CN102827265A - Snx家族新基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了SNX家族的新基因及其用途。其中，一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该多肽，能够治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

Description

SNX家族新基因及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其是，本发明涉及SNX11基因及其用途。

背景技术

内涵体是真核细胞内部众多独立的膜泡结构，分布于整个细胞质之中，负责在细胞不同部位之间的物质转运，对细胞内物质转运意义重大。一旦内涵体转运出现混乱，就会影响细胞的正常生理进程，例如内涵体负责的信号分子受体转运障碍会导致细胞增殖，分化失控等。Sorting Nexins(SNXs)是对内涵体进行精细调控的蛋白家族，这个家族发现的比较晚，在人(Homo sapiens)中共有33个成员，都具有PX结构域(phox-homology domain)作为这一家族的特征结构域。

目前对于SNX家族的研究仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

发明人经过分析，该多肽在SNX家族进化树上与SNX10最为接近，二者PX结构域的相似性为78％，为此将该多肽在本文中命名为SNX11。发明人发现，在哺乳动物细胞中表达SNX11后发现它不产生和SNX10相似的成泡现象。而当发明人将SNX10和SNX11共转染到细胞中时，发明人发现SNX11可以显著的抑制SNX10诱导的成泡现象。另外，发明人发现SNX11抑制了晚期内涵体的异常扩大和成熟，但对Rab7的募集不产生影响。

进一步，发明人发现，通过表达SNX11可以抑制VacA在细胞中的空泡化作用。发明人发现在VacA处理后的细胞中，出现大量的扩大的晚期内涵体。当细胞转染表达根据本发明实施例的多肽SNX11后，虽然Rab7依然出现聚集现象，但晚期内涵体的进一步扩大则被抑制。

另外，发明人建立了SNX11基因敲除小鼠，发现与野生型对照组相比，SNX11缺陷鼠可显著抑制疟原虫的增殖，并有较高比率的小鼠存活，来自SNX11缺陷鼠的脾脏细胞在体外表现出更强的细胞增殖反应和分泌与抗疟疾免疫力相关的白介素12(IL-12)和γ干扰素，表明疟疾感染在SNX11缺陷鼠中可诱导更强的免疫反应。疟原虫感染后检测血清特异性抗体水平显示，SNX11小鼠产生了高水平的抗疟疾抗体。SNX11基因表达水平分析表明，该基因在脑组织中表达丰富；在主要免疫细胞(CD4T细胞、CD8T细胞B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞)中，SNX11都有表达，其中，SNX11基因在中性粒细胞中表达最高，而且在疟原虫感染后，该基因表达在所分析的上述主要免疫细胞中均有显著下降。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该寡核苷酸能够编码前面所述的多肽。根据本发明实施例的寡核苷酸能够编码前面所述的多肽，由此，可以有效地实现体外表达本发明所分离的多肽，并且适于大规模表达分离所述的多肽。根据本发明的实施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高表达根据本发明实施例的多肽的效率。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，该表达载体包含编码前面所述分离的多肽的核酸分子。由此，利用该表达载体，能够有效地在体外表达体系例如重组细胞中，表达根据本发明实施例的多肽。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞中包含前面所述多肽的核酸分子，优选地包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，任选地所述细胞为动物细胞，优选非人哺乳动物细胞，更优选啮齿类动物细胞，最优选小鼠细胞。

在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的多肽、寡核苷酸、或者表达载体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物可以用于下列至少之一：治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备前面所述重组细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使用前面所述的表达载体转化宿主细胞；以及分离重组细胞，任选地所述宿主细胞为动物细胞，优选非人哺乳动物细胞，更优选啮齿类动物细胞，最优选小鼠细胞。利用该方法，能够有效地获得根据本发明实施例所述的重组细胞。

在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包含前面所述的多肽、寡核苷酸、表达载体和重组细胞的至少一种，该药物用于下列至少之一：治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

在本发明的第八方面，本发明提出了一种动物细胞及其衍生物。根据本发明的实施例，该动物细胞的SNX11基因的表达量下降。根据本发明的实施例，该动物细胞的基因组中，至少一个SNX11等位基因被敲除。由此，构建了基因组中缺失了SNX11基因的动物细胞，进一步可以利用该细胞构建缺失SNX11的动物，例如小鼠。

在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于SNX11基因敲除的载体。根据本发明的实施例，该载体包含：插入序列，所述插入序列不具有SNX11基因的全部活性；第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，其中，所述第一同源臂和第二同源臂适于与基因组上SNX11基因的侧翼区发生同源重组。由此，利用该载体，能够有效地构建基因敲除细胞/动物。

在本发明的第十方面，本发明提出了一种构建SNX11基因敲除动物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：通过同源重组向胚胎干细胞基因组内导入前面所述的用于SNX11基因敲除的载体；从胚胎干细胞中繁殖杂合和/或纯合的基因敲除动物，以及获得SNX11基因敲除动物，优选动物为非人哺乳动物，更优选啮齿类动物，最优选小鼠。

在本发明的第十一方面，本发明提出了抑制SNX11基因表达的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制疟原虫的增殖。

在本发明的第十二方面，本发明提出了一种筛选用于抑制疟原虫的增殖的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的重组细胞与药物候选物接触；检测与所述药物候选物接触前后，所述重组细胞中SNX11基因的表达量，以便分别获得第一表达量和第二表达量；以及第二表达量低于第一表达量为所述药物候选物为用于抑制疟原虫增殖的药物的指示。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例，SNX11通过抑制V-ATPase，抑制晚期内涵体的成熟，其中，A显示SNX11抑制细胞中SNX10导致的空泡化现象，B显示SNX10在细胞中导致晚期内涵体的异常成熟，C显示SNX11抑制SNX10作用下晚期内涵体的成熟，D显示SNX11与V-ATPase的V1D亚基相互作用；

图2显示了根据本发明的一个实施例，SNX11抑制VacA在细胞的空泡化作用，其中，A显示SNX11抑制VacA在细胞中诱导空泡，B显示了A的统计结果，C显示SNX11抑制VacA作用下晚期内涵体的扩大；

图3显示了根据本发明一个实施例的SNX11晶体结构，其中，(a)显示了SNX11-142C的总体结构，(b)显示了SNX11-170C的总体结构；

图4显示了SNX11磷脂结合及表面电势分析，其中，(a)显示了SNX11-142C和P40^phox-pX结构域的磷脂酰肌醇结合口袋中关键氨基酸残基的比对，(b)显示了SNX11-142C的B分子可能的膜结合界面的表面电势图；

图5显示了根据本发明一个实施例，SNX11中的两个碱性口袋与硫酸根离子结合，其中，(a)显示了磷脂酰肌醇结合口袋与硫酸根离子结合，(b)显示了SNX11-142C的A分子中第二个碱性口袋与硫酸根离子结合，(c)显示了SNX11-142C的B分子中第二个碱性口袋与硫酸根离子结合；

图6显示了SNX11膜结合模型，其中，(a)W32和F88插入到膜双分子层中，L76远离胞膜。(b)F88和L76插入到膜双分子层中，W32不与膜结合；

图7显示了根据本发明的一个实施例，SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)感染小鼠疟原虫(Plasmodium berghei)后的血虫水平变化(A)和存活率(B)；

图8显示了根据本发明一个实施例，来自SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)的脾脏细胞体外增殖反应水平(A)和分泌gamma干扰素(B)及白介素12(C)的能力；

图9显示了根据本发明的实施例，疟疾感染5周后，SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)血清抗疟原虫特异性抗体水平；

图10显示了根据本发明的实施例，SNX11基因在不同组织器官中(A)和分离纯化的免疫细胞(B)中的表达水平；以及

图11显示了根据本发明的实施例，构建SNX11基因敲除载体的流程示意图(A)以及对利用该载体制备的基因敲除小鼠的PCR鉴定结果(B)以及该小鼠大脑中SNX11的mRNA的RT-PCR检测结果(C)。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

SNX11及其编码基因

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人分离了一种多肽，该多肽具有如下所示的氨基酸序列：

MGFWCRMSENQEQEEVITVRVQDPRVQNEGSWNSYVDYKIFLHTNSKAFTAKTSCVRRRYREFVWLRKQLQRNAGLVPVPELPGKSTFFGTSDEFIEKRRQGLQHFLEKVLQSVVLLSDSQLHLFLQSQLSVPEIEACVQGRSTMTVSDAILRYAMSNCGWAQEERQSSSHLAKGDQPKSCCFLPRSGRRSSPSPPPSEEKDHLEVWAPVVDSEVPSLESPTLPPLSSPLCCDFGRPKEGTSTLQSVRRAVGGDHAVPLDPGQLETVLEK(SEQ ID NO：1)。该多肽在本文中被命名为“SNX11”，其编码基因被命名为“SNX11基因”。在本文中所使用的表达方式“SNX11”与“根据本发明实施例的多肽”或者“多肽”是可以替换使用的。需要说明的是，该命名本身，并不对本发明实施例的肽本身作出任何限制。另外，本发明还提出了一种分离的寡核苷酸。根据本发明的实施例，该寡核苷酸能够编码前面所述的多肽。根据本发明实施例的寡核苷酸能够编码前面所述的多肽，由此，可以有效地实现体外表达本发明所分离的多肽，并且适于大规模表达分离所述的多肽。根据本发明的实施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：

atgggctttt ggtgtaggat gtcggagaac caagaacagg aggaggtgat tacagtgcgt

gttcaggacc cccgagtgca gaatgagggc tcctggaact cttatgtgga ttataagata

ttcctccata ccaacagcaa agcctttact gccaagactt cctgtgtgcg gcgccgctac

cgtgagttcg tgtggctgag aaagcagcta cagagaaatg ctggtttggt gcctgttcct

gaacttcctg ggaagtcaac cttcttcggc acctcagatg agttcattga gaagcgacga

caaggtctgc agcacttcct tgaaaaggtc ctgcagagtg tggttctcct gtcagacagc

cagttgcacc tattcctgca aagceagctc tcggtgcctg agatagaagc ctgtgtceag

ggccgaagta ccatgactgt gtctgatgcc attcttcgat atgctatgtc aaactgtggc

tgggcccagg aagagaggca gagctcttct cacctggcta aaggagacca gcctaagagt

tgctgctttc ttccaagatc gggtaggagg agctctccct caccgcctcc cagtgaagaa

aaggaccatt tagaagtgtg ggctccagtt gttgactctg aggttccttc cttggaaagt

cccactctcc cacccctctc ctcaccatta tgctgtgatt ttggaagacc caaagaggga

acctccactc ttcagtctgt gaggagggct gtgggaggag atcatgctgt gcctttggac

cctggtcagt tagaaacagt tttggaaaag tga(SEQ ID NO：2)。由此，可以进一步提高表达根据本发明实施例的多肽即SNX11的效率。

如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”是包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，此处使用“多肽”意在包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。

发明人经过分析，该多肽在SNX家族进化树上与SNX10最为接近，二者PX结构域的相似性为78％，为此将该多肽在本文中命名为SNX11。PX结构域是一种磷脂结合结构域，其主要的结合靶点是PI3P(phosphatidylinositol-3-monophosphate)。这是一种广泛的分布于内涵体膜上的磷脂，SNX家族通过PX结构域与磷脂的结合定位到内涵体表面，从而发挥对内涵体转运多样的调节。如SNX1的PX结构域以PI(3，5)P2为靶点，定位到内涵体膜上，对EGFR向晚期内涵体/溶酶体的转运和降解起到重要的调节作用。在这个过程中，SNX1与Hrs(Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)、EGFR(表皮生长因子受体)形成大的复合体并定位在早期内涵体上，调节了EGFR从早期内涵体向晚期内涵体的转运。同时SNX1与SNX2一起调节向内涵体向TGN(反面高尔基体网络结构，Trans-Golgi Network)的逆转运(retrograde transport)。SNX1/SNX2通过PX定位内涵体膜上时，它们将VPS26/29/35复合体募集到膜上，形成Retromer复合体，这个复合体将引导有关受体如M6PR向TGN方向的转运。

为了研究该分离多肽的功能，发明人首先从人类基因组中克隆出了编码根据本发明实施例的所分离多肽的基因，并将它构建到真核表达载体上。在哺乳动物细胞中表达SNX11后发现它不产生和SNX10相似的成泡现象。而当发明人将SNX10和SNX11共转染到细胞中时，发明人发现SNX11可以显著的抑制SNX10诱导的成泡现象。

为了研究SNX11显著抑制SNX10诱导成泡现象的机理，发明人进一步分析了SNX10在内涵体中的分布。发明人采用内涵体体特异性的Rab蛋白来标记不同的内涵体，发现由于SNX10作用下的巨大空泡表面都呈现Rab7阳性。Rab7主要定位于晚期内涵体和溶酶体，Rab7阳性意味着SNX10诱导了晚期内涵体的异常扩大和成熟。随后，发明人分析了根据本发明实施例的SNX11作用下内涵体的变化。发明人发现SNX11与SNX10定位在相同的内涵体上，这些内涵体都呈现Rab阳性，但与SNX10单独作用下情况相比，这些内涵体的进一步扩大过程被抑制了。即SNX11抑制了晚期内涵体的异常扩大和成熟，但对Rab7的募集不产生影响。

进一步，发明人对SNX11调节晚期内涵体的机制进行了研究。SNX10对内涵体的调节是通过V-ATPase来实现的，SNX10通过与V1D的相互作用来激活细胞中的V-ATPase活性，从而造成内涵体的扩大。发明人推测SNX11也可能通过V-ATPase来调节内涵体形态。进一步，发明人通过利用293T细胞的免疫共沉淀实验，发现SNX11也与V1D相互作用。这一结果说明，SNX11抑制了SNX10对V-ATPase的激活作用，从而抑制了SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

VacA诱导的细胞空泡化是幽门螺旋杆菌诱导的胃溃疡发生过程中的一个重要致病因素。VacA通过激活V-ATPase导致胃表皮细胞空泡化，使得这些细胞变得脆弱，容易脱落或死亡，导致了胃表面溃疡的发生。基于发明人发现SNX11可以抑制V-ATPase的异常活化，进而抑制晚期内涵体空泡的产生，那么SNX11也有可能对胃表面溃疡过程起作用。发明人对细胞进行VacA处理，发现在细胞中出现大量的晚期内涵体空泡，而在转染表达SNX11的细胞中，这个空泡数量显著下降。即发明人发现通过表达SNX11可以抑制VacA在细胞中的空泡化作用。分析这个过程，发明人发现在VacA处理后的细胞中，出现大量的扩大的晚期内涵体。当细胞转染表达根据本发明实施例的多肽SNX11后，虽然Rab7依然出现聚集现象，但晚期内涵体的进一步扩大则被抑制。

另外，发明人首次解析成功SNX11的晶体结构(图3)。图3显示了SNX11晶体结构。如图3所示，(a)显示了SNX11-142C的总体结构，(b)显示了SNX11-170C的总体结构，其中，品红色的是传统的PX结构域，蓝紫色的是传统的PX结构域C端附加的螺旋。发明人用硫酸根离子模拟PI3P的结合，发现SNX11-142C的磷脂酰肌醇结合口袋中的硫酸根离子与P40phox-PX结构域中PI3P 3-磷酸基团的取向是一致的(如图4)。图4显示了SNX11磷脂结合及表面电势分析。如图4所示，(a)显示了SNX11-142C和P40^phox-PX结构域的磷脂酰肌醇结合口袋中关键氨基酸残基的比对，其中，SNX11-142C的磷脂酰肌醇结合口袋用白色的表面和蓝绿色的飘带表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇结合口袋中结合磷脂酰肌醇氨基酸侧链用品红色表示，P40^phox-PX结构域的磷脂酰肌醇结合口袋中结合磷脂酰肌醇氨基酸侧链用深绿色表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇结合口袋中的硫酸根离子(用品红色棍状模型表示)与P40^phox-PX结构域中PI3P 3-磷酸基团的取向是一致的。(b)显示了SNX11-142C的B分子可能的膜结合界面的表面电势图，红色表示带负电区域，蓝色表示带正电荷区域，白色表示疏水区域，两个碱性口袋结合的硫酸根离子用棍状模型表示，SNX11-142C的A分子(品红色)、SNX11-142C的B分子(蓝绿色)和SNX11-170C(蓝紫色)中主要疏水残基(W32、L76、F88和F89，用棍状模型表示)的结构比对。同时硫酸根离子也更多的参与与SNX11的三维构象上(如图5)。图5显示了SNX11中的两个碱性口袋与硫酸根离子结合，其中，(a)显示了磷脂酰肌醇结合口袋与硫酸根离子结合，参与硫酸根离子结合的残基侧链用棍状模型表示，参与硫酸根离子结合的水分子用红色的球体表示，氢键用虚线表示；(b)显示了SNX11-142C的A分子中第二个碱性口袋与硫酸根离子结合，其中，“Sulfate”指硫酸根离子；(c)显示了SNX11-142C的B分子中第二个碱性口袋与硫酸根离子结合。通过其晶体结构，发明人分析了SNX11膜结合的可能形式，发现除了与PI3P结合外，SNX11本身也需要插入到膜双分子层中。图6显示了SNX11膜结合模型。结合图6可知，这有两种可能的形式：(a)W32和F88插入到膜双分子层中，L76远离胞膜；(b)F88和L76插入到膜双分子层中，W32不与膜结合，其中，PI3P用球状模型表示，磷脂酰肌醇结合口袋之外的参与膜结合的残基侧链用黄色的棍状模型表示。通过这些结构的解析，有助于针对其功能寻找药物靶点，并设计可能与之特异性作用的药物，应用到胃溃疡的治疗中。

为进一步研究本发明所分离多肽SNX11的功能，发明人建立了SNX11基因敲除小鼠，并对敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染疟原虫的情况进行了比较，进而对SNX11基因对抗感染免疫血功能进行了分析研究，结果见图7。图7显示了SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)感染小鼠疟原虫(Plasmodium berghei)后的血虫水平变化(A)和存活率(B)。结果显示，与野生型对照组相比，SNX11缺陷鼠可显著抑制疟原虫的增殖，并有较高比率的小鼠存活(如图7)。进一步免疫学分析显示，来自SNX11缺陷鼠的脾脏细胞在体外表现出更强的细胞增殖反应和分泌与抗疟疾免疫力相关的白介素12(IL-12)和γ干扰素(如图8)，表明疟疾感染在SNX11缺陷鼠可诱导更强的免疫反应。疟原虫感染后检测血清特异性抗体水平显示，SNX11小鼠产生了高水平的抗疟疾抗体(如图9)。SNX11基因表达水平分析表明，该基因在脑组织中表达丰富；在主要免疫细胞中SNX11都有表达，其中，在SNX11基因在中性粒细胞中表达最高，而且在疟原虫感染后，该基因表达在所分析的多种细胞(CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞)中均有显著下降(如图10)。具体地，图8显示了来自SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)的脾脏细胞体外增殖反应水平(A)和分泌gamma干扰素(B)及白介素12(C)的能力；图9显示了疟疾感染5周后，SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)血清抗疟原虫特异性抗体水平；图10显示了SNX11基因在小鼠不同组织器官中(A)和分离纯化的免疫细胞(B)中的表达水平，其中，在A中：H，心脏；Li，肝脏；K，肾脏；Lo，肺脏；S，脾脏；Sto，胃组织；Thy，胸腺；B，脑组织；Int，肠组织；M，肌肉组织。在B中：CD4，CD4T细胞；CD8，CD8T细胞；B，B细胞；DC，树突状细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，中性粒细胞；NK，自然杀伤细胞。

表达载体

本发明还提出了一种能够有效地表达根据本发明实施例的多肽SNX11的表达载体。根据本发明的实施例，该表达载体中包含核酸分子，该核酸分子能够编码分离的多肽。根据本发明的实施例，该核酸分子具有如SEQ ID NO：2所示的核酸序列。由此，利用该表达载体，能够有效地在体外表达体系例如重组细胞中，表达根据本发明实施例的多肽，即SNX11。

术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达载体，例如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。载体的RNA形式(其包括RNA病毒载体)也可在本发明中发现用途。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的表达载体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。

另外，根据本发明的实施例的表达载体还可以进一步包含其他的元件，从而为表达载体赋予额外的有益效果。本领域技术人员可以根据需要，选择这些元件在表达载体上与编码目的基因(SNX11)的核酸分子的相对位置。即可以设置在编码目的基因(SNX11)的核酸分子的上游，也可以设置在编码目的基因(SNX11)的核酸分子的下游，只要这些元件能够发挥其相应的功能即可。在本发明中所使用的术语“5’侧”可以与“上游”互换使用，“3’侧”可以与“下游”互换使用。

根据本发明的一个实施例，表达载体可以进一步包含启动子序列，所述启动子序列与所述编码目的基因(SNX11)的核酸分子可操作地相连。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过表达载体在动物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动编码目的基因(SNX11)的核酸分子的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中编码目的基因(SNX11)的核酸分子的表达效率。根据本发明的具体实例，所述启动子为CAG启动子。发明人发现，当采用该启动子时，可以有效地在动物细胞中表达突变型生长激素受体基因。

根据本发明的一个实施例，表达载体可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映表达载体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。或者报告蛋白可以是一种能够与底物相互作用以产生可检测信号的酶，例如lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能催化一系列底物转化成极易检测的不同颜色的产物。但是lacZ在细胞内本底表达较高，并且检测需要破碎细胞壁，从而限制了其应用。因而，根据本发明的一些实施例，报告蛋白可以为选自发光蛋白、荧光蛋白、酶的至少一种。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。这其中，优选发光蛋白，因为发光蛋白能够发出特定波长的光，因而能够容易对发光蛋白进行检测，并且容易对其进行定量检测。根据本发明的一个实施例，报告蛋白为绿色荧光蛋白。由此，可以便捷地通过荧光显微镜，就能够确定表达载体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。

根据本发明的一个实施例，表达载体可以进一步包括筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受表达载体的动物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源表达载体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加抗生素，则相应连同载体接受并表达抗生素抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，所述筛选标记基因为新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源表达载体的重组细胞的效率。

上面对根据本发明实施例的表达载体进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，表达载体还可以包含其他常规的元件以促进表达载体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。重组细胞及其制备方法

在本发明的又一方面，本发明还提出了一种重组细胞，该重组细胞能够表达根据本发明实施例的多肽SNX11。根据本发明的实施例，重组细胞中可以包含编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核酸分子，以便能够使得该重组细胞表达具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽。根据本发明的具体实施例，该重组细胞中可以包含的编码核酸分子的序列为SEQ IDNO：2。由此，可以进一步提高重组细胞表达SNX11多肽的效率。

在重组细胞中，编码外源多肽(在本发明中为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SNX11)的分离核酸可以整合在重组细胞的基因组中，也可以游离在重组细胞的基因组之外，只要能够有效表达外源多肽(在本发明中为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SNX11)即可。根据本发明的实施例，优选编码外源多肽(在本发明中为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SNX11)的分离核酸整合在重组细胞的基因组中，由此，可以进一步提高表达外源多肽(在本发明中为具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SNX11)的效率。

另外，根据本发明的实施例，本发明还提出了制备上述重组细胞(在本文中，也可以称为“转基因细胞”)的方法。根据本发明的实施例，该方法包括可以以下步骤：使用前面所述表达载体转化宿主细胞；以及分离重组细胞。利用该方法，能够有效地制备前面所述的重组细胞。在本文中，所使用的术语“转化”指外源核酸(即DNA分子)通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，吸收质粒穿过细胞膜、病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。本文使用的术语“宿主细胞”的类型并不受特别限制。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核物种，例如大肠杆菌(Escherichia coli)；哺乳动物细胞系，例如CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9和真菌细胞物种，例如酿酒酵母。可以将标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。

需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作。在分离重组细胞后，可以通过PCR方法验证重组细胞中是否含有目的核酸序列。当然也可以通过分析目的核酸序列表达蛋白的酶活性来验证。但从效率角度来考虑，优选通过PCR方法验证，因而，根据本发明的实施例，还可以进一步包括通过PCR方法验证重组细胞中含有所述目的核酸序列的步骤。

基因敲除

在本发明的又一方面，本发明提出了用于从非人动物细胞中敲除SNX11基因的手段。

首先，提供了一种可以用于从非人动物细胞中敲除SNX11基因的载体(在本发明中，该载体也被称为“敲除载体”)。根据本发明的实施例，该敲除载体包含与染色体上SNX11外显子侧翼的上游和下游序列同源的基因组DNA序列。选择此同源序列的长度为允许与SNX11等位基因定向同源重组的长度。该同源序列的长度可为2.5kb直至300kb。优选地，此同源序列的长度是3kb至6kb。优选地，该同源序列包含SNX11启动子的至少一部分。

如图11所示，发明人按照以下步骤构建用于SNX11基因敲除的载体并将其转入小鼠胚胎干细胞：

首先，为了研究SNX11的体内作用，发明人利用Neo-PGK基因框取代了exon 4和5的靶载体构建SNX11基因敲除载体(图11A)。然后，将上述构建好的线性SNX11基因敲除载体转入129/6s胚胎干细胞中，并筛选获得298个胚胎干细胞克隆。获得的四个阳性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚以繁殖嵌合体小鼠。接着，将其与C57BL/6J小鼠杂交，以获得混合遗传背景的杂合子小鼠。然后，将这些杂合子小鼠自交获得SNX11敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通过PCR鉴定这些杂合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用1个野生型等位基因上共有的反义引物(P3)和2个分别位于目标等位基因(P2)和野生型等位基因(P1)上的正义引物进行的。其中，PCR检测结果如图11B所示。对小鼠大脑中SNX11的mRNA进行RT-PCR分析证实，SNX11缺陷小鼠完全缺乏SNX11的mRNA(见图11C)。

其中，上述基因敲除小鼠由上海南方模式生物研究中心制备。上述引物P1、P2、P3的序列如下所示：

P1：5’-GTTCCCGACAGAAGATTTACAAG-3’(SEQ ID NO：3)；

P2：5’-CGGAGATGAGGAAGAGGAGAACA-3’(SEQ ID NO：4)；

P3：5’-GCTGCCTATCAAGCCACTAGG-3’(SEQ ID NO：5)。

根据本发明的实施例，该敲除载体可以额外地包含报道基因。所述报道基因位于同源的SNX11侧翼序列之间。根据本发明的实施例，优选地，在向基因组内整合后，所述报道基因表达受到SNX11启动子及任选地受到其它SNX11调节元件的控制。报道基因可选自LacZ或其衍生物、碱性磷酸酶、荧光蛋白质、萤光素酶或可在多种组织或细胞中特异性检测和定量的其它酶或蛋白质。根据本发明的实施例，优选地，该报道基因是LacZ。在一个优选的实施方案中，在SNX11基因组序列内插入此报道基因，从而保留了SNX11基因的内源起始密码子。根据本发明的实施例，还可以进一步包含选择标记基因，以便便于筛选。选择标记基因可以是正选择标记。正选择标记可选自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟素S抗性基因、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因或zeomycin抗性基因。可以在正选择标记外侧加入重组酶识别位点，此识别位点允许在选择了成功同源重组事件后切除正选择标记基因。因此，可以避免正选择标记表达对报道基因表达的任何影响。此重组酶识别位点可选自包含针对flp重组酶的frt位点和针对cre重组酶的loxP位点(包括突变的loxP位点)。优选地，正选择标记是新霉素抗性基因。选择标记基因还可以是负选择标记。负选择标记可选自但不限于白喉毒素基因和HSV-胸苷激酶基因。优选地，负选择标记是白喉毒素基因。

优选地，该敲除载体同时包含正选择标记和负选择标记。更优选地，该敲除载体包含新霉素抗性基因和白喉毒素基因。在一个优选的实施方案中，敲除载体是整合在质粒中(如图11A)。

本发明还提供了产生非人的基因敲除动物的方法，该动物SNX11基因的一个或两个等位基因发生突变和/或截短以致于表达较低活性或无活性的SNX11蛋白质，优选地，非人的基因敲除动物中SNX11基因的Exon 4和5被neo替换，见图11A。

根据本发明的实施例，该产生非人的基因敲除动物的方法包括：(a)通过同源重组向胚胎干细胞基因组内导入如上所述的敲除载体，(b)从所述的胚胎干细胞中繁殖杂合和/或纯合的基因敲除动物，以及(c)产生非人的基因敲除动物，该动物SNX11基因的一个或两个等位基因被突变和/或截短以致于表达较低活性或无活性的SNX11蛋白质。

在一个优选的实施方案中，在该产生非人的基因敲除动物的方法的步骤(c)中可产生非人的基因敲除动物，该方法还进一步包括：将所产生的基因敲除动物进一步与可识别正选择标记基因外侧的识别位点的重组酶转基因动物杂交繁殖。如通过Joyner，A.L.(GeneTargeting.1999，第二版，The PracticalApproach Series，Oxford University Press，New York)和Hogan，B.等(Manipulating the mouse embryo.1994，第二版，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，通过参照将其并入本文)所提供的方法，本领域可常规地得到包含定向突变的基因敲除动物。

例如，可通过如下步骤产生上述方法中的杂合和/或纯合的基因敲除动物：对携带如上所述的靶向SNX11等位基因的胚胎干(ES)细胞克隆进行选择、验证重组胚胎干细胞克隆中的定向突变、向野生型动物的胚泡中注入已验证的重组胚胎干细胞、将这些已注射的胚泡转移至假孕代孕母体中、将来自胚泡的嵌合体培育为野生型动物、检验来自这些繁殖体的后代中定向突变的存在、繁殖杂合动物以任选地产生纯合基因敲除动物。

本领域所用且还可在本发明方法中利用的胚胎干细胞包括例如源自小鼠品系如C57BL/6、BALB/c、DBA/2、CBA/和SV129的胚胎干细胞。优选地，使用源自C57BL/6小鼠的胚胎干细胞(Seong，E等(2004)TrendsGenet.20，59-62；Wolfer，D.P.等，TrendsNeurosci.25(2002)：336-340，通过参照将其并入本文)。

本发明还提供了通过以上所述的任一方法所产生的非人的基因敲除动物。根据本发明的实施例，本发明提供了非人的基因敲除动物，该动物SNX11基因的一个或两个等位基因被突变和/或截短以致于表达较低活性或无活性的SNX11蛋白质。优选地，可以用报道基因替代非人的基因敲除动物SNX11基因的一个或两个等位基因。优选地，该报道基因是LacZ。

在一个优选的实施例中，提供了非人的基因敲除动物，该动物SNX11基因的一个或两个等位基因包含lacZ等位基因。

非人的基因敲除动物可以是本领域内所知的任意可用于本发明方法的动物。优选地，本发明动物是哺乳动物，更为优选地本发明基因敲除动物是啮齿动物。最优选的非人的基因敲除动物为小鼠。甚至更优选地，非人的基因敲除动物是C57BL/6的同类系突变小鼠品系。

本发明还涉及如本发明所提供的非人的基因敲除动物的后代(也可称为后裔)，其通过与相同或另一基因型的动物繁殖得到。还可以通过与相同遗传背景的动物繁殖得到后代。

基因敲除动物可用于制备原代细胞培养物以及用于制备源自这些动物的原代细胞制品的次代细胞系。此外，基因敲除动物可用于制备组织外植体或器官外植体及其培养物。此外，基因敲除动物还可用于制备组织提取物或细胞提取物，如膜制品或突触小体制品。

本发明还提供了如本发明所提供的非人的基因敲除动物或其后代的原代细胞培养物及次代细胞系。此外，本发明提供了如本发明所提供的非人的基因敲除动物或其后代的组织外植体或器官外植体和其培养物，以及组织提取物或细胞提取物。组织提取物或细胞提取物是例如膜制品或突触小体制品。可使用例如从该动物的尾部活组织检查中分离的DNA，通过包括基因组DNA印迹和PCR分析的多种方法检测遗传性构建体整合入基因组。

对本领域技术人员显而易见的是，存在可用于检测报道基因表达的多种分析性方法，其包括RNA水平的方法，如通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或RNA印迹、原位(in situ)杂交对mRNA定量，以及蛋白质水平的方法，包括组织化学、免疫印迹分析和体外(in vitro)结合研究。还可以通过本领域技术人员常用的ELISA技术确定靶基因表达水平的量

可使用多种标准测定法完成定量性测量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保护作用、RNA印迹分析和RNA点印迹分析的杂交方法测量转录水平。通过ELISA、蛋白质印迹分析以及通过比较免疫组织化学或组织化学染色的组织切片分析蛋白质水平。还可用免疫组织化学染色、酶组织化学染色及免疫电子显微镜法评估存在或不存在SNX11蛋白质。还可以使用组织切片的免疫组织化学lacZ染色或组织化学lacZ染色，或者用组织匀浆物或组织提取物所开展的定量性酶lacZ测定法，利用在SNX11非人的基因敲除动物中的NLSlacZ报道分子定量SNX11表达。

由此，本发明的又一方面提出了一种动物细胞。根据本发明的实施例，该动物细胞的SNX11基因的表达量下降。根据本发明的实施例，在该动物细胞的基因组中，SNX11被敲除。根据本发明的实施例，该动物为小鼠。

发明人在建立SNX11基因敲除小鼠之后，并对敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染疟原虫的情况进行了比较，进而对SNX11基因对抗感染免疫血功能进行了分析研究。结果显示，与野生型对照组相比，SNX11缺陷鼠可显著抑制疟原虫的增殖，并有较高比率的小鼠存活(如图7)。进一步免疫学分析显示，来自SNX11缺陷鼠的脾脏细胞在体外表现出更强的细胞增殖反应和分泌与抗疟疾免疫力相关的白介素12IL-12)和γ干扰素(如图8)，表明疟疾感染在SNX11缺陷鼠可诱导更强的免疫反应。疟原虫感染后检测血清特异性抗体水平显示，SNX11小鼠产生了高水平的抗疟疾抗体(如图9)。SNX11基因表达水平分析表明，该基因在脑组织中表达丰富；在主要免疫细胞中SNX11都有表达，其中，在SNX11基因在中性粒细胞中表达最高，而且在疟原虫感染后，该基因表达在所分析的多种细胞(CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞)中均有显著下降(如图10)。

具体地：

图7显示了SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)感染小鼠疟原虫(Plasmodiumberghei)后的血虫水平变化(A)和存活率(B)，其中，如图所示，WT表示野生型小鼠，KO表示基因敲除小鼠，图7A的纵轴为红细胞中寄生虫血症的比例，图7B的纵轴为小鼠的存活比例，两图的横轴均为感染后的天数；

图8显示了来自SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)的脾脏细胞体外增殖反应水平(A)和分泌gamma干扰素(B)及白介素12(C)的能力，其中，如图所示，WT表示未感染的野生型小鼠，KO表示未感染的基因敲除小鼠，WT Pb-inf表示感染后的野生型小鼠，KO Pb-inf表示感染后的基因敲除小鼠，图8A显示了未感染(WT/KO)，感染后(WT Pb-inf，KO Pb-inf)小鼠的脾脏细胞样品在对照(Medium)及疟原虫抗原(Pb-Ag)再刺激后的体外增殖反应水平，其中CPM(count per minute)是用3H-Thymidine标记细胞增殖时液闪的读数，图8B和图8C分别显示了前述相同样品中的gamma-干扰素及白介素12的水平；

图9显示了疟疾感染5周后，SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)血清抗疟原虫特异性抗体水平，其中从左至右的三个图分别显示了感染后，SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)的血清中总的疟原虫特异抗体(Ig)及其亚型(IgG1和IgG2a)的水平；

图10显示了SNX11基因在小鼠不同组织器官中(A)和分离纯化的免疫细胞(B)中的表达水平，其中，如图10A所示，横轴中：H，心脏；Li，肝脏；K，肾脏；Lo，肺脏；S，脾脏；Sto，胃组织；Thy，胸腺；B，脑组织；Int，肠组织；M，肌肉组织；T，睾丸。如图10B所示，横轴中：CD4，CD4阳性细胞；CD8，CD8阳性细胞；B，B细胞；DC，树突状细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，中性粒细胞；NK，自然杀伤细胞。

应用

如前所述发明人经过分析，发现本发明发现的新型多肽在SNX家族进化树上与SNX10最为接近，二者PX结构域的相似性为78％。发明人发现，在哺乳动物细胞中表达SNX11后发现它不产生和SNX10相似的成泡现象。而当发明人将SNX10和SNX11共转染到细胞中时，发明人发现SNX11可以显著的抑制SNX10诱导的成泡现象。另外，发明人发现SNX11抑制了晚期内涵体的异常扩大和成熟，但对Rab7的募集不产生影响。

进一步，发明人发现，与SNX10相反，SNX11结合V-ATPase，抑制了SNX10对它的激活，从而抑制了SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。并且通过表达SNX11可以抑制VacA在细胞中的空泡化作用。发明人发现在VacA处理后的细胞中，出现大量的扩大的晚期内涵体。当细胞转染表达根据本发明实施例的多肽SNX11后，虽然Rab7依然出现聚集现象，但晚期内涵体的进一步扩大则被抑制。

因而，本发明的SNX11及其编码基因、表达载体以及表达该基因的重组细胞，可以用于治疗胃溃疡、降低抑制V-ATPase或抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

由此，根据本发明的实施例，本发明提出了SNX11及其编码基因、表达载体以及表达该基因的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于下列至少之一：治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

本发明还提供了包含本发明的SNX11蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的SNX11蛋白的药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病症诊断、检测或监控，病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善和/或研究。在具体实施例中，还可以包含其他已知已经在该病症例如胃溃疡的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用的药物。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的SNX11蛋白可以掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的SNX11蛋白和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强结合蛋白的保存期限或效力。

各种递送系统是已知的，且可以用于施用本发明的SNX11蛋白或本发明的SNX11与其他药物的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如治疗胃溃疡。例如，被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达SNX11的表达载体和重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。在具体实施方案中，本发明的药物通过肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。

在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶膜、聚合物、纤维基质(例如，)、或胶原基质。

另外，发明人建立了SNX11基因敲除小鼠，发现与野生型对照组相比，SNX11缺陷鼠可显著抑制疟原虫的增殖，并有较高比率的小鼠存活，来自SNX11缺陷鼠的脾脏细胞在体外表现出更强的细胞增殖反应和分泌与抗疟疾免疫力相关的白介素12(IL-12)和γ干扰素，表明疟疾感染在SNX11缺陷鼠可诱导更强的免疫反应。疟原虫感染后检测血清特异性抗体水平显示，SNX11小鼠产生了高水平的抗疟疾抗体。SNX11基因表达水平分析表明，该基因在脑组织中表达丰富；在主要免疫细胞中SNX11都有表达，其中，在SNX11基因在中性粒细胞中表达最高，而且在疟原虫感染后，该基因表达在所分析的多种细胞(CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞)中均有显著下降。

由此，发明人提出了一种抑制哺乳动物中疟原虫增殖的方法。根据本发明的实施例，该方法包括降低所述哺乳动物中SNX11基因的表达。根据本发明的实施例，可以通过将哺乳动物细胞中的SNX11基因进行沉默，例如敲除，通过使用SNX11活性抑制剂、SNX11表达抑制剂诸如RNAi技术，抑制哺乳动物中疟原虫增殖。

由此，根据本发明的实施例，本发明提出了抑制SNX11基因表达的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制疟原虫的增殖。关于药物的赋形剂等方面的描述，前面针对胃溃疡所描述的内容，同样适用，不再赘述。

根据本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选可以用于抑制疟原虫增殖的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

将前面所述的表达SNX11的重组细胞与药物候选物接触，并检测与所述药物候选物接触前后，所述表达SNX11的重组细胞中SNX11基因的表达量，以便分别获得第一表达量和第二表达量；以及第二表达量低于第一表达量为所述药物候选物为用于抑制疟原虫增殖的药物的指示。与药物候选物接触后，SNX11基因的表达量比接触前有所降低，可以确定该药物候选物可以作为抑制SNX11基因表达的试剂，进而，可以用于抑制疟原虫的增殖。因而利用该方法，能够有效地筛选抑制疟原虫的增殖的药物。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：SNX11基因的扩增

提取HEK293T细胞RNA，反转录成cDNA。根据Genbank发表的人SNX11序列(NCBIgene ID：29916)，设计引物，在293T cDNA中扩增出SNX11基因片段，连入PCR3.1-GFP-flag载体。

用于扩增的引物：

hSNX11U：ATGGGCTTTTGGTGTAGGATGTCGG(SEQ ID NO：6)

hSNX11L：CTTTTCCAAAACTGTTTCTAACTGACCAGGG(SEQ ID NO：7)

将PCR产物连入PCR3.1载体的EcoRV位点，用载体上游引物T7(TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO：8))和SNX11下游引物hSNX11L鉴定基因插入方向，并测序鉴定序列。最终构建完成PCR3.1-hSNX11-GFP-flag真核表达载体，用于在哺乳动物细胞中表达SNX11。

实施例2：SNX11晶体的解析

蛋白表达和纯化

发明人构建了2个SNX11片段，用于SNX11的结构研究。其中一个是具有残基7-142的SNX11-142C，另一个是具有残基7-170的SNX11-170C。这两个cDNA片段被插入pET21a中，并通过测序验证。蛋白在生长于LB培养基上的Rosetta2(DE3)细胞中表达。其中，当OD₆₀₀的值为0.6-0.8时，于16℃下，将细胞用0.3毫米的IPTG诱导22小时后，细胞中SNX11-142C表达；当OD₆₀₀的值为0.6-0.8时，于25℃下，将细胞用0.3毫米的IPTG诱导14小时后，细胞中SNX11-170C表达。通过离心、洗涤收集细菌，并于4℃下将其重悬于裂解液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，7mM β-巯基乙醇)中。然后，通过3次超声将细胞进行裂解。最后，利用标准规程的Ni²⁺亲和柱(GE医疗)纯化SNX11-142C。而将洗脱的蛋白进一步纯化是通过凝胶过滤进行的，其中，凝胶过滤使用经过包含20mMMES，pH 6.5，100mM NaCl and 5mM DTT的缓冲液平衡的Superdex 75柱(GE医疗)。SNX11-170C的纯化方法与SNX11-142C一样，只是在经过Ni²⁺亲和层析柱纯化后，会产生还原甲基化37。

结晶、数据收集和结构确定

在293K温度下，通过Sitting-drop Vapor Diffraction方法，利用来自Hampton Research的Sparse Matrix Crystallization Kit对SNX11-142C(浓度为6.5mg/ml)和甲基化的SNX11-170C(浓度为5.5mg/ml)进行结晶。SNX11-142C晶体从0.2M硫酸铵，0.1M pH 6.5的二甲砷酸钠三水和30％聚乙二醇8000中长出。甲基化的SNX11-170C晶体在含有0.1M pH7.5的羟乙基和20％聚乙二醇8000的情况下出现。在数据收集之前，利用添加有30％PEG400作为冷冻保护剂的母液，将晶体进行低温冷却。衍射数据是在上海同步辐射装置(theShanghai Synchrotron Radiation Facility)的17U光束线下，于100K温度下，波长为

时测定的。SNX11-142C晶体属于在不对称单位中具有两个分子的空间群P2₁。甲基化的SNX11-170C晶体属于每一个不对称单位包含一个分子的空间群P2₁2₁2₁。利用程序Mosflm³⁸处理数据集。通过以Grd19p(PDB code 1OCS)作为搜索模型的分子替换解析SNX11-142C的结构。利用DM³⁹对初始阶段的数据进行优化。利用ARP/wARP⁴⁰完成建模。甲基化SNX11-170C的晶体结构是利用SNX11-142C模型的分子替换进行解析的。利用Buccaneer⁴¹进行模型建立。使用Refmac⁴²对以上两种晶体的结构进行细化。尽管对SNX11-170C进行了甲基化处理，但其赖氨酸残基显示，与那些未甲基化的SNX11-142C相比，两者没有显著差异。

实施例3：SNX11与SNX10功能的研究

一、SNX11抑制晚期内涵体(late endosome，LE)的成熟

发明人首先在细胞中转染构建的SNX11真核表达载体。发现在Hela细胞中过表达SNX11并不能引起与SNX10相似的细胞空泡化现象。相反，当将SNX11与SNX10载体同时转染进Hela细胞时，发明人发现SNX10引起的空泡被显著抑制(图1，A)。通过用Rabs标记不同的内涵体形式，发明人发现在表达SNX10的细胞中，空泡表面都被Rab7所标记。这说明SNX10的作用是促进晚期内涵体的扩大化(图1，B)。而在同时表达SNX10，SNX11的细胞中，SNX10，SNX11共定位在同一类内涵体结构上。这类内涵体表面同时有Rab5(早期内涵体标记)和Rab7。这一结果说明尽管Rab7在这些内涵体上的募集并没有被阻止，SNX10诱导下晚期内涵体的进一步扩大被抑制了(图1，C)。(在上述实验中，发明人用lipofectamin2000将SNX10，SNX11表达载体转染入Hela细胞。转染后24小时用相差显微镜照相分析空泡化情况或将细胞固定进行免疫荧光操作，然后用激光共聚焦显微镜分析其内涵体结构和定位。)

发明人已经发现SNX10对内涵体的调节通过V-ATPase来完成。发明人进一步分析了SNX11调节内涵体的分子机制。发明人发现，SNX11与V-ATPase的一个亚基V1D与相互作用(图1，D)。这说明SNX11也可能通过对V-ATPase活性的调节来完成其对内涵体形态的调节。(在本实验中，发明人将flag-tagged的SNX11或GFP载体和HA-tagged的V1D载体用PEI共转染入293T细胞，转染48小时后裂解细胞做免疫共沉淀，用表面偶联flag抗体的树脂沉淀SNX11或GFP，然后用western blot检验V1D蛋白水平。)

二、SNX11抑制VacA引起细胞空泡化

VacA是幽门螺旋杆菌分泌的空泡毒素，它进入胃表皮细胞后可以引起剧烈的空泡化现象。在机制研究中，经常用Hela来完成这一过程。发明人在Hela细胞中转染SNX11GFP或GFP对照，然后对这些细胞用VacA进行处理。结果发现在表达SNX11GFP的细胞中，VacA诱导空泡的能力显著降低(图2A，B)。进一步分析这些细胞中的内涵体变化。发明人发现，在表达GFP的细胞中，VacA诱导出大量晚期内涵体空泡(Rab7标记)。而在表达SNX11的细胞中，只有很少Rab7标记的膜泡被扩大(图2，C)。SNX11与Rab7有明显的共定位。这些结果说明SNX11可以抑制VacA引起的晚期内涵体扩大，在一定程度上减弱VacA对细胞的毒性。

实施例4、SNX11敲除小鼠的构建

发明人按照以下步骤构建用于SNX11基因敲除的载体并将其转入小鼠胚胎干细胞：

首先，为了研究SNX11在体内的作用，发明人通过一个利用Neo-PGK基因盒取代了exon4和5的靶载体构建SNX11基因敲除载体(图11A)。然后，将上述构建好的线性SNX11基因敲除载体转入129/6s胚胎干细胞中，并筛选获得298个胚胎干细胞克隆。获得的四个阳性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚，以繁殖嵌合体小鼠。其由C57BL/6J育成，以期获得混合遗传背景的杂合子小鼠。将这些杂合子小鼠进行交配，以繁殖获得SNX11敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通过PCR鉴定这些杂合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用1个野生型等位基因上共有的反义引物(P3)和2个分别位于目标等位基因(P2)和野生型等位基因(P1)上的正义引物进行的。其中，PCR检测结果如图11B所示。对小鼠大脑中SNX11的mRNA进行RT-PCR分析证实，SNX11缺陷小鼠完全缺乏SNX11的mRNA(见图11C)。

实施例5、SNX11敲除小鼠活性观察

按照以下步骤检测比较SNX11敲除小鼠及对照的活性：

将在液氮中保存的小鼠红细胞期疟原虫Plasmodium berghei虫种经腹腔注射到普通BALB/c小鼠；感染后6-9天检测血液中疟原虫水平(方法见后述)，待血虫水平达到15％左右时，从小鼠采血，用PBS稀释到每毫升含10⁶疟原虫感染的红细胞。

然后，对实验动物即SNX11敲除小鼠及其对照，经腹腔注射上述获得的疟原虫感染的红细胞(10⁶/只)。自感染后3天开始，从小鼠尾尖采血，制备血抹片，空气中晾干后，用吉姆萨染液染色。并在晾干后于显微镜下计数被疟原虫感染的红细胞的百分比，即血虫水平(＝每一百个红细胞中感染了疟原虫的红细胞数量)。

对敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染疟原虫的情况的比较结果见图7。图7显示了SNX11敲除小鼠(KO)和野生对照小鼠(WT)感染小鼠疟原虫(Plasmodium berghei)后的血虫水平变化(A)和死亡率(B)。结果显示，与野生型对照组相比，SNX11缺陷鼠可显著抑制疟原虫的增殖，并有较高比率的小鼠存活。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (12)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种分离的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸编码权利要求1所述的多肽，优选地所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于，包含编码权利要求1所述的分离的多肽的核酸分子，优选地包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中包含编码权利要求1所述多肽的核酸分子，优选地包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，任选地所述细胞为动物细胞，优选非人哺乳动物细胞，更优选啮齿类动物细胞，最优选小鼠细胞。

5.一种制备权利要求4所述重组细胞的方法，其特征在于，包括：

使用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞；以及

分离重组细胞，

任选地所述宿主细胞为动物细胞，优选非人哺乳动物细胞，更优选啮齿类动物细胞，最优选小鼠细胞。

6.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的寡核苷酸、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于下列至少之一：

治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

7.一种药物，其特征在于，包含选自权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的寡核苷酸、权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的重组细胞的至少一种，

所述药物用于下列至少之一：

治疗胃溃疡、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期内涵体的异常扩大。

8.一种动物细胞及其衍生物，其特征在于，所述动物细胞的SNX11基因的表达量下降，

任选地，所述动物细胞的基因组中，至少一个SNX11等位基因被敲除，

优选所述动物细胞为非人哺乳动物细胞，更优选啮齿类动物细胞，最优选小鼠细胞。

9.一种用于SNX11基因敲除的载体，其特征在于包含：

插入序列，所述插入序列不具有SNX11基因的全部活性；

第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及

第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，

其中，

所述第一同源臂和第二同源臂适于与基因组上SNX11基因的侧翼区发生同源重组。

10.一种构建SNX11基因敲除动物的方法，其特征在于，包括：

通过同源重组向胚胎干细胞基因组内导入如上权利要求9所述的载体；

从所述胚胎干细胞中繁殖杂合和/或纯合的基因敲除动物，以及

获得所述SNX11基因敲除动物，

优选所述动物为非人哺乳动物，更优选啮齿类动物，最优选小鼠。

11.抑制SNX11基因表达的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于抑制疟原虫的增殖。

12.一种筛选用于抑制疟原虫的增殖的药物的方法，其特征在于，包括：

将权利要求4所述的重组细胞与药物候选物接触；

检测与所述药物候选物接触前后，所述重组细胞中SNX11基因的表达量，以便分别获得第一表达量和第二表达量；以及

第二表达量低于第一表达量为所述药物候选物为用于抑制疟原虫增殖的药物的指示。

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