CN102863521A - 高分子量谷蛋白亚基优异等位变异g330e的鉴定及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高分子量谷蛋白亚基优异等位变异G330E的鉴定及其应用。具体而言，本发明涉及氨基酸序列为SEQ ID NO：2的HMW-GS优异等位变异G330E蛋白、其获得方法、其全长编码区序列及其应用。本发明还测定了G330E对面粉加工品质的影响作用，测定结果显示G330E对面粉的加工品质具有明显的正向作用。

Description

高分子量谷蛋白亚基优异等位变异G330E的鉴定及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，本发明涉及HMW-GS优异等位变异G330E基因的编码序列、该基因编码的蛋白质与其在改良小麦加工品质方面的应用。

背景技术

小麦是我国最主要的粮食作物之一，其产量和消费量均居世界首位。小麦面粉加水后具有特殊的制面特性，面团既具有弹性又具有延展性，可以被用来加工成各种食品，如：面包、面条、饼干和糕点，因此关于小麦加工品质的研究一直备受各国研究者的重视。目前的研究已显示：小麦籽粒中蛋白的含量及其组成对品质有着非常重要的影响。小麦籽粒蛋白主要包括两部分：与代谢相关的清蛋白和球蛋白，与品质密切相关的面筋蛋白(gluten)。根据在不同溶液中溶解性的差异和结构的特点，面筋蛋白又分为醇溶蛋白、高分子量谷蛋白亚基和低分子量谷蛋白亚基。醇溶蛋白主要影响面团的延展性，而谷蛋白亚基主要影响面团的弹性，同时对延展性也有影响(Payne，1987；Shewry等，1992，1995)。其中高分子量谷蛋白亚基的类型和组成对品质的作用最大，因此世界各国关于其遗传学和功能学的研究也最多，并且取得了很大的进展。

在普通小麦(2n＝6x＝42)中，高分子量谷蛋白亚基由位于第一染色体组长臂上的Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1三个位点编码，每个位点内存在两个基因，一个编码分子量较小的y-型亚基，另一个则编码分子量较大的x-型亚基(Payne，1987)。由于等位基因沉默现象的发生，在普通小麦中往往只有4-5个表达。根据在SDS-PAGE上蛋白迁移率的不同，许多高分子量谷蛋白亚基的等位变异被分离和鉴定出来，并且根据其对品质的作用进行了评分。例如，Glu-D1位点的1Dx5+1Dy10亚基组合对面筋的强度和面团的弹性具有很大的正向作用，被认为是最优异的亚基组合之一(Payne，1987；Wieser and Zimmermann，2000)，在欧美国家优质小麦品种中的出现频率很高。同时Glu-A1位点的1Ax1(Wang等2010)和1Ax2*(Payne等，1987)也被证明对品质有明显的正向影响，Glu-B1位点的1Bx14+1By15和1Bx17+1By18对面团的延展性和弹性有积极作用(Li等，2004；Xu等，2006；Branlard等，2001，刘丽等，2003)。这些已经被证明的HMW-GS的优异等位变异，其中的一部分已经被申请了专利保护。为了扩展HMW-GS编码基因的遗传资源，国内外的很多研究者从小麦的各种近缘种中也分离和克隆了许多HMW-GS的等位基因，但是由于小麦遗传转化技术的困难，这些推测对品质具有正向作用的亚基并不能很快的应用到小麦育种中。在提高小麦品质的研究方面，国内外仍存在着优异等位变异稀少的困境。

我国小麦的品质改良起步于上世纪80年代末，较国外的研究明显落后，经过近20年的研究，已经取得了很大进展。例如制定了小麦品质区化方案，明确了各区优质麦的方向，并培育出了许多含有优良亚基组合和较好生产适应性的优质品种(何中虎等，2005)。强筋和强中筋小麦：小偃系列的小偃54和小偃81，含有1Bx14+1By15优质亚基组合；济麦20，含有1Bx13+1By16优质亚基组合，藁优9409和中优9507则含有1Dx5+1Dy10优质亚基组合(吴学旭等，2009；刘凤云等，2007)。此外还有弱筋优质小麦扬麦13、扬麦14和豫麦50等，这些适用于制作饼干和糕点。但是与国外的优质品种相比，我国优质小麦的仍存在如下差距：优质亚基组合的含量相对较低，如1A位点1Ax1和1Ax2*等；蛋白含量和湿面筋含量虽然较高，但是面粉的面团质量相对较差；在面包品质上，面团烘烤体积小、弹性差、质地不够理想(魏益民等，2004；吴学旭等，2009)。因此改良小麦的HMW-GS亚基组成，在提升小麦品质和促进小麦遗传改良的进步是非常必要的。

目前国内外的研究者已经申请了一些利用高分子量麦谷蛋白亚基基因改良小麦面粉加工面包性能的专利。如国外的专利WO9725419，专利WO9807747，专利WO9808607和专利WO9903985，这4项专利均是采用遗传转化的手段把优质亚基(1Ax，1Dx5或1Dy10等)导入到普通小麦中或非麦类植物中，达到改良小麦面粉的面包的烘烤品质和面团的弹性或者改良非麦类植物籽粒的终用途。国内专利，如公开号为CN 1428351A专利，该专利涉及小偃54中HMW-GS 1Bx14的编码区、启动子和特异性分子标记；公开号为CN1621412的专利涉及小偃54中HMW-GS 1By15及其编码基因与应用。目前为止还没有通过EMS化学诱变的方法使HMW-GS 1Ax1发生点突变，从中选择优异等位变异，提高HMW-GS亚基对品质的正向作用，并近而提高加工小麦品质的专利申请。

参考文献

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发明内容

本发明中我们以优质小麦品种小偃54(HMW-GS组成：1Ax1，1Bx14+1Bx15，1Dx2+1Dy12)为材料，采用一定浓度的EMS进行化学诱变，然后采用SDS-PAGE分析诱变后代的HMW-GS组成，获得一个1Ax1亚基分子量变大的突变体。

本发明利用分子克隆技术，从突变体的基因组中得到了该编码基因的编码区全长序列，与野生型1Ax1亚基的核酸序列相比，发现仅在989bp处核苷酸G突变为了A，从而导致推导的蛋白序列中第330位的氨基酸由甘氨酸(G)变为谷氨酸(E)，我们由此命名为G330E。

本发明为了证明该突变位点确实能够造成亚基的迁移率变慢，利用DNA重组技术，采用原核表达的方法，将该突变体的成熟编码蛋白表达后进行SDS-PAGE，发现其迁移率与突变体种子中的1Ax1亚基一致，明显慢于野生型1Ax1亚基。

本发明还将突变体与野生型回交4代，然后自交3代后，得到了遗传背景一致，但只有1Ax1亚基不同的遗传材料BC₄F₃(普通小麦，Triticumaestivum)，该材料已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期为2011年6月21日，保藏编号为CGMCC No.4973。通过测定突变体和野生型连续3年的面粉蛋白特性、粉质仪参数和拉伸仪参数，发现突变体G330E的品质参数明显优于野生型，烘烤的面包体积也明显变大。本发明达到了使优质小麦小偃54品质更优的目的。

因此，本发明一方面涉及一种HMW-GS优异等位变异G330E蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面涉及一种多核苷酸，其编码权利要求1所述HMW-GS优异等位变异G330E蛋白。本领域技术人员可根据蛋白的氨基酸序列以及目的宿主细胞的密码子偏好性设计多核苷酸的编码序列。优选地，编码本发明的HMW-GS优异等位变异G330E蛋白的多核苷酸序列可以是如SEQID NO：1所示的序列。

本发明又一方面涉及HMW-GS优异等位变异G330E蛋白或其编码多核苷酸在制作具有改良品质的食品中的应用。本领域技术人员可以根据需要方便地表达本发明的蛋白并将其用于制作具有改良品质的食品。例如，本发明的蛋白可通过原核宿主细胞进行表达。本领域技术人员也可以用本发明的多核苷酸产生转基因植物，例如小麦转基因植物，并从中收获种子，进而制作具有改良品质的食品。

本发明又一方面涉及一种获得HMW-GS优异等位变异蛋白的方法，其中包括用EMS处理小麦种子的步骤。优选地，该方法还包括测量1Ax1亚基迁移率的步骤。优选地，该方法包括鉴定并获得1Ax1亚基迁移率变慢的突变体，进而通过本领域已知的方法进行分析，从而获得HMW-GS优异等位变异蛋白，例如G330E蛋白。

本发明又一方面涉及一种小麦面粉，其含有本发明的HMW-GS优异等位变异G330E蛋白。本发明还涉及用这样的小麦面粉制作的食品。

本发明的优异等位变异G330E的品质在多方面具有显著改善，例如蛋白含量、粉质仪、拉伸仪参数和烘烤的面包体积等方面。

附图说明

图1：G330E编码基因特异的PCR扩增。

图2：G330E原核表达载体图谱。

图3：G330E原核表达蛋白和种子中麦谷蛋白亚基的SDS-PAGE，其中：1.小偃54种子麦谷蛋白；2.G330E种子麦谷蛋白；3.G330E基因非诱导对照；4.G330E基因经IPTG诱导表达蛋白。

附表说明：

表1：G330E编码基因序列六次克隆与野生型1Ax1亚基的比较结果。

表2：G330E优异等位变异与野生型小麦小偃54品质性状的分析。

序列说明：

SEQ ID NO.1：G330E编码基因的全长序列。

SEQ ID NO.2：G330E的蛋白序列。

生物材料的保藏信息：

通过本发明的方法获得的G330E的BC4F3种子G330E-BC4F3(普通小麦，Triticum aestivum)已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期为2011年6月21日，保藏编号为CGMCCNo.4973，该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。

实施例1：EMS化学诱变获得1Ax1亚基突变体G330E

EMS化学诱变可以产生较高频率的点突变，而染色体畸变相对较少，可以对作物的某一种特殊性状进行改良。以纯合的小偃54自交一粒传种子为材料，种子室温吸胀7小时后，采用0.4％的EMS 18℃黑暗处理16个小时，然后水洗7小时，共诱变处理1000粒种子，最后得到475株可结实的M1单株，自交后得到M2种子。每个M1单株取10粒M2种子，采用SDS-PAGE分析HMW-GS的组成，从中发现了1粒1Ax1亚基迁移率变慢的突变体G330E，把该粒种子套袋自交繁殖后，得到了较多的突变材料。

实施例2：G330E亚基编码基因全长序列的分子克隆和测序

为了得到1Ax1亚基变大突变体G330E基因的全长编码区序列，根据已经发表的1Ax1亚基的核酸序列，设计了一对特异扩增1Ax1亚基的引物：AX-1：-ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-和AX-2：-TGCAGATAGTTCTATCACTGG-，以突变体种子的基因组DNA为模板用高保真的Tag酶进行PCR扩增，得到了预期大小的约2.5kb的特异的目的条带，如图1所示。将特异的扩增条带切胶后，采用凝胶回收试剂盒(Promega公司，按照试剂盒说明书进行)回收纯化。纯化后的产物与PGEM-Teasy载体(Promega公司)连接，连接体系10μl，连接酶为T4-DNAligase(Promega公司)，4℃连接过夜，然后连接产物转化大肠杆菌DH10B的感受态细胞(Invitrogen公司)，37℃培养12个小时后，得到阳性克隆，采用质粒提取试剂盒(北京博大泰克公司)提取阳性克隆的质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI酶切鉴定，酶切正确的克隆进行DNA测序。由于x型HMW-GS编码基因的分子量较大，而且中间的重复序列较多，采用一般的引物步移法测序，很难拿到基因的全长序列，因此我们采用如下方法：首先从中挑选3个阳性克隆，以T7和SP6通用引物先进行末端测序，序列比较确定为1Ax1亚基后，然后用限制性内切酶HindIII+BstXI双酶切阳性克隆，回收中间片段亚克隆到pEASY-blunt载体(北京全式金生物技术公司)上，再对中间片段进行测序，最后得到亚基编码基因的全序列。为了保证实验的客观性，我们对该编码基因进行了6次分子克隆。实验结果均显示：与野生型小偃54中的1Ax1亚基相比，在989bp处核苷酸G突变为了A，从而导致推导的蛋白序列中第330位的氨基酸由甘氨酸(G)变为谷氨酸(E)，如表1所示。

表1.G330E编码基因序列六次克隆与野生型1Ax1亚基的比较结果

实施例3：G330E亚基成熟蛋白的体外表达

x型HMW-GS的蛋白结构显示，前21个氨基酸为信号肽，蛋白正确折叠后，会被切除。为了得到与成熟种子中蛋白亚基G330E迁移率一致的体外表达蛋白，我们设计了一对表达引物：Ax-NdeI：-ACCCATATGGAAGGTGAGGCCTCTGGGCAACT-；Ax-XhoI：-CTCTCTCGAGTTACTGGCTGGCCAACAATGCGTC-。以上述实施例2中得到的正确克隆为模板，采用Clontech公司的高保真的Tag酶和GCbuffer I进行PCR扩增，得到除信号肽外的全长序列，PCR片段回收纯化后(采用Promega公司回收试剂盒)，与PGEM-Teasy载体(Promega公司)连接，连接产物转化DH10B感受态细胞(Invitrogen公司)，挑选阳性克隆采用实施例2中的技术进行DNA测序。选取测序正确的克隆和原核表达载体PET-30a(Novagen公司)，分别用NdeI和XhoI(NEB公司)37℃酶切4小时，酶切产物凝胶回收后(Promega公司)，采用T4-DNA ligase(Promega公司)16℃连接过夜，连接产物转化BL-21感受态细胞(Merck公司)，得到了G330E的原核表达载体：pET-30a-G330E(如图2所示)。阳性克隆接种5ml的LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素，34μg/ml氯霉素)，37℃振荡培养，OD600值达到0.5-0.6时，加入终浓度1mM的IPTG诱导蛋白表达，继续培养4小时后取1.5ml菌体12000rpm离心10min收集菌体蛋白。加入120μl蛋白裂解液(4％SDS，0.125M(pH 6.8)Tris-Hcl，30％甘油，5％巯基乙醇和0.005％溴酚蓝)，100℃煮沸5min，12000rpm离心10min，取10μl进行SDS-PAGE。电泳结果显示：G330E亚基的体外表达蛋白的迁移率与种子中的蛋白一致，均比野生型1Ax1亚基迁移率慢(图3)，这表明我们确实从小偃54突变体材料中拿到了G330E亚基正确的全长编码区序列。

实施例4：G330E优异等位变异与野生型小麦小偃54面粉品质特性的测定

为了得到与野生型遗传背景一致，但只有1Ax1亚基差异的纯合G330E遗传材料，我们用实施例1中得到的突变材料与野生型小偃54回交4代然后自交3代，获得了G330E的BC₄F₃纯合种子。G330E BC₄F₃与小偃54纯合的种子收获并晾干后，采用BUHLER试验磨按照NY/T1094.1-2006的方法实验制粉。面粉制好以后，分别测定蛋白质品质、粉质仪参数、拉伸仪参数和面包品质，结果如表2所示。其中蛋白质含量测定采用Perton7200型近红外分析仪，按照AACC 39-10方法测定；面粉湿面筋含量采用Perton1500面筋仪，按GB/T14608-1993方法测定；Zeleny沉降值按NY/T1095-2006方法测定；面粉粉质仪参数用Brebender公司生产的810106002型粉质仪，按照GB/T14614-2006方法测定；面粉拉伸仪参数用Brebender公司生产的860033002型拉伸仪，按照GB/T14614-2006方法测定；面包烘焙品质实验参照AACC 10-09(1999)、AACC 10-10B(1999)和GB/T 14612-2008进行。从表2可以明显的看出G300E等位变异与野生型小偃54相比，面团的形成时间和稳定时间明显变长；而拉伸面积、抗延阻力、最大抗延阻力和延展性都得到很大的提高，并且达到了极显著水平；烘烤的面包体积也明显变大，较对照达到了显著差异水平。由上可见G330E等位变异是一种优异的等位变异，对近一步提高优质麦小偃54的品质有着显著的作用。

表2.G330E优异等位变异与野生型小偃54品质性状的分析

注：数值＝平均值±标准差；*和**分别表示5％和1％的显著水平。

Claims (10)

1.一种HMW-GS优异等位变异G330E蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO：2。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述HMW-GS优异等位变异G330E蛋白。

3.权利要求2的多核苷酸，其序列为SEQ ID NO：1。

4.一种表达载体，其包含权利要求2或3的多核苷酸。

5.权利要求1的HMW-GS优异等位变异G330E蛋白或权利要求2的多核苷酸在制作具有改良品质的食品中的应用。

6.一种获得HMW-GS优异等位变异蛋白的方法，其中包括用EMS处理小麦种子的步骤。

7.权利要求6的获得HMW-GS优异等位变异蛋白的方法，还包括测量1Ax1亚基迁移率的步骤。

8.权利要求6或7的获得HMW-GS优异等位变异蛋白的方法，其中所述HMW-GS优异等位变异蛋白为G330E蛋白。

9.一种小麦面粉，其含有权利要求1的HMW-GS优异等位变异G330E蛋白。

10.一种食品，其通过权利要求9的小麦面粉制作。

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