CN102858993A - 筛选具有抗氧化作用的细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用秀丽隐杆线虫筛选对氧化应激具有抵御作用的食品级细菌的方法。

Description

筛选具有抗氧化作用的细菌的方法
技术领域
本发明属于筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法的领域。
背景技术
所有活体都在其细胞内保持还原环境。然而，由于线粒体的需氧代谢以及其他因素，产生了诸如过氧化物和氧自由基的活性氧源性物质。还原环境由诸如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的酶维持。如果正常的氧化还原状态遭到破坏，活性氧物质可破坏包括蛋白质、脂质且尤其是DNA在内的所有细胞组分。活性氧物质的产生和去除活性中间体毒性或修复由活性氧物质引起的损害的能力之间的这种失衡，称为氧化应激。在人体内，氧化应激是衰老以及与衰老有关的退行性疾病(例如癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病和亨廷顿氏病)的重要因素。衰老的自由基理论认为，生物体衰老是由于细胞随时间累积了由活性氧物质引起的损害。
为了阻止氧化应激的有害作用，需要筛选具有抗氧化性质的膳食组分。特别地，食品级细菌，尤其是乳酸细菌是合适的抗氧化膳食组分，原因是它们的使用通过肠道定殖而有利地导致对抗氧化作用的长期作用。
US 6,884,415专利公开了通过使含具有超氧化物歧化酶(SOD)样活性和过氧化氢酶(CAT)活性的植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)的食品在含锰的天然物质存在下发酵而生产的抗氧化食品。然而，已知包括乳酸细菌在内的食品级细菌可以具有不依赖于过氧化氢酶或SOD活性的抗氧化性质。
国际申请WO 03/002131公开了发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株作为抗氧化益生菌。该菌株的抗氧化性质通过体外的酶促试验和通过测定谷胱甘肽还原/氧化电位而表征。
WO 00/20013国际申请公开了乳酸杆菌属(Lactobacillus)或丙酸杆菌属(Propionibacterium)菌株，其在哺乳动物的肠内产生数量提高的丙酸，用于制造降低诸如IL-6、活性氧物质和粘附分子的氧化应激因子的药物。
秀丽隐杆线虫(C.elegans)是自由生长的透明线虫(线虫类)，其生长在温和的土壤环境中。秀丽隐杆线虫以细菌，尤其是大肠杆菌(Escherichiacoli)OP50菌株为食，其由于多种原因而已被广泛用作模型生物。秀丽隐杆线虫株廉价，易于培养，并可以冷冻，且在随后被解冻时仍保持存活而便于长期储存，其具有短且可再生的寿命。秀丽隐杆线虫具有作为足够简单的多细胞真核生物而进行非常细致的研究的优势。该类线虫在整个基因组中具有接近40%的人垂直同源基因，这使得其成为与人类状况相关的生物。
秀丽隐杆线虫已经用作评价氧化损伤和对衰老的影响的动物模型系统(Larsen,1993,PNAS 90:8905-8909)。该研究利用与其亲本株相比对氧化应激具有高度抗性的突变株展开。
此外，Ikeda等人(2007,AEM 73:6404-6409)已经研究了乳酸细菌对秀丽隐杆线虫寿命及其沙门氏菌属（Salmonella）抗性的影响。作者认为，秀丽隐杆线虫可能是用于筛选益生菌菌株(当摄入足量时对人的健康产生有益作用)或膳食性抗衰老物质的合适模型。然而，在该研究中并没有评价对氧化应激的抗性。还已知，秀丽隐杆线虫的寿命提高与胰岛素通路有关，且与人体内涉及胰岛素样生长因子和糖尿病的垂直同源基因有关(Glenn等人，2004,JGerontol A Biol Sci Med Sci.59:1251-1260)。
发明内容
本发明的发明人发现，秀丽隐杆线虫动物模型系统是用于筛选食品级细菌对抗氧化应激损害作用的能力的合适模型。所述筛选试验可以在其中加入了细菌的含液体培养基的微滴定平板中进行，也可以在具有所饲喂的细菌菌苔的琼脂平板上进行。
特别地，可以利用秀丽隐杆线虫测试这些食品级细菌对氧化应激、尤其是氧化活性物质形式的氧化应激引起的损害的预防作用。发现对秀丽隐杆线虫施加氧化应激的合适方式是加入过氧化氢。本发明的筛选方法相对简单，然而所获得的结果与人类状况有关。最后，有利的是，所述方法可以筛选具有整体抗氧化应激作用的食品级细菌菌株，而不像现有技术那样受到抗氧化作用涉及的特定机制，例如特定酶的存在(例如CAT、SOD)或特定因子的释放的选择的限制。
具体实施方式
使用秀丽隐杆线虫的筛选方法
本发明的一个实施方式涉及筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法，所述方法包括：
a．使秀丽隐杆线虫的生长同步的步骤；
b．用待测试的食品级细菌饲养所述秀丽隐杆线虫的步骤；
c．在氧化应激存在下温育所述秀丽隐杆线虫的步骤；
d．测定在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤；以及
e．选择在氧化应激存在下产生所述秀丽隐杆线虫的最高存活率的食品级细菌的步骤。
本发明的另一个实施方式涉及秀丽隐杆线虫在筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法中的应用。
使秀丽隐杆线虫的生长同步化，原因是本发明的方法有利地在处于相同生长状态的线虫上进行。培养秀丽隐杆线虫以及使之同步化的方法为本领域已知(W.B.Wood(编辑)“The nematode Caenorhabditis elegans”.Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,第587-606页;Chen等人，2008,J.Cell Commun.Signal.2:81-92)。实现同步化生长的合适方式是从妊娠成虫收集虫卵并开始孵化这些虫卵。孵化虫卵的合适方式是在加入了5μg/ml胆固醇的M9培养基(10%vol MRS(De Man,Rogosa，Sharpe培养基),氟代脱氧尿苷100μg/ml)中过夜温育这些虫卵。随后，可以分离L1期线虫并按照本领域已知方法进行培养(W.B.Wood(编辑)“The nematode Caenorhabditiselegans”;上文引用)。优选地，将线虫培养在微滴定平板的孔内。优选地，将线虫在没有振荡下在25°C和80-85%相对湿度下培养三天。
在本发明方法的优选实施方式中，使用了秀丽隐杆线虫突变株BA17fem-1(hc17)(Nelson等人，1978,Dev.Biol.66:386-409)。有利的是，该秀丽隐杆线虫突变株在25°C的繁殖力受到限制，从而更易于控制其生长和繁殖。
在本发明方法的步骤b的优选实施方式中，使用大肠杆菌，优选大肠杆菌OP50(其是秀丽隐杆线虫的常规食物源)作为对照食物。
除了对照食物外，可在待测定的食品级细菌存在下培养线虫。
优选地，为了找到不同条件之间的相关差异，每个测试条件至少有50只线虫(存在或不存在氧化应激)。
当线虫达到成虫期时，优选在3天培养之后，可以在氧化应激存在下温育这些线虫。采用氧化应激的合适方式是通过加入过氧化氢，优选加入浓度在1mM至20mM之间的终浓度，更优选在2mM至10mM之间的终浓度，甚至更优选在2mM至5mM之间的终浓度的过氧化氢。5mM过氧化氢是最佳浓度。优选地，作为对照，不加入H2O2。
在本发明方法的步骤c的优选实施方式中，秀丽隐杆线虫在氧化应激存在下温育5分钟至48小时，更优选1小时至10小时。5小时是用于该温育步骤的合适时间。
实施在氧化应激存在下的温育步骤的一个方式是在液体培养基中，例如在微滴定平板的孔中。该方法的优势是，可以同时测试多个条件。或者，所述方法可以在固体培养基，例如琼脂平板上进行。该方法与微滴定测试法相比更费力耗时，但优势是可以排除食品级细菌对氧化应激诱导剂(例如过氧化氢)的直接作用。
在本发明方法的步骤c的实施方式中，作为对照，秀丽隐杆线虫还可以在无氧化应激存在下进行温育。
在本发明方法的步骤d的优选实施方式中，抗氧化抗性的评价作为存活力读取。这可以通过显微镜观察。如果线虫麻痹或者没有观察到活动，则认为线虫死亡。
在本发明方法的步骤d的实施方式中，当具有在步骤c无氧化应激存在下作为对照温育的秀丽隐杆线虫时，将在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力与在无氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力进行比较。
本发明方法的最后步骤e可以通过选择赋予秀丽隐杆线虫在氧化应激存在下的高存活率的食品级细菌而进行。
在所述步骤e的优选实施方式中，同时评价秀丽隐杆线虫在无氧化应激存在下的存活率并将其设为100%。
在所述步骤e的另一个实施方式中，对食品级细菌和对照食物(例如大肠杆菌)对秀丽隐杆线虫的存活率(或者存活力)的影响进行比较。
食品级细菌
本发明的食品级细菌涉及选自以下的细菌：双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳酸杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、足球菌属(pediococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、酒球菌属(oenococcus)、肠球菌属(enterococcus)、气球菌属(aerococcus)、肉食杆菌属(carnobacterium)、魏斯氏菌属(weisella)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、杆菌属(bacillus)、芽孢乳酸杆菌属(sporolactobacillus)、棒状杆菌属(corynebacterium)和短杆菌属(brevibacterium)。
优选地，所述食品级细菌为乳酸细菌(LAB)。本发明的乳酸细菌涉及选自以下的细菌：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属、足球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、肠球菌属、气球菌属、肉食杆菌属和魏斯氏菌属。更优选地，所述食品级细菌选自乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属。
所测试的食品级菌株可以按照本领域已知方法进行培养。通过示例的方式，属于双歧杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属的菌株分别培养在具有半胱氨酸的MRS、MRS和Elliker培养基中。
在本发明方法的优选实施方式中，对于微滴定平板测试法，所测试的食品级细菌是有存活力的。
在本发明方法的另一个优选实施方式中，对所述食品级细菌进行预培养并在对数期收集。
在本发明方法的另一个优选实施方式中，将不同的食品级细菌的培养物加入到含秀丽隐杆线虫的液体培养基中，终浓度为1x105个细胞/ml至1x108个细胞/ml，更优选1x106个细胞/ml至1x107细胞个/ml。4x107cfu/ml是用于液体培养基中的测试的优选浓度。或者，当在琼脂平板上测试秀丽隐杆线虫时，待测试的食品级细菌可以以菌落的形式或者菌苔的形式存在于琼脂平板上。
在本发明方法的另一个优选实施方式中，在抑制食品级细菌的进一步生长的抗生素存在下将所述食品级细菌加入至秀丽隐杆线虫生长培养基中。此外，必须存在在实验过程中抑制所述细菌进一步生长的抗生素。优选地，在抗生素，更优选卡那霉素，甚至更优选10至100μg/ml浓度的卡那霉素存在下，培养并温育线虫。有利的是，卡那霉素还抑制对照食物埃希氏大肠杆菌的生长。抑制乳酸杆菌的一些菌株的其他合适的抗生素为万古霉素、新霉素和红霉素。
应用
本发明的方法优选用以筛选抵御氧化应激和/或防止氧化应激施加的损害的食品级细菌的菌株。这些食品级细菌随后可用于药物组合物、营养补充剂和/或食物组合物产品的制造。
此类组合物适于遭受氧化应激的人。特别地，老年人是合适的目标人群，原因是老化的肠道和免疫衰老往往对氧化应激和ROS的产生的抗性效力较低。
实施例1：在微滴定平板中基于在具有或没有氧化应激下秀丽隐杆线虫存活 率筛选乳酸细菌
测试属于双歧杆菌属、乳酸杆菌属和链球菌属的100株食品级菌株的抗氧化性质。将这些菌属分别培养在具有半胱氨酸的MRS、MRS和Elliker培养基中。由于体内抗氧化活性的生物测试法利用不同乳酸细菌的活细胞样品进行，在对数生长期收集细菌。在分析生长曲线后，细胞收集的最佳时间为培养15小时后链球菌属、乳酸杆菌属和双歧杆菌属的DO600分别为1、1.5和1.7。将按照上述获得的不同乳酸细菌的培养物添加至混合物中，终浓度为4x106个细胞/ml。
随后，对100个细菌菌株对避免大肠杆菌生长而使用的抗生素卡那霉素的敏感性进行分析。必须存在该抗生素以防止所述细菌在测试中的进一步生长。发现浓度为30μg/ml的卡那霉素足以抑制大肠杆菌OP50的生长，属于双歧杆菌属和乳酸杆菌属的20%的细菌菌株不受该抗生素的抑制。然而，由于双歧杆菌属不能在需氧条件下增殖，不必要存在抗生素。抑制一些乳酸杆菌菌株的其他合适的抗生素为万古霉素(250μg/ml)、新霉素(10-35μg/ml)和红霉素(1-100μg/ml)。
使用秀丽隐杆线虫突变株BA17fem-1(hc17)进行试验，该突变株在25°C的繁殖力受到抑制。通过在20°C从妊娠成虫分离虫卵并在加入了5μg/ml胆固醇的M9培养基(10vol%MRS,氟代脱氧尿苷110μg/ml)中过夜孵化这些虫卵并在微滴定平板的孔中分离L1期线虫，而使BA17线虫同步化。将所述线虫在没有振荡下在25°C和80-85%相对湿度下培养3天。将这些幼虫转移至含加入了胆固醇的M9培养基的平板中，在25°C和80-85%相对湿度下培养3天，同时进行对照或实验培养。每孔至少有50只线虫。
3天后，当线虫达到成虫期时，通过添加过氧化氢H2O2(2mM、3mM和5mM)而施加氧化应激，或者没有H2O2(无应激对照)。在该实验中使用两个对照，具有大肠杆菌而非乳酸细菌的孔作为细菌饲喂对照，具有大肠杆菌和2mM、3mM或5mM H2O2的孔作为氧化应激对照。发现浓度为5mM的H2O2最佳。抗氧化应激抗性作为存活力读取，在5小时后通过显微镜进行评价。将线虫温育在这些条件下5小时。为了对抗氧化能力评分，如果线虫麻痹，则认为其死亡(受应激)。
在与大肠杆菌一起温育的时间中在无氧化应激存在下，存活力在100%至约90%之间变化。在最初的测试中，乳酸细菌具有类似或更好的存活率，这表示类似的或提高的寿命。一些所筛选的菌株的影响的结果示于下表1中。
表1：乳酸细菌食物对秀丽隐杆线虫寿命的影响
  菌株   存活力（%）
  S2A   95.7
  S1B   98.0
  S2B   94.1
  S1C   94.5
  S1D   98.2
  S1E   100.0
  S1F   95.
  S1G   98.2
  S1H   97.1
  L2A   91.9
  L5A   100
  L6A   94.1
  L8A   96.0
  L9A   91.75
  大肠杆菌OP50   89.5
利用2mM、3mM和5mM H2O2测试99株乳酸细菌在氧化应激下对秀丽隐杆线虫的存活率的影响。发现，5mM H2O2是测试氧化应激的最佳浓度。在5mM H2O2存在下，线虫在大肠杆菌OP50存在下的存活力与无氧化应激存在下相比为约93%。这表示大肠杆菌OP50对抗氧化应激具有93%的保护作用。
下表2显示，与由对照大肠杆菌OP50菌株产生的保护作用(设为100%)相比，所选择的乳酸细菌对抵抗氧化应激的保护作用水平。
表2：与大肠杆菌OP50产生的保护作用相比，由一些乳酸细菌产生的对抗5mM H2O2氧化应激的保护作用的水平。
  菌株   保护作用的水平%
  大肠杆菌OP50   100
  乳酸杆菌
  L8F   14.6
  L9F   21.6
  L10F   9.7
  L1G   102.5
  L3G   7
  L4G   30
  L6G   23
  L7G   95
  L8G   18
  L9G   81
  L10G   77
  L1H   70
  L4H   87
  L5H   6
  L7H   3
  L8H   9
  L10H   8
  L8B   76.8
  L9A   18.7
  L9B   13.3
  L10B   5.2
  L11B   70.9
  L2C   15.7
  L4C   12.8
  L6C   0.0
  L8C   59.3
  L10C   105
  L11C   96.3
  L4D   7.5
  L6B   21.2
  L8B   82.2
  L5C   4.1
  L7C   5.7
  L2D   0.0
  L5D   0.0
  L2E   0.0
  L3F   0.0
  L4F   85.1
  L6F   0.0
  L7F   11.0
  L11A   102
  L4B   109
  L3B   80.1
  L6A   26.3
  L2A   100
  L2B   16.0
  L5A   9.8
  L7B   0.0
  L5B   89.6
  L8A   111
  L8D   87.1
  L9D   91.6
  L10D   94.1
  L11D   100
  L3E   104
  L4E   59.4
  L5E   34.2
  L6E   56.7
  L8E   54.2
  L9E   58.1
  L10E   88.6
  L1F   87.5
  L2F   52.2
  L3A   3
  L1B   1
  双歧杆菌
  B1B   35.8
  B1C   26.2
  B1D   7.4
  B1E   0.0
  B1G   9.0
  B2G   5.9
  链球菌
  S2A   84.3
  S1B   61.5
  S2B   85.0
  S1C   45.8
  S1D   93.8
  S1E   89.7
  S1F   8.2
  S1G   11.7
  S1H   42.3
由上表2可以看出，意外的是双歧杆菌属菌株不产生对氧化应激的抗性，而其在厌氧条件下培养时使秀丽隐杆线虫的寿命延长(Ikeda等人，2007，上文有引用)。此外，意外的是仅非常少的链球菌属和乳酸杆菌属菌株能够产生水平高于对照菌株的氧化应激抗性。在无氧化应激存在下提高存活力的菌株不一定也是产生针对氧化应激的最佳保护作用的菌株。这说明乳酸细菌对存活力的提高的作用不仅仅是由对氧化应激的作用引起的，与对照大肠杆菌OP50相比，仅非常少，尤其是所筛选的链球菌属和乳酸杆菌属菌株具有降低抗氧化应激的能力。
实施例2：所筛选的乳酸细菌的菌株对在琼脂糖平板上培养的野生型秀丽隐 杆线虫的氧化应激抗性的影响
将野生型秀丽隐杆线虫N2在线虫培养基(NG)琼脂平板上培养5天(使线虫同步化)，所述平板具有产生针对氧化应激的保护作用的大肠杆菌OP50菌苔或者从实施例1筛选的乳酸细菌菌株的菌苔，并与3mM H2O2一起温育5小时。在5小时温育前后评价线虫的存活力，并且通过计算在温育过程中死亡的线虫的百分数而计算氧化应激下的存活百分数。结果示于表3中。
表3:在琼脂平板上，相对于由大肠杆菌OP50产生的保护作用，由乳酸细菌产生的针对3mM H2O2氧化应激的保护作用水平。
Figure BDA00001864196900111
在利用琼脂平板(而非微孔)的所述实验中，乳酸细菌的特定菌株显示针对氧化应激的保护作用，但并不是实施例1中的所有测试菌株都对氧化应激有效。在99株菌株中，3株乳酸杆菌菌株10C、11D和3E对氧化应激有效。
在所测试的链球菌(S2B、S1E和S1D)中，无一能够在琼脂平板实验中以高于埃希氏大肠杆菌OP50的水平抵抗氧化应激。
由前述看出，所述琼脂平板方法比微滴定平板测试法更具选择性。由于琼脂平板测试法与微滴定平板测试法相比较费力耗时，当仅测试少量食品级细菌时可以适当地使用琼脂平板测试法。

Claims (14)

1.筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法，所述方法包括：
a．使秀丽隐杆线虫的生长同步的步骤；
b．用待测试的食品级细菌饲养所述秀丽隐杆线虫的步骤；
c．在氧化应激存在下温育所述秀丽隐杆线虫的步骤；
d．测定在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤；以及
e．选择在氧化应激存在下产生所述秀丽隐杆线虫的最高存活率的食品级细菌的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤c进一步包括作为对照在无氧化应激存在下温育秀丽隐杆线虫的步骤；和
步骤d进一步包括比较在氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力与无氧化应激存在下温育的所述秀丽隐杆线虫的存活力的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫为秀丽隐杆线虫突变株BA17fem-1(hc17)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在微滴定平板的孔内培养所述秀丽隐杆线虫。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在琼脂平板上培养所述秀丽隐杆线虫。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，作为对照，一组线虫接受大肠杆菌饲喂、更优选大肠杆菌OP50饲喂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，在抗生素存在下培养和温育所述线虫。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗生素是卡那霉素，优选浓度为10至100μg/ml的卡那霉素。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，通过添加过氧化氢(H2O2),施加所述氧化应激，优选地，过氧化氢的终浓度为1至20mM。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤c进行5分钟至48小时，优选1小时至10小时。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述食品级细菌是属于乳酸细菌的菌株。
12.秀丽隐杆线虫在筛选具有抗氧化性质的食品级细菌的方法中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述食品级细菌是乳酸细菌。
14.根据权利要求12或13所述的用途，其特征在于，所述秀丽隐杆线虫为秀丽隐杆线虫突变株BA17fem-1(hc17)。
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