CN102813643A - bumetanide在抑制肝癌细胞转移中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种bumetanide在抑制肝癌转移中的应用。布美他尼(bumetanide)可用于制备抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物，制备治疗肝癌的药物，制备降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品。布美他尼(bumetanide)可以降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白的含量，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。本发明肝癌的治疗具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种bumetanide的新用途，具体涉及bumetanide在抑制肝癌细胞转移中的应用。
背景技术
原发性肝癌中90％以上为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，HCC是一种很常见的、致死率非常高的恶性肿瘤，每年约650,000人死于HCC，且其发病率有逐年增高的趋势。HCC多发于东南亚和非洲等发展中国家，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二位，另外，在发达国家HCC的发病率也在逐年上升。HCC的早期诊断一直是临床治疗中的瓶颈。临床上的手术切除肝脏肿瘤以及肝移植被认为是HCC获得根治的最佳手段，但是仅仅有10-20％的HCC病人适合外科手术治疗；即使是根治性切除，5年内仍有60-70％的病人会出现HCC的转移复发，而局部治疗的转移复发率则更高。HCC的转移是影响治疗效果和预后的最大障碍，是导致其高死亡率的主要原因。
布美他尼(bumetanide)是一种利尿剂，主要抑制肾小管髓袢升支厚壁段对NaCl的主动重吸收，对近端小管重吸收Na+也有抑制作用，但对远端肾小管无作用。能抑制前列腺素分解酶的活性，使前列腺素E2含量升高，从而具有扩张血管作用。扩张肾血管，降低肾血管阻力，使肾血流量尤其是肾皮质深部血流量增加，在布美他尼的利尿作用中具有重要意义，也是其用于预防急性肾功能衰竭的理论基础。另外，布美他尼能扩张肺部容量静脉，降低肺毛细血管通透性，加上其利尿作用，使回心血量减少，左心室舒张末期压力降低，有助于急性左心衰竭的治疗。由于布美他尼可降低肺毛细血管通透性，为其治疗成人呼吸窘迫综合征提供了理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种布美他尼(bumetanide)在抑制肝癌转移中的应用。
本发明提供了布美他尼(bumetanide)在制备抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物中的应用。
所述肝癌细胞可为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
本发明还保护布美他尼(bumetanide)在制备治疗肝癌的药物中的应用。
所述肝癌可为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞引起的。
本发明还保护布美他尼(bumetanide)在制备降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品中的应用；所述NKCC1蛋白为如下(I)或(II)：
(I)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(II)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭相关的由序列1衍生的蛋白质。
所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
本发明还保护一种抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物，它的活性成分为布美他尼(bumetanide)。
所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
本发明还保护一种治疗肝癌的药物，它的活性成分为布美他尼(bumetanide)。
所述肝癌为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞引起的。
本发明还保护一种降低肝癌细胞中所述磷酸化NKCC1蛋白含量的产品，它的活性成分为布美他尼(bumetanide)。
所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
质膜蛋白与肿瘤的转移密切相关。目前已发现的药物靶标大部分定位于细胞质膜，许多与肿瘤发生发展相关的质膜蛋白可作为重要的药物靶标。此外，部分质膜蛋白可从细胞表面脱落进入体液，成为潜在的生物标志物。因此针对HCC细胞质膜蛋白的研究不仅能促进HCC转移机理的揭示，还有利于发现检测肿瘤转移的生物标志物和临床治疗的药物靶点。Na-K-Cl协同转运蛋白(NKCC1)定位于细胞质膜，在高转移肝癌细胞株中表达上调，介导转运Na、K、Cl离子进出细胞，维持和调节细胞体积和离子浓度，调节细胞的生长和发育。
布美他尼(bumetanide)可以降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白的含量，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。本发明肝癌的治疗具有重大价值。
附图说明
图1为活性实验检测不同转移能力肝细胞癌细胞株中NKCC1的活性。
图2为活性实验检测bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞中NKCC1活性的影响。
图3为Western blot检测bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞中NKCC1的活性影响。
图4为bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞体外增殖能力的影响。
图5为bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞体外侵袭能力的影响。
图6为bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞MMP-2分泌量的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
肝癌细胞株MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所，其转移能力依次增强。Huh7细胞购自ATCC。鸡抗人NKCC1一抗购自GenWay Biotech公司。鼠抗人GAPDH一抗购自Prote inTech Group。HRP标记的抗鸡的二抗购自Abcam公司。HRP标记的抗兔的二抗、HRP标记的抗鼠的二抗均购自北京中杉金桥生物技术公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自株式会社同仁化学研究所。BDBioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber购自美国BD公司。BCA法蛋白测定试剂盒购自Thermo。布美他尼(bumetanide)购自sigma公司。pluronic acid与sodiumbinding benzofuran isophthalate acetoxy methyl esters-AM(SBFI)购自Invitrogen公司。DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司。
实施例中所用的PBS缓冲液均为将0.8g NaCl，0.02g KCl，0.358g Na2HPO4-12H2O，0.024g KH2PO4溶于1000mL水得到的；pH7.4。
细胞裂解液：质量百分含量为4％的SDS，质量百分含量为2％的DTT，120mM Tris-Cl(pH6.8)，5mM氟化钠，1mM矾酸钠，10mM焦磷酸钠，蛋白酶抑制剂(Cocktail)。
实施例1、比较不同转移能力肝癌细胞株中NKCC1活性的表达情况
本实施例中，通过检测蛋白液中的钠离子含量比较不同肝癌细胞株中NKCC1活性的表达情况，相关机理见文献AR.Jayakumar，ML.Liu，M.Moriyama.et al.Na-K-ClCotransporter-1 in the Mechani sm of Ammonia-induced Astrocyte Swelling.TheJournal of Biological Chemi stry.2008，283(49)：33875。
分别将MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3进行如下操作：
1、将细胞按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养；待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，加入DMEM高糖培养基于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养30min。
2、吸弃培养基，加入含有0.05％(体积百分含量)pluronic acid和10μM sodiumbinding benzofuran isophthalate acetoxy methyl esters-AM(SBFI)的DMEM高糖培养基于37℃、5％ CO2培养箱中避光培养2h。
3、吸弃培养基，用冷的PBS缓冲液清洗2次后加入500μl 0.2％(体积百分含量)的Triton X-100水溶液，用细胞刮把细胞刮下来后超声破碎10s(每个循环为：超声0.2s，停2s；超声振幅为24％)，得到的溶液即为蛋白液。
4、一部分蛋白液用来测定蛋白浓度，剩下的蛋白液用荧光分光光度计测荧光密度(激发光波长为340nm/385nm，吸收光波长为510nm)，NKCC1的活性以“荧光强度单位units/mg蛋白”为单位呈现。
结果见图1。HCCLM3中NKCC1的活性最高，MHCC97H次之，MHCC97L活性最低，即在这三种细胞中，NKCC1的活性与细胞的转移能力一致。
实施例2、检测bumetanide对肝癌细胞NKCC1活性的影响
一、荧光分光光度计检测
1、肝癌细胞株MHCC97H
(1)将肝癌细胞株MHCC97H按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
(2)待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(MHCC97H)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(MHCC97H+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养30min。
(3)吸弃培养基，加入含有0.05％(体积百分含量)pluronic acid和10μM sodiumbinding benzofuran isophthalate acetoxy methyl esters-AM(SBFI)的DMEM高糖培养基于37℃、5％ CO2培养箱中避光培养2h。
(4)吸弃培养基，用冷的PBS缓冲液清洗2次后加入500μl 0.2％(体积百分含量)的Triton X-100水溶液，用细胞刮把细胞刮下来后超声破碎10s(每个循环为：超声0.2s，停2s；超声振幅为24％)，得到的溶液即为蛋白液。
(5)一部分蛋白液用来测定蛋白浓度，剩下的蛋白液用荧光分光光度计测荧光密度(激发光波长为340nm/385nm，吸收光波长为510nm)，NKCC1的活性以“荧光强度单位units/mg蛋白”为单位呈现。
结果见图2A。bumetanide作用后的肝癌细胞株MHCC97H中NKCC1的活性下降，即bumetanide可降低肝癌细胞株MHCC97H中NKCC1的活性。
2、Huh7细胞
(1)将Huh7细胞按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
(2)待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(Huh7)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(Huh7+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养30min。
步骤(3)至步骤(5)同步骤1的步骤(3)至步骤(5)。
结果见图2B。bumetanide作用后的Huh7细胞中NKCC1的活性下降，即bumetanide可降低Huh7细胞中NKCC1的活性。
二、Western blot检测
1、肝癌细胞株MHCC97H
(1)将肝癌细胞株MHCC97H按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养；
(2)待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(MHCC97H)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(MHCC97H+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养30min后收集细胞。
(3)用细胞裂解液裂解步骤1收集的细胞，然后4℃、10000g离心15min，收集裂解液上清，即为细胞总蛋白。
(4)将细胞总蛋白在95℃下煮5min，然后进行Western blot检测。
Western blot检测的具体参数：采用12％ SDS-PAGE电泳；总NKCC1的检测采用鸡抗人NKCC1一抗(1∶1000稀释)和HRP标记的抗鸡的二抗(1∶10000稀释)；P-NKCC1(磷酸化NKCC1)的检测采用P-NKCC1兔多抗(1∶3000稀释)和HRP标记的抗兔的二抗(1∶10000稀释)；内参为GAPDH，采用鼠抗人GAPDH一抗(1∶10000稀释)和HRP标记的抗鼠的二抗(1∶10000稀释)。
(5)对条带进行光密度扫描，检测各组NKCC1蛋白和内参GAPDH蛋白所对应条带A值，然后将AP-NKCC1/AGAPDH的比值进行统计学分析(Quantity One软件)。
肝癌细胞株MHCC97H的Western blot胶片图见图3A。bumetanide作用后的肝癌细胞株MHCC97H中p-NKCC1的蛋白含量下降(见图3B)，而总蛋白量不变(见图3C)，说明bumetanide可降低肝癌细胞株MHCC97H中p-NKCC1的蛋白含量，从而降低了NKCC1的活性。
2、Huh7细胞
(1)将Huh7细胞按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
(2)待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(Huh7)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(Huh7+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养30min后收集细胞。
步骤(3)至步骤(5)同步骤1的步骤(3)至步骤(5)。
Huh7细胞的Western blot胶片图见图3D。bumetanide作用后的Huh7细胞中p-NKCC1的蛋白含量下降(见图3E)，而总蛋白量不变(见图3F)，说明bumetanide可降低Huh7细胞中p-NKCC1的蛋白含量，从而降低了NKCC1的活性。
实施例3、bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞体外增殖能力的影响
一、肝癌细胞株MHCC97H
1、取对数生长期(70％-80％汇合度)的肝癌细胞株MHCC97H，用0.25％胰酶(Hyclone公司)消化成细胞悬液。
2、将96孔板中的孔分为两组：
第一组(MHCC97H)：加入含有10％(体积百分含量)FBS的DMEM高糖培养基，然后接种细胞悬液，细胞浓度为1000个/μl；
第二组(MHCC97H+BUM)：加入含有10％(体积百分含量)FBS和50μM bumetanide的DMEM高糖培养基，然后接种细胞悬液，细胞浓度为1000个/μl；
置于37℃、5％ CO2培养箱中培养培养12小时。
3、采用CCK-8试剂盒分别在0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天在酶标仪OD450nm处测量各孔的吸光值(自接种细胞开始第一个12小时完成后作为起始时刻，记作第0天，自起始时刻开始第24小时结束后作为第1天，依次类推)。设置三次重复实验，结果取平均值。
结果见图4A。NKCC1的活性受bumetanide抑制后，细胞的体外贴壁增殖能力与MHCC97H组细胞相比有显著的降低，说明降低NKCC1的活性使MHCC97H细胞的增殖能力显著下降，即bumetanide通过降低NKCC1的活性水平抑制了了MHCC97H细胞的增殖。
二、Huh7细胞
1、取对数生长期(70％-80％汇合度)的Huh7细胞，用0.25％胰酶(Hyclone公司)消化成细胞悬液。
2、将96孔板中的孔分为两组：
第一组(Huh7)：加入含有10％(体积百分含量)FBS的DMEM高糖培养基，然后接种细胞悬液，细胞浓度为1000个/μl；
第二组(Huh7+BUM)：加入含有10％(体积百分含量)FBS和50μM bumetanide的DMEM高糖培养基，然后接种细胞悬液，细胞浓度为1000个/μl；
置于37℃、5％ CO2培养箱中培养培养12小时。
步骤3同步骤一的3。
结果见图4B。NKCC1的活性受bumetanide抑制后，细胞的体外贴壁增殖能力与Huh7组细胞相比有显著的降低，说明降低NKCC1的活性使Huh7细胞的增殖能力显著下降，即bumetanide通过降低NKCC1的活性水平抑制了Huh7细胞的增殖。
实施例4、bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞体外侵袭能力的影响
一、bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H体外侵袭能力的影响(Transwell实验)
1、将肝癌细胞株MHCC97H按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养；
2、待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(MHCC97H)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(MHCC97H+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养24小时。
3、消化后，离心弃去培养基，用PBS缓冲液清洗，用含有1％(体积百分含量)BSA的DMEM高糖培养基重悬，调整细胞密度为1×106/ml(细胞悬液)。把小室从-20℃取出，放置至室温；在小室和24孔板中加入预温的DMEM高糖培养基，37℃、5％ CO2培养箱孵育2小时；下室加入750μl含有10％(体积百分含量)FBS的DMEM高糖培养基，用无菌镊将Transwell小室放入有培养基的孔内，必须确认膜下没有气泡，并避免小室在液体中形成角度。分别取二组细胞悬液500μl加入Transwell小室中，每组细胞设3个平行复孔实验；置于培养箱中常规培养24h；24h后从培养箱中取出Transwell小室，用棉签蘸无血清的DMEM培养基擦拭除去Transwell小室上层的胶和细胞；将Transwell小室置于甲醇中固定10min，PBS缓冲液清洗5min×3次；将Traswell小室移入0.1％结晶紫中，染色30min，PBS缓冲液清洗5min×3次；取出Transwell小室，底面朝上，置于光镜下，膜上滴一滴水，上置盖玻片；每个滤膜随即选取5个视野，计数穿膜细胞数，以穿膜细胞的数目表示细胞的相对侵袭能力。
结果见图5(B为照片；A为每个视野中的细胞数量，5个视野的平均值)。NKCC1的活性受bumetanide抑制后，肝癌细胞株MHCC97H的体外侵袭能力有显著的降低，说明降低NKCC1的活性使肝癌细胞株MHCC97H的侵袭能力显著下降，即bumetanide通过降低NKCC1的活性水平降低了肝癌细胞株MHCC97H的侵袭能力。
二、bumetanide对Huh7细胞体外侵袭能力的影响(Transwell实验)
1、将Huh7细胞按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
2、待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(Huh7)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(Huh7+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养24小时。
步骤3同步骤一的3。
结果见图5(D为照片；C为每个视野中的细胞数量，5个视野的平均值)。NKCC1的活性受bumetanide抑制后，Huh7细胞的体外侵袭能力有显著的降低，说明降低NKCC1的活性使Huh7细胞的侵袭能力显著下降，即bumetanide通过降低NKCC1的活性水平降低了Huh7细胞的侵袭能力。
实施例5、bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H和Huh7细胞MMP-2分泌量的影响
一、bumetanide对肝癌细胞株MHCC97H MMP-2分泌量的影响(明胶酶谱法)
1、将肝癌细胞株MHCC97H按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
2、待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(MHCC97H)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(MHCC97H+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养24小时，收集上清液。
3、将上清液与2×上样缓冲液(0.125mol/L Tris-HCl、pH6.8，体积百分含量为20％的甘油，质量百分含量为4％的SDS，质量百分含量为0.002％的溴酚蓝)按1∶1的体积比混合后静置10分钟。
4、将步骤3的混合液进行恒压125V的10％SDS-PAGE(含0.1％明胶)电泳，结束后将凝胶置1×复性缓冲液(Invitrogen)室温振荡洗脱2次，每次40分钟；弃复性缓冲液，加1×孵育缓冲液(Invitrogen)室温振荡平衡30分钟；将凝胶置新鲜1×孵育缓冲液中，37℃孵育至少4h；考马斯亮蓝染液染色30分钟；用脱色液脱色至亮带出现。设置三次重复实验，结果取平均值。
电泳结果见图6B。以第一组(MHCC97H)中MMP-2的表达量为1，计算第二组(MHCC97H+BUM)中MMP-2的相对表达量(Ratio)，见图6A。结果显示NKCC1活性受到抑制后，肝癌细胞株MHCC97H培养上清中MMP-2的活性显著下降，即其分泌量显著下降，也就表明肝癌细胞株MHCC97H的转移和侵袭能力显著下降，也就可以解释前期实验所得结果第二组(MHCC97H+BUM)细胞的转移和侵袭能力下降。
二、bumetanide对Huh7细胞MMP-2分泌量的影响(明胶酶谱法)
1、将Huh7细胞按2×105个/ml的密度接种于六孔培养板，每孔接种2ml细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱培养。
2、待细胞生长至80-90％汇合度后，吸弃液体，分成两组：
第一组(Huh7)：加入DMEM高糖培养基；
第二组(Huh7+BUM)：加入含50μM bumetanide的DMEM高糖培养基；
于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养24小时，收集上清液。
步骤3和4同步骤一的3和4。
电泳结果见图6D。以第一组(Huh7)中MMP-2的表达量为1，计算第二组(Huh7+BUM)中MMP-2的相对表达量(Ratio)，见图6C。结果显示NKCC1活性受到抑制后，Huh7细胞培养上清中MMP-2的活性显著下降，即其分泌量显著下降，也就表明Huh7细胞的转移和侵袭能力显著下降，也就可以解释前期实验所得结果第二组(Huh7+BUM)细胞的转移和侵袭能力下降。
Claims (10)
1.布美他尼在制备抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
3.布美他尼在制备治疗肝癌的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述肝癌为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞引起的。
5.布美他尼在制备降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品中的应用；
所述NKCC1蛋白为如下(I)或(II)：
(I)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(II)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭相关的由序列1衍生的蛋白质。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞。
7.一种抑制肝癌细胞增殖和/或侵袭和/或转移的药物，它的活性成分为布美他尼。
8.一种治疗肝癌的药物，它的活性成分为布美他尼。
9.一种降低肝癌细胞中磷酸化NKCC1蛋白含量的产品，它的活性成分为布美他尼；
所述NKCC1蛋白为如下(I)或(II)：
(I)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(II)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与癌细胞增殖和/或迁移和/或浸润和/或侵袭相关的由序列1衍生的蛋白质。
10.如权利要求7或8所述的药物，或如权利要求9所述的产品，其特征在于：所述肝癌细胞为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞；所述肝癌为肝癌细胞株MHCC97H或Huh7细胞引起的。
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2011
- 2011-06-10 CN CN201110155384.0A patent/CN102813643B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
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| FREIMUT SCHLIESS，ET AL: "Expression and regulation of the Na+/K+/2Cl- cotransporter NKCC1 in rat liver and human HuH-7 hepatoma cells", 《ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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