CN102834116B - Wnt/卷曲蛋白相关疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

提供了治疗Wnt/卷曲蛋白相关疾病的方法，包括给予氯硝柳胺化合物。还提供了预测疾病是否响应氯硝柳胺化合物治疗的方法。

Description

WNT/卷曲蛋白相关疾病的治疗

相关应用的交叉参照

本申请要求2009年9月21日提交的美国临时申请号61/244,399的优先权，其通过引入全文纳入本文。

关于联邦资助研究的声明

本申请是由政府支持在国家卫生研究院批准号5RO1 CA113656-03下完成。政府对本发明拥有某些权利。

序列表

序列表仅以电子形式与申请一起提交，并通过引用纳入本文。序列表文本文件"B2437638.txt"于2010年9月21日创建，大小为33,888个比特。

简介

Wnt信号传递途径在生物体的整个生命周期中起着基础作用-在胚胎发育中指导组织模式形成，在成熟生物体内维持组织内稳态，还与癌症有关。Wnt配体是以多种形式存在的分泌糖蛋白。人类表达19种不同的Wnt亚型，它们是至少10种不同的7次跨膜卷曲蛋白受体的激动剂。卷曲蛋白受体是一种具有7个跨膜结构域的细胞表面受体。Wnt与卷曲蛋白受体的结合活化胞质蓬乱蛋白，其导致卷曲蛋白受体内化。因此Wnt结合导致下游信号传导事件，包括通过防止GSK3β磷酸化来稳定胞质β-联蛋白，稳定化的β-联蛋白转位到核，然后活化转录因子LEF/TCF。

因此，Wnt蛋白与卷曲蛋白受体结合，介导Wnt信号转导的发育、形态发生和组织再生效果。失调的Wnt信号转导与许多癌症相关。因此，各种蛋白与Wnt信号级联相关，包括可及的质膜受体例如卷曲蛋白，提供治疗干预的靶点。然而，目前没有FDA批准的调节Wnt-介导的受体运输和随后Wnt信号转导的药物或临床候选物。

发明内容

在本发明的一个方面，提供了一种预测癌细胞对一种预测癌细胞对氯硝柳胺化合物治疗的响应的方法，包括：确定癌细胞中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和将所述蛋白的水平与标准水平作比较；其中所述蛋白水平之间的差异表明癌细胞响应氯硝柳胺化合物的治疗。可通过测定蛋白质的基因表达水平来检测蛋白质水平。蛋白质可选自胞质β-联蛋白、Wnt蛋白、卷曲蛋白和蓬乱蛋白。

在本发明的一个方面，提供了鉴定患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的对象的方法，包括：确定对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和将所述蛋白的水平与标准水平作比较；其中所述蛋白水平的差异表明对象患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病。可通过测定蛋白质的基因表达水平来检测蛋白质水平。蛋白质可选自胞质β-联蛋白、Wnt蛋白、卷曲蛋白和蓬乱蛋白。

在本发明的一个方面，提供了治疗患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的对象的方法，包括：确定对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和将所述蛋白的水平与标准水平作比较；  其中所述蛋白水平的差异表明对象患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病；和给予对象有效量的氯硝柳胺化合物以治疗疾病，其中Wnt/卷曲蛋白相关疾病不是肿瘤。在一些方面，Wnt/卷曲蛋白相关疾病是心血管疾病。可通过测定蛋白质的基因表达水平来检测蛋白质水平。蛋白质可选自胞质β-联蛋白、Wnt蛋白、卷曲蛋白和蓬乱蛋白。

在本发明的一个方面，提供了检测对象中肿瘤的方法，包括：确定对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的蛋白的水平；和将所述至少一种蛋白的水平与标准水平作比较；其中蛋白水平之间的差异表明个体患有肿瘤。可通过测定蛋白质的基因表达水平来检测蛋白质水平。蛋白质可选自胞质β-联蛋白、Wnt蛋白、卷曲蛋白和蓬乱蛋白。肿瘤可以是癌，选自结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、白血病、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、脑肿瘤和乳腺癌。

在本公开的一个方面，提供了一种在需要治疗的个体内治疗Wnt/卷曲蛋白相关疾病的方法，所述方法包括给予对象有效量的式I的氯硝柳胺化合物或其药物学上可接受的盐：

其中

D是N或CR⁹;

E是N或CR¹⁰;

F是N或CR¹¹;

R¹是H、卤化物、OR¹²、SR¹³NR¹⁴R¹⁵或下式所述之一：

R²是H,OH,或OR¹²;

R³是H,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基;

或R²和R³组合形成六元环，其中1位与以下基团之一的4位相连：

R⁴和R⁸分别独立选自H,卤化物,CF₃,OR²⁸,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基；

R⁵,R⁶,和R⁷分别独立选自H,C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3 10烷基杂环基,或C_1-7杂烷基，卤化物，NO₂,CO₂H,SO₃H,CF₃,CN,OR²⁹,SR³⁰,或以下所述式：

X¹,X²,X³,和X⁴独立地是O,S;或NR³⁸;

Y是CR²⁵R²⁶,O,S,或NR²⁷;

Z是O,S,或CR⁵⁰R⁵¹;

Q独立地是O,S,或NR⁵²;

R⁹,R¹⁰,和R¹¹分别独立地是H,OH,OR¹²,C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_1-7杂烷基,卤化物，或NO₂；

R¹²和R¹³分别独立地是酰基，C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基；

R¹⁷,R²²,R³⁵,R³⁶,R³⁷,R³⁸和R⁵²分别独立地是C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基,或C_1-7杂烷基;

R¹⁴,R¹⁵,R¹⁶,R¹⁸,R¹⁹,R²⁰,R²¹,R²³,R²⁴,R²⁵,R²⁶,R²⁷,R²⁸,R²⁹,R³⁰,R³¹,R³²,R³³,R³⁴,和R⁴⁷分别独立地是H,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基,或C_1-7杂烷基；和

R³⁹,R⁴⁰,R⁴¹,R⁴²,R⁴³,R⁴⁴,R⁴⁵,R⁴⁶,R⁴⁷,R⁴⁸,R⁴⁹,R⁵⁰,和R⁵¹分别独立地是H,卤化物,CN,NO₂,CF₃,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基，和

其中Wnt/卷曲蛋白相关疾病不是肿瘤。

在本公开的一个方面，提供了一种在需要治疗的对象内治疗Wnt/卷曲蛋白相关心血管疾病的方法，所述方法包括如上所述给予对象有效量的式I的氯硝柳胺化合物或其药物学上可接受的盐：

本公开提供并包括了其它方面和实施方式，本领域技术人员根据下文描述能够清楚了解。

附图简要说明

图1A是用对照条件培养基(CTL CM)处理6小时的稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞的图像。图1B是用Wnt3A条件培养基(Wnt3A CM)处理6小时的稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞的图像。图1C是用Wnt5A条件培养基(Wnt5A CM)处理6小时的稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞的图像。

图2A是Fzd1-GFP稳定U2OS细胞(Fzd1GFP-U2OS)的图像，其在37℃接触载剂(DMSO)6小时。图2B是Fzd1-GFP稳定U2OS细胞(Fzd1GFP-U2OS)的图像，其在37℃接触12.5μM氯硝柳胺6小时。图2C是氯硝柳胺的化学结构。图2D是载剂处理的卷曲蛋白1-GFP细胞的图像。图2E是用获自第二来源(西格玛—奥德里奇公司（Sigma-Aldrich），密苏里州圣路易斯)的氯硝柳胺(12.5μM)处理的细胞的图像。图2F是用DMSO处理的稳定表达Her2-GFP的U2OS细胞(Her2GFP-U2OS)的图像。图2G是用12.5μM氯硝柳胺处理的稳定表达Her2-GFP的U2OS细胞(Her2GFP-U2OS)的图像。

图3是4℃下进行细胞表面生物素标记的Fzd1-GFP稳定U2OS细胞的免疫印迹。上图显示用中性亲和素珠下拉(pull down)和用于卷曲蛋白1-GFP检测的抗-GFP抗体富集的经生物素标记的卷曲蛋白1-GFP的免疫印迹。下图显示了β-肌动蛋白的免疫印迹。在印迹上方标出了表面生物素化、谷胱甘肽、氯硝柳胺处理和温度。

图4A-E是用12.5μM氯硝柳胺处理0、1、2、4和6小时的Fzd1-GFP稳定的U2OS细胞的图像。图4F是胞质中不同时间点含卷曲蛋白1-GFP的囊泡数量图。

图5A-F是用含DMSO(0μM)或氯硝柳胺(0.47μM,0.94μM,1.88μM,3.75μM,和7.5μM)的载剂处理6小时的Fzd1-GFP稳定U2OS细胞图像。图5G是对于不同浓度氯硝柳胺的内化囊泡/细胞。

图6A是含有β₂-肾上腺素能受体-RFP(β₂AR-RFP)的未刺激U2OS细胞的图像。图6B是含有Fzd1-GFP的未刺激U2OS细胞的图像。图6C是A和B的合并图像。图6D-E是37℃下用0.1μM异丙托溴铵(iso)刺激2小时和6小时的细胞中受体的图像。合并图像在6F中。图6G-H是用12.5μM氯硝柳胺37℃刺激2小时和6小时的细胞中受体的图像，图6I为合并图像。图6J-K是表达Fzd1-GFP并37℃接触100μg/mlAlexa-546转铁蛋白(Tf)和12.5μM氯硝柳胺2小时的细胞的图像，图6L是合并图像。

图7A是用12.5μM氯硝柳胺处理6小时的U2OS细胞中内源胞质蓬乱蛋白-2的免疫印迹，右侧标出了分子量标准，用β-肌动蛋白作为加样对照。图7B是用1-7.5μM氯硝柳胺处理的U2OS细胞中内源胞质蓬乱蛋白-2的免疫印迹。

图8A是DMSO(载剂)或12.5μM氯硝柳胺(niclo)处理诱导Wnt3A刺激的TOPFlash报道活性，其中CTL CM和Wnt3A CM分别描述了对照和Wnt3A条件培养基。图8B是用不同浓度的氯硝柳胺诱导Wnt3A刺激的TOPFlash报道活性。图8C是用7.5μM氯硝柳胺处理的U2OS细胞中胞质β-联蛋白的免疫印迹，用β-肌动蛋白作为加样对照。图8D是用不同浓度氯硝柳胺处理的U2OS细胞中胞质β-联蛋白的免疫印迹，用β-肌动蛋白作为加样对照。

图9是氯硝柳胺和奥沙利铂存在下，用MTT实验测定的(A)结直肠癌细胞系和(B)结直肠癌外植体的细胞生长(OD562nm)。

图10是氯硝柳胺和奥沙利铂存在下用MTT实验测定的结直肠癌细胞系随时间的增殖%。

图11显示了孵育72小时后，用基于流式的实验测定的膜联蛋白V(+)作为凋亡标记于不同浓度的氯硝柳胺下在癌细胞和正常细胞中表达的增加。

图12显示了用不同水平的氯硝柳胺处理后HCT116或CRC57细胞中β-联蛋白(克隆C-11)、Dvl2(克隆3F12)和β-肌动蛋白(克隆C-11)的水平。

图13是不同水平的氯硝柳胺(有或没有奥沙利铂)存在下，孵育72小时后MT实验测定的Ht29或HCT116结直肠癌细胞系的细胞生长（OD 565nm或OD 562nm）。

图14是(A)口服给药后NOD/SCID小鼠血浆中氯硝柳胺浓度随时间的图，和(B)口服给药后NOD/SCID小鼠肿瘤组织中相对于血浆的氯硝柳胺浓度。

图15显示了不同浓度氯硝柳胺处理后，用HCT116或CRC039结直肠癌细胞接种的NOD/SCID小鼠中的肿瘤体积。

图16显示了NOD/SCID小鼠中的CRC028或HCT116结直肠癌细胞，所述小鼠用或不用氯硝柳胺处理并对Dvl-2或β-联蛋白染色。

发明详述

广义上本公开提供了氯硝柳胺化合物和方法，包括用化合物作为Wnt/卷曲蛋白活性和功能的调节剂，和作为研究Wnt信号转导在例如癌症、心血管疾病以及分子水平的再生中的生理学影响的研究工具。已证明氯硝柳胺在短期给予时对人是安全的。氯硝柳胺化合物(包括类似物、衍生物等)能对有潜在Wnt介导疾病，例如各种癌症和心血管疾病的病人提供安全有效的药物治疗。

如下文非限制性和说明性实施方式所述，已用卷曲蛋白1胞吞作为读出值的主要基于图像的GFP荧光实验检测了FDA-批准的药物库作为卷曲蛋白内化调节剂的效用。如实施例所示，发现一种用于治疗绦虫的药物抗蠕虫氯硝柳胺促进卷曲蛋白1内化(胞吞)，下调蓬乱蛋白-2，并抑制Wnt3A刺激的β-联蛋白稳定化和LEF/TCF报道活性。另外，在氯硝柳胺介导的内化后，卷曲蛋白1受体共定位于含有转铁蛋白和激动剂活化的β₂-肾上腺素能受体的囊泡中。因此，氯硝柳胺化合物可通过耗尽上游信号分子(即卷曲和蓬乱蛋白)作为Wnt/卷曲蛋白1信号转导的负调节物。

本文所用的“氯硝柳胺化合物”包括氯硝柳胺、氯硝柳胺类似物和氯硝柳胺衍生物，及其任意组合。已知一些非限制性氯硝柳胺化合物，如PCT公开号WO2004/006906(通过引用纳入本文)中所述，包括但不限于具有式I的化合物：

或其盐。

在式I中，D是N或CR⁹；E是N或CR¹⁰；F是N或CR¹¹；R¹是H、卤化物、OR¹²、SR¹³NR¹⁴R¹⁵或下式所述之一：

R²是H,OH,或OR¹²;

R³是H,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基;或

R²和R³组合形成六元环，其中1位与以下基团之一的4位相连：

R⁴和R⁸分别独立选自H,卤化物,CF₃,OR²⁸,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基；

R⁵,R⁶,和R⁷分别独立选自H,C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3 10烷基杂环基,或C_1-7杂烷基，卤化物，NO₂,CO₂H,SO₃H,CF₃,CN,OR²⁹,SR³⁰,或以下所述式：

对于式I的化合物，各X¹,X²,X³,和X⁴独立地是O,S;或NR³⁸;Y是CR²⁵R²⁶,O,S,或NR²⁷;Z是O,S,或CR⁵⁰R⁵¹;各Q独立地是O,S,或NR⁵²;R⁹,R¹⁰,和R¹¹各独立地是H,OH,OR¹²,C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_1-7杂烷基,卤化物，或NO₂；R¹²和R¹³各独立地是酰基，C_1-7烷基，C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基；R¹⁷,R²²,R³⁵,R³⁶,R³⁷,R³⁸和R⁵²各独立地是C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基,或C_1-7杂烷基;R¹⁴,R¹⁵,R¹⁶,R¹⁸,R¹⁹,R²⁰,R²¹,R²³,R²⁴,R²⁵,R²⁶,R²⁷,R²⁸,R²⁹,R³⁰,R³¹,R³²,R³³,R³⁴,和R⁴⁷各独立地是H,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基,或C^1-7杂烷基；和R³⁹,R⁴⁰,R⁴¹,R⁴²,R⁴³,R⁴⁴,R⁴⁵,R⁴⁶,R⁴⁷,R⁴⁸,R⁴⁹,R⁵⁰,和R⁵¹各独立地是H,卤化物,CN,NO₂,CF₃,C_1-7烷基,C_2-7链烯基,C_2-7炔基,C_2-6杂环基,C_6-12芳基,C_7-14烷芳基,C_3-10烷基杂环基，或C_1-7杂烷基。

式I的一些非限制性化合物包括式II-V的化合物：

其中F,E,D,X³,R¹,R⁴,R⁵,R⁶,R⁷,R⁸,R⁹,R¹⁰,R¹¹,R²³和R²⁴如上定义。

在一些实施方式中，提供了预测Wnt/卷曲蛋白相关疾病，例如肿瘤或心血管疾病对至少一种氯硝柳胺化合物或其组合物的治疗的响应的方法。所述方法可包括确定肿瘤中至少一种蛋白的水平，其中所述蛋白涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径，并将该蛋白水平与标准水平比较。蛋白水平提高可表明肿瘤响应氯硝柳胺化合物的治疗。  所述方法可包括测定Wnt/卷曲蛋白信号转导途径在疾病组织和/或细胞中相对于正常组织和/或细胞是否失调。在一些实施方式中，预测氯硝柳胺化合物对Wnt/卷曲蛋白信号转导途径相对于正常组织和/或细胞失调的疾病有效。

在一些实施方式中，该方法可在例如当某类癌症实际上是一组具有不同基因组成的癌症时有用。即当两种癌症可被鉴定为同一类型(例如基于组织学)时，它们可涉及不同的基因突变。在这种情况下，一种癌症可包括失调的Wnt/卷曲蛋白信号传递途径，而另一种癌症不包括。预期具有失调的Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的癌症将比没有失调的Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的癌症更强烈地响应氯硝柳胺化合物治疗。可用本文所述的方法鉴定预期更强烈响应氯硝柳胺化合物治疗的癌症。

可用本领域技术人员理解的各种技术测定蛋白质水平。例如，可用包括但不限于蛋白质印迹、ELISA、RNA印迹、实时PCR、免疫荧光或FACS分析在蛋白质或mRNA水平上评估蛋白质表达水平。可通过测定蛋白质的基因表达水平来检测蛋白质水平。例如，可通过用荧光标记的蛋白质特异性抗体染色细胞显影、蛋白表达的蛋白质印迹分析和蛋白转录物的RT-PCR来评估蛋白表达水平。

如本文所用，用于基因表达水平的“表明性”中的“表明”意味着基因表达水平相较标准/正常基因表达水平的上调、下调、改变或其它变化。类似的，术语“表明”用于蛋白水平时指蛋白水平相较标准/正常蛋白水平更高、更低、提高或降低、改变或变化。

本文所用的“标准水平”指不患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的群体中的对象、成员或细胞，例如不患有心血管疾病、癌症或癌前病症的对象或成员中的水平。术语“标准蛋白水平”指不患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的群体的对象或成员中的蛋白水平。确定群体的因素包括种族、性别、年龄、地理位置和种群起源。在一个实施方式中，基因的标准基因表达水平是对象所属的未感染群体基因的平均表达水平，该群体是例如成年美国女性或男性，或是在感染前的特定对象。水平差异表明患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的个体。例如，可在医学实验室从某一对象获得外周血样品，血样经处理并筛选基因表达，筛选结果与标准品作比较，并告知该对象其疾病状态。

预测可包括使用实施例中获得的或通过其它实体产生的信息，以给出预测。预测可基于单一实验内部比较或与标准的比较。例如，可用蛋白表达水平预测癌症对治疗的响应。可根据上述标准或对照产生预测。这并不意味着预测的事件将100％必然发生。预测还包括但不限于根据统计学指示特定事件是否会发生，例如癌症是否会响应某些药物治疗。

参与Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的蛋白质包括但不限于β-联蛋白(SEQ IDNO：2)，Wnt蛋白，卷曲蛋白(SEQ ID NO：3)，和蓬乱蛋白(Dvl1，SEQ ID NO：4，SEQID NO:5，SEQ ID NO:6)。Wnt蛋白包括但不限于Wnt3A(SEQ ID NO：1)。

本文所用的“Wnt/卷曲蛋白相关疾病”是Wnt/卷曲蛋白信号传递途径失调的疾病。一些示例性Wnt/卷曲蛋白相关疾病包括但不限于心血管疾病、肿瘤、肥胖、骨质疏松、神经元变性、癌症以及伤口愈合和组织修复中的紊乱。Wnt/卷曲蛋白信号传递途径在例如疾病组织和/或细胞包括以下至少一种情形时可视作失调：与正常组织和/或细胞相比，β-联蛋白水平提高；LEF-TCF-介导的转录提高；一种或多种Wnt蛋白水平提高，包括但不限于Wnt3A；卷曲蛋白水平提高；和/或蓬乱蛋白水平提高。如本文所用，术语“组织”包括所有生物学组织，包括但不限于器官组织、肿瘤组织、皮肤、血液等。

在一些实施方式中，Wnt/卷曲蛋白相关疾病是心血管疾病，例如心肌梗塞和心脏肥大。心血管疾病可进一步包括冠心病(包括心脏病发作和心绞痛或胸痛)；中风；血压升高、高血压；心脏衰竭；风湿热/风湿性心脏病；先天性心血管缺陷；心律不齐(心率紊乱)；动脉、微血管和毛细血管疾病(包括动脉粥样硬化和川崎病)；细菌性心内膜炎；心肌病；瓣膜心脏病；肺循环疾病；静脉和淋巴小血管疾病；和其它循环系统疾病。在一些实施方式中，这些心血管疾病中Wnt信号传递的抑制产生对梗死愈合的有益效果，提高血管生成，和/或在心脏中减弱肥大反应。

在一些实施方式中，Wnt/卷曲蛋白相关疾病是肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤是癌或癌细胞。一些示例性Wnt/卷曲蛋白相关癌症包括但不限于结肠癌、黑色素瘤、肝细胞癌、白血病、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、脑瘤和乳腺癌。

在一些实施方式中，测定癌症是否包含失调的Wnt/卷曲蛋白信号传递途径可包括检测一种或多种Wnt、卷曲蛋白、β-联蛋白、和/或蓬乱蛋白的水平，将所述水平与正常组织和/或细胞比较。在一些这类实施方式中，如果癌与正常组织和/或细胞相比具有更高水平的Wnt、卷曲蛋白、β-联蛋白和/或蓬乱蛋白，预测癌症响应氯硝柳胺化合物的治疗。在一些实施方式中，测定癌症是否含有失调的Wnt/卷曲蛋白信号传递途径包括检测LEF-TCF介导的转录水平，与正常组织和/或细胞中的LEF/TCF介导的转录相比较。在一些这类实施方式中，如果癌与正常组织和/或细胞相比具有更高水平的LEF-TCF介导的转录，预测癌症响应氯硝柳胺化合物的治疗。

在一些实施方式中，提供了鉴定患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的对象的方法。该方法可包括确定对象样品中至少一种蛋白的水平，其中所述蛋白涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径，并将该蛋白水平与标准水平作比较。蛋白水平的提高可表明对象患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病。

在一些实施方式中，提供了治疗患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病的对象的方法。该方法可包括确定对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和将所述蛋白的水平与标准水平比较；  其中所述蛋白的水平增加表明对象患有Wnt/卷曲蛋白相关疾病；和进一步给予对象有效量的氯硝柳胺化合物以治疗疾病。

“给药”或“给予”指通过任何合适途径递送化合物，以实现所需效果。给药可包括但不限于口腔、舌下、肌肉内、皮下、静脉内、透皮、外用、胃肠外、粘膜、直肠、和通过注射、吸入和移植物。

术语“接触细胞”用于指在体外、离体或体内(即在个体内，例如哺乳动物，包括人类、小鼠、大鼠、兔、猫和犬)直接或间接接触细胞。接触细胞也包括与细胞“反应”，可以作为对个体给药的结果发生。接触包括对细胞、组织、哺乳动物、个体、病人或人类给药。另外，接触细胞包括将药物加入细胞培养物。其它合适的方法包括用合适的方法和如上所述的给药途径将药物引入或给予细胞、组织、哺乳动物、个体或病人。

“有效量”指有效引发所需效果的化合物或组合物的剂量。本文所用的该术语还指能在动物，优选人类中产生所需体内效果的有效量，例如疾病治疗。

本文所用的术语“治疗”在文中指治疗病症，一般涉及实现所需疗效的治疗或疗法，不论是对人或动物(例如在兽医应用中)。例如，治疗包括预防和改善或缓解病症、疾病或症状，或治疗可抑制病症或疾病的发展(例如减慢疾病/症状发展的速度或使疾病/症状进展的速度停滞)。

在一些实施方式中，提供了检测对象中肿瘤的方法。该方法可包括确定对象样品中至少一种蛋白的水平，其中所述蛋白涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径，并将至少一种蛋白的水平与标准水平作比较。蛋白的水平提高可表明对象具有肿瘤。

在一些实施方式中治疗癌症的方法包括首先预测癌症是否响应氯硝柳胺化合物的治疗，如果预测癌症响应治疗，则给予氯硝柳胺化合物。

应理解本文所引的任何数值包括从下限值到上限值。例如，如果浓度范围描述成1％-50％，意味着诸如2％-40％、10％-30％或1％-3％等数值都明确列举在本说明书内。这些仅仅是特定提到的例子，在最低值和最高值之间的全部可能的数值组合都被认为在本申请中明确表述。

而且，应理解本文所用的词语和术语用于描述目的，而非限制性。本文所用的术语例如“包含”、“包括”、“具有”及其变化意味着包括其后列出的元素及其等价物，以及额外的物件。“包含”涵盖了术语“由……组成”和“基本由……组成”。“基本由……组成”的使用意味着组合物或方法可包括额外的成分和/或步骤，但仅当额外成分和/或步骤不会实质性改变所要求的组合物或方法的基本和新型特征。

本文引用的所有专利出版物和参考文献都通过引用全文纳入本文。

虽然下面的实施例进一步提供了一些本发明实施方式的详细描述，它们应当仅视作说明性的，且不以任何方式限制由所附权利要求限定的本发明。

实施例

实施例1：材料和方法

试剂

氯硝柳胺购自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.，密苏里州圣路易斯)。7-AAD和膜联蛋白V-生物素试剂盒购自免疫技术公司(Immunotech)（法国马赛，目录号PN IM3422)。

质粒、抗体和条件培养基pCS2ratFrizzled1-GFP(储液#16821)和pLKO.1(储液#10878)获自Addgene(马赛诸塞州剑桥)。报道质粒p8xTOPFlash获自Randall Moon博士。萤火虫荧光素酶质粒购自普罗麦加（Promega）。β2-肾上腺素能受体-RFP(β₂AR-RFP)如GFP衍生物所述类似制备(Chen，W.，等Science2003，301，1391-1394；Barak，L. S.，等Mol Pharmacol 1997，51，177-184，其都通过引用纳入本文)。β-联蛋白(sc-7963)，卷曲蛋白-I(sc-8025)，蓬乱蛋白-2(sc-13974，批号A242)，蓬乱蛋白-3(sc-8027,和sc-28846)，和β-肌动蛋白(sc-47778)抗体获自圣克鲁斯（Santa Cruz）。产生Wnt3A(CRL-2647)，Wnt5A(CRL-28I4)和对照(CCL-1.3)条件培养基的细胞系获自ATCC。根据http://www.stanford.edu/～musse/assays/W3aPurif.htm#assay所述的方案通过在DMEM+10％FBS中培养细胞，产生条件培养基。

稳定细胞系产生为了获得卷曲蛋白1-GFP稳定细胞系(Fzd1GFP-U2OS)，用pCS2ratFrizzled1-GFP和pLKO.I(10∶1重量比)根据Amaxa的核转染方案转染U2OS细胞，在培养基中用1.5μg/mL嘌呤霉素选择稳定表达受体的克隆。为了产生TOPFlash稳定细胞系，用p8xTOPFlash、萤火虫荧光素酶质粒和pLKO.1以10∶3∶1的重量比转染HEK293细胞，用含1μg/ml嘌呤霉素的培养基选择稳定克隆。用pLKO.1对稳定克隆赋予嘌呤霉素抗性。

基于图像的初步筛选实验含约1200FDA批准药物和药物样工具化合物的文库购自普雷斯维克化学公司（Prestwick Chemicals Inc）。用Multidrop384分配器(Titertek设备公司（Titertek Instruments），阿拉巴马州亨茨维尔)将稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞以6000细胞/25μL培养基/孔分入玻璃底的384孔板(MGBI01-1-2-LG，MatriCal，华盛顿州士波肯市)中。平板在37℃，5％CO₂中过夜孵育。翌日，将来自普雷斯维克文库的化合物(5mM，DMSO中)用培养基1∶80稀释，然后将其中6.25μL用装有96通道头的Biomek FX液体处理器(贝克曼库尔特公司（Beckman Coulter），加利福尼亚州圣何塞)加到各细胞孔中，产生1∶400的总体稀释度，最终化合物浓度为每孔12.5μM。细胞与化合物在37℃孵育6小时，然后用含有0.5％多聚甲醛和0.002％荧光核染料DRAQ5的PBS固定。4℃储存平板直到在ImageXpress超高通量成像系统(分子仪器公司（Molecular Devices），加利福尼亚州森尼韦尔)上分析，该系统配有488nm的氩激光以成像GFP，还配有568nM的氪激光以成像DRAQ5。通过目测验证全部成像数据，对于实验稳健度计算出Z’因子为0.44。

细胞表面生物素化内化实验用表面生物素标记法评估卷曲蛋白1内化(Yang，X.L.等Mol Cell Neurosci 2005，28，335-346,通过引用全文纳入本文)。Fzd1GFP-U2OS细胞在6厘米平板上生长至汇合，用含有10mM HEPES的PBS洗涤两次，用2ml 1mg/ml的硫-NHS-S-生物素(皮尔斯（Pierce），伊利诺伊州罗克福德)4℃孵育1小时，用含有50μM Tris-HCl的冷PBS洗涤三次。为了评估卷曲蛋白1内化，细胞在含或不含12.5μM氯硝柳胺的培养基中37℃孵育4小时，回到4℃，用新鲜的谷胱甘肽切割溶液(50mM还原型L-谷胱甘肽，75mM NaCl，10mM EDTA，1％ BSA，和0.075 N NaOH)孵育两次，每次15分钟，以除去细胞表面残余的生物素。然后用冷PBS洗涤细胞三次，用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，PH 8.0，150mM NaCl，1％ NP40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS)裂解。用中性亲和素珠(皮尔斯，伊利诺伊州罗克福德)将生物素化蛋白从细胞裂解液中拉下，用拉姆力（Laemmli）SDS加样缓冲液/50mM二硫苏糖醇室温洗脱珠2小时。用SDS-PAGE和抗-GFP抗体鉴定洗脱的卷曲蛋白1-GFP。作为对照，PBS/50μMTris-HCl洗涤后的表面生物素化细胞直接用RIPA缓冲液裂解以检测总生物素标记的卷曲蛋白1-GFP，或立即进行谷胱甘肽切割以监测生物素去除效率。

图像分析和内化囊泡定量用蔡司（Zeiss）LSM510共焦显微镜获得共焦图像，并用计算机程序Metamorph(通用成像公司（Universal Imaging Corporation）)如(Lu，J.，等Neuron 2007，55，874-889，通过引用全文纳入本文)所述分析。为了测定每个细胞的内化囊泡，仔细追踪胞质以排除细胞膜。  通过将图像阈值设定为背景强度的3倍，确定内化囊泡。用Metamorph软件对每个细胞的内化囊泡数进行计数。每个样品分析30个以上细胞，以获得统计显著性。

转铁蛋白胞吞实验细胞在MEM中血清饥饿15分钟，然后与Alexa-543偶联的转铁蛋白(Tf，100μg/mL)以及氯硝柳胺(12.5μM)37℃孵育2小时。为了除去残余的表面结合Tf，细胞在室温下接触未标记转铁蛋白(10mg/mL)2分钟。然后细胞用4％多聚甲醛固定，用LSM510共焦显微镜(蔡司)成像。

TOPFlash报道子实验对于TOPFlash荧光素酶实验，将TOPFlash稳定细胞以150μL生长培养基/孔接种于96孔板内，至100％汇合。在每孔中加入含待测试的化合物或DMSO的50μl条件培养基。8小时处理后，用PBS洗涤1次细胞，用80μL MPER溶液(皮尔斯，伊利诺伊州罗克福德)裂解。在96孔板读数仪(FluoStar Optima，伊利诺伊州芝加哥的BMG莱伯泰科公司（BMG Labtech）)中用30μl细胞裂解液测定荧光素酶活性。

胞质β-联蛋白和蓬乱蛋白的检测为了测定胞质β-联蛋白稳定化和蓬乱蛋白-2表达，U2OS细胞生长到100％汇合，然后用对照条件培养基或补充有DMSO或不同浓度氯硝柳胺的Wnt3A条件培养基处理6小时。处理后，如(Mikels，A.J.，等PLoS Biol 2006，4，e115，通过引用全文纳入本文)所述分离胞质组分和细胞膜。用-联蛋白或蓬乱蛋白-2抗体的免疫印迹检测胞质或细胞膜上的各蛋白水平，用β-肌动蛋白免疫印迹作为加样对照。

小鼠.NOD.CB17-Prkdcscid/J(NOD/SCID)小鼠购自杰克逊实验室(JacksonLabs，缅因州巴尔港)，在杜克综合癌症中心隔离机构饲养。所有工作都根据杜克IAUAC批准方案进行。

结直肠癌细胞系结直肠癌细胞系HT29(ATCC HTB-38)、HCT116(ATCCCCL-247)和CaCO2(ATCC HTB-37)购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯)。

从病人的结直肠癌样本中分离肿瘤细胞并在NOD/SCID小鼠中建立外植体病人接受手术切除转移到肝脏的结直肠癌，所述癌难以由标准化疗治愈(包括氟尿嘧啶、奥沙利铂和贝伐单抗)，在手术前提供了由杜克大学医学中心研究审核委员会批准的经签署的知情同意书。收集结直肠癌样本后，用刀片将组织切成小于2mm的块，用含有胶原酶IV(1mg/ml，密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)、透明质酸酶(100μg/mL，密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)和脱氧核糖核酸酶(20U/mL，密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)的三重酶缓冲液在RPMI1640培养液中中消化过夜。旋转沉淀细胞，用PBS洗涤三次，重悬浮于汉克斯平衡盐溶液中，与基质胶（Matrigel，加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司（BD Biosciences）)1∶1混合。将细胞(消化过程获得的一半细胞，通常为1x10⁶细胞)注射回NOD/SCID小鼠。体内生长2-4个月后，当肿瘤直径达到约1cm时，杀死小鼠并切下肿瘤，切碎，置于体外培养物中。一些打碎的细胞注入NOD/SCID小鼠腋下，进行一系列体内传代。用体外生长的结直肠癌(CRC)细胞作为实验的靶细胞。

MTT实验AsPC-1肿瘤细胞与T细胞以1∶5的比例在MEDI-565或Cont BiTE(100ng/mL)存在下培养7天。在第7日，弃去漂浮细胞，用0.05％胰蛋白酶/EDTA仅收获AsPC-1贴壁细胞，用PBS洗涤3次。在96孔平底板的含200μL完全RPMI1640培养基的各孔中加入1x10⁴ AsPC-1肿瘤细胞。使细胞粘附在平板上37℃过夜(第0日)，进一步孵育1、2、4或7天。在各孔中加入20μL的10X MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-溴化四唑，5mg/mL)溶液，37℃孵育2小时。用150μL二甲亚砜(DMSO)裂解贴壁细胞，测定550nm处的光密度(OD)。

基于流式的细胞毒性实验对于细胞毒性实验，将1x10⁵肿瘤细胞置于含有0.2μM-20μM浓度的氯硝柳胺的12孔平底板中。孵育3日后，用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获全部细胞，并离心沉淀。用生物素偶联的膜联蛋白V标记细胞，然后用7-AAD和链霉亲和素-APC染色。用FACSCalibur仪(BD生物科学)获取样品，用CellQuest软件分析。分析细胞中作为凋亡标记的膜联蛋白V的表达。

蛋白质印迹分析在6孔板中培养CRC外植体和结直肠癌细胞系。当细胞在孔中达到亚融合时，用不同浓度(0，0.4，1，2，5，10μM)的氯硝柳胺处理细胞过夜(18小时)。用PBS洗涤细胞三次后，采用由10mM Tris-HCl，pH7.4和0.2mM MgCl₂，组成并补充有1x停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(赛默飞世尔皮尔斯（ThermoScientific Pierce）蛋白质研究产品，伊利诺伊州罗克福德)的低渗裂解缓冲液，以制备用于蛋白质印迹分析的细胞裂解物。

免疫组化：切除用或不用氯硝柳胺处理的NOD/SCID小鼠腋下生长的肿瘤，用10％中性缓冲甲醛固定。将石蜡包埋的样品切成4μM厚的系列切片。二甲苯脱蜡并在乙醇中依次重新水合后，对切片进行热诱导的抗原修复。用3％H2O₂封闭内源过氧化物酶活性，用非免疫马血清封闭非特异性结合。然后切片与一抗4℃过夜孵育。_抗β-联蛋白(sc-65483，加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，）)和抗-Dvl-2(sc-8026，加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司)单克隆抗体以1∶50的稀释度使用。漂洗后，切片与生物素化二抗(1∶200稀释；丹麦哥本哈根的DAKO公司（Dakopatts）)在室温下孵育30分钟，然后根据生产商说明书与来自Vector Elite ABC试剂盒(载体实验室（Vector Laboratories），加利福尼亚州伯林盖姆)的链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合物一起孵育。用3，3’-二氨基联苯胺四盐酸和H₂O₂完成观察。用苏木精反染样本。

氯硝柳胺的药物动力学分析NOD/SCID小鼠(重23-25g)接受口服给予的氯硝柳胺(100mg/kg体重)。通过注射预定剂量的开他敏安乐死后，或在给药后的0.25、0.5、0.75、1、1.5、4、8、12、24小时，从上腔静脉获得血样。将血样置于含有10μL肝素(1000U/mL)的EP管内，1，200g离心10分钟。收集血浆，-20℃冷冻直至HPLC分析。用HPLC法测定小鼠血浆中的氯硝柳胺浓度。

HPLC根据Yi-Wei Chang等(J.Food Drug Anal，2006，14：4，329-333，通过引用全文纳入本文)发表的LC/MS/MS法指导小鼠血浆和肿瘤组织中的氯硝柳胺定量，改良该方法以提高血浆中的检测极限，实现在肿瘤组织中的测定，和使方法适应现有仪器。使用Shimadzu 20A系列LC系统和应用生物系统（AppliedBiosystems）API 4000 QTrap串联质谱仪，参数如下：柱安捷伦(Agilent）Eclipse50x4.6mm，1.8mm；流动相A：10mM乙酸铵，含0.1％甲酸的水；流动相B：甲醇；流速：1mL/分钟；柱温：50°C；注射：5mL；洗脱梯度：0-2分钟50-90％B，2-4.5分钟90％B，注射100mL甲醇(夹带洗涤)，4.5-8.5分钟90％B，8.5-9分钟90-50％B，9-13分钟50％B；MS/MS转换：氯硝柳胺为327/289，萘普生(内标)为229/185。校准曲线在0.2ng/mL(定量下限，LLOQ)到300ng/mL之间呈线性。

肿瘤组织中的氯硝柳胺浓度用HCT116肿瘤细胞(5x10⁶细胞)接种NOD/SCID小鼠，在第4日，开始口服给予(强饲)氯硝柳胺(200mg/kg体重)或对照溶剂。3周治疗后，最后一次口服给药24小时后杀死小鼠，收集血液和肿瘤组织用于分析氯硝柳胺浓度。如上所述从血液中分离血浆。肿瘤组织冷冻于液氮中，粉碎成小片/粉末，用3体积的去离子水在FastPrep仪器(4mm陶瓷珠，20s，速度4；加拿大蒙特利尔的Qbiogene)内的2ml聚丙烯管中匀浆，将50μL等分样品储存在-80℃直至分析。还用HPLC分析测定了组织中的氯硝柳胺浓度。

氯硝柳胺的体内抗肿瘤效果用0.05％胰蛋白酶/EDTA从烧瓶中收集HCT116结肠癌细胞，用PBS洗涤，以5x10⁶细胞/100μL浓度重悬于汉克斯缓冲溶液中。用同样过程收集体外培养的CRC外植体(CRC039)，与等体积的基质胶混合，达到1x10⁶细胞/100μL浓度。将100μl细胞悬液接种到NOD/SCID小鼠腋下，4日后开始治疗。用强饲技术进行氯硝柳胺口服给药，每周6天，持续2(HCT116)或3(CRC039)周。一周3次测量肿瘤大小，直到杀死小鼠。

实施例2：稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞系的产生

为了筛选卷曲蛋白受体内化的小分子调节剂和开发一种对高通量筛选兼容的实验，生成了稳定表达卷曲蛋白1-GFP(Fzd1GFP-U2OS)的U2OS细胞系。用对照条件培养基(CTL CM；图1A)、Wnt3A条件培养基(Wnt3A CM，图1B)和Wnt5A条件培养基(Wnt5A CM；图1C)处理稳定表达卷曲蛋白1-GFP的U2OS细胞6小时。用共焦显微镜初步评估卷曲蛋白1-GFP的细胞分布，用具有IOOX物镜和488nm激发的LSM510共焦显微镜(蔡司)显像细胞。在图1中，用箭头标出了内化的囊泡。卷曲蛋白1-GFP主要位于质膜中，当细胞不用Wnt配体刺激时，几乎不存在内化囊泡(图1A)。当用Wnt3A条件培养基处理时，细胞显示受体荧光的少量内化(图1B)，而接触Wnt5A条件培养基的细胞显示中度胞内荧光量(图1C)。这些观察结果表明卷曲蛋白1内化可提供激动剂/配体活性的读数。

实施例3：FDA-批准的化合物在卷曲蛋白内化实验中的筛选

37℃下，Fzd1-GFP稳定U2OS细胞(Fzd1GFP-U2OS)以384孔形式接触超过1200种来自普雷斯维克（Prestwich）化合物文库的浓度为12.5μM的FDA批准药物和药物样化合物6小时。用ImageXpress超高通量共焦成影系统对细胞进行显像，使用40倍物镜和488nm激发。图2A显示了载剂(DMSO)处理的细胞。图2B显示了接触氯硝柳胺(普雷斯维克01D11，12.5μM)的细胞，箭头标出了内化的囊泡。图2C显示了氯硝柳胺的化学结构。该初步筛选揭示氯硝柳胺(普雷斯维克O1D11)刺激卷曲蛋白1-GFP内化，氯硝柳胺比Wnt3A或Wnt5A刺激(图1B和1C)产生强许多的内化(图2A-2C)。为了验证该结果，还用来自另外供应商(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)的氯硝柳胺处理了Fzd1GFP-U2OS细胞，观察到类似的强卷曲蛋白1-GFP内化。图2D显示载剂处理的卷曲蛋白1-GFP细胞，图2E显示用来自第二来源(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)的氯硝柳胺(12.5μM)处理的细胞，用箭头标出了囊泡。用100倍的物镜和488nm激发的蔡司LSM510共焦显微镜显像细胞。作为对照，用DMSO(图2F)或12.5μM氯硝柳胺(图2G)处理在质膜上稳定表达人EGF受体2-GFP(Her2-GFP)的U2OS细胞。氯硝柳胺不诱导Her2-GFP-U2OS细胞内化卷曲蛋白1-GFP。

在初步筛选过程中，鉴定出另外25种对卷曲蛋白1-GFP内化有些效果的小分子化合物(表1)，但是用TOPFlash荧光素酶报道子实验评估几乎没有或没有观察到对Wnt信号传递的效果(数据未显示)。对于表1中的数据，目测评分卷曲蛋白1，列出了命中化合物的名称和分子量。因此，对这25种化合物不再进行研究，而对显示可能调节Wnt信号传递的氯硝柳胺详细进一步研究。

表1：卷曲蛋白1-GFP内化筛选的总结

实施例4：氯硝柳胺存在下生物素化卷曲蛋白1-GFP的内化

为了评估氯硝柳胺对卷曲蛋白1内化的影响，使用了与生物素标记卷曲蛋白1-GFP质膜受体的初步筛选方法独立和互补的方法。首先，4℃表面生物素化Fzd1GFP-U2OS细胞，仅标记细胞表面受体群。接着，标记的细胞在37℃孵育，在氯硝柳胺存在下内化受体。该实验中内化的受体的生物素标记受到保护免受谷胱甘肽切割，可用抗-GFP免疫印迹呈现。图3的上图显示了用中性亲和素珠下拉和用于卷曲蛋白1-GFP检测的抗-GFP抗体富集的生物素标记的卷曲蛋白1-GFP的免疫印迹(IB)。图3的下图显示了β-肌动蛋白的免疫印迹(IB)，其作为加样对照确保等量细胞裂解物用于中性亲和素下拉。图3中印迹上方标出了表面生物素化、谷胱甘肽、氯硝柳胺和温度的处理。在图3中，泳道1显示了总生物素标记的细胞表面卷曲蛋白1-GFP，泳道2中接近完全消除的卷曲蛋白1条带显示细胞表面的受体(4℃，未内化)易于被谷胱甘肽切下其生物素标记。相反，在37℃的允许内化温度下接触氯硝柳胺的生物素化卷曲蛋白1-GFP(图3泳道4)与未经氯硝柳胺处理细胞(图3泳道3)相比产生强免疫印迹信号，表明氯硝柳胺内化的卷曲蛋白1受体源于质膜。

实施例5：氯硝柳胺存在下卷曲蛋白1-GFP内化的时程

用氯硝柳胺(12.5μM)处理Fzd1-GFP稳定U2OS细胞6小时，在0、1、2、4和6小时死亡时间点取样。为了测定卷曲蛋白1-GFP受体内化的时程，测定胞质斑点/囊泡的聚集(图4A-4E)。通过用计算机程序Metamorph对胞质内含有卷曲蛋白1-GFP的囊泡计数来评估内化，在图表内提供了给定时间的结果(0小时，n=51细胞；1小时，n=69；2小时，n=32；4小时，n=55，和6小时，n=61)。用学生t检验分析针对时间0小时的配对数据，显著性P≤0.0005。图4F是内化时程图示，显示了氯硝柳胺诱导的卷曲蛋白1内化的t_1/2是2.4±0.5小时。

还用含DMSO(0μM)或不同浓度氯硝柳胺(0.47μM，0.94μM，1.88μM，3.75μM，和7.5μM)的载剂处理Fzd1-GFP稳定U2OS细胞6小时。图4定量描述了每个细胞中的囊泡，各细胞数对应于一单独剂量：n=51，42，75，64，55，和57。用学生t检验针对0μM样品进行配对分析数据，显著性P≤0.0005。图5A-5G显示了提高浓度的氯硝柳胺存在下卷曲蛋白1-GFP内化在6小时时间点的剂量依赖性。在1-2μM氯硝柳胺浓度下，观察到内化受体数的显著增加，表明氯硝柳胺诱导的内化在低微摩尔范围内的效力(图5G)。

实施例6：氯硝柳胺存在下卷曲蛋白1-GFP与β ₂ -肾上腺能受体-RFP的共定 位

许多类的膜受体内化到网格蛋白包被小窝。具体地，β₂-肾上腺能受体是G蛋白偶联受体的网格蛋白依赖性内化的原型(Barak，L.S.，等Mol Pharmacol 1997，51，177-184；Goodman，O.B.，Jr.，等Nature 1996，383，447-450，两者都通过引用纳入本文)。转铁蛋白是广泛记载的网格蛋白所介导内化的通用标准(Mellman，I.Annu Rev Cell Dev Biol 1996，12，575-625，通过引用纳入本文)。检测了内化的卷曲蛋白是否与β₂-肾上腺能受体或转铁蛋白一起在胞内囊泡中共定位。图6A-6C显示了同时表达β2-肾上腺能受体-RFP(β₂-AR-RFP，图6A)和卷曲蛋白1受体(Fzd1-GFP，图6B)的未刺激U2OS细胞在活化前的共焦图像。图6C显示了合并图像，表明在这些条件下这两个受体并不在胞内共定位。

细胞37℃接触0.1μM异丙托溴铵(Iso，图6D-F)和12.5μM氯硝柳胺(图6G-I)2小时和6小时。合并的图像显示于图6F和图6I。接触异丙托溴铵和氯硝柳胺2小时或6小时(图6D-6I)导致各受体的胞内分布多处重叠。

在表达Fzd1-GFP受体的细胞中进行了类似研究，其于37℃接触100μg/ml的Alexa-546转铁蛋白(Tf)和12.5μM氯硝柳胺2小时。合并的图像示于（图6L），其中箭头表示共定位囊泡。2小时的内化转铁蛋白显示与内化卷曲蛋白1明显共定位(图6J-6L)。这些数据提示氯硝柳胺诱导的卷曲蛋白1的内化通过网格蛋白包被小窝发生。

实施例7：氯硝柳胺抑制内源性蓬乱蛋白-2的胞质表达。

蓬乱蛋白(哺乳动物细胞中的蓬乱蛋白1、2、和3)是转导卷曲蛋白信号的胞内分子。为了评估氯硝柳胺对Wnt信号机制的效果，在用12.5μM氯硝柳胺处理6小时的U2OS细胞中检测蓬乱蛋白的蛋白表达。在用对照或Wnt3A条件培养基刺激的U2OS细胞中，如免疫印迹所证明，用氯硝柳胺处理6小时导致内源性蓬乱蛋白-2蛋白水平剧烈减少(图7A，其中分子量标准如右侧所示，β-肌动蛋白作为加样对照)。氯硝柳胺浓度约1μM时发生蓬乱蛋白-2的半最大减少，如图7B的免疫印迹所示。在膜组分中检测不到内源性蓬乱蛋白-2，用商业抗体检测不到内源性蓬乱蛋白-1和3。

实施例8：氯硝柳胺存在下LEF/TCF转录因子的活性

LEF/TCF转录因子报道物(TOPFlash)实验是经典Wnt信号传递途径的通用读数。为了评估氯硝柳胺对Wnt信号传递活性的影响，产生了HEK293细胞系，其响应Wnt介导的β-联蛋白诱导而稳定表达LEF/TCF转录因子报道质粒(TOPFlash)。还生成萤火虫荧光素酶质粒作为内部对照。用对照条件培养基或Wnt3A条件培养基在DMSO(载剂)或氯硝柳胺(niclo)存在下处理稳定表达TOPFlash荧光素酶报道子和萤火虫荧光素酶的HEK293细胞。图8A显示了12.5μM氯硝柳胺对Wnt3A刺激的TOPFlash报道活性的抑制效果(ns，不显著(P>0.05)；^＊＊＊，P<0.0001，t检验)，其中CTL CM和Wnt3A CM分别描述了对照和Wnt3A条件培养基。氯硝柳胺促进卷曲蛋白1内化的能力提示了其激动剂或部分激动剂样性能。氯硝柳胺单独并不显著提高TOPFlash(LEF/TCF)报道子信号(图8A)。Wnt3A刺激后，观察到诱导了140倍的LEF/TCF报道子信号(图8A)。很明显，在Wnt3A条件培养基中加入氯硝柳胺阻断了用Wnt3A单独观察到的报道子信号增加(图8A)，表明氯硝柳胺抑制完全激动剂(此情况中是Wnt)诱导的Wnt/卷曲蛋白信号传递。

用不同浓度的氯硝柳胺重复该研究。Wnt3A+DMSO处理的平均TOPFlash报道活性设为100％，计算Wnt3A的相对报道活性+指定氯硝柳胺浓度并作图。如图8B所示，抑制效果具有剂量依赖性，IC₅₀是0.5±0.05μM。

实施例9：氯硝柳胺存在下的胞质β-联蛋白水平

胞质β-联蛋白聚集是经典Wnt信号传递的量度(Mikels，A.J.，和Nusse，R.PLoS Biol 2006，4，e115，通过引用纳入本文)。报道子实验表明Wnt诱导型胞质β-联蛋白聚集应在氯硝柳胺存在下减少。图8C显示了氯硝柳胺防止U2OS细胞内Wnt3A刺激的胞质β-联蛋白稳定化，如胞质β-联蛋白免疫印迹所示(比较泳道3和4，上图，胞质)。用β-肌动蛋白作为加样对照。然而，膜结合β-联蛋白水平相对不变(图8C，下图，膜)，表明信号传递-β联蛋白库中的减少不是由于-联蛋白表达的损失。通过图8D的免疫印迹中存在的剂量依赖性测定氯硝柳胺抑制在Wnt所介导β-联蛋白稳定中的效力。图8C显示了7.5μM氯硝柳胺处理的效果，其中图8D显示了抑制效果在1-7.5μM氯硝柳胺(n=3)的范围内发生。Wnt3A信号传递的半最大抑制在约1μM的氯硝柳胺浓度下发生。

总之，数据表明氯硝柳胺促进卷曲蛋白1内化下调蓬乱蛋白-2的表达，抑制Wnt3A刺激的LEF/TCF(TOPflash)报道活性和β-联蛋白稳定化。因此，氯硝柳胺的功能是Wnt信号转导的抑制物。

实施例10：氯硝柳胺对结直肠癌外植体和细胞系的细胞毒性效果

在该研究中使用了三种结直肠癌细胞系：HT29、CaCO2和HCT116。HT29和CaCO2表达突变APC和未突变的β-联蛋白。HCT116细胞表达突变β-联蛋白和未突变的APC。全部三种细胞都表达卷曲蛋白-1和卷曲蛋白-2。

结直肠癌细胞以5000细胞/孔在96孔平底板的200μL完全RPMI1640培养基中培养。细胞37℃粘附在平板上过夜(第0日)。加入数剂氯硝柳胺(0.4μM，2μM，10μM)或10μM奥沙利铂(作为对照)，细胞再培养3日(72小时)。然后在各孔中加入20μL 10xMTT溶液，37℃孵育2小时。用150μL DMSO裂解贴壁细胞，然后测定562nm处的光密度(OD)。用DMSO或培养基作为对照。全部三种细胞系都显示在氯硝柳胺存在下增殖减少(图9A)。HCT116细胞最敏感，而HT29细胞对氯硝柳胺较不敏感，仅在最高浓度(10μM)显示抗增殖效应。即使在2μM浓度下，氯硝柳胺也显示对HCT116和CaCO2细胞的细胞毒性作用强于10μM奥沙利铂。

对8种不同CRC外植体(CRC007，CRC010，CRC020，CRC025，CRC028，CRC039，CRC057，CRC119)分析氯硝柳胺针对原代培养细胞的细胞毒性作用。CRC外植体以10,000细胞/孔在96孔平底板的200μL完全RPMI1640培养基中培养。细胞37℃粘附在平板上过夜(第0日)。加入数剂氯硝柳胺(0.4μM，2μM，10μM)或10μM奥沙利铂(作为对照)，细胞再培养3日(72小时)。然后在各孔中加入20μL 10xMTT溶液，37℃孵育2小时。用150μL DMSO裂解贴壁细胞，然后测定562nm处的光密度(OD)。用DMSO或培养基作为对照。所有CRC外植体都显示氯硝柳胺的细胞毒性作用，代表性例子如图9B所示。在所有CRC外植体中都观察到氯硝柳胺的剂量依赖性作用，其中敏感性有些不同。

实施例11：氯硝柳胺随时间对结肠癌细胞系的效应

为了评估氯硝柳胺随时间对结肠癌的效应，以5000细胞/孔培养3种细胞系(HT29，HCT116，和CaCO2)。过夜孵育后，加入不同浓度的氯硝柳胺(0.4μM，2μM，10μM)或奥沙利铂(10μM，20μM作为阳性对照)，平板孵育24、48、72或96小时。在每个时间点进行MTT实验。通过将不同氯硝柳胺浓度下的每个OD562nm值除以相同时间点对照条件(单独培养基，氯硝柳胺0μM)的OD562nm值来测定与对照相比的增殖百分数。如图10所示，HT29细胞对氯硝柳胺不敏感，而HCT116和CaCO2对氯硝柳胺敏感。氯硝柳胺在低于其它细胞系的浓度(0.4μM)下随时间杀死HCT116。有趣的是，2μM和10μM氯硝柳胺对结直肠癌细胞系的细胞毒性大于10μM或20μM已知临床有效的奥沙利铂。

实施例12：氯硝柳胺对非肿瘤细胞的作用

可用膜联蛋白V作为凋亡和其它形式的细胞死亡的标记。为了评估氯硝柳胺的毒性，使用来自正常供体的外周血单核细胞(PBMC)和分离自结直肠癌病人肿瘤组织的成纤维细胞并检测膜联蛋白V。HCT116和CRC119肿瘤细胞(1x10⁵细胞/孔)、成纤维细胞(1x10⁵细胞/孔)、或衍生自正常供体的外周血单核细胞(PBMC，1x10⁶细胞/孔)在12孔平底板中与浓度范围为0.2μM-20μM的氯硝柳胺一起培养。培养3日后，用0.05％胰蛋白酶/EDTA收获细胞，用生物素偶联的膜联蛋白V标记，然后用7-AAD和链霉亲和素－APC染色。用FACSCalibur获得样品，分析膜联蛋白V阳性细胞百分数，如图1 1所示作图。分析细胞中作为凋亡标记的膜联蛋白V的表达。各种细胞类型对于不同浓度的氯硝柳胺显示了膜联蛋白V阳性群体的百分数增加(与未处理对照相比)。CRC外植体和HCT116细胞分别显示1μM或0.2μM氯硝柳胺下膜联蛋白V阳性细胞急剧增加。这些肿瘤细胞中膜联蛋白V阳性细胞的最大百分数达到约60-80％，提示凋亡细胞死亡的显著诱导。然而，成纤维细胞不显示显著增加的凋亡细胞死亡，PBMC在更高剂量显示凋亡(约10-20μM)。该结果表示氯硝柳胺对非肿瘤细胞没有强毒性，虽然较高浓度(约10-20μM)时在PBMC中诱导适度凋亡。

实施例13：氯硝柳胺抑制结直肠癌细胞中内源性蓬乱蛋白-2和β-联蛋白的胞 质表达。

用不同浓度氯硝柳胺(0.1μM、5μM、10μM)过夜(18小时)处理CRC057外植体和结直肠细胞系HCT116的Dvl-2和β-联蛋白表达。用PBS洗涤细胞后，用等渗裂解缓冲液制备细胞裂解物。分离裂解物的胞质组分，用抗-蓬乱蛋白2(克隆3F12)、抗-β-联蛋白(克隆7D11)、和抗-β-肌动蛋白(克隆C-11)单克隆抗体进行蛋白质印迹分析。揭示了在这些癌细胞中氯硝柳胺也下调Dvl-2表达和β-联蛋白表达(图12)。有趣的是，根据上述细胞毒性实验(MTT实验)对氯硝柳胺不敏感的HT29细胞也显示了较温和的胞质Dvl-2/β-联蛋白表达的改变，而敏感的CRC外植体和细胞系(CRC057，CRC119，HCT116，和CaCO2)显示更明显的Dvl-2表达和β-联蛋白表达的下调。结果揭示了细胞毒效应和Wnt/卷曲蛋白1信号传递抑制的关联性。

实施例14：抗癌药物奥沙利铂与氯硝柳胺的联合效果

我们力求在72小时培养后通过MTT实验评估氯硝柳胺与其它抗癌药对结直肠癌的联合效果。在该研究中，使用奥沙利铂，因为它是联合治疗中广泛使用的药物。结直肠癌细胞系(HT29，HCT116)在96孔板中以5,000细胞/孔培养，用各种氯硝柳胺和奥沙利铂的组合处理(0，0.4μM，2.0μM，5.0μM，10.0μM的氯硝柳胺；0，5.0μM的奥沙利铂)。72小时孵育后进行MTT实验。用DMSO裂解细胞后，测定562nm处的光密度(OD)。如图13A所示，即使添加较低浓度(约1-2μM)的奥沙利铂，也比单用氯硝柳胺诱导更多的CaCO2细胞杀伤。例如，加入2μM奥沙利铂，氯硝柳胺的IC50从1.0μM降低到了0.5μM。用CRC外植体细胞(CRC020，图13B)观察到类似的加成效果，虽然这些细胞被5μM氯硝柳胺显著杀伤，而用约2.5-10μM奥沙利铂不能诱导额外的细胞毒性。

实施例15：NOD/SCID小鼠中口服给药后氯硝柳胺的药物动力学分析。

分析了口服给药的氯硝柳胺的药物动力学。NOD/SCID小鼠(重23-25g)接受口服给药的氯硝柳胺(200mg/kg体重，溶于90％聚乙烯Glycol-300、10％1-甲基-2-吡咯烷酮)。在给药后的0.25，0.5，0.75，1，1.5，4，8，12，24小时从上腔静脉获得预定剂量的血样。用肝素(100U/ml)离心(1200g，10分钟)收集血浆。通过LC/MS/MS进行小鼠血浆的氯硝柳胺定量，报道为ng/mL(基于分子量327，100ng/mL=0.306μM)。口服给药200mg/kg后小鼠中氯硝柳胺的血浆浓度如图14A所示。从2点直线(12小时和24小时)的斜率计算消除率(z-λ)和半衰期（t1/2）为0.217/小时和3.2小时。有趣的是，浓度-时间数据显示锐峰(Tmax 0.25小时，Cmax 893.7ng/mL)，血浆浓度在口服给药30分钟后急剧下降，在1.5小时显示第2峰(77.6ng/mL)，逐渐下降直到24小时时间点。1小时处的反弹可解释为氯硝柳胺从小肠重吸收或药物分布到第三区室。1小时后的两相消除也可用重吸收解释。口服后0.5-12小时，血浆浓度较为稳定地维持在39.5-77.6ng/mL(约0.1-0.2μM)范围内。

还分析了肿瘤组织中的氯硝柳胺浓度。用HCT116肿瘤细胞(5x10⁶细胞)接种NOD/SCID小鼠，在第4日，开始口腔给强饲氯硝柳胺(200mg/kg体重)或对照溶剂。3周治疗后，最后一次口服给药24小时后杀死小鼠，同时收集血液和肿瘤组织以测定氯硝柳胺浓度。如上所述从血液中分离血浆。肿瘤组织在液氮中低温破碎，用三体积去离子水匀浆。用LC/MS/MS定量小鼠血浆和肿瘤组织中的氯硝柳胺。对每只小鼠的肿瘤组织中的氯硝柳胺浓度(ng/g组织)和血浆中的浓度(ng/ml)作图(图14B)。肿瘤组织的氯硝柳胺浓度和血浆中的浓度显示良好关联性，提示氯硝柳胺从血液中有效分布到肿瘤组织。

实施例16：体内氯硝柳胺抗肿瘤效果

如上所示，氯硝柳胺在体外实验中对结直肠癌细胞有细胞毒性。还进行了体内实验评估氯硝柳胺的抗肿瘤效果。使用了HCT116细胞和CRC039细胞。

用0.05％胰蛋白酶/EDTA从烧瓶中收集HCT116结肠癌细胞，以5x10⁶细胞/100μL浓度重悬于汉克斯缓冲溶液中。用同样过程收集体外培养的CRC外植体(CRC039)并与等体积的基质胶混合，达到1x10⁶细胞/100μL浓度。将细胞悬液（100μl）接种到NOD/SCID小鼠腋下，4日后开始治疗。每周通过强饲给予氯硝柳胺(0，10，100，或200mg/kg体重)6日，共2周(HCT116，左)或3周(CRC039，右)。最初，对HCT116和CRC039都计划进行2周治疗。然而，由于NOD/SCID小鼠比HCT116细胞系生长慢得多，因此对于CRC039细胞的治疗延长到3周。一周3次测量肿瘤大小，直到小鼠安乐死。在氯硝柳胺治疗过程中，小鼠内未观察到明显副作用。如图15所示，氯硝柳胺显著抑制HCT116和CRC039肿瘤的生长。在快速生长的肿瘤(HCT116)中，200mg/kg体重的剂量在2周治疗后将肿瘤生长抑制到一半体积。然而，100mg/kg氯硝柳胺可将相对较缓慢生长的肿瘤(CRC039)生长抑制到相同程度。分析了另一CRC外植体(CRC028)，观察到氯硝柳胺(每天25mg/kg)对肿瘤生长的抑制与未处理小鼠相似。因此，体外结果在体内得到证实，即氯硝柳胺在NOD/SCID小鼠中抑制结直肠癌的生长。

实施例17：氯硝柳胺处理的结直肠癌肿瘤中蓬乱蛋白-2和β-联蛋白的表达。

用结直肠癌外植体或细胞系移植NOD/SCID小鼠。腋下肿瘤建立后，用或不用氯硝柳胺(200mg/kg体重)处理小鼠2或3周。切下肿瘤，用10％中和的缓冲福尔马林固定。将石蜡包埋的样品切成4μM厚的系列切片。脱蜡和重新水合后，进行热诱导抗原修复。用3％H2O₂封闭内源过氧化物酶活性，用非免疫马血清封闭非特异性结合。然后将切片与抗β-联蛋白和抗Dvl-2单克隆抗体(1∶50稀释)一起4℃孵育过夜。漂洗后，切片与生物素化二抗(1∶200稀释)室温孵育30分钟，然后与链霉亲和素-生物素过氧化酶复合物一起孵育。用3，3’-二氨基联苯胺四盐酸和H₂O₂完成观察。用苏木精反染样本。氯硝柳胺处理的肿瘤显示胞质Dvl-2和β-联蛋白表达水平相较对照处理的肿瘤下降(图16，放大200倍)。该结果表明氯硝柳胺体内对于Wnt/β-联蛋白信号传递的延长抑制效果。

实施例18：氯硝柳胺化合物治疗高血压

进行体内实验以评估氯硝柳胺化合物对心血管疾病，例如高血压的效果。实验使用一种或多种心血管疾病的现有或后来开发的模型，例如心血管疾病的大鼠模型，例如自发高血压大鼠(SHR/NCrl，马里兰州德国镇的查尔斯河实验室（CharlesRiver Laboratories）)。该模型系统能纳入失调的Wnt/卷曲蛋白信号级联。可以任何可接受的途径(例如口腔、肌肉、通过注射等)和任何已知技术，例如强饲技术给予氯硝柳胺化合物。给予治疗相关量的氯硝柳胺化合物(例如0、10、100或200mg/kg，一周6次，1-10周)后，预期氯硝柳胺化合物能就所述模型系统中指示高血压的生理症状和/或生物标记显示明显的减轻和/或改善。

实施例19：氯硝柳胺化合物治疗心血管疾病

进行体内实验以评估氯硝柳胺化合物对心血管疾病的效果。使用心血管疾病大鼠，例如自发高血压心脏衰竭大鼠(SHHF/MccGmiCrl-Lepr^cp，马里兰州德国镇的查尔斯河实验室)。该模型系统能纳入失调的Wnt/卷曲蛋白信号级联。可以任何可接受的途径(例如口腔、肌肉、通过注射等)和任何已知技术，例如强饲技术给予氯硝柳胺化合物。给予治疗相关量的氯硝柳胺化合物(例如0、10、100或200mg/kg，一周6次，1-10周)后，预期氯硝柳胺化合物能就指示心脏衰竭的生理症状和/或生物标记显示明显的减轻和/或改善。

实施例20：氯硝柳胺衍生物或类似物对Wnt/卷曲蛋白信号途径的效果。

表2所示的化合物购自西格玛—奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)或Chembridge(加利福尼亚州圣地亚哥)。用Top-flash实验如上所述检测了作为Wnt/卷曲蛋白信号途径负调节物的各种化合物的活性。结果见表3。

表2：氯硝柳胺化合物

X¹=O;D=CR⁹;E=CR¹⁰;F=CR¹¹;R=H，除非如下指定

表3.氯硝柳胺化合物作为Wnt/卷曲蛋白信号途径负调节物的活性。

SEQ ID NO：1

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号BAB61052

352氨基酸

1    maplgyflll cslkqalgsy piwwslavgp qysslgsqpi lcasipglvp kqlrfcrnyv

61   eimpsvaegi kigiqecqhq frgrrwnctt vhdslaifgp vldkatresa fvhaiasagv

121  afavtrscae gtaaicgcss rhqgspgkgw kwggcsedie fggmvsrefa darenrpdar

181  samnrhnnea grqaiashmh lkckchglsg scevktcwws qpdfraigdf lkdkydsase

241  mvvekhresr gwvetlrpry tyfkvpterd lvyyeaspnf cepnpetgsf gtrdrtcnvs

301  shgidgcdll ccgrghnara errrekcrcv fhwccyvscq ectrvydvht ck

β-联蛋白=SEQ ID NO:2

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号NP_001091679,NP_001091680.1,或NP_001895.1

781氨基酸

1    matqadlmel dmamepdrka avshwqqqsy ldsgihsgat ttapslsgkg npeeedvdts

61   qvlyeweqgf sqsftqeqva didgqyamtr aqrvraamfp etldegmqip stqfdaahpt

121  nvqrlaepsq mlkhavvnli nyqddaelat raipeltkll ndedqvvvnk aavmvhqlsk

181  keasrhaimr spqmvsaivr tmqntndvet arctagtlhn lshhreglla ifksggipal

241  vkmlgspvds vlfyaittlh nlllhqegak mavrlagglq kmvallnktn vkflaittdc

301  lqilaygnqe skliilasgg pqalvnimrt ytyekllwtt srvlkvlsvc ssnkpaivea

361  ggmqalglhl tdpsqrlvqn clwtlrnlsd aatkqegmeg llgtlvqllg sddinvvtca

421  agilsnltcn nyknkmmvcq vggiealvrt vlragdredi tepaicalrh ltsrhqeaem

481  aqnavrlhyg lpvvvkllhp pshwplikat vglirnlalc panhaplreq gaiprlvqll

541  vrahqdtqrr tsmggtqqqf vegvrmeeiv egctgalhil ardvhnrivi rglntiplfv

601  qllyspieni qrvaagvlce laqdkeaaea ieaegatapl tellhsrneg vatyaaavlf

661  rmsedkpqdy kkrlsvelts slfrtepmaw netadlgldi gaqgeplgyr qddpsyrsfh

721  sggygqdalg mdpmmehemg ghhpgadypv dglpdlghaq dlmdglppgd snqlawfdtd

781  1

卷曲蛋白1=SEQ ID NO:3

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号NP_003496.1

647氨基酸

1    maeeeapkks raagggaswe lcagalsarl aeegsgdagg rrrppvdprr larqlllllw

61   lleaplllgv raqaagqgpg qgpgpgqqpp pppqqqqsgq qyngergisv pdhgycqpis

121  iplctdiayn qtimpnllgh tnqedaglev hqfyplvkvq csaelkfflc smyapvctvl

181  eqalppcrsl cerarqgcea lmnkfgfqwp dtlkcekfpv hgagelcvgq ntsdkgtptp

241  sllpefwtsn pqhgggghrg gfpggagase rgkfscpral kvpsylnyhf lgekdcgapc

301  eptkvyglmy fgpeelrfsr twigiwsvlc castlftvlt ylvdmrrfsy perpiiflsg

361  cytavavayi agflledrvv cndkfaedga rtvaqgtkke gctilfmmly ffsmassiww

421  vilsltwfla agmkwgheai eansqyfhla awavpaikti tilalgqvdg dvlsgvcfvg

481  lnnvdalrgf vlaplfvylf igtsfllagf vslfrirtim khdgtktekl eklmvrigvf

541  svlytvpati viacyfyeqa frdqwerswv aqscksyaip cphlqaggga pphppmspdf

601  tvfmikylmt livgitsgfw iwsgktlnsw rkfytrltns kqgettv

蓬乱蛋白Dvl1=SEQ ID NO:4

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号CAI23185.1

670氨基酸

1    maetkiiyhm deeetpylvk lpvapervtl adfknvlsnr pvhaykfffk smdqdfgvvk

61   eeifddnakl pcfngrvvsw lvlaegahsd agsqgtdsht dlppplertg gigdsrppsf

121  hpnvassrdg mdnetgtesm vshrrerarr rnreeaartn ghprgdrrrd vglppdsast

181  alsselesss fvdsdedgst srlsssteqs tssrlirkhk rrrrkqrlrq adrassfssi

241  tdstmslniv tvtlnmerhh flgisivgqs ndrgdggiyi gsimkggava adgriepgdm

301  llqvndvnfe nmsnddavrv lreivsqtgp isltvakcwd ptprsyftvp radpvrpidp

361  aawlshtaal tgalpryele eapltvksdm savvrvmqlp dsgleirdrm wlkitianav

421  igadvvdwly thvegfkerr earkyassll khgflrhtvn kitfseqcyy vfgdlcsnla

481  tlnlnsgssg tsdqdtlapl phpaapwplg qgypyqypgp ppcfppayqd pgfsygsgst

541  gsqqsegsks sgstrssrra pgrekerraa gaggsgsesd htapsgvgss wrerpagqls

601  rgssprsqas atapglppph pttkaytvvg gppggppvre laavppeltg srqsfqkamg

661  npceffvdim

蓬乱蛋白Dvl2=SEQ ID NO:5

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号NP_004413.1

736氨基酸

1    magsstgggg vgetkviyhl deeetpylvk ipvpaeritl gdfksvlqrp agakyffksm

61   dqdfgvvkee isddnarlpc fngrvvswlv ssdnpqpema ppvheprael appapplppl

121  ppertsgigd srppsfhpnv ssshenlepe tetesvvslr rerprrrdss ehgagghrtg

181  gpsrlerhla gyessstlmt selestslgd sdeedtmsrf sssteqssas rllkrhrrrr

241  kqrpprlert ssfssvtdst mslniitvtl nmekynflgi sivgqsnerg dggiyigsim

301  kggavaadgr iepgdmllqv ndmnfenmsn ddavrvlrdi vhkpgpivlt vakcwdpspq

361  ayftlprnep iqpidpaawv shsaaltgtf paypgsssms titsgsslpd gcegrglsvh

421  tdmasvtkam aapesglevr drmwlkitip naflgsdvvd wlyhhvegfp errearkyas

481  gllkaglirh tvnkitfseq cyyvfgdlsg gcesylvnls lndndgssga sdqdtlaplp

541  gatpwpllpt fsyqypaphp yspqpppyhe lssytygggs assqhsegsr ssgstrsdgg

601  agrtgrpeer apesksgsgs esepssrggs lrrggeasgt sdggpppsrg stggapnlra

661  hpglhpygpp pgmalpynpm mvvmmppppp pvppavqppg appvrdlgsv ppeltasrqs

721  fhmamgnpse ffvdvm

蓬乱蛋白Dvl3=SEQ ID NO:6

多肽序列

智人(homo sapiens),登录号NP_004414.3

716氨基酸

1    mgetkiiyhl dgqetpylvk lplpaervtl adfkgvlqrp sykfffksmd ddfgvvkeei

61   sddnaklpcf ngrvvswlvs aegshpdpap fcadnpselp ppmertggig dsrppsfhph

121  agggsqenld ndtetdslvs aqrerprrrd gpehatrlng takgerrrep ggydssstlm

181  sselettsff dsdeddstsr fsssteqssa srlmrrhkrr rrkqkvsrie rsssfssitd

241  stmslniitv tlnmekynfl gisivgqsne rgdggiyigs imkggavaad griepgdmll

301  qvneinfenm snddavrvlr eivhkpgpit ltvakcwdps prgcftlprs epirpidpaa

361  wvshtaamtg tfpaygmsps lstitstsss itssipdter lddfhlsihs dmaaivkama

421  spesglevrd rmwlkitipn afigsdvvdw lyhnvegftd rrearkyasn llkagfirht

481  vnkitfseqc yyifgdlcgn manlslhdhd gssgasdqdt laplphpgaa pwpmafpyqy

541  pppphpynph pgfpelgysy gggsassqhs egsrssgsnr sgsdrrkekd pkagdsksgg

601  sgsesdhttr sslrgprera psersgpaas ehshrshhsl asslrshhth psygppgvpp

661  lygppmlmmp pppaamgppg appgrdlasv ppeltasrqs frmamgnpse ffvdvm

Claims (17)

1.有效量的氯硝柳胺化合物或其药物学上可接受的盐用于制备在需要治疗的对象内治疗Wnt/卷曲蛋白相关疾病的药物的用途，其中所述氯硝柳胺化合物选自：N-(4-氨基-2-氯苯基)-5-氯-2-羟基苯甲酰胺、5-氯-2-羟基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺、5-氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-甲氧基-苯甲酰胺、氯硝柳胺、氯羟柳胺、碘醚柳胺、氯生太尔、3,5-二溴-N-(4-溴苯基)-2-羟基苯甲酰胺、N-(5-氯-2-甲基-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺、3,5-二氯-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺、5-溴-N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺、5-溴-2-羟基-N-(4-硝基苯基)苯甲酰胺、N-(2-溴-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-2-羟基苯甲酰胺、5-氯-2-羟基-N-(2-甲氧基-4-硝基苯基)苯甲酰胺、或5-氯-N-(2-氯-4-(甲基磺酰基)-2-羟基苯甲酰胺，其中Wnt/卷曲蛋白相关疾病是心血管疾病。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病是心脏衰竭或高血压。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述疾病涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平与至少一种蛋白的标准水平有差异。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病是心脏衰竭或高血压。

5.一种用于确定涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平的试剂的用途，其特征在于，用于制备试剂盒，鉴定患有对氯硝柳胺化合物治疗易感的Wnt/卷曲蛋白相关疾病对象，所述鉴定包括：

a)确定对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和

b)将样品中至少一种蛋白的水平与至少一种蛋白的标准水平作比较；

其中样品中至少一种蛋白水平的差异将对象鉴定为患有对氯硝柳胺化合物治疗易感的Wnt/卷曲蛋白相关疾病。

6.一种用于确定涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平的试剂用于制备试剂盒的用途，其特征在于，该试剂盒用于优化Wnt/卷曲蛋白相关疾病治疗的疗效，所述优化包括：

a)确定患有所述Wnt/卷曲蛋白相关疾病的对象样品中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和

b)给予对象氯硝柳胺化合物；和

c)给予氯硝柳胺化合物后，测定对象内涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；

其中当至少一种蛋白的水平在给予氯硝柳胺化合物后降低约30％或以下时，该水平表明需要提高随后给予对象的氯硝柳胺化合物量。

7.一种用于确定涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平的试剂用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于预测癌细胞对氯硝柳胺化合物治疗的响应，所述预测包括：

a)确定癌细胞中涉及Wnt/卷曲蛋白信号传递途径的至少一种蛋白的水平；和

b)将至少一种蛋白的水平与至少一种蛋白的标准水平作比较；

其中癌细胞中至少一种蛋白水平之间的差异表明癌细胞响应氯硝柳胺化合物的治疗。

8.权利要求3-7中任一所述的用途，其特征在于，所述至少一种蛋白的水平是通过测定编码该蛋白的mRNA的表达水平来检测。

9.如权利要求3-7中任一所述的用途，其特征在于，所述至少一种蛋白选自胞质β-联蛋白、Wnt蛋白、卷曲蛋白和蓬乱蛋白。

10.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述Wnt蛋白是Wnt3A。

11.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述Wnt/卷曲蛋白相关疾病选自肿瘤和心血管疾病。

12.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，Wnt/卷曲蛋白相关疾病是肿瘤。

13.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是癌。

14.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述癌症是癌、腺瘤、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、髓细胞性白血病、淋巴白血病、母细胞瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、间皮瘤或生殖细胞瘤。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述癌来自结肠、直肠、宫颈、皮肤、表皮、肌肉、肾脏、肝脏、淋巴、骨骼、血液、卵巢、前列腺、肺、脑、或乳腺。

16.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌细胞来自癌、腺瘤、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、髓细胞性白血病、淋巴白血病、母细胞瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、间皮瘤或生殖细胞瘤。

17.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述癌细胞来自结肠、直肠、宫颈、皮肤、表皮、肌肉、肾脏、肝脏、淋巴、骨骼、血液、卵巢、前列腺、肺、脑、或乳腺。