhydrin)
经典的Kaiser检测溶液包括以下三种溶液：(1)5克水合茚三酮与100mL乙醇的混合溶液；(2)80克苯酚与20mL乙醇的混合溶液；(3)2mL 0.001mol/L氰化钾的水溶液与98mL吡啶的混合溶液。使用时各取三种溶液2至3滴溶液，与待测样品混合，在100至120℃之间加热约5分钟。不存在游离氨基时，样品保持原来的颜色，如果存在很少量的游离氨基，大部分氨基酸会出现明显的蓝色，少数氨基酸呈现其他颜色，凭肉眼即可观察。
上述的茚三酮检测试剂，根据文献报道其作用机理为，氰化钾提供的氰离子作为还原剂，催化有色物质的生成(Hyman Rosen，Archives of Biochemistry andBiophysics，1957，Volume 67，Issue 1，Pages 10-15；Walter Troll等，The Journal ofBiological Chemistry，1953，Volume 200，Issue 2，Pages 803-811)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成。当用于监测固相合成多肽的反应终点时，其检测游离氨基的灵敏度和准确度高于传统Kaiser检测溶液(由水合茚三酮、苯酚、氰化钾和吡啶组成)，更易于判断各氨基酸在缩合反应中的完全转化，对提高固相合成多肽的收率具有显著的作用。
本发明的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成。
上述溶液的溶剂为乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂，优选水和乙醇的混合溶剂。
上述检测溶液中，水合茚三酮的浓度为0.5％～10％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有0.005g～0.1g的水合茚三酮；铁氰化钾的浓度为0.1％～2％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有0.001g～0.02g的铁氰化钾；苯甲酸的浓度为0.001％～1％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有1×10-5g～1×10-2g的苯甲酸。
上述检测溶液中，水合茚三酮的浓度优选为4％～5％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有0.04g～0.05g的水合茚三酮。
上述检测溶液中，铁氰化钾的浓度优选为0.4％～0.5％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有0.004g～0.005g的铁氰化钾。
上述检测溶液中，苯甲酸的浓度优选为0.01％～0.1％(w/v，g/mL)，即1mL溶剂中含有1×10-4g～1×10-3g的苯甲酸。
一种上述检测溶液的制备方法：将一定重量的水合茚三酮溶于一定体积的溶剂中，制得溶液A；将一定重量的铁氰化钾溶于一定体积的溶剂中，制得溶液B；将一定重量苯甲酸溶于一定体积的溶剂中，制得溶液C；取一定体积溶液A、溶液B和溶液C混合均匀，得到上述浓度的检测溶液；其中，溶液A和溶液C的溶剂优选为乙醇，溶液B的溶剂优选为水，所得检测溶液的溶剂优选为水和乙醇的混合溶剂。
其中，水合茚三酮，英文名：Ninhydrin，分子式：C9H6O4，CAS号为485-47-2；铁氰化钾，英文名：Potassium Ferricyanide，分子式：C6FeK3N6，其CAS号为13746-66-2；苯甲酸，英文名：Benzoic Acid，分子式：C7H6O2，其CAS号为65-85-0。
w/v是指溶质的重量(w)与溶剂的体积(v)之比，其中w的单位为“克”，简写为“g”；v的单位为“毫升”，简写为“mL”；如浓度为1％(w/v)的溶液，是指1g溶质溶解于100mL的溶剂中形成的溶液，本发明的溶质包含水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸等，溶剂包含乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂等。
固相合成多肽是指将单个氨基酸或者多个氨基酸组成的多肽片段连在固相载体上，通过化学合成的方法，进行氨基酸缩合反应，以最终得到目标多肽的方法，所述的固相载体通常是指各种树脂，如Wang树脂等。本发明的检测溶液用于氨基酸缩合反应中，判断树脂上各氨基酸在合成多肽或多肽片段过程中的缩合反应是否进行完全。
一种监测固相合成多肽反应终点的检测方法：取少量载有多肽的树脂到容器中，加入一定量的检测溶液，置于100℃～110℃中加热5分钟，取出观察，若溶液和/或树脂呈现蓝色(个别多肽呈现红棕色或其他颜色)，表明缩合反应未完全，如果树脂和溶液呈现无色或树脂本身的颜色，如淡黄色，表示缩合反应完全。
待测树脂上的游离氨基与水合茚三酮反应生成有色物质的反应，需要适当加热才会发生，常用的加热温度为90℃～120℃，为了实现快速检测，通常选择100℃以上，升温时间和保温时间合计仅需几分钟，即可达到满意的显色效果，为了方便操作，推荐的加热温度范围100℃～110℃，升温时间和保温时间共计4～6分钟。
本发明所述检测溶液相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
发明人在固相多肽合成的研究中通过大量的实验意外的发现，得到一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成，溶液的溶剂选择为水、乙醇，或水和乙醇的混合溶剂等常规溶剂即可，避免了毒性物质KCN和具有恶臭味溶剂吡啶的使用；在固相合成多肽实践中发现，该检测溶液比传统的Kaiser检测溶液更灵敏，能够更准确地反映缩合反应的终点。
本发明提供的检测溶液可以避免使用剧毒的氰化钾试剂。根据2011年03月02日颁布的国务院令第591号《危险化学品安全管理条例》修订版的规定，氰化钾的购买、运输、保存和使用需要特殊的专业资格，并受到严格的管制。这导致使用氰化钾需要付出额外的审批时间和管理成本。而氰化钾本身在水溶液或者潮湿的空气中容易发生复分解反应、水解反应和氧化反应，长期存放容易变质。本发明使用的铁氰化钾的稳定性相对提高，而且毒性很低，属非管制危险化学品。
本发明检测溶液，经发明人用于大量固相合成多肽实践中予以筛选和验证，优选得到检测溶液中水合茚三酮的浓度为0.5％～10％(w/v，g/mL)，特别是4％～5％(w/v，g/mL)；铁氰化钾的浓度为0.1％～2％(w/v，g/mL)，特别是0.4％～0.5％(w/v，g/mL)；苯甲酸的浓度为0.001％～1％(w/v，g/mL)，特别是0.01％～0.1％(w/v，g/mL)；将优选得到的检测溶液用于固相合成多肽比伐芦定的缩合反应中发现，比传统的Kaiser检测溶液更灵敏，能够更准确地反映缩合反应的终点，对比实验结果显示，应用本发明的检测试剂能够显著提高比伐芦定的合成收率。
本发明检测溶液可有效用于监测固相合成多肽反应终点的检测，提高固相合成多肽产品的收率，降低生产成本，可以广泛用于多肽及其他含有氨基酸的物质的工业化生产，具有重要意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。
实施例1检测溶液的组成及配制方法
检测溶液的组成及配制方法：称取2.5g分析纯水合茚三酮到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL乙醇，摇匀溶解，得A溶液；称取2.5g分析纯铁氰化钾到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL蒸馏水，摇匀溶解，得B溶液；称取0.15g分析纯苯甲酸到125mL棕色试剂瓶内，加入100mL乙醇，摇匀溶解，得C溶液。
使用前取A溶液0.5mL，B溶液和C溶液各0.05mL进行混合，得到检测溶液；该检测溶液中：水合茚三酮的浓度为4.17％(w/v)；铁氰化钾的浓度为0.42％(w/v)；苯甲酸的浓度为1.25×10-2％(w/v)。
实施例2检测溶液的组成及配制方法
检测溶液的组成及配制方法：称取3.0g分析纯水合茚三酮到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL乙醇，摇匀溶解，得A溶液；称取3.0g分析纯铁氰化钾到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL蒸馏水，摇匀溶解，得B溶液；称取1.2g分析纯苯甲酸到125mL棕色试剂瓶内，加入100mL乙醇，摇匀溶解，得C溶液。
使用前取A溶液0.5mL，B溶液和C溶液各0.05mL进行混合，得到检测溶液；该检测溶液中：水合茚三酮的浓度为5.0％(w/v)；铁氰化钾的浓度为0.5％(w/v)；苯甲酸的浓度为0.1％(w/v)。
实施例3检测溶液的组成及配制方法
检测溶液的组成及配制方法：称取2.4g分析纯水合茚三酮到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL乙醇，摇匀溶解，得A溶液；称取2.4g分析纯铁氰化钾到125mL棕色试剂瓶内，加入50mL蒸馏水，摇匀溶解，得B溶液；称取0.12g分析纯苯甲酸到125mL棕色试剂瓶内，加入100mL乙醇，摇匀溶解，得C溶液。
使用前取A溶液0.5mL，B溶液和C溶液各0.05mL进行混合，得到检测溶液；该检测溶液中：水合茚三酮的浓度为4.0％(w/v)；铁氰化钾的浓度为0.4％(w/v)；苯甲酸的浓度为1.0×10-2％(w/v)。
实施例4固相合成比伐芦定及Kaiser检测溶液在固相合成比伐芦定中的应用
参照CN200810008131.9实施例1固相合成比伐芦定的方法制备比伐芦定，具体制备步骤如下：
(1)、C端第1个氨基酸对-烷氧基苯甲醇(Fmoc-Leu-Wang)树脂的脱保护
(a)称取Fmoc-Leu-Wang树脂置于硅烷化的玻璃反应器中，每1g树脂加DMF 3mL～7mL，使树脂完全浸入其中，溶胀25～60分钟；
(b)抽滤掉DMF，在树脂中加入3mL～7mL浓度为15％～25％哌啶/溶剂，轻微振荡下反应3～10分钟，抽滤掉反应液后，再加入3mL～7mL浓度为15％～25％哌啶/溶剂，轻微振荡下反应10～20分钟，抽去反应液；
(c)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出约10mg树脂放入小玻璃试管中，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(Kaiser检测溶液，加入量为下述组成Kaiser试液的溶液A′、溶液B′和溶液C′各2～3滴)，100℃～110℃下加热4～6分钟，溶液和树脂呈深蓝色，说明脱除Fmoc完全；
(2)、C端第二个氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH与H2N-Leu-Wang树脂的偶联
反应式如下：
称取原料：Fmoc-Tyr(tBu)-OH：是树脂负载量的2～5倍；
DIC：是树脂负载量的2～5倍；
HOBt：是树脂负载量的2～5倍；
(a)将称取的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和HOBt溶于3～7mL DMF中，加入到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应30～60分钟；
(b)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出约10mg树脂放入小玻璃试管中，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(Kaiser检测溶液，加入量为下述组成Kaiser试液的溶液A′、溶液B′和溶液C′各2～3滴)，100℃～110℃下加热4～6分钟，溶液和树脂呈无色或树脂本身的淡黄色，说明缩合反应完全后，按照多肽氨基酸连接顺序，进行下一个氨基酸的缩合；
(3)、C端第3～20个氨基酸的依次缩合
按照上述步骤1、2的方法，分别将第3～20个氨基酸依次缩合，完成20个氨基酸的缩合反应；
第3～20个氨基酸的称取量均为树脂负载量的2～5倍；
(4)、最终产物20个氨基酸肽Fmoc保护剂的脱除
裂解干燥至恒重的肽树脂10g，加入100mL裂解液(95％TFA：2.5％TIS：2.5％H2O)，室温下反应2h，将裂解液滴入到1000mL冰冷的乙醚中沉淀，离心洗涤几遍粗品，真空干燥至恒重，得比伐芦定粗品，粗品进行进样分析。比伐芦定粗品的分析采用CN200810008131.9公开的HPLC方法。
采用Kaiser检测溶液用于缩合反应的终点判断，所得比伐芦定粗品收率约68％，纯度80％。
Kaiser检测溶液的组成及配制方法：(1)称取5克水合茚三酮到125mL棕色试剂瓶内，与50mL乙醇，摇匀溶解，得溶液A′；(2)称取80克苯酚到125mL棕色试剂瓶内，加入20mL乙醇，摇匀溶解，得溶液B′；(3)量取2mL的0.001mol/L氰化钾的水溶液，加入到98mL吡啶，得溶液C′。
其中，上述固相合成方法中，，各试剂及载体的缩写为如下定义：
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| DIC | N，N-二异丙基碳二亚胺 |
| tBu | 叔丁基 |
| TFA | 三氟醋酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| MeOH | 甲醇 |
| ● | Wang树脂 |
实施例5本发明的检测试剂在固相合成比伐芦定中的应用
按照实施例4的方法合成比伐芦定，在实施例4步骤(1)(c)、(2)(b)和(3)分别取出约10mg树脂放入小试管里，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(实施例4的Kaiser检测溶液用本发明实施例1的检测溶液代替，加入量约0.6mL)，置于100～110℃中加热5分钟，当溶液和树脂呈现无色或树脂本身的淡黄色，表示缩合反应完全。采用该检测溶液用于缩合反应的终点判断，所得比伐芦定粗品收率为92％，纯度91％。
实施例6本发明的检测试剂在固相合成比伐芦定中的应用
按照实施例4的方法合成比伐芦定，在实施例4步骤(1)(c)、(2)(b)和(3)分别取出约10mg树脂放入小试管里，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(实施例4的Kaiser检测溶液用本发明实施例2的检测溶液代替，加入量约0.6mL)，置于100～110℃中加热5分钟，取出小试管观察，当溶液和树脂呈现无色或树脂本身的淡黄色，表示缩合反应完全。采用该检测溶液用于缩合反应的终点判断，所得比伐芦定粗品收率为90％，纯度89％。
实施例7本发明的检测试剂在固相合成比伐芦定中的应用
按照实施例4的方法合成比伐芦定，在实施例4步骤(1)(c)、(2)(b)和(3)分别取出约10mg树脂放入小试管里，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(实施例4的Kaiser检测溶液用本发明实施例3的检测溶液代替，加入量约0.6mL)，置于100～110℃中加热5分钟，取出小试管观察，当溶液和树脂呈现无色或树脂本身的淡黄色，表示缩合反应完全。采用该检测溶液用于缩合反应的终点判断，所得比伐芦定粗品收率为92％，纯度90％。
实施例8“铁氰化钾替换氰化钾的Kaiser试液”在固相合成比伐芦定中的应用
按照实施例4的方法合成比伐芦定，在实施例4步骤(1)(c)、(2)(b)和(3)分别取出约10mg树脂放入小试管里，用乙醇洗涤2～3遍，倾去乙醇，加入一定量检测溶液(实施例4的Kaiser检测溶液用“铁氰化钾替换氰化钾的Kaiser试液”代替，加入量为下述组成“铁氰化钾替换氰化钾的Kaiser试液”的溶液A″、溶液B″和溶液C″各2～3滴)，置于100～110℃中加热5分钟，取出小试管观察，当溶液和树脂呈现无色或树脂本身的淡黄色，表示缩合反应完全。采用该检测溶液用于缩合反应的终点判断，所得比伐芦定粗品收率约65％，纯度79％。
“铁氰化钾替换氰化钾的Kaiser试液”的组成及配制方法：(1)称取5克水合茚三酮到125mL棕色试剂瓶内，与50mL乙醇，摇匀溶解，得溶液A″；(2)称取80克苯酚到125mL棕色试剂瓶内，加入20mL乙醇，摇匀溶解，得溶液B″；(3)量取2mL的0.001mol/L铁氰化钾的水溶液，加入到98mL吡啶，得溶液C″。
从上述实施例发现，实施例5～7实验结果证明当本发明实施例1～3的检测溶液分别用于固相合成比伐芦定缩合反应终点的检测时，因该检测溶液判断缩合反应终点灵敏度和准确度明显高于Kaiser试液，显著提高了比伐芦定粗品收率和纯度；从实施例4和8实验结果可以得出，用铁氰化钾简单替换氰化钾后，用于固相合成比伐芦定缩合反应终点的检测时，比伐芦定粗品收率和纯度相当，说明铁氰化钾替换氰化钾的Kaiser试液与Kaiser试液的检测结果基本一致，其灵敏度和准确度明显差于本发明的检测溶液。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，由水合茚三酮、铁氰化钾和苯甲酸的溶液组成，溶液的溶剂为乙醇、水、或水和乙醇的混合溶剂，1mL溶剂中含有0.005g～0.1g的水合茚三酮；1mL溶剂中含有0.001g～0.02g的铁氰化钾；1mL溶剂中含有1×10-5g～1×10-2g的苯甲酸。
2.如权利要求1所述的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，1mL溶剂中含有0.04g～0.05g的水合茚三酮。
3.如权利要求1～2任一权利要求所述的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，1mL溶剂中含有0.004g～0.005g的铁氰化钾。
4.如权利要求1～2任一权利要求所述的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，1mL溶剂中含有1×10-4g～1×10-3g的苯甲酸。
5.如权利要求3所述的一种监测固相合成多肽反应终点的检测溶液，其特征在于，1mL溶剂中含有1×10-4g～1×10-3g的苯甲酸。
6.一种监测固相合成多肽反应终点的检测方法，其特征在于：取固相合成中载有多肽的树脂到容器中，加入如权利要求1～5任一权利要求所述的检测溶液，置于100℃～110℃中加热5分钟，如果溶液和树脂呈现无色或树脂本身的颜色，表示缩合反应完全。
7.如权利要求6所述的一种监测固相合成多肽反应终点的检测方法，其特征在于：所述多肽为比伐芦定。
8.一种固相合成比伐芦定的方法，其特征在于：使用权利要求1～5任一权利要求所述的检测溶液用于检测氨基酸缩合反应是否进行完全。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101880311A (zh) * | 2010-05-28 | 2010-11-10 | 吉林大学 | 提高多肽固相合成效率的二甲苯溶剂配方及应用 |
| CN102072846A (zh) * | 2010-12-06 | 2011-05-25 | 贵州神奇药业股份有限公司 | 复方氨基酸（8）维生素（11）胶囊的质量检测方法 |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102890085A (zh) | 2013-01-23 |
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