CN102822674A

CN102822674A - 具有扩大的动态范围的阵列及相关方法

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Publication number: CN102822674A
Application number: CN2011800173594A
Authority: CN
Inventors: S·卡伍斯; M·劳费米尔; C·朗
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2011-02-07
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2031-02-07
Also published as: US8648016B2; US20110195853A1; KR20120129947A; US20140200157A1; EP2534485A1; US11143651B2; KR101833558B1; EP2534485B1; CN102822674B; WO2011097552A1

Abstract

在一实施方案中，定量所关注的分子的浓度的系统和方法包括在多个测试位点建立多种测试环境，所述多种测试环境的每一种与多个反应曲线之一相关，所述多个反应曲线的每一个与所述多个反应曲线的其他反应曲线不同，储存得自所述多个反应曲线的总和的合并的反应曲线，将所述多个测试位点暴露于具有一定浓度的所关注的分子的样品，获得多个定量信号，所述多个定量信号的每一个与所述多个测试位点之一相关，将所述多个定量信号的总和与储存的合并的反应曲线关联，以及基于所述关联产生与所关注的分子的浓度相关的信号。

Description

具有扩大的动态范围的阵列及相关方法

技术领域

本发明涉及诊断测试，并且更具体地涉及基于亲和力的诊断测试。

背景技术

可以在个人护理点如在病人的床边、在护理提供者的位置或者在患者的家中进行的诊断测试变得越来越受欢迎。诊断测试包括涉及鉴定生物标记如核酸、蛋白和小分子的测试。许多诊断测试装置集成基于亲和力的传感器，据认为这在生物标记的检测中是最先进的。

基于亲和力的生物传感器根据“钥匙-锁”原理发挥功能，其中将与所关注的生物标记具有非常高的关联因子的分子用于检测。例如，妊娠测试试剂盒可以包含hCG的β-亚基(βhCG)特异性的单克隆抗体。将抗体与标签如金、胶乳或荧光团缀合，所述标签用于检测。如果靶向的分子与缀合的抗体结合，那么标记的钥匙-锁对会例如通过可见的测试线而可检测。

ELISA板和微阵列(例如核酸、肽和蛋白)包括相似原理。图1示出ELISA测定10，其中将抗体12固定在基底14上。基底14可以位于孔内(未显示)。提供封阻剂16以覆盖抗体12周围的基底表面。在典型的ELISA测定中，然后将样品18加入固定一抗12的孔中。然后，将样品温育一段时间。温育期间，封阻剂16防止样品中所关注的分子结合至基底14的表面以避免错误的结合。温育期间，如图2所示，一些所关注的分子18与一些抗体12结合。温育之后，洗涤剩余的样品以去除未结合的分子18。

随后，将具有结合的标记22的二抗20加入孔中，温育并洗涤，导致图3的构型。如图3所示，标记的二抗20结合至所关注的分子18，所关注的分子18又结合至抗体12。因此，通过抗体20结合至所关注的分子18的标记22的数量与靶分子的浓度成比例。根据所用的标记的类型，标记的数量最终可以利用比色法、电流分析法、磁力测定、伏安法、发光或荧光检测来检测。其他不含标记的抗体方法如表面等离子共振可以可选地使用。

上文讨论的诊断测试的质量可以利用检出限(LoD)和定量限(LoQ)分析来评价。为了产生可以通过可用的检测方法识别的足够大数量的复合物所需的靶分子的最低浓度LoD受探针分子与靶分子之间的相互亲和力、探针分子的密度、温育条件以及检测机制中的背景和噪声水平影响。如Burtis,etal.,“Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics,”Elsevier Saunders,2005所报道，通常认为特定测定的LoD是产生的信号为平均背景信号的2-3倍的靶分子浓度。

LoQ度量包括上限和下限。如Burtis,et al.“Tietz Textbook of ClinicalChemistry and Molecular Diagnostics,”Elsevier Saunders,2005定义的上限和下限分别为在特定测定的可接受的总误差内可以定量测量的最高浓度和最低浓度。一般来说，在美国，特定测定的可接受的误差由食品和药物管理局基于所谓的“金标准测试”的标准差来定义。

特定测定的下LoQ与上LoQ之间的浓度范围是该测定的动态范围。如上文所讨论的，下LoQ涉及LoD，所述LoD涉及基底上的亲和探针分子密度。因此，在许多测定中包含高亲和探针分子密度，以便增加特定测定的灵敏度。然而，上LoQ通常是在特定测定中可以达到的探针分子的最大密度或浓度的函数。

给定亲和探针分子的特定浓度，从特定测定获得的归一化信号不随所关注的分析物的浓度线性变化。作为示例，图4示出反应曲线(RC)。在本文中使用时，术语“反应曲线”是示出特定测定的多个样品中的各种浓度的所关注的分子与从所述多个样品获得的多个定量信号之间的关系的曲线。在图4中，特定测定的典型的信号反应对靶浓度示出为反应曲线30。在图4的信号范围内，下LoQ由在约10^-12mol/l的线32定义，而上LoQ由在约10^-10mol/l的线34定义。在下LoQ 32与上LoQ 34之间，反应曲线30的形状像S形。产生图4的反应曲线30的测定的动态范围为约2个数量级。典型测定的动态范围通常为1-3个数量级。

特定测定的动态范围限制该测定在应用中的可用性，其中测试样品中的预期变化为几个数量级。作为示例，人血清中可检测的蛋白的丰度范围从克至十分之一皮克每毫升。此外，血清蛋白丰度在刺激时可以改变高达10,000倍。如S.F.Kingsmore,“Multiplexed protein measurement:technologiesand applications of protein and antibody arrays,”Nature Reviews Dru Discovery,No.4,pp.310-320,2006所报道的，最常测量的许多蛋白如急性期反应物五聚环蛋白或趋化因子也表现出大的变化。因此，许多生物分子的表达范围可以跨越6个数量级或更多，并且方便的测定应当具有相等的动态范围，而典型测定的动态范围一般为1-3个数量级。

在多重测定和微阵列中，狭窄限制的动态范围的问题特别相关，因为检测多个生物标记对于提高诊断至关重要。然而，即使结合其他耗时的实验室技术如连续稀释，微阵列也难以达到建立的优化测试如ELISA可以实现的定量水平。因此，虽然微阵列大量使用并经历指数增长，这类使用主要涉及检测所关注的分子而不是定量所关注的分子。然而，即使使用多重测定和微阵列作为检测机制也是有限的。例如，即使健康个体也携带这样的标记，所述标记在以较大浓度存在时可以表明疾病的存在。

响应早期测定中有限的上LoQ，一些制造商已开发基底，所述基底允许更高密度的固定的探针分子和因此而更高的动态范围。这类基底一般包括这样的三维结构，所述三维结构在提供更大的动态范围的同时，还可以增加测定变化。一些这样的方法导致探针分子的结合动力学和稳定性，并且甚至可以引起动态范围的减小。

增加测定的动态范围的另一方法是对样品进行一系列的稀释，从而稀释的样品之一提供在测定的动态检测范围内的靶浓度。这样的方法已由Patrick Domnanich,et al.“Protein microarray for the analysis of humanmelanoma biomarkers，”Sensors and A ctuators B:Chemical，Vol."In Press，Corrected Proof″,2008报道。这种简单但有效的方法存在缺点，其需要相当数量的额外步骤(包括多个稀释以及实际测定的多次运行)，这延长测试时间并增加成本和操作费用。

最近，已建议其他解决方法以增加测定的动态范围。美国专利申请公开第2006/0019404A1号公开的护理点装置的一种这样的解决方法包括使用具有不同动态范围的两条带。不同动态范围可以通过使用不同抗体来实现，并且通过结合结果，可以实现测定的更广的动态范围。N.Ohmura,et al.,“Combinational Use of Antibody Affinities in an Immunoassay for Extension ofDynamic Range and Detection of Multiple Analytes，”Analytical Chemistry，Vol.75,No.1,pp.104-110,2003以及A.P.Drabovich,et al.,“Smart AptamersFacilitate Multi-Probe Affinity Analysis of Proteins with Ultra-Wide DynamicRange of Measured Concentrations,”Journal of the American Chemical Society,Vol.129,No.23,pp.7260-7260,2007报道的其他解决方法包括使用两种或更多种对分析物具有不同亲和力的探针分子、抗体或适配体，以便扩大动态范围。这类方法需要所用的不同探针分子的动态范围之间重叠，并且因此受限于具有期望的亲和力的多种抗体或适配体的可用性。

对包含低成本抗体的进行量化测定的装置和方法存在需要。对提供准确的量化结果的低成本测定包括多重测定、蛋白阵列、横向流动装置、夹心测定、竞争性测定或基于珠的阵列以及使用这类阵列的方法存在进一步的需要。提供相对线性的结果的方法和装置会进一步有益。

发明内容

按照一实施方案，定量所关注的分子的浓度的系统和方法包括在多个测试位点建立多种测试环境，所述多种测试环境的每一种与多个反应曲线之一相关，所述多个反应曲线的每一个与所述多个反应曲线的其他反应曲线不同，储存得自所述多个反应曲线的总和的合并的反应曲线，将所述多个测试位点暴露于具有一定浓度的所关注的分子的样品，获得多个定量信号，所述多个定量信号的每一个与所述多个测试位点之一相关，将所述多个定量信号的总和与储存的合并的反应曲线关联，以及基于所述关联产生与所关注的分子的浓度相关的信号。

按照另一实施方案，定量所关注的分子的浓度的方法包括在第一测试位点建立第一测试环境，在第二测试位点建立第二测试环境，从而所述第二位点的反应曲线与所述第一位点的反应曲线不同，储存得自所述第二位点的反应曲线与所述第一位点的反应曲线的总和的合并的反应曲线，将所述第一测试位点和所述第二测试位点暴露于具有一定浓度的所关注的分子的样品，从所述第一测试位点获得第一定量信号，从所述第二测试位点获得第二定量信号，合并所述第一定量信号和所述第二定量信号，将合并的第一定量信号和第二定量信号与储存的反应曲线关联，以及基于所述关联产生与所关注的分子的浓度相关的信号。

附图说明

图1示出ELISA阵列内现有技术测试位点的原理图，当将样品加入该测试位点时在基底上形成抗体和封阻剂；

图2示出图1的结合位点，将该结合位点温育并洗涤后所关注的分子结合至一些图1的抗体；

图3示出加入标记的二抗并将测试位点再次温育和洗涤，从而标记的二抗结合至结合的所关注的分子后的图2的测试位点；

图4示出典型测定的反应曲线，显示系统的归一化的输出信号为测试样品中所关注的分析物的浓度的函数；

图5示出配置为将单个样品暴露于不同环境条件的多位点生物传感器系统，其允许在扩大的浓度范围中测定样品中所关注的分子的浓度；

图6示出以微阵列形式提供多个不同测试位点的平台；

图7示出可以用来在平台上的各种测试位点建立不同测试环境以将样品暴露于多种测试环境的方法；

图8示出合并的反应曲线，显示当将具有不同测试环境的两个位点的反应曲线加和时，系统的归一化的输出信号为测试样品中所关注的分析物的浓度的函数；

图9示出合并的反应曲线，显示当将具有低亲和力调制的两个位点的反应曲线加和时，系统的归一化的输出信号为测试样品中所关注的分析物的浓度的函数；以及

图10示出合并的反应曲线，显示当将具有高亲和力调制的两个位点的反应曲线加和时，系统的归一化的输出信号为测试样品中所关注的分析物的浓度的函数。

具体实施方式

为了促进本发明的原理的理解，现在参考附图中说明和以下书面说明书中描述的实施方案。应当理解不期望由此限制本发明的范围。还应当理解本发明包括对说明的实施方案的任何改变和修改，并且包括本发明相关领域的技术人员会一般了解的本发明的原理的进一步应用。

参考图5，示出一般称为100的多位点生物传感器系统的代表。生物传感器系统100包括I/O装置102、处理电路104和存储器106。I/O装置102可以包括用户界面、图形用户界面、键盘、指点装置、远程和/或本地通信连接、显示器以及允许将外部产生的信息提供给生物传感器系统100和允许生物传感器100的内部信息与外部通信的其他装置。

处理电路104可以适合地为通用计算机处理电路如微处理器及其相关电路。处理电路104可操作地进行本文中归于它的操作。

在存储器106内是各种程序指令108。在适当的时候，程序指令108可以通过处理电路104和/或任何其他组件执行，程序指令108中的一些在下文更全面地描述。亲和力数据库110和反应曲线(RC)数据库112也位于存储器106内。

生物传感器系统100还包括环境控制设备114、环境检测器套件116和标记读数器118。标记读数器118可以包括在与系统100的其他组件一起的单一装置中。或者，系统100的一个或多个组件可以提供为单独的装置，其位于距系统100的其他组件较远的地方。

在这个实例中，配置环境控制设备114配置为在图6示出的微阵列120中建立并维持环境条件。各种方法可以用来形成微阵列平台120。作为示例，美国专利第5,807,522号公开用于形成微阵列的方法。微阵列平台120包括多个不同的子阵列122。子阵列122包括多个测试位点124。子阵列122的数量以及子阵列122的每一个内的测试位点124的数量可以在本发明的范围内变化。微阵列120还包括两个校准阵列126和128。在一些实施方案中，处理器104也可以位于微阵列120上。

如D.R.Jackola et al.,“Entropy-favored human antibody binding reactionswith a non-infectious antigen”Molecular Immunology，Vol.45，No.5，pp.1494-1500,2008所报道的，温度改变一些分子的结合效率。因此，在图5的实施方案中，环境控制设备114可操作地在微阵列平台120内建立温度曲线。测试位点124的每一个以及校准阵列126和128内的精确温度可以通过检测器套件116检测。

测试位点124以及校准阵列126和128用有效捕获所关注的生物分子的捕获剂来制备。关于生物传感器系统100的进一步细节参考图7的方法130提供。处理器104执行程序指令108以执行图7的方法130的至少一些。在不同实施方案中，可以修改方法130以包括更多或更少步骤，这取决于具体标准。

在模块132鉴定所关注的分子，然后鉴定对所关注的分子具有亲和力的探针分子如抗体、合成肽、适配体等(模块134)。然后对至少两个不同环境条件鉴定所关注的分子(α_i)与鉴定的抗体的结合效率系数(模块136)并储存在亲和力数据库110之一中(模块138)。

然后鉴定与至少两个结合效率系数相关的反应曲线(模块140)并储存在RC数据库112中(模块142)。在模块144，微阵列平台120通过将期望量的选定的捕获剂沉积在测试位点124的每一个以及校准位点126和128中来制备。在可选实施方案中，测试位点124的子集和校准位点126可以用第一捕获剂制备，而测试位点124的另一子集和校准测试位点128可以用第二捕获剂制备，以便允许在单个微阵列平台120内进行两个不同测试。还可以使用单个微阵列平台120内的额外的配置。作为示例，子阵列122之一内的每个测试位点可以用相同捕获剂制备，而子阵列122的每一个包括不同捕获剂。

一旦制备微阵列平台120，将样品引入选定的测试位点124的集合(模块146)。引入之前，可以首先通过诸如过滤和扩增的过程制备样品，包括加入试剂和其他控制预处理。还可以将对照物质引入校准位点126和128(模块148)。

如果尚未建立，控制选定的测试位点124的集合的每一个内的环境以在选定的测试位点124的集合的每一个内建立不同测试环境(模块150)。在这个实例中，控制的环境条件为温度。因此，横跨微阵列平台120建立热曲线。根据具体实施方案，这可以通过为选定的测试位点124的集合或子阵列122的每一个提供独有的加热器/冷却器来完成。在其他实施方案中，在微阵列平台120的一端施加热，并且将散热器热连接至微阵列平台120的另一端，以便建立横跨微阵列平台120的热梯度。还控制在校准位点126和128的环境(模块152)。

然后将样品和对照物质在建立的测试/校准环境中温育预定的时间(模块154)。在温育期间，通过环境检测器套件116监测选定的测试位点124的集合的每一个内的实际测试环境，并且将指示建立的测试环境的数据提供给处理电路104(模块156)。此外，通过环境检测器套件116监测校准位点126和128的每一个内的实际校准环境，并且将指示建立的校准环境的数据提供给处理电路104(模块158)。还监测在校准位点126和128的键合(bonding)活性，并且将指示活性的数据提供给处理电路104。可以通过处理电路104分析在校准位点126和128的键合活性以修改测试位点环境的控制(模块160)。在其他实施方案中，校准位点126和128用来重建实际环境以修正误差，例如在模块172。

当样品已充分温育时，洗涤测试位点124(模块162)，将标记的二抗引入选定的测试位点124的集合(模块164)并温育(模块166)。然后洗涤选定的测试位点124的集合(模块168)，并且通过标记读数器118检测测试位点124中剩余的标记(模块170)。基于与选定的测试位点124的集合中剩余的标记数量相关的信号，通过处理电路104计算样品内所关注的分子的浓度(模块172)。

计算所关注的分子的浓度是可能的，因为控制测试位点124的测试环境以提供具有合并的最小LoQ以及合并的最大LoQ的合并的反应曲线，所述合并的最小LoQ在期望定量的最小浓度或之下，所述合并的最大LoQ在期望定量的最大浓度或之上。此外，控制测试位点124的测试环境，从而在所关注的整个浓度范围中，与特定测试位点124相关的反应曲线的S形与至少一个其他测试位点124的反应曲线的S形重叠。前述内容可以参考图8来理解。

图8示出合并的反应曲线180，其在最小浓度182和最大浓度184限定的所关注的整个浓度范围中基本上线性延伸。对于给定的测试环境，所关注的浓度范围大于任何单一测试位点124的动态范围。

作为示例，反应曲线186与第一测试位点124相关。反应曲线186具有最小LoQ 188和最大LoQ 190。最小LoQ 188大于最小浓度182，而最大LoQ 190远小于最大浓度184。因此，与反应曲线186相关的测试位点124可以用来提供具有略高于所关注的浓度范围的最小浓度182并远小于最大浓度184的浓度的样品的可靠定量。因此，与反应曲线186相关的测试位点124不可以用来提供所关注的整个浓度范围中的浓度的可靠定量。

继续参考图8，反应曲线192具有最小LoQ 194和最大LoQ 196。最小LoQ 194小于反应曲线186的最大LoQ 190，而最大LoQ 196大于最大浓度184。因此，与反应曲线192相关的测试位点124可以用来提供具有在反应曲线186的最大LoQ 190的浓度以及高达在所关注的浓度范围的最大浓度184的浓度的样品的可靠定量。

因此，从最小浓度182延伸至最大浓度184的所关注的浓度范围内的样品的定量通过加和获得自与反应曲线186和192相关的测试位点124的信号是可能的。与合并信号相关的浓度利用反应曲线180获得，所述反应曲线180是反应曲线186和192的总和。因为反应曲线180是反应曲线186和192的总和，所以反应曲线180的最小LoQ 198会是略小于最灵敏的反应曲线(反应曲线186)的最小LoQ的浓度，而反应曲线180的最大LoQ 200会是略大于最不灵敏的反应曲线(反应曲线192)的最大LoQ的浓度。

因此，通过小心地控制在多个测试位点124的每一个的环境，可以获得合并的输出信号，其与所关注的分子的浓度具有相对线性的关系。此外，虽然完全覆盖图8中所关注的浓度范围仅需要两条反应曲线，但是如果期望增加的动态范围，可以进一步控制在额外的位点的测试环境以提供高于反应曲线192(如图8所示的右边)或低于反应曲线186(如图8所示的左边)的反应曲线。

在图7的模块150选择控制的环境因素的重要考虑是选择两种或更多种测试环境，其导致以期望的方式重叠的反应曲线。“重叠”是在至少两个反应曲线的动态范围内的浓度范围。通过控制在不同测试位点124的测试环境以提供如图8所示的重叠可以优化合并的反应曲线的线性。

随着重叠增加，合并的反应曲线的斜率增加。作为示例，图9示出反应曲线210和反应曲线212。在与反应曲线212相关的测试位点的亲和力仅略低于在与反应曲线210相关的测试位点的亲和力。亲和力的这种低调制导致合并的反应曲线214，与反应曲线180相比其表现出增加的斜率。然而，合并的反应曲线214的动态范围远小于合并的反应曲线180的动态范围。因此，对于固定数目的测试位点环境，减少重叠允许更大的动态范围。

然而，随着重叠的减少，所得的合并的反应曲线的斜率减小。作为示例，图10示出反应曲线220和反应曲线222。在与反应曲线222相关的测试位点的亲和力显著小于在与反应曲线220相关的测试位点的亲和力。亲和力的这种高调制导致合并的反应曲线224，与反应曲线180相比其表现出减小的斜率。此外，合并的反应曲线224的动态范围大于合并的反应曲线180的动态范围。然而，合并的反应曲线224还具有展平区(flattened region)226。在展平区226中，分析物浓度定量中潜在的误差增加。然而，提供另一测试位点可以消除展平区226，所述测试位点具有大于与反应曲线222相关的测试位点的亲和力并小于与反应曲线220相关的测试位点的亲和力。

在前述实例中，控制测试位点124的每一个内的温度以提供不同的结合效率。在包含CMOS技术的实施方案中，可以利用芯片上电阻如多晶硅电阻或集成的Peltier元件建立芯片内的温度梯度。低功耗芯片上温度传感器可以用来准确地测量每个测试位点内的温度。因此可以在印刷电路板、玻璃、塑料基底上，或者在具有金、玻璃、环氧树脂、聚合物或凝胶涂层的CMOS芯片上，或者甚至在孔板如96孔板中实现多点生物传感器。如果期望，可以在印刷电路板或CMOS芯片中提供控制、读数还有控制感应。CMOS技术允许制造靠得很近的多个感应位点。这有助于维持测试位点之间非受控环境因素的均匀性。芯片可以是使用独立的微流体或毛细管原理的系统的一部分，或者可以与单独提供的装置一起使用。如果期望，信号估计和测定数据可以在CMOS芯片上硬编码。

温度不是可以用来建立不同测试环境的唯一环境因素。如J.J.Goodinget al.，“Electrochemical modulation of antigen-antibody binding，“Biosensors and Bioelectronics,Vol.20,No.2,pp.260-268,2004,M.L.O’Grady，et al.,“Dynamic Control of Protein-Protein Interactions,”Langmuir,Vol.24(1),pp.316-322,2008,R.J.Heaton et al.,“Electrostatic surface plasmon resonance:direct electric field-induced hybridization and denaturation in monolayernucleic acid films and label-free discrimination of base mismatches,”Proceedings of National Academy of Science,Vol.98,No.7,pp.3701-3704,2001,和I.Wong et al.,“Dynamic control of biomolecular activity usingelectrical interfaces,”Soft Matter,Vol.3,No.3,pp 267-274,2007所报道的，证实其中进行温育的电场改变分子的结合效率。

在一些实施方案中，可以控制每个测试位点内的电场以与其他测试位点的每一个内的电场不同。电场可以用来改变例如局部浓度、pH等。深层机制包括电解和离子吸引力。AC信号的使用可以例如通过电流体动力效应(electrohydrodaynamic effect)产生样品内的离子运动来进一步提供局部混合。提供前述效应的许多电压范围是CMOS兼容的。因此，可以使用具有表面电极的CMOS芯片。根据期望的效应，可以在特定测试位点提供一个、两个或更多个电极，并且从测试样品暴露或分离。另一制造方法包括具有电极(例如，ITO、金)的载玻片或者具有印刷电极(例如，碳、金、银)的塑料或纸膜。

控制测试环境的另一方法是通过使用磁珠和受控的磁场。用对一定范围的生物分子如抗体、环氧树脂、核酸或适配体具有高亲和力的分子将磁珠官能化。当磁珠横跨传感器位点运动时，不同分子会以不同速率结合它们，从而刮擦测试位点的表面并“清洁”测试位点。控制测试位点内的磁场影响在每个测试位点发生的“清洁”的程度，从而改变不同分子的结合效率，这取决于分子与抗体之间形成的键的强度。外部磁体可以在各种实施方案中使用以使磁场偏向于期望的值，因为CMOS集成线圈仅可以产生中度磁场。

另一方法是在温育/洗涤点时在不同测试位点利用不同压力来调节亲和力，因为如M.L.Yarmush,et al.,"Immunoadsorption:strategies for antigenelution and production of reusable adsorbents,"Biotechnology Progress,Vol.8,No.3,pp.168-178,1992所报道的，压力可以用来改变亲和力。压力改变可以在流体设置中实现。

传感器的类型或集成入标记读数器118的传感器会根据所用的具体标记变化。因此各种实施方案可以使用发光、荧光、比色、电化学、阻抗和磁性传感器。应当配置传感器以允许分离选定的一个或多个测试位点产生的信号。同样地，集成入环境检测器套件116的传感器可以包括IR传感器和Hall传感器。可以提供AMR传感器或GMR传感器以监测测试位点表面上的磁珠密度。基于ISFET或CMOS的电荷检测电路可以用于电化学实施方案。

因此可以在大的浓度范围中获得所关注的分子的浓度，即使浓度范围超过可以用单一测试位点实现的动态范围。此外，方法130可以用于各种测试位点平台，包括96-孔板、具有较少或额外的孔的平板、微阵列平台、印刷电路板平台、CMOS芯片平台、多重测定、蛋白测定、横向流动装置、夹心测定、竞争性测定、基于珠的测定或其他适当的平台。方法130还可以用于检测所关注的各种分子以及除抗体以外的不同类型的分子。作为示例，方法130还可以用于检测核酸、蛋白或小分子。

虽然本发明在附图和前述描述中详细说明和描述，但是应当认为附图和前述描述的特征是说明性而不是限制性的。应当理解仅呈现优选的实施方案，并且期望保护本发明的精神内的所有改变、修改和进一步的应用。

Claims

1.一种定量所关注的分子的浓度的方法，所述方法包括：

在多个测试位点建立多种测试环境，所述多种测试环境的每一种与多个反应曲线之一相关，所述多个反应曲线的每一个与所述多个反应曲线的其他反应曲线不同；

储存得自所述多个反应曲线的总和的合并的反应曲线；

将所述多个测试位点暴露于具有一定浓度的所关注的分子的样品；

获得多个定量信号，所述多个定量信号的每一个与所述多个测试位点之一相关；

将所述多个定量信号的总和与储存的合并的反应曲线关联；以及

基于所述关联产生与所关注的分子的浓度相关的信号。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个反应曲线的每一个与所述多个反应曲线的其他反应曲线的至少一个重叠。

3.如权利要求1所述的方法，其中建立多种测试环境包括：

控制由所述多个测试位点的每一个的温度、电场、磁场、pH和缓冲液类型组成的环境因素的组的至少一种环境因素，从而受控的至少一种环境因素在所述多个测试位点的至少两个之间不同。

4.如权利要求3所述的方法，其中控制至少一种环境因素包括：

控制所述至少一种环境因素，从而在所述多个位点的每一个的所述受控的至少一种环境因素与所述多个测试位点的其他测试位点的每一个不同。

5.如权利要求1所述的方法，其中建立多种测试环境包括：

提供至少一种捕获剂；

对所述多个测试位点的每一个鉴定各自的捕获剂配方，其中所述多个测试位点的每一个的捕获剂配方与所述多个测试位点的其他测试位点的每一个的捕获剂配方不同；以及

按照鉴定的配方，将所述至少一种捕获剂固定在所述多个测试位点的每一个中。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种捕获剂包含多种捕获剂，所述多种捕获剂的每一种表现出与所述多种捕获剂的另一种对所关注的分子的亲和力不同的对所关注的分子的亲和力。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述多个测试位点的每一个的捕获剂配方包括与所述多个测试位点的其他测试位点中的至少一种捕获剂不同的至少一种捕获剂的选定的一种。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述多个测试位点的第一个的捕获剂配方包括与所述多个测试位点的第二个中的至少一种捕获剂相同的至少一种捕获剂的选定的一种。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述多个测试位点的第一个中的至少一种捕获剂中的选定的一种的浓度大于所述多个测试的第二个中的至少一种捕获剂的选定的一种的浓度。

10.如权利要求1所述的方法，其还包括：

在多孔板的各孔中形成所述多个测试位点的每一个。

11.如权利要求1所述的方法，其还包括：

在CMOS基底上形成所述多个测试位点的每一个。

12.一种定量所关注的分子的浓度的方法，所述方法包括：

在第一测试位点建立第一测试环境；

在第二测试位点建立第二测试环境，从而所述第二位点的反应曲线与所述第一位点的反应曲线不同；

储存得自所述第二位点的反应曲线与所述第一位点的反应曲线的总和的合并的反应曲线；

将所述第一测试位点和所述第二测试位点暴露于具有一定浓度的所关注的分子的样品；

从所述第一测试位点获得第一定量信号；

从所述第二测试位点获得第二定量信号；

合并所述第一定量信号和所述第二定量信号；

将合并的第一定量信号和第二定量信号与储存的反应曲线关联；以及

基于所述关联产生与所关注的分子的浓度相关的信号。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述多个反应曲线的每一个与所述多个反应曲线的其他反应曲线的至少一个重叠。

14.如权利要求12所述的方法，其中：

建立第一测试环境包括控制由所述第一测试位点的温度、电场、磁场和pH组成的环境因素的组的至少一种环境因素；以及

建立第二测试环境包括控制所述第二测试位点的至少一种环境因素，从而受控的至少一种环境因素在所述第一测试位点与所述第二测试位点之间不同。

15.如权利要求12所述的方法，其还包括：

提供至少一种捕获剂；

对所述第一测试位点和所述第二测试位点的每一个鉴定各自的捕获剂配方，其中所述第一测试位点和所述第二测试位点的每一个的捕获剂配方与所述第一测试位点和所述第二测试位点的另一个的捕获剂配方不同；以及

按照鉴定的配方，将所述至少一种捕获剂固定在所述第一测试位点和所述第二测试位点的每一个中。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述至少一种捕获剂包含多种捕获剂，所述多种捕获剂的每一种表现出与所述多种捕获剂的另一种对所关注的分子的亲和力不同的对所关注的分子的亲和力。

17.如权利要求12所述的方法，其还包括：

在多孔板的各孔中形成所述第一测试位点和所述第二测试位点的每一个。

18.如权利要求12所述的方法，其还包括：

在CMOS基底上形成所述第一测试位点和所述第二测试位点的每一个。