CN102812126A

CN102812126A - 用于抑制vegf的组合物和方法

Info

Publication number: CN102812126A
Application number: CN2010800610197A
Authority: CN
Inventors: N·德纳卡
Original assignee: Opko Ophthalmics LLC
Current assignee: Opko Ophthalmics LLC
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2012-12-05
Also published as: EP2507373A1; US8227444B2; WO2011069155A1; US20110142915A1; RU2012127772A; EP2507373A4; CA2782728A1; US20130039971A1; JP2013512677A

Abstract

本文中公开了用于抑制血管内皮生长因子(VEGF)同种型表达的siRNA组合物和方法。牵涉受VEGF的过表达刺激的血管生成的疾病例如糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和许多类型的癌症可通过施用公开的小干扰RNA来进行治疗。

Description

用于抑制VEGF的组合物和方法

交叉参考相关申请:

本申请要求2009年12月4日提交的标题为“COMPOSITIONS ANDMETHODS FOR INHIBITI ON OF VEGF”的美国临时专利申请No.61/266,645的优先权权益，将其完整内容通过引用并入本文。

政府利益：不适用

联合研究协议的其他方：不适用

并入光盘上提交的参考材料：不适用

背景

1.发明领域:不适用

2.相关领域描述:不适用

发明概述

血管生成(Angiogenesis)，定义为新毛细血管的生长或“新血管形成(neovascularization)”，在生长和发育中起着基础性作用。在成熟的人中，起始血管生成的能力存在于所有组织中，但受到严格的控制。血管生成的关键调节剂是血管内皮生长因子(“VEGF”)，也称为血管通透因子(vascular permeability factor，“VPF”)。当分泌的VEGF结合Flt-1和Flk-1/KDR受体(也称为VEGF受体1和VEGF受体2)时，起始血管生成，所述受体在内皮细胞的表面上表达。Flt-1和Flk-1/KDR是跨膜蛋白酪氨酸激酶，并且VEGF的结合起始细胞信号级联，从而最终导致周围组织的新血管形成。

在人中存在3种主要的不同的VEGF选择性剪接形式(即，同种型)(VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅和VEGF₁₈₉)，然而还存在许多其它变体(VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₃、VEGF₁₄₈、VEGF_165b和VEGF₁₄₅)。值得注意地，并非所有同种型都是促血管生成的。已证明，至少VEGF_165b能够抵消VEGF₁₆₅诱导的血管生成效应。不受理论限制，VEGF_165b似乎能够阻止VEGF受体2的信号转导。因此，VEGF_165b的分泌可能能够阻止或延迟病理状态中的血管生成。

异常血管生成或新血管的病理生长牵涉许多病况。这类病况包括糖尿病视网膜病变、银屑病、渗出型老年性黄斑变性或湿性老年性黄斑变性(“ARMD”)、类风湿性关节炎和其他炎性疾病以及大多数癌症。与这些病况相关的患病组织或肿瘤表达异常高水平的VEGF，并且显示高度的血管化或血管通透性。

特别地，ARMD为临床上重要的血管生成疾病。该病况的特征在于老龄化个体的一只或两只眼中的脉络膜新生血管化，并且是工业化国家中失明的主要原因。

RNA干扰(在下文中称为“RNAi”)是在许多真核生物中保守的转录后基因调控的方法。RNA i由存在于细胞中的短(即，少于30个核苷酸)双链RNA(“dsRNA”)分子诱导。此类短dsRNA分子(称为“短干扰RNA”或“siRNA”)引起与所述siRNA共有序列同一性(达到一个核苷酸的分辨率)的信使RNA(“mRNA”)的破坏。据认为，siRNA和靶向的mRNA结合至“RNA诱导沉默复合体”或“RISC”，所述复合体切割靶向的mRNA。siRNA明显被再循环，与多次周转酶十分相似，1个siRNA分子能够诱导约1000个mRNA分子的切割。siRNA介导的mRNA的RNAi降解从而比用于抑制靶基因的表达的目前可用的技术更有效。然而，此类方法并且不能直接转变成用于治疗疾病的治疗剂。

因此，所需要的是，在哺乳动物中以催化或亚化学计量的量选择性抑制促血管生成VEGF的表达同时诱导或维持抗血管生成VEGF同种型的分泌的试剂。

本公开内容涉及特异性靶向和引起来自VEGF及其同种型的mRNA的RNAi-诱导的降解的siRNA。本公开内容的siRNA化合物和组合物用于抑制血管生成，特别地用于治疗癌性肿瘤、老年性黄斑变性及其它血管生成疾病。

因此，本公开内容提供了靶向人VEGF mRNA或其选择性剪接形式、突变体或同源物(cognate)的分离的siRNA。例如，在一个实施方案中，siRNA靶向促血管生成VEGF mRNA同种型例如VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₃、VEGF₁₄₈和/或VEGF₁₄₅。在某些实施方案中，siRNA包含形成RNA双链体的有义RNA链和反义RNA链。有义RNA链包含与靶mRNA中的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列。

本公开内容还提供了表达本文中公开的s iRNA的重组质粒和病毒载体，以及包含这样的siRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。

本公开内容还提供了抑制人促血管生成VEGF mRNA或其选择性剪接形式、突变体或同源物的表达，同时使抗血管生成VEGF mRNA免受降解的方法，包括给试者施用有效量的siRNA以便降解靶mRNA。

本公开内容还提供了抑制受试者中的血管生成的方法，包括给受试者施用有效量的靶向促血管生成人VEGF mRNA或其选择性剪接形式、突变体或同源物的siRNA。

本公开内容还提供了治疗血管生成疾病的方法，包括给有此治疗需要的受试者施用有效量的靶向人促血管生成VEGF mRNA或其选择性剪接形式、突变体或同源物的siRNA，以便与血管生成疾病相关的血管生成被抑制。

附图概述

本申请的文件包含至少一张彩色照片或附图。具有彩色附图或照片的本专利的拷贝可在请求和支付必要的费用后由Patent andTrademark Office提供。

为了更全面地理解本发明的性质和有利方面，应当结合附图参考下列详细描述，在所述附图中:

图1A和1B是不用siRNA(“-”)、用非特异性siRNA(“非特异性”)或靶向人VEGF mRNA的siRNA(“VEGF”)处理的缺氧293和HeLa细胞中的VEGF浓度(以pg/ml表示)的直方图。还显示了非缺氧293和HeLa细胞中的VEGF浓度(以pg/ml表示)。每一个条棒(bar)表示4个实验的平均值，误差为平均值的标准差。

图2是不用siRNA(“-”)、用非特异性siRNA(“非特异性”)或靶向人VEGF mRNA的siRNA(“VEGF”)处理的缺氧NIH 3T3细胞中的鼠VEGF浓度(以pg/ml表示)的直方图。每一个条棒表示6个实验的平均值，误差为平均值的标准差。

图3是在GFP siRNA(深灰色条棒)或人VEGF siRNA(浅灰色条棒)存在的情况下，用表达人VEGF的腺病毒(“AdVEGF”)注射的小鼠的视网膜中的人VEGF浓度(pg/总蛋白)的直方图。每一个条棒表示5只眼的平均值，误差棒表示平均值的标准差。

图4是显示视网膜下注射了GFP siRNA的对照眼(N=9；“GFPsiRNA”)中和视网膜下注射了小鼠VEGF siRNA的眼(N=7；“小鼠VEGF siRNA”)中的激光诱导的CNV的平均面积(以mm2表示)的直方图。误差棒表示平均值的标准差。

图5是pAAVsiRNA，用于产生本发明的重组AAV病毒载体的顺式作用质粒的示意图。“I TR”:AAV末端反向重复；“U6”:U6RNA启动子；“sense”:siRNA有义编码序列；“Anti”:siRNA反义编码序列；“PolyT”:聚胸苷(polythymidine)终止信号。

图6显示用小鼠抗-VEGF siRNA(“mVEGF1.siRNA”)或对照siRNA(“GFP1.siRNA”)进行(A)视网膜下或(B)玻璃体内注射的小鼠眼的激光诱导的CNV的平均面积(以mm2表示)的直方图。误差棒表示平均值的标准差。(C)是在激光诱导后第1天用不具有siRNA的磷酸缓冲盐溶液(“PBS”；在激光诱导后第14天测量CNV面积)、在激光诱导后第14天用对照siRNA(“GFP1.siRNA”；在激光诱导后第21天测量CNV面积)或在激光诱导后第14天用小鼠抗-VEGF siRNA(“mVEGF1.siRNA”；在激光诱导后第21天测量CNV面积)进行玻璃体内注射的小鼠眼中激光诱导的CNV的平均面积(以mm²表示)的直方图。误差棒表示平均值的标准差。

图7是在注射后第0(n=2；pre-siRNA注射)、6(n=3)、10(n=3)和14(n=3)天后用人抗-VEGF siRNA(“Cand5”)和对照siRNA(“GFP1.siRNA”)进行视网膜下注射的小鼠眼中的VEGF蛋白的百分比(“%VEGF”)的图。%VEGF=(Cand5眼中的[VEGF]/GFP1.siRNA眼中的[VEGF])*100。

图8是用人VEGF siRNA、非特异性siRNA(EGFP siRNA)转染的293细胞中的hVEGF蛋白水平或无siRNA的模拟转染的293细胞中的hVEGF蛋白水平的图。

图9是利用Cand5(bevasrianib)、hVEGF#1、hVEGF#2、hVEGF#3、hVEGF#4、hVEGF#6和hVEGF#7进行的剂量响应研究的图。

图10是VEGF的不同同种型及其外显子使用(usage)的示意图。

图11是比较VEGF₁₆₅与VEGF_165b在外显子7/8接合处上的同源性的示意图。

图12描述了对于靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的不同siRNA，表达的VEGF蛋白的量。

图13描述了对于靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的不同siRNA，人VEGF蛋白的百分比敲低。

图14描述了对于靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA的二次筛选，表达的VEGF蛋白的量。

图15描述了对于靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA的二次筛选，人VEGF蛋白的百分比敲低。

图16描述了对于不同浓度的靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA的二次筛选，人VEGF蛋白的百分比敲低。

图17描述了对于靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA的二次筛选，在7天的时间中人VEGF蛋白的百分比敲低。

图18描述了使用RT-PCR测量的靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA对GAPDH mRNA表达的影响。

图19描述了使用RT-PCR测量的靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA对VEGF₁₆₅mRNA表达的影响。

图20描述了使用RT-PCR测量的靶向VEGF外显子7/8接合处的siRNA对VEGF₁₈₉mRNA表达的影响。

图21描述了使用RT-PCR测量的靶向VEGF外显子7/8接合处的siRNA对VEGF₁₂₁mRNA表达的影响。

图22描述了使用RT-PCR测量的靶向VEGF₁₆₅外显子7/8接合处的siRNA对VEGF_165bmRNA表达的影响。在约600bp处的两条带是人工假像。

图23描述了在用选择的s i RNA处理后ARPE19细胞的细胞因子谱。

图24描述了siRNA对由ARPE19细胞分泌的总VEGF蛋白的影响。

图25描述了siRNA对由ARPE19细胞分泌的总VEGF蛋白的影响。

图26描述了siRNA对由ARPE19细胞分泌的总VEGF蛋白的影响。

图27描述了siRNA对由ARPE19细胞分泌的总VEGF蛋白的影响。

图28描述了在不同的温度条件下随时间过去bevasiranib的稳定性。

图29描述了在不同的温度条件下随时间过去bevasiranib的稳定性。

图30描述了在不同的温度条件下随时间过去OPK-HVB-004的稳定性。

图31描述了在不同的温度条件下随时间过去OPK-HVB-009的稳定性。

图32描述了在不同的温度条件下随时间过去OPK-HVB-010的稳定性。

图33描述了在3'末端上人、大鼠和小鼠VEGF序列之间的同源性。

图34描述了siRNA对C6细胞分泌大鼠VEGF的影响。

图35描述了siRNA对NIH3T3细胞分泌小鼠VEGF的影响。

图36描述了siRNA对ARPE19细胞分泌VEGF的影响。

图37描述了siRNA对ARPE19细胞分泌VEGF的影响。

图38描述了siRNA对ARPE19细胞分泌VEGF的影响。

图39描述了siRNA对NIH3T3细胞分泌小鼠VEGF的影响。

图40描述了siRNA对ARPE19细胞中的VEGF mRNA信使的影响。

图41描述了siRNA对C6细胞中的VEGF表达的影响。

发明详述

在描述本发明的组合物和方法之前，应理解，本发明不限定于所描述的具体过程、组合物或方法，因为这些可以变化。还应理解，说明书中使用的术语仅仅是为了描述特定形式或实施方案，并且无意限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但现描述优选的方法、装置和材料。将本文中提及的所有出版物通过引用整体并入本文。此处的任何信息都不能被解释为承认，没有权利通过在先发明而使本发明早于这样的公开物。

还必须指出，如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确地指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指物。因此，例如，“分子”是指一个或多个分子和本领域技术人员已知的其等同物等。如本文中所使用的，术语“约”意指，与其一起使用的数字的数值的正或负10%。因此，约50%意指在45%-55%的范围内。

如本文中所使用的，“受试者”包括人类或非人动物。在某些实施方案中，受试者是人类。

如本文中所使用的，“有效量”的siRNA是足以引起细胞中的靶mRNA的RNAi介导的降解的量。术语临床上有效量是，当给受试者施用时，将通过RNA沉默抑制受试者的血管生成的进展的量。

如本文中所使用的，“分离的”意指通过人干预从天然状态改变的或取出的。例如，天然存在于活动物中的siRNA不是“分离的”，但合成的siRNA或与其天然状态的共存材料部分或完全分离的siRNA是“分离的”。分离的siRNA可以以大体上纯的形式存在，或可存在于非天然环境(例如已将所述siRNA递送入其中的细胞)中。

如本文中所使用的，“靶mRNA”意指包含与siRNA反义链互补的有义序列的mRNA。这样的靶mRNA不必与siRNA反义链具有100%同源性，只要siRNA能够沉默靶mRNA或另外地与靶mRNA形成RISC复合物。特别用于本公开内容的方法的靶mRNA包括例如，促血管生成VEGFmRNA同种型例如VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅和VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₃、VEGF₁₄₈和VEGF₁₄₅及其组合。在某些其它实施方案中，靶mRNA不包括抗血管生成VEGF₁₆₅bmRNA，但靶向至少一种其它的VEGF同种型。

如本文中所使用的，术语“部分不互补”意欲表示这样的siRNA序列，所述siRNA序列，虽然可能与非靶序列共有一定的序列同源性，但仍然充分不同以致对于非靶序列不发生RNA沉默。部分不互补包括与非靶序列具有90%同源性、85%同源性、80%同源性、75%同源性、70%同源性、65%同源性、60%同源性、55%同源性、50%同源性、45%同源性、40%同源性、35%同源性、30%同源性、25%同源性、20%同源性、15%同源性、10%同源性、5%同源性、2%同源性和1%同源性的序列。与非靶序列完全不同源的序列被认为是与序列不互补的。

如本文中所使用的，基因或mRNA与人VEGF或来自另一个哺乳动物物种的与人VEGF具有同源性的mRNA“同源(cognate)”。例如，来自小鼠的同源VEGF mRNA示于SEQ ID NO:1中。

除非另外指出，否则本文中的所有核酸序列以5'至3'方向给出。同样地，核酸序列中的所有脱氧核糖核苷酸由大写字母显示(例如，脱氧胸苷为“T”)，并且核酸序列中的核糖核苷酸由小写字母显示(例如，尿苷为“u”)。

包含靶向VEGF及其各种同种型的siRNA的组合物和方法可用于抑制血管生成，特别地用于治疗血管生成疾病。siRNA据认为引起此类mRNA的RNAi介导的降解，以致不产生或以减少的量产生VEGF和及其同种型的蛋白质产物。因为VEGF对Flt-1或Flk-1/KDR受体的结合是起始和维持血管生成所需的，VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDRmRNA的siRNA介导的降解还可用于抑制血管生成过程。

因此，本公开内容的一个方面提供了靶向靶mRNA的分离的siRNA，其包含长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸，以及在某些实施方案中长度为约19至约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基-配对相互作用退火在一起的(在下文中称为“碱基-配对的”)有义RNA链和互补反义RNA链。如在下文中更详细地描述的，有义链包含与靶mRNA内包含的靶序列同一或充分同源的核酸序列。

siRNA的有义和反义链可包含两个互补的单链RNA分子，或可包含其中两个互补部分是碱基配对的并且通过单链“发夹”区域共价连接的单个分子。不希望受任何理论束缚，据认为，后一种类型的siRNA分子的发夹区域被“Dicer”蛋白(或其等同物)细胞内切割，形成包含两个单独的、碱基配对的RNA分子的siRNA。

人VEGF的剪接变体是已知的，包括促血管生成VEGF mRNA同种型例如VEGF₁₂₁(SEQ ID NO:2)、VEGF₁₆₅(SEQ ID NO:3)和VEGF₁₈₉(SEQ IDNO:4)、VEGF₂₀₆(SEQ ID NO:5；GenBank登录号CS245579)、VEGF₁₈₃(GenBank登录号AJ010438)、VEGF₁₄₈(GenBank登录号AF 091352)和VEGF₁₄₅(GenBank登录号CS245578)，以及抗血管生成VEGF_165bmRNA(GenBank登录号AF430806)。可使用本领域公知的技术分析从人VEGF及其同种型以及Flt-1(SEQ ID NO:6)或Flk-1/KDR(SEQ ID NO:7)基因转录的mRNA的其它选择性剪接形式。此类技术包括逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、northern印迹法和原位杂交。用于分析mRNA序列的技术描述于例如，Busting SA(2000),J.Mol.Endocrinol.25:169-193中，其完整公开内容通过引用并入本文。用于鉴定选择性剪接的mRNA的代表性技术也描述于下文中。

例如，包含与给定的疾病基因相关的核苷酸序列的数据库可用于鉴定选择性剪接的mRNA。此类数据库包括GenBank、Embase和CancerGenome Anatomy Project(CGAP)数据库。CGAP数据库例如包含来自各种类型的人癌症的表达序列标签(EST)。来自VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR基因的mRNA或基因序列可用于查询这样的数据库，以确定是否已发现这些基因的代表选择性剪接的mRNA的EST。

称为“RNA酶保护”的技术也可用于鉴定选择性剪接的VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR mRNA。RNA酶保护包括，基因序列至合成的RNA的翻译，所述合成的RNA与来源于其它细胞(例如来自新血管形成的位置上或其附近的组织的细胞)的RNA杂交。随后将杂交的RNA与识别RNA:RNA杂交体错配的酶一起温育。小于预期的片段表示存在选择性剪接的mRNA。可利用本领域技术人员公知的方法克隆假定的选择性剪接的mRNA并且对其进行测序。

RT-PCR也可用于鉴定选择性剪接的VEGF及其同种型以及Flt-1或F l k-1/KDR mRNA。在RT-PCR中，使用本领域技术人员公知的方法，利用逆转录酶将来自组织或细胞的mRNA转化成cDNA。随后使用位于5'翻译区的正向引物和位于3'翻译区的反向引物通过PCR扩增cDNA的编码序列。在一些实施方案中，扩增编码cDNA的所有碱基。可以例如通过将扩增产物的大小与来自正常剪接的mRNA的预期产物的大小相比较(例如，通过琼脂糖凝胶电泳)，分析扩增产物的选择性剪接形式。扩增产物的大小的任何改变可表示选择性剪接。

从突变的VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR基因产生的mRNA也可通过上述用于鉴定选择性剪接形式的技术来容易地鉴定。如本文中所使用的，“突变的”VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR基因或mRNA包括在序列上与本文中所示的VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR序列不同的人VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR基因或mRNA。因此，为了本发明的目的，这些基因的等位基因形式以及从其产生的mRNA被认为是“突变体”。

应理解，人VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR mRNA可包含与它们各自的选择性剪接形式、同源物或突变体共有的靶序列。因此，包含这样的共有靶向序列的单个siRNA可诱导包含共有靶向序列的不同RNA类型的RNAi介导的降解。例如，如图10中所显示的，所有VEGF同种型共有外显子1-5。然而，在VEGF₁₂₁(SEQ ID NO:2)中，外显子6和7(7a和7b)缺失。在VEGF₁₆₅(SEQ ID NO:3)，外显子6(6a和6b)缺失。在VEGF₁₈₉(SEQ ID NO:4)中，外显子6b缺失。在VEGF₁₈₃中，外显子6a的一部分以及完整的外显子6b序列缺失。VEGF₁₄₈具有外显子6(6a和6b)以及外显子7b和部分外显子8的缺失。在VEGF₁₄₅中，外显子6b和外显子7(7a和7b)缺失。VEGF的唯一已知的抗血管生成同种型，VEGF_165b缺乏外显子6(6a和6b)，但额外地包含假外显子(pseudo-exon)9。假外显子9是由缺失终止密码子(从而允许一部分3'UTR被翻译成蛋白质)产生的读框移位的结果。参见例如，Bates等人，Can.Res.62:4123(2002)，通过引用整体并入本文。VEGF₂₀₆(SEQID NO:5)是不具有缺失的全长序列VEGF。因此，在某些实施方案中，siRNA靶向一个或多个同种型，例如VEGF₁₂₁(SEQ ID NO:2)、VEGF₁₆₅(SEQID NO:3)和VEGF₁₈₉(SEQ ID NO:4)、VEGF₂₀₆(SEQ ID NO:5；GenBank登录号CS245579)、VEGF₁₈₃(GenBank登录号AJ010438)、VEGF₁₄₈(GenBank登录号AF091352)和/或VEGF₁₄₅(GenBank登录号CS245578)，但不靶向其它同种型，例如VEGF_165b，因为siRNA靶向某些同种型(而非其它同种型)之间共有的外显子。

在一个实施方案中，提供了包含第一RNA链和第二RNA链的双链体的分离的siRNA，所述第一RNA链包含与血管内皮生长因子(VEGF)同种型的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，所述同种型选自人VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₃、VEGF₁₄₈、VEGF₁₄₅及组合；此外其中所述siRNA至少部分不互补于VEGF_165b，前提是人VEGF mRNA不是SEQ ID NO.42。其它实施方案包括，使用此类siRNA抑制血管生成的方法和包含治疗有效量的抑制血管生成的此类siRNA的药物组合物。

s iRNA可包含部分纯化的RNA、大体上纯的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA以及与天然存在的RNA相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的改变的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加，包括使siRNA抗核酸酶降解的修饰。

siRNA的一条或两条链还可包含3'悬突。如本文中所使用的，“3'悬突”是指从双链化RNA链的3'末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方案中，siRNA不包含悬突并且具有平端。在一些实施方案中，siRNA的两个末端都包含平端。在一些实施方案中，siRNA包含与靶mRNA邻接的17聚体和dTdT悬突。在一些实施方案中，siRNA为可抑制VEGF从来自不同物种的细胞分泌或产生的siRNA。例如，在一些实施方案中，siRNA可抑制从人细胞、大鼠细胞和/或小鼠细胞分泌或产生VEGF。在一些实施方案中，siRNA可抑制从小鼠细胞和人细胞分泌或产生VEGF，但不抑制从大鼠细胞分泌或产生VEGF。在一些实施方案中，siRNA可抑制VEGF从大鼠细胞和人细胞的分泌或产生，但不抑制VEGF从小鼠细胞的分泌或产生。在一些实施方案中，siRNA可抑制VEGF从人细胞、小鼠细胞和大鼠细胞的分泌或产生。siRNA的选择性可基于不同序列之间的同源性。例如，图33显示编码人、小鼠和大鼠VEGF的末端密码子之间的同源性。这些差异可用于产生可选择性抑制从一个或多个物种产生VEGF的siRNA。

在一些实施方案中，包含少于21个核苷酸，例如17、18、19或20个核苷酸的siRNA可用于避免任何潜在的非特异性体内应答。(参见，Ambati,Nature,452,591-597(2008年4月3日))。例如，包含少于21个核苷酸的siRNA可用于避免激活体内TLR3应答。

因此，在一个实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至约6个核苷酸(其包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选长度为1至约4个核苷酸和特别优选长度为约2至约4个核苷酸的3'悬突。

在其中siRNA分子的两条链都包含3'悬突的实施方案中，对于每一条链，悬突的长度可以是相同的或不同的。在最优选的实施方案中，3'悬突存在于siRNA的两条链上，并且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的每一条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3'悬突。

为了增强本发明的siRNA的稳定性，还可稳定3'悬突以抗降解。在一个实施方案中，通过包含嘌呤核苷酸例如腺苷或鸟苷核苷酸来稳定悬突。或者，利用修饰的类似物置换嘧啶核苷酸，例如用2'-脱氧胸苷置换3'悬突中的尿苷核苷酸是耐受的并且不影响RNAi降解的效率。特别地，2'-脱氧胸苷中2'羟基的不存在显著增强了3'悬突在组织培养基中的核酸酶抗性。

在某些实施方案中，siRNA包含序列AA(N19)TT或NA(N21)，其中N为任意核苷酸。此类siRNA包含约30-70%的GC，优选包含约50%的G/C。有义siRNA链的序列分别相应于(N19)TT或N21(即，位置3至23)。在后一种情况下，有义siRNA的3'末端被转化成TT。该序列转化的原理是，在有义和反义链3'悬突的序列组成方面产生对称双链体。随后将反义RNA链合成为有义链的位置1至21的互补序列。

因为这些实施方案中的23-nt有义链的位置1不被反义链以序列特异性的方式识别，因此，可有意地选择反义链的最3'核苷酸残基。然而，反义链的倒数第二个核苷酸(在任一实施方案中与23-nt有义链的位置2互补)通常与靶向的序列互补。

在另一个实施方案中，siRNA包含序列NAR(N17)YNN，其中R为嘌呤(例如，A或G)并且Y为嘧啶(例如，C或U/T)。因此，该实施方案的各自21-nt的有义和反义RNA链通常始于嘌呤核苷酸。这样的siRNA可从pol III表达载体表达而无靶向位点的改变，因为仅当第一个转录的核苷酸为嘌呤时，RNA从pol III启动子的表达被认为是有效的。

在其它实施方案中，siRNA包含具有不超过五(5)个的连续嘌呤或嘧啶的序列。在其它实施方案中，siRNA包含具有不超过五个(5)的具有相同核碱基(即，A、C、G或U/T)的连续核苷酸的序列。

siRNA可靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中的约19-25个连续核苷酸的任何区段。例如，在Tuschl T等人，“The siRNA User Guide”(于2002年10月11日修订，将其完整公开内容通过引用并入本文)中给出了用于选择siRNA的靶序列的技术。“The siRNA User Guide”可在由Dr.Thomas Tuschl,Department of Cellular Biochemistry,AG 105,Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry,37077Germany维持的网站上在万维网上获得，并且可通过访问Max Planck Institute的网站并且用关键词“siRNA”搜索而寻找到。因此，本发明的siRNA的有义链包含与靶mRNA中的约19至约25个核苷酸的任何连续区段同一的核苷酸序列。

在一些实施方案中，siRNA为19个核苷酸并且包含与靶mRNA同一的17个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA长度为19个核苷酸，包含至少一个平端。在一些实施方案中，19聚体的每一个末端具有平端。在一些实施方案中，19聚体包含至少一个dT悬突。在一些实施方案中，19聚体包含两个dT悬突。

通常，靶mRNA上的靶序列可选自相应于靶mRNA的给定的cDNA序列，优选始于起始密码子下游(即，在3'方向)的50至100nt。然而，靶序列可位于5'或3'非翻译区域中，或位于起始密码子附近的区域中(参见，例如，下文表1中的SEQ ID NOS:73和74的靶序列，其在VEGF121cDNA的5'末端的100nt内)。

在本发明的其它实施方案中，靶mRNA序列包含不超过五(5)个的连续嘌呤或嘧啶。例如，VEGF121cDNA序列中的合适的靶序列为:

TCATCACGAAGTGGTGAAG(SEQ ID NO：8)

因此，靶向该序列并且在每一条链上具有3'uu悬突(悬突以粗体显示)的siRNA为:

5’-ucaucacgaaguggugaag

-3’(SEQ ID NO：9)

3’-

aguagugcuucaccacuuc-5’(SEQ ID NO：10)

靶向该相同序列但在每一条链上具有3'TT悬突(悬突以粗体显示)的siRNA为:

5’-ucaucacgaaguggugaag

-3’(SEQ ID NO：11)

3’-

aguagugcuucaccacuuc-5’(SEQ ID NO：12)

表1中给出了siRNA可源自于其的其它VEGF₁₂₁靶序列。应理解，表1中所列的所有VEGF₁₂₁靶序列在VEGF₁₂₁选择性剪接形式的与所有人VEGF选择性剪接形式共同的部分内。因此，表1中的VEGF₁₂₁靶序列还可靶向VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆mRNA。还可容易地鉴定靶向特定VEGF同种型的靶序列。例如，靶向VEGF₁₆₅mRNA但非VEGF₁₂₁mRNA的靶序列为AACGTACTTGCAGATGTGACA(SEQ ID NO:13)。相反地，靶向促血管生成VEGF mRNA同种型例如VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅和VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF₁₈₃、VEGF₁₄₈和VEGF₁₄₅及其组合但不靶向抗血管生成VEGF_165bmRNA的靶序列包括表2中发现的序列，前提是VEGF mRNA不为SEQ ID No.42。在某些实施方案中，所述人VEGF mRNA选自SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98。在某些实施方案中，所述人VEGF mRNA选自SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.94。

通过选择性靶向VEGF的血管生成同种型，而不靶向抗-血管生成同种型，可以增强siRNA处理的抗血管生成作用。如图11中显示的，外显子7与9之间的区域在血管生成与抗血管生成序列之间不同。根据不同的实施方案，可以选择性靶向该区域，其中siRNA与血管生成同种型至少部分互补，但与抗血管生成同种型至少部分或完全不互补。因此，在某些实施方案中，siRNA不抑制抗血管生成同种型VEGF_165b的表达，前提是VEGF mRNA不是SEQ ID No.42。在某些实施方案中，所述人VEGF mRNA选自SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89；SEQ ID NO:90；SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:92；SEQ ID NO:93；SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:97；SEQ ID NO:98,SEQ ID NO 99,SEQ ID NO 100,SEQID NO 101,SEQ ID NO:102,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:104,SEQID NO:105,SEQ ID NO:106,SEQ ID NO:107,SEQ ID NO:108,SEQID NO:109,SEQ ID NO:110,SEQ ID NO:111,SEQ ID NO:112,SEQID NO:113,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:115,SEQ ID NO:116,SEQID NO:117和SEQ ID NO:118。在某些实施方案中，所述人VEGF mRNA选自SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.94。

人Flk-1/KDR的人Flt-1的示例性靶序列示于2003年7月18日提交的PCT/US2003/0022444(通过引用整体并入本文)中。

表1-VEGF靶序列

表2-选择性排除VEGF_165b的VEGF靶序列

siRNA名称	靶序列(5′-3′)
		OPK-HVB-001	AACGTACTTGCAGATGTGA(SEQ ID NO：86)
OPK-HVB-002	ACGTACTTGCAGATGTGAC(SEQ ID NO：87)
		OPK-HVB-003	CGTACTTGCAGATGTGACA(SEQ ID NO：42)
OPK-HVB-004	GTACTTGCAGATGTGACAA(SEQ ID NO：88)
		OPK-HVB-005	TACTTGCAGATGTGACAAG(SEQ ID NO：89)
OPK-HVB-006	ACTTGCAGATGTGACAAGC(SEQ ID NO：90)
		OPK-HVB-007	CTTGCAGATGTGACAAGCC(SEQ ID NO：91)
OPK-HVB-008	TTGCAGATGTGACAAGCCG(SEQ ID NO：92)
		OPK-HVB-009	TGCAGATGTGACAAGCCGA(SEQ ID NO：93)
OPK-HVB-010	GCAGATGTGACAAGCCGAG(SEQ ID NO：94)
		OPK-HVB-011	CAGATGTGACAAGCCGAGG(SEQ ID NO：95)
OPK-HVB-012	AGATGTGACAAGCCGAGGC(SEQ ID NO：96)
		OPK-HVB-013	GATGTGACAAGCCGAGGCG(SEQ ID NO：97)
OPK-HVB-014	ATGTGACAAGCCGAGGCGG(SEQ ID NO：98)
		OPK-HVB-004be	GTACTTGCAGATGTGACAA(SEQ ID NO：99)
OPK-HVB-009be	TGCAGATGTGACAAGCCGA(SEQ ID NO：100)

OPK-HVB-010be	GCAGATGTGACAAGCCGAG(SEQ ID NO：101)
		OPK-HVB-012be	AGATGTGACAAGCCGAGGC(SEQ ID NO：102)
OPK-HVB-001a	AACGTACTTGCAGATGT(SEQ ID NO：103)
		OPK-HVB-002a	ACGTACTTGCAGATGTG(SEQ ID NO：104)
OPK-HVB-003a	CGTACTTGCAGATGTGA(SEQ ID NO：105)
		OPK-HVB-004a	GTACTTGCAGATGTGAC(SEQ ID NO：106)
OPK-HVB-005a	TACTTGCAGATGTGACA(SEQ ID NO：107)
		OPK-HVB-006a	ACTTGCAGATGTGACAA(SEQ ID NO：108)
OPK-HVB-007a	CTTGCAGATGTGACAAG(SEQ ID NO：109)
		OPK-HVB-008a	TTGCAGATGTGACAAGC(SEQ ID NO：110)
OPK-HVB-009a	TGCAGATGTGACAAGCC(SEQ ID NO：111)
		OPK-HVB-010a	GCAGATGTGACAAGCCG(SEQ ID NO：112)
OPK-HVB-011a	CAGATGTGACAAGCCGA(SEQ ID NO：113)
		OPK-HVB-012a	AGATGTGACAAGCCGAG(SEQ ID NO：114)
OPK-HVB-013a	GATGTGACAAGCCGAGG(SEQ ID NO：115)
		OPK-HVB-014a	ATGTGACAAGCCGAGGC(SEQ ID NO：116)
OPK-HVB-015a	TGTGACAAGCCGAGGCG(SEQ ID NO：117)
		OPK-HVB-016a	GTGACAAGCCGAGGCGG(SEQ ID NO：118)

具有名称“OPK-HVB-XXXbe”的序列是指这样的序列，其为相似21聚体的19聚体平端对应物。具有名称“OPVHVB-XXXa”的序列是指其中存在17bp核苷酸序列与dTdT悬突的19聚体。也可制备具有相似性质的本文中未明确例举的、靶向VEGF而不靶向VEGF165b的其它序列。

还可使用其它平端核酸分子，但这不必一定不靶向VEGF165b。例如，可使用包含有义链SEQ ID NO:119和含有SEQ ID NO:120的反义链的siRNA。包含SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120的siRNA(其中每一个siRNA包含平端)还可被称为bevasiranib-be。例如，在一些实施方案中，siRNA是包含SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120的具有平端的19聚体(参见图36)。

siRNA可使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，siRNA可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生，例如使用Tuschl等人的美国公布的申请2002/0086356(将其全部公开内容通过引用并入本文)中描述的果蝇体外系统。

在某些实施方案中，siRNA可使用适当地保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪来化学合成。可将siRNA合成为两个独立的互补的RNA分子，或合成为具有两个互补区域的单个RNA分子。合成RNA分子或合成试剂的商业提供者包括Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(partof Perbio Science,Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。

或者，还可使用任何适当的启动子从重组环状或线性DNA质粒表达siRNA。用于从质粒表达siRNA的适当启动子包括例如，U6或H1RNApol III启动子序列以及巨细胞病毒启动子。其它适当的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包含用于在特定组织中或在特定细胞内环境中表达siRNA的诱导型或可调控的启动子。

可利用标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的siRNA，或可在体内在新血管形成的区域或附近细胞内表达siRNA。在下文中更详细地描述了重组质粒将siRNA递送至体内细胞的用途。

可将siRNA从重组质粒表达为两个分开的、互补的RNA分子，或表达为具有两个互补区域的单个RNA分子。

适用于表达siRNA的质粒的选择、用于将表达siRNA的核酸序列插入质粒的方法以及将重组质粒递送至目标细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Tuschl,T.(2002),Nat.Biotechnol，20:446-448；Brummelkamp TR等人(2002),Science 296:550-553；Miyagishi M等人(2002),Nat.Biotechnol.20:497-500；PaddisonPJ等人(2002),Genes Dev.16:948-958；Lee NS等人(2002),Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul CP等人(2002),Nat.Biotechnol.20:505-508，将所述文献的完整公开内容通过引用并入本文。

包含用于表达s iRNA的核酸序列的质粒描述于下文的实施例7中。称为pAAVsiRNA的该质粒包含处于人U6RNA启动子的控制之下的与polyT终止序列有效连接的有义RNA链编码序列和处于人U6RNA启动子的控制之下的与polyT终止序列有效连接的反义RNA链编码序列。质粒pAAVsiRNA最终意欲用于产生包含用于表达siRNA的相同核酸序列的重组腺伴随病毒载体。

如本文中所使用的，“与polyT终止序列有效连接”意指，编码有义或反义链的核酸序列与polyT终止信号(在5'方向上)直接邻接。在从质粒转录有义或反义序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。

如本文中所使用的，“处于启动子的控制之下”意指，编码有义或反义链的核酸序列位于启动子的3'，以便启动子可起始有义或反义编码序列的转录。

还可在体内在新血管形成的区域或附近细胞内从重组病毒载体表达siRNA。本发明的重组病毒载体包含编码siRNA的序列和用于表达siRNA序列的任何适当的启动子。适当的启动子包括例如U6或H1RNApol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。其它适当的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在特定组织或在特定细胞内环境中表达siRNA的诱导型或可调控的启动子。重组病毒载体将siRNA递送至体内细胞的用途在下文中进行了更详细地描述。

可从重组病毒载体将siRNA表达为两个分开的互补的RNA分子，或表达为具有两个互补区域的单个RNA分子。

可使用能够接受用于表达siRNA分子的编码序列的任何病毒载体，例如来源于腺病毒(AV)；腺伴随病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等的载体。还可通过用来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原假型化载体来改变病毒载体的向性。例如，可利用来自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病、Ebola、Mokola等的表面蛋白假型化本发明的AAV载体。

适用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将表达siRNA的核酸序列插入载体的方法和将病毒载体递送至目标细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301-310；Eglitis MA(1988),Biotechniques 6:608-614；MillerAD(1990),Hum Gene Therap.1:5-14；和Ander son WF(1998),Nature392:25-30，将所述文献的完整公开内容通过引用并入本文。

优选的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。在特别优选的实施方案中，siRNA从包含例如U6或H1RNA启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子的重组AAV载体表达为两个分开的互补的单链RNA分子。

用于表达siRNA的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于将载体递送至靶细胞内的方法描述于Xia H等人(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010中。

用于表达s i RNA的适当的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送入靶细胞的方法描述于Samulski R等人(1987),J.Virol.61:3096-3101；Fisher KJ等人(1996),J.Virol.,70:520-532；Samulski R等人(1989),J.Virol.63:3822-3826；美国专利No.5,252,479；美国专利No.5,139,941；国际专利申请No.WO94/13788；和国际专利申请No.WO 93/24641(将所述文献的完整公开内容通过引用并入本文)中。用于产生本发明的重组AAV载体的示例性方法描述于下文的实施例7中。

可使用用于测量细胞的RNA或蛋白质水平的标准技术评估包含给定的靶序列的siRNA引起靶mRNA的RNAi介导的降解的能力。例如，可将siRNA递送至培养的细胞，可利用Northern印迹或斑点印迹技术，或通过定量RT-PCR测量靶mRNA的水平。或者，可利用ELISA或Western印迹法测量培养细胞中VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR受体蛋白的水平。用于测量本发明的siRNA对靶mRNA或蛋白质水平的影响的适当的细胞培养系统描述于下文的实施例1中。

还可利用新血管形成的动物模型例如ROP或CNV小鼠模型评估用包含给定的靶序列的siRNA对靶mRNA进行的RNAi介导的降解。例如，可在施用siRNA之前和之后测量ROP或CNV小鼠的新血管形成的面积，并且在一些实施方案中，将其与未处理的动物相比较。在施用siRNA后，这些模型的新血管形成的面积的减小表明，在一些实施方案中，靶mRNA的下调(参见下文中的实施例6)。

如上文中所论述的，siRNA能够靶向VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR mRNA或其选择性剪接形式、突变体或同源物，优选VEGF和更优选人VEGF并且引起其的RNA i介导的降解。本发明的siRNA对靶mRNA的降解减少了功能基因产物从VEGF及其同种型以及Flt-1或Flk-1/KDR基因的产生。因此，本发明的另一个实施方案提供了抑制受试者的VEGF及其同种型(例如VEGF₁₂₁(SEQ ID NO:2)、VEGF₁₆₅(SEQID NO:3)和VEGF₁₈₉(SEQ ID NO:4)、VEGF₂₀₆(SEQ ID NO:5；GenBank登录号CS245579)、VEGF₁₈₃(GenBank登录号AJ010438)、VEGF₁₄₈(GenBank登录号AF091352)和/或VEGF₁₄₅(GenBank登录号CS245578))以及Flt-1或Flk-1/KDR的表达的方法，包括给受试者施用有效量的siRNA，以便靶mRNA被降解。由于VEGF及其同种型以及Flt-1和Flk-1/KDR基因的产物是起始和维持血管生成所需的，因此本发明的另一个实施方案提供了通过利用本发明的siRNA对靶mRNA进行RNAi介导的降解来抑制受试者的血管生成的方法。

如上所述的，可使用用于分离和定量mRNA或蛋白质的标准技术，通过测量受试者的细胞中靶mRNA或蛋白质的水平来检测靶mRNA的RNAi介导的降解。

可通过直接测量受试者的病理或非病理性血管生成的进展来评估血管生成的抑制；例如，通过在用siRNA进行治疗之前和之后观察新血管形成面积的大小。如果新血管形成面积的大小保持相同或减小，则表明血管生成被抑制。用于观察和测量受试者的新血管形成面积的大小的技术在本领域技术人员的能力范围之内；例如，可以例如通过荧光素血管造影术(fluorescein angiography)观察脉络膜新生血管化的面积。

血管生成的抑制还可通过观察与血管生成相关的病理病况的改变或逆转来进行推断。例如，在ARMD中，视觉丧失的减缓、停止或逆转表示脉络膜中血管生成的抑制。对于肿瘤，肿瘤生长的减缓、停止或逆转或肿瘤转移的减缓或停止表示在肿瘤位置上或附近的血管生成的抑制。还可从例如在施用siRNA后脂肪丧失或胆固醇水平的下降来推断非病理性血管生成的抑制。

应理解，siRNA可以以亚化学计量的量降解靶mRNA(从而抑制血管生成)。不希望受任何理论束缚，据认为siRNA以催化方式引起靶mRNA的降解。因此，与标准抗血管生成治疗相比较，只需在新血管形成的位置上或其附近递送显著更少的siRNA就可具有治疗作用。

通过考虑因素例如受试者的大小和体重、新血管形成或疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康状况和性别、施用途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定待施用至给定的受试者的siRNA的有效量。通常，有效量的siRNA在新血管形成位置或其附近包含约1纳摩尔(nM)至约100nM，优选约2nM至约50nM，更优选约2.5nM至约10nM的细胞内浓度。预期可施用更大或更少量的siRNA。

本发明的方法可用于抑制非病理性血管生成，即，因受试者的正常过程而引起的血管生成。非病理性血管生成的实例包括子宫内膜的新血管形成，以及参与脂肪组织或胆固醇的产生的过程。因此，本发明提供了用于抑制非病理性血管生成，例如用于控制体重或促进脂肪丧失，用于降低胆固醇水平或用作堕胎药的方法。

本发明的方法还可抑制与血管生成疾病(即其中病因与不适当或不受控制的血管生成相关的疾病)相关的血管生成。例如，大多数癌性实体瘤通过在肿瘤位置及其周围诱导血管生成来为它们自已提供充足的血液供给。该肿瘤诱导的血管生成通常是肿瘤生长所必需的，并且还允许转移细胞进入血流。

其它血管生成疾病包括糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性(ARMD)、银屑病、类风湿性关节炎和其它炎性疾病。此类疾病的特征在于，正常组织被新血管形成区域中的新形成的血管破坏。例如，在ARMD中，毛细血管侵入并且破坏脉络膜。ARMD中脉络膜的血管生成驱动的破坏最终导致部分或完全失明。

优选地，siRNA用于抑制与癌症相关的实体瘤的生长或转移；例如乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、腹部癌(abdominal cancer)、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胃肠癌、神经胶质瘤、肝癌、舌癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、Wilm's肿瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌(例如，黑素瘤)、淋巴瘤和血癌。

更优选，siRNA用于抑制老年性黄斑变性中的脉络膜新血管形成。

为了治疗血管生成疾病，可将siRNA与不同于本发明的siRNA的药物试剂组合施用给受试者。或者，可将siRNA与另一种经设计用以治疗血管生成疾病的治疗方法组合施用给受试者。例如，可将siRNA与目前用于治疗癌症或防止肿瘤转移的治疗方法(例如，放射疗法、化学疗法和手术)组合施用。为了治疗肿瘤，优选将siRNA与放射疗法组合，或与化学治疗剂例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素或他莫昔芬组合施用给受试者。

在本发明的方法中，可将本发明的siRNA作为裸露的siRNA、与递送试剂结合或作为表达所述siRNA的重组质粒或病毒载体来给受试者施用。

用于与本发明的s i RNA结合施用的适当的递送试剂包括但不限于Mirus Transit TKO亲脂试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin或聚阳离子(例如，聚赖氨酸)或脂质体。在一些实施方案中，递送试剂为RiboJuice^TM(Novagen)(siRNA转染试剂)，其包含基于胺和脂质的试剂。优选的递送试剂为脂质体。在一些实施方案中，在无脂质体递送剂的情况下递送siRNA。

脂质体可帮助将siRNA递送至特定组织，例如视网膜或肿瘤组织，并且还可增加siRNA的血液半衰期。从标准囊泡形成脂质(vesicle-forminglipid)形成适用于本发明的脂质体，所述脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。一般通过考虑因素例如期望的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期来指导脂质的选择。用于制备脂质体的多种方法是已知的，如例如Szoka等人(1980),Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利No s.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(将所述文献的完整公开内容通过引用并入本文)中描述的。

优选，封装本发明的siRNA的脂质体包含配体分子，其可将脂质体靶向在血管生成的位置或其附近的特定细胞或组织。结合肿瘤或血管内细胞中普遍存在的受体的配体，例如结合肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原的单克隆抗体，是优选的。

特别优选地，修饰封装本发明的siRNA的脂质体(例如通过使调理素作用-抑制部分(opsonization-inhibition moiety)结合至结构的表面)以避免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除。在一个实施方案中，本发明的脂质体可包含调理素作用-抑制部分和配体。

用于制备本发明的脂质体的调理素作用-抑制部分通常是结合至脂质体膜的大的亲水性聚合物。如本文中所使用的，当调理素作用-抑制部分被化学地或物理地连接至膜(例如通过脂溶性锚嵌入膜本身或通过直接结合膜脂质的活性基团)时，其“结合”至脂质体膜。此类抑制调理素作用的亲水性聚合物形成显著减少脂质体被巨噬细胞-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)吸收的保护性表面层；例如，如美国专利No.4,920,016(将其完整公开内容通过引用并入本文)中描述的。用调理素作用-抑制部分修饰的脂质体从而比未修饰的脂质体在循环中保留长得多的时间。为此原因，此类脂质体有时被称为“隐形”脂质体。

已知隐形脂质体(Stealth liposome)在由多孔或“渗漏”微脉管系统(microvasculature)供养的组织中积累。因此，特征在于此类微脉管系统缺陷的靶组织，例如实体瘤，将有效地积累此类脂质体；参见Gabizon,等人(1988),P.N.A.S.,USA，18:6949-53。此外，RES的减小的吸收通过防止在肝和脾中大量积累而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理素作用-抑制部分修饰的本发明的脂质体可将本发明的siRNA递送至肿瘤细胞。

适用于修饰脂质体的抑制调理素作用的部分优选为具有约500至约40,000道尔顿，更优选约2,000至约20,000道尔顿的数均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性、分枝或树枝状聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇例如，聚乙烯醇和聚木糖醇，其与羧基或氨基化学连接，以及神经节苷脂例如神经节苷脂GM₁。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理素作用的聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理素作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶；胺化多糖或寡糖(线性的或分枝的)；或羧化多糖或寡糖(例如，与碳酸的衍生物反应，结果产生羧基的连接)。

优选地，调理素作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化的脂质体”。

可通过任何公知的技术将调理素作用抑制部分结合至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯结合至磷脂酰-乙醇胺脂溶性锚，随后将其结合至膜。类似地，可在60℃下使用Na(CN)BH₃和溶剂混合物(例如30:12的四氢呋喃与水)通过还原胺化作用，用硬脂胺脂溶性锚衍生葡聚糖聚合物。

表达s iRNA的重组质粒在上文中进行了论述。还可将此类重组质粒直接施用或与适当的递送试剂包括Mirus Transit LT1亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)或脂质体结合施用。还在上文中论述了表达siRNA的重组病毒载体，用于将此类载体递送至患者的新血管形成区域的方法也在本领域技术人员的能力之内。

可通过适用于将siRNA递送至新血管形成区域或其附近的组织的细胞的任何方法将siRNA施用给受试者。例如，可通过基因枪、电穿孔或通过其它适当的胃肠外或经肠施用途径施用siRNA。

适当的经肠施用途径包括口服、经直肠或鼻内递送。

适当的胃肠外施用途径包括血管内施用(例如，静脉内快速浓注(bolus injection)、静脉内输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织旁和组织内施用(例如，肿瘤旁和瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；至新血管形成的位置或其附近的区域的直接(例如，局部)施用，例如通过导管或其它放置装置(例如，角膜丸剂(corneal pellet)或栓剂、滴眼管或包含多孔、非多孔或凝胶状材料的植入物)；和吸入。适当的放置装置包括美国专利No.5,902,598和6,375,972(将其完整公开内容通过引用并入本文)中描述的眼植入物和美国专利No 6,331,313(将其完整公开内容通过引用并入本文)中描述的生物可降解的眼植入物。此类眼植入物可从ControlDelivery Systems,Inc.(Watertown,MA)和Oculex Pharmaceuticals,Inc.(Sunnyvale,CA)获得。

在优选的实施方案中，在新血管形成的位置上或其附近进行siRNA的注射或输注。更优选，将siRNA局部施用至眼，例如以液体或凝胶形式施用至下眼睑或结膜穹窿，这在本领域技术人员的能力之内(参见，例如，Acheampong AA等人,2002,Drug Metabol.andDisposition 30:421-429，其完整公开内容通过引用并入本文)。

通常，以约5微升至约75微升，例如约7微升至约50微升，优选约10微升至约30微升的量给眼局部施用siRNA。应理解，以大于75微升的体积在眼中局部滴注s i RNA可导致s i RNA通过溢出和排水从眼丧失。因此，优选以尽可能小的体积施用高浓度的s iRNA(例如，100-1000nM)。

特别优选的胃肠外施用途径是眼内施用。应理解，本发明的s i RNA的眼内施用可通过对眼的注射或直接(例如，局部)施用来实现，只要施用途径允许s iRNA进入眼即可。除了上述至眼的局部施用途径外，适当的眼内施用途径还包括玻璃体内、视网膜内、视网膜下、球筋膜下(subtenon)、眼眶旁和眼眶后(peri-and retro-orbital)、经角膜(trans-corneal)和经巩膜(trans-scleral)施用。此类眼内施用途径在本领域技术人员的能力之内；参见例如，Acheampong AA等人，2002,同上；和Bennett等人(1996),Hum.Gene Ther.7:1763-1769以及Ambati J等人，2002,Progress in Retinal and Eye Res.21:145-151(所述文献的完整公开内容通过引用并入本文)。在另一个优选实施方案中，通过玻璃体内注射施用siRNA。

可以以单一剂量或以多个剂量施用siRNA。在通过输注施用siRNA的情况下，输注可以是单次持续给药或可通过多次输注进行递送。优选在新血管形成的位置上或其附近将试剂直接注射入组织。试剂至新血管形成的位置上或其附近的组织内的多次注射是特别优选的。

本领域技术人员还可容易地确定用于给给定的受试者施用siRNA的适当给药方案。例如，可给受试者施用siRNA一次，例如通过在新血管形成位置上或其附近进行单次注射或沉积。或者，可每天多次或每周多次给受试者施用siRNA。例如，可每周一次地给受试者施用siRNA，进行约3至约28周，或者约7至约10周的时期。在某些给药方案中，每周一次在新血管形成的位置上或其附近注射(例如，玻璃体内)siRNA，进行7周。应理解，定期施用siRNA且进行不确定的时间长度对于患有慢性新血管形成疾病例如湿ARMD或糖尿病视网膜病变的受试者，可能是必需的。

在给药方案包括多次施用的情况下，应理解，给受试者施用的有效量的siRNA可包括在整个给药方案过程中施用的siRNA的总量。

按照本领域已知的技术，在给受试者施用之前，优选将siRNA配制为药物组合物。本发明的药物组合物的特征在于，为至少无菌的并且无热原的。如本文中所使用的，“药物制剂”包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的能力之内，例如如Remington's Pharmaceutical Science，第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1985)(将其完整公开内容通过引用并入本文)中描述的。

在一个实施方案中，药物制剂包含与生理学上可接受的载体介质混合的siRNA(例如，按重量计0.1至90%)或其生理学上可接受的盐。优选的生理学上可接受的载体介质为水、经缓冲的水、盐溶液(例如，生理盐水或平衡盐溶液例如Hank's或Earle's平衡盐溶液)、0.4%的盐水、0.3%的甘氨酸、透明质酸等。

药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。适当的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量摩尔渗透压浓度调节剂(osmolalityadjusting agent)、缓冲剂和pH调节剂。适当的添加剂包括生理学上生物相容的缓冲剂(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合复合物(例如DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的添加或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡糖酸钙或乳酸钙)的添加。可以以液体形式包装本发明的药物组合物以待使用，或可冷冻干燥所述药物组合物。

为了给眼局部施用，可使用常规眼内递送试剂。例如，用于局部眼内递送的本发明的药物组合物可包含上文中描述的盐溶液、角膜穿透促进剂、不溶性颗粒、矿脂(petrolatum)或其它基于凝胶的软膏、在滴入眼后经历粘度增加的聚合物、或粘膜粘着聚合物。优选，眼内递送试剂增加角膜穿透或通过粘度效应或通过建立与覆盖角膜上皮的粘蛋白层的物理化学相互作用而延长siRNA的眼前保留。

用于局部眼内递送的适当的不溶性颗粒包括Bell等人的美国专利No.6,355,271(其完整公开内容通过引用并入本文)中描述的磷酸钙颗粒。在眼内滴注后经历粘度增加的适当的聚合物包括聚乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物例如泊洛沙姆407(例如，以25%的浓度)、醋酸邻苯二甲酸纤维素(例如，以30%的浓度)或低乙酰基胶凝糖胶例如

(可从CP Kelco,Wilmington,DE获得)。适当的粘膜粘着聚合物包括具有多个亲水官能团例如羧基、羟基、酰胺基和/或硫酸基团的水胶体；例如，羟丙基纤维素、聚丙烯酸、高分子量聚乙二醇(例如，大于200,000的数均分子量)、葡聚糖、透明质酸、聚半乳糖醛酸和木聚糖(xylocan)。适当的角膜穿透促进剂包括环糊精、苯扎氯铵、聚氧乙烯二醇月桂醚(polyoxyethylene glycol lauryl ether)(例如，

35)、聚氧乙烯二醇硬脂酸醚(polyoxyethylene glycol stearylether)(例如，

78)、聚氧乙烯二醇油醇醚(polyoxyethyleneglycol oleyl ether)(例如，

98)、乙二胺四乙酸(EDTA)、洋地黄皂苷、牛磺胆酸钠(sodium taurocholate)、皂苷和聚氧乙烯蓖麻油例如Cremaphor EL。

对于固体组合物，可使用常规无毒固体载体；例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文中所列的任何载体和赋形剂以及10-95%，优选25%-75%的一种或多种siRNA。用于气雾剂(吸入的)施用的药物组合物可包含按重量计0.01-20%，优选按重量计1%-10%的一种或多种封装在上述脂质体内的siRNA和喷射剂。需要时还可包含载体；例如用于鼻内递送的卵磷脂。

现通过下列非限定性实施例举例说明本发明。

实施例1-siRNA转染和体外缺氧诱导

siRNA设计-选择位于离人VEGF mRNA的5'末端329nt的19nt序列作为靶序列：AAACCTCACCAAGGCCAGCAC(SEQ ID NO:51)。为了确保其不包含在来自任何其它基因的mRNA中，将该靶序列输入由NCBI提供的BLAST搜索引擎。BLAST算法的使用描述于Altschul等人(1990),J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402(其公开内容通过引用整体并入本文)中。由于未发现包含靶序列的其它mRNA，因此合成siRNA双链体以靶向该序列(Dharmacon Research,Inc.,Lafayette,CO)。

siRNA双链体具有下列有义和反义链。

有义:

5’-accucaccaaggccagcacTT-3’(SEQ ID NO：77).

反义:

5’-gugcuggccuuggugagguTT-3’(SEQ ID NO：78).

siRNA有义和反义链一起形成19nt双链siRNA，且在每一条链上具有TT 3'悬突(以粗体显示)。该siRNA被称为“候选物5”或“Cand5”。如对于Cand5(bevasiranib)所描述的，设计并且测试靶向人VEGFmRNA的其它siRNA。

靶向绿色荧光蛋白(GFP)mRNA中的下列序列的siRNA用作非特异性对照：GGCTACGTCCAGCGCACC(SEQ ID NO:79)。siRNA购自Dharmacon(Lafayette,CO)。

siRNA转染和体外缺氧诱导-在转染前一天将人细胞系(293；Hela和ARPE19)于250微升的完全DMEM培养基中分别接种入24孔板中，以便转染时细胞为约50%的汇合。用2.5nM Cand5 siRNA转染细胞，以无siRNA或以2.5nM非特异性siRNA(靶向GFP)作为对照。如制造商(Mirus)所推荐的，用“Transit TKO Transfection”试剂在所有细胞系中进行转染。

转染后24小时，通过在每一个孔中添加甲磺酸去铁胺至130微摩尔的终浓度来诱导细胞的缺氧。转染后24小时，从所有孔中取出细胞培养基，并如可从制造商获得的Quantikine human VEGF ELISA方案(其完整公开内容通过引用并入本文)中所描述的，对培养基进行人VEGF ELISA(R&D systems,Minneapolis,MN)。

如可在图1中观察到的，由Cand5 siRNA诱导的RNAi降解显著降低由缺氧293和HeLa细胞产生的VEGF的浓度。在由未用siRNA处理的或用非特异性siRNA对照处理的缺氧细胞产生的VEGF的量上基本上不存在差异。对于在相同条件下处理的人ARPE19细胞，也观察到类似的结果。因此，使用靶向VEGF的siRNA的RNA干扰在体外中断人培养细胞中的VEGF的病理性上调。

使用小鼠特异性VEGF siRNA(参见下文的实施例6)对小鼠NIH3T3细胞重复上文概述的实验，并且如可从制造商获得的Quantikinemouse VEGF ELISA方案(其全部公开内容通过引用并入本文)中所述，用小鼠VEGF ELISA(R&D systems,Minneapolis,MN)定量VEGF产量。获得与图1中对于人细胞系所报导的结果相似的结果。

实施例2-递增的siRNA浓度对人培养细胞的VEGF产量的影响使用10nM至50nM的一系列siRNA浓度，利用人293、HeLa和ARPE19细胞重复实施例1中概述的实验。Cand5 siRNA下调VEGF产量的能力适度地增加，直至约13nM siRNA，但高于该浓度观察到平台效应。这些结果突显了mRNA的siRNA-介导的RNAi降解的催化性质，因为平台效应反映了未被siRNA转染的少数细胞的VEGF产生。对于已被siRNA转染的大多数细胞，由缺氧诱导的增加的VEGF mRNA产生在高于约13nM的siRNA浓度上被siRNA诱导的靶mRNA的降解超过。

实施例3-siRNA靶向的特异性

将NIH 3T3小鼠成纤维细胞在标准条件下培养于24孔板中，以便在转染前1天细胞达到约50%的汇合。将人VEGF siRNA Cand5转染入NIH 3T3小鼠成纤维细胞，如实施例1中一样。随后在转染的细胞中诱导缺氧，并利用ELISA测量鼠VEGF的浓度，如实施例1一样。

被人VEGF siRNA Cand5靶向的序列与鼠VEGF mRNA相异在于一个核苷酸。如可在图2中观察到的，人VEGF siRNA对小鼠细胞在缺氧后上调小鼠VEGF的能力没有影响。这些结果显示，siRNA诱导的RNAi降解是序列特异性的，达到1个核苷酸的分辨率。

实施例4-siRNA至鼠视网膜色素上皮细胞的体内递送

VEGF在患有老年性黄斑变性(ARMD)的人患者的视网膜色素上皮(RPE)细胞中被上调。为了显示可将功能性siRNA体内递送至RPE细胞，利用重组腺病毒在小鼠视网膜中表达GFP，并且用siRNA沉默GFP表达。如下进行实验。

如Bennett等人(1996)(同上)中所述，利用包含约1x10⁸个含有由CMV启动子驱动的eGFP的腺病毒颗粒和20皮摩尔的缀合有transitTKO试剂(Mirus)的靶向eGFP的siRNA的混合物视网膜下注射5只成年C57/Black6小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)的每一只的一只眼睛。

作为阳性对照，用包含约1x10⁸个含有由CMV启动子驱动的eGFP的腺病毒颗粒和20皮摩尔的缀合有transit TKO试剂(Mirus)的靶向人VEGF的siRNA的混合物注射对侧眼。在注射后48小时和60小时，利用眼底检眼镜检查(fundus ophthalmoscopy)检测GFP的表达。在注射后第48小时或第60小时处死动物。摘出眼睛，将其固定在4%多聚甲醛中，制备为铺片(flat mount)或加工成10微米冰冻切片以进行荧光显微镜检查。

在5只小鼠的4只中，在接收靶向GFP mRNA的siRNA的眼中通过检眼镜检查未能检测到GFP荧光，然而在接收非特异性对照siRNA的对侧眼中可检测到GFP荧光。通过荧光显微镜检查分析的代表性铺片显示，在接收GFP siRNA的眼中，与接收非特异性对照siRNA的眼相比，不存在GFP荧光。另一个视网膜的冰冻切片显示，重组腺病毒有效地靶向RPE细胞，并且当腺病毒伴随靶向GFP mRNA的siRNA时，GFP转基因的表达被停止。

虽然在接收靶向GFP mRNA的siRNA的眼中可通过荧光显微镜检查检测到一定的GFP荧光，但与接收非特异性siRNA的对照相比，荧光被大大抑制。这些数据显示，可将功能性siRNA体内递送至RPE细胞。

实施例5-人VEGF在鼠视网膜中的体内表达和siRNA-诱导的 RNAi降解

为了证明靶向VEGF的siRNA在体内起作用，如实施例4中一样，通过视网膜下注射，将外源人VEGF表达盒经腺病毒递送至小鼠RPE细胞。一只眼接收Cand5 siRNA，并且对侧眼接收靶向GFP mRNA的siRNA。在注射后60小时处死动物，取出经注射的眼睛，在摘出术后将其快速冷冻于液N₂中。随后将眼睛在裂解缓冲液中进行匀浆，使用标准Bradford蛋白质测定法(Roche,Germany)测量总蛋白质。在如实施例1中所述通过ELISA分析人VEGF之前，针对总蛋白质对样品进行标准化。

VEGF的表达在动物之间存在一定的变化。VEGF水平的变异性与在实施例4的GFP实验中观察到的变异性良好相关，这可归因于注射之间的一些误差，以及腺病毒在每一只动物中递送靶基因的能力的差异。然而，与接收非特异性对照siRNA的眼相比，在接收VEGF siRNA的每一只眼中VEGF表达明显减弱(图4)。这些数据表明，Cand5 siRNA具有效力并且在体内有效沉默鼠RPE细胞中的人VEGF表达。

实施例6-小鼠CNV模型中的脉络膜新血管形成的抑制

有证据显示，ARMD中的脉络膜新血管形成归因于RPE细胞中VEGF的上调。可通过使用激光烧伤视网膜上的点(“激光光凝(laserphoto-coagulation)”或“激光诱导”)来在小鼠中建立该人病理性病况的模型。在愈合过程中，VEGF据认为在烧伤区域的RPE细胞中被上调，这导致脉络膜的重新血管生成(re-vascularization)。该模型称为小鼠脉络膜新血管形成(“CNV”)模型。

为了拯救小鼠CNV模型，设计了与实施例1的人“Cand5”siRNA相比掺入了一个核苷酸变化的小鼠siRNA。所述小鼠siRNA在序列AAACCUCACCAAAGCCAGCAC(SEQ ID NO:80)上特异性靶向小鼠VEGFmRNA。还可设计和测试靶向小鼠VEGF的其它siRNA。还将在实施例1中用作非特异性对照的GFP siRNA在此处用作非特异性对照。

激光诱导后24小时，用包含约1x10⁸个含有CMV启动子驱动的LacZ的腺病毒颗粒和20皮摩尔的缀合有transit TKO试剂(Mirus)的靶向小鼠VEGF的siRNA的混合物视网膜下注射11只成年C57/Black6小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)的每一只的一只眼睛，如实施例4中一样。作为对照，对侧眼接收包含约1x10⁸个含有由CMV启动子驱动的LacZ的腺病毒颗粒和20皮摩尔的缀合有transit TKO试剂(Mirus)的靶向GFP的siRNA的混合物。

在激光处理后14天，用荧光素灌注小鼠，测量烧伤点周围的新血管形成的面积。将对侧眼中的烧伤点的面积用作对照。接收靶向小鼠VEGF的siRNA的动物中围绕烧伤点的新血管形成的位置平均为对照区域的面积的1/4。这些数据支持了针对VEGF的siRNA(也称为“抗-VEGFsiRNA”)用于治疗ARMD的用途。

实施例7-用于表达siRNA的腺伴随病毒载体的产生

基本如Samulski R等人(1987)(同上)中所述，通过基于PCR的亚克隆产生“顺式作用”质粒，其用于产生递送siRNA的重组AAV载体。顺式作用质粒称为“pAAVsiRNA”。

按该顺序用下列序列替代psub201的rep和cap基因：处于人U6RNA启动子控制之下的与polyT终止序列有效连接的19nt有义RNA链编码序列和处于人U6RNA启动子控制之下的与polyT终止序列有效连接的19nt反义RNA链编码序列。图5中提供了pAAVsiRNA的示意图。

通过将pAAVsiRNA转染入先前用缺失E1的腺病毒感染的人293细胞来获得重组AAV siRNA载体，如Fisher KJ等人(1996)(同上)中所描述的。如Samulski R等人(1989)(同上)中所描述的，由反式作用质粒pAAV/Ad提供AAV rep和cap功能。如Fisher KJ等人(1996)(同上)中所描述的，根据基因组拷贝数/ml滴定重组AAV siRNA载体的生产批次。

实施例8-针对VEGF的siRNA抑制实验性脉络膜新血管形成

如下测试针对鼠VEGF的siRNA抑制小鼠中的实验性激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)的能力。

使用810nm二极管激光器(75um,140mw,0.10秒)(OcuLightSix；IRIS Medical,Mountain View,CA)对成年雌性C57BL/6小鼠的视网膜进行激光光凝。对每只小鼠的两只眼睛应用3个激光点。在激光光凝后36小时，将靶向小鼠VEGF的siRNA(“mVEGF1.siRNA”)视网膜下或玻璃体内递送至每一只小鼠的一只眼睛中。对于视网膜下注射，用Transit TKO转染试剂(Mirus)缀合siRNA，然后将其与重组腺病毒(r-腺病毒)混合。对于玻璃体内注射，在转染试剂和r-腺病毒不存在的情况下递送siRNA。作为对照，每一只小鼠的对侧眼接收具有靶向GFP的siRNA(“GFP1.siRNA”)的相同制剂的视网膜下或玻璃体内注射，所述siRNA与小鼠VEGF不具有同源性。

激光处理后14天，用高分子量FITC-葡聚糖灌注所有动物，如上所述制备脉络膜铺片，并且对铺片进行拍照，以掩蔽的方式用显微镜进行分析。利用Openlab软件(Improvision,Boston,MA)测量每一个铺片中的CNV的面积。对于视网膜下(图6A；P<0.003)和玻璃体内(图6B；P<0.04)递送，用mVEGF1.siRNA处理的眼中的CNV的平均面积都显著小于用GFP1.siRNA处理的眼中的面积。

在第二实验中，如上所述对成年雌性C57BL/6小鼠的视网膜进行激光光凝，然后将动物分成对照组和测试组。在激光光凝后1天，将磷酸缓冲盐溶液玻璃体内递送至对照组的动物，在激光处理后14天用葡萄糖-荧光素对所述动物进行灌注。随后制备脉络膜铺片，并如上测量每一个铺片中的CNV的面积。

在激光光凝后14天，通过玻璃体内注射将mVEGF1.siRNA递送入测试组的每一只小鼠的一只眼睛。用GFP1.siRNA注射对侧眼，作为对照。在激光处理后21天，用高分子量葡聚糖-荧光素灌注测试组动物。随后制备脉络膜铺片，并如上测量每一个铺片中的CNV的面积。

在后一个实验中，在CNV生长过程中(与在CNV生长前不同)施用抗-VEGF siRNA，从而更能代表患有湿性AMD的人患者的病况。如可从图6观察到的，mVEGF1.siRNA-处理的眼中的CNV的平均面积显著小于在GFP1.siRNA-处理的眼中测量到的面积(图6C；P<0.05)。第21天的mVEGF1.siRNA-处理的眼中与第14天的对照(“PBS”)眼中的CNV的平均面积无显著差异(图6C；P=0.469)。

这些实验的结果表明，老年性黄斑变性可用抗-VEGF siRNA治疗。

实施例9-鼠RPE细胞中由抗-VEGF siRNA诱导的人VEGF的体内RNA干扰

如下评估随时间过去Cand5 siRNA体内诱导VEGF的RNAi的能力。

从腺伴随病毒载体表达人VEGF的AAV.CMV.VEGF由Dr.A.Auricchio慷慨地提供。将AAV.CMV.VEGF视网膜下和双侧地注射入5只C57B1/6小鼠的眼中。在AAV.CMV.VEGF注射后28天，通过玻璃体内注射将Cand5 siRNA注射入一只眼，通过玻璃体内注射将对照GFP1.siRNA递送入每一只动物的对侧眼。

在第0天(s i RNA注射前)和在siRNA注射后第6、10和14天，处死小鼠，在摘出术后将眼睛于液氮中快速冷冻。随后将眼睛在裂解缓冲液(Roche,Basel,Switzerland)中进行匀浆，使用Bradford测定法测量总蛋白质，如上文实施例5中一样。将2只小鼠用于第0天的时间点(n=2)，将3只小鼠用于第6、10和14天的时间点(n=3)。根据制造商的推荐(R&D systems,Minneapolis,Minnesota)，在用ELISA测定人VEGF之前，针对总蛋白质对样品进行标准化。将每一只小鼠的VEGF的百分比(%VEGF)计算为，用Cand5处理的眼中的VEGF的浓度(“[VEGF]”)除以用GFP1.siRNA注射的眼中的[VEGF]，并乘以100。

如可从图7观察到的，在siRNA注射后6天，Cand5的单次注射诱导约70%的VEGF水平的RNAi-介导的降低，且约35%的VEGF产量的减少持续至siRNA注射后至少14天。这些结果表明，针对人VEGF的siRNA能够在体内诱导人VEGF的RNAi，持续一段时间。

实施例10-用抗-VEGF siRNA在猴子中体内RNA干扰VEGF

本研究的目的是，测定Cand5的安全性和效率(当在诱导CNV后通过单次玻璃体内注射施用至雄性食蟹猴时)。以下列剂量水平将Cand5于媒介物对照品中给首次用于实验的雄性食蟹猴施用：0mg/眼(对照)、0.07mg/眼、0.18mg/眼、0.35mg/眼和0.70mg/眼。

通过激光处理每一只动物的两只眼睛的黄斑来诱导CNV，在激光处理后迅速提供Cand5的剂量。评估动物的临床体征、体重或眼睛状况的变化(广泛的眼睛检查、视网膜电描记术和眼压测量法)。进行荧光素血管造影术，并收集血液样品。在研究结束时(第44天)，无痛处死所有动物，进行充分的肉眼尸检(gross necropsy)。收集选择的组织，将其保存以用于组织病理学评估。

当在激光损伤黄斑后以达到0.70mg/眼的剂量给猴子的两只眼睛施用单次玻璃体内注射时以及在随后CNV的产生过程中，未检测到Cand5的全身性或局部(眼)的副作用。

实施例11-在人胚肾293细胞中用抗-VEGF siRNA体外RNA干扰VEGF

将人胚肾293细胞(获自ATCC,Manassas,VA)培养在含有10%胎牛血清(FBS；来自JRH Biosciences,Lenexa,KS)和抗生素-抗霉菌剂(antimycotic reagent)(用于防止细胞培养生长污染物，来自Gibco,Carlsbad,CA)的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM；获自Cellgro,Herndon,VA)中。

通过Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成siRNA。siRNA靶序列示于表2中。在本研究中使用靶向增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的另外的siRNA，作为阴性对照。

表2.

siRNA转染和体外缺氧诱导。将人293细胞在37℃和5%CO2下于24孔板中培养过夜。第二天，当细胞达到约50%-70%汇合时，进行转染。用针对人VEGF的siRNA转染细胞。将siRNA于CaPi试剂中混合，然后添加至20μl的250mM CaCl₂溶液中。将siRNA/CaCl₂混合物逐滴添加至20μl的2X Hanks平衡盐溶液(HBS)，同时通过涡旋混合。将siRNA/CaCl₂/HBS复合物直接添加至每一个孔的培养基(300μL/孔)中。在37℃下温育4小时后，除去培养基，用含有10%的DMSO的无血清培养基进一步温育细胞(300μL/孔，于室温下进行1-2分钟)。随后除去该培养基，再次用生长培养基(500μL/孔)饲养细胞。阴性对照包括无siRNA的转染试剂和非特异性siRNA(EGFP1 siRNA)。对于筛选实验，以25nM的浓度使用siRNA。对于剂量响应实验，以1nM、5nM和25nM的浓度使用siRNA。在转染后4小时，以130uM的终浓度用去铁胺诱导缺氧。去铁胺模拟缺氧状态，因为其被认为通过抑制血红素-Fe2+相互作用来中断哺乳动物细胞中的正常氧感受途径。

VEGF蛋白的定量。转染后约48小时，从所有孔中取出上清液，如Quantikine human VEGF ELISA方案中所述，对293细胞进行人VEGFELISA(R&D systems,Minneapolis,MN)。将VEGF特异性抗体添加至每一个孔，从而引起与结合至板的VEGF的量成比例的显色。在AD340板读数器(Beckman Coulter)上于450nm处读取ELISA结果。

结果。人VEGF siRNA抑制293细胞中的人VEGF蛋白的缺氧诱导的上调。人VEGF被去铁胺介导的缺氧的诱导上调。OD 450nm的读数反映细胞样品中的人VEGF蛋白水平。缺氧诱导的hVEGF蛋白水平的增加在所有用人VEGF siRNA转染的细胞中显著降低(图8)。对于利用非特异性siRNA(EGFP siRNA)的转染或无s iRNA的模拟转染，未观察到对hVEGF水平的影响。对Cand5、hVEGF#1、hVEGF#2、hVEGF#3、hVEGF#4、hVEGF#6和hVEGF#7进行剂量响应研究(图9)。

实施例12-VEGF同种型的体外RNA干扰

VEGF_165b已被鉴定为内源抗-血管生成VEGF同种型。设计siRNA以选择性抑制某些VEGF同种型例如VEGF₁₆₅，但不抑制VEGF_165b。

方法：将ARPE19细胞接种在24孔板中(50,000个细胞/孔)。接种后18至24小时，细胞达到50-75%汇合并且用于转染。设计和测试14种人VEGF-A特异性siRNA。按照制造商的方案，使用RiboJuice^TMsiRNA转染试剂(Novagen)，用siRNA(25nM)转染细胞。特别地，对于单个孔的细胞，利用移液器将40.5μL无血清

转移至eppendorf管中，随后将2μL RiboJuice^TM添加至OPTI-MEM中。通过轻轻涡旋混合溶液，然后短暂离心以在管底部收集内容物，将其在室温下温育5分钟。将siRNA(7.5μL的1μM原液)添加至RiboJuice^TM/培养基混合物，轻轻混合，短暂离心以在管底部收集内容物。将混合物在室温下温育15分钟。在温育期间，从细胞除去培养基，用250μL的新鲜完全ARPE19生长培养基(DMEM/F12；10%FBS,1%青霉素/链霉素)替代。在15分钟的温育后，向细胞逐滴添加siRNA/RiboJuice^TM/培养基混合物(50μL)。siRNA在300μL体积中的终浓度为25nM。将细胞在37℃、5%CO₂下维持24小时。在另外的实验中，按比例放大反应，用每一种siRNA在一式三份孔中转染细胞。转染后24小时，取出转染混合物，用500μL无血清DMEM/F12、含有10ng/mL人重组TGFβII的DMEM/F12或含有10ng/mL TGF βII和5μg/mL环己酰亚胺的DMEM/F12处理细胞。将细胞返回37℃和5%CO₂，进行另外24小时。之后，将培养基从细胞移出，用ELISA(Quantikine human VEGF ELISA试剂盒(R&D Systems))分析蛋白质表达。将培养基从细胞移出，收集在eppendorf管中，置于冰上，立即通过ELISA分析VEGF蛋白，或于-80℃下贮存，在更迟的时间点上分析VEGF蛋白。

基于这些结果，将选择数目的siRNA候选物通过另一轮转染筛选。收集细胞，提取RNA，进行半定量RT-PCR以测定siRNA对VEGF₁₆₅、VEGF_165b、VEGF₁₂₁和VEGF₁₈₉的抑制作用。将GAPDH管家基因表达用作对照。特别地，从孔中除去培养基后，将200μL来自RNAqueous试剂盒(Ambion)的裂解/结合溶液添加至每一个孔。通过分光光度计(OD260nM)定量RNA。收集裂解的细胞，按照制造商的方案提取RNA。按照制造商的方案，使用SuperScript^TMIII逆转录酶(Invitrogen)逆转录RNA。使用PCR分析GAPDH、VEGF₁₆₅、VEGF_165b、VEGF₁₂₁和VEGF₁₈₉的cDNA。用于PCR的引物示于表3中。

表3.

对于PCR分析，将3μL cDNA与1μL各种适当的正向引物(10μM)和反向引物(10μM)以及45μL的Platinum PCR Supermix(Invitrogen)组合，以便各种引物的终浓度为200nM。利用下列PCR条件在热循环仪上扩增cDNA:

步骤1:在94℃下进行2分钟

步骤2:在94℃下进行15秒

步骤3:在55℃下进行30秒

步骤4:在72℃下进行30秒

步骤5:重复步骤2-4，对于GAPDH、VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁和VEGF₁₈₉重复30次或对于VEGF_165b重复35次

步骤6:在72℃下进行10分钟

步骤7:4℃

随后在于1X TAE缓冲液中制备的2%琼脂糖凝胶上显现PCR产物。

结果：用TGF βII对ARPE19细胞的处理在ARPE19细胞中诱导了VEGF的产生，并且ELISA结果显示，几个siRNA候选物在ARPE19细胞中抑制TGF βII-诱导的VEGF的产生。RT-PCR确认，2个候选物抑制VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁和VEGF₁₈₉的产生，但不抑制VEGF_165b的产生。如图12(pg/mL hVEGF)和13(hVEGF的敲低%)中显示的，就抑制ARPE19细胞产生VEGF蛋白的能力(如通过ELISA测试的)筛选VEGF siRNA候选物(表2)。用10ng/mL TGF βII处理细胞以上调VEGF的产量。ELISA测量总VEGF蛋白，并且对于任何特定剪接变体不具有选择性。几个候选物(OPK-HVB-004、OPK-HVB-010和OPK-HVB-011)显示抑制作用并且被批准用于进一步研究。如图14(pg/mL hVEGF)和15(hVEGF的敲低%)中所显示的，使用与图12和13中相同的方法进行的VEGF产量的二次筛选证实，OPK-HVB-004和OPK-HVB-010抑制VEGF蛋白产生并且被批准用于进一步研究。

图16、24和27显示，利用不同浓度的几个候选物(OPK-HVB-004、OPK-HVB-010和OPK-HVB-012)进行的人VEGF敲低的剂量响应效率。

图17显示，几个候选物(OPK-HVB-004、OPK-HVB-010和OPK-HVB-012)在一周(7天)内对人VEGF的下调。

作为对照，如图18中所示，对经历各种处理的细胞进行GAPDHRT-PCR。虽然未定量存在的RNA的实际量，但当与参照对照泳道3相比较时，该方法是半定量的。特别地，当条带显示更弱时，证明RNA产量下调。在本实验中，用10ng/mL TGFβII处理泳道2-11中的样品以上调VEGF的产量。FAM-GAPDH siRNA下调GAPDH信使(泳道4)，然而其它处理对GAPDH mRNA无作用，因此，确认了在处理的细胞中总RNA产量无变化。

如图19中显示的，还对处理的细胞进行VEGF₁₆₅同种型RT-PCR。用10ng/mL TGFβII处理泳道2-11的样品以上调VEGF的产量。在用TGFβII诱导(泳道2)后，25nM bevasiranib(泳道6)(已知其下调所有VEGF同种型)、25nM OPK-HVB-004(泳道7)和25nM OPK-HVB-010(泳道8)下调VEGF₁₆₅mRNA的产量，如通过与泳道3的对照相比较更浅的条带所证明的。

如图20中所示，还进行VEGF₁₈₉同种型RT-PCR。用10ng/mL TGFβII处理泳道2-11中的样品以上调VEGF的产量。

在用TGFβII诱导(泳道2)后，25nM bevasiranib(泳道6)、25nM OPK-HVB-004(泳道7)和25nM OPK-HVB-010(泳道8)下调VEGF₁₈₉mRNA的产量，如通过与泳道3中的对照相比较更浅的条带所证明的。

随后如图21中所示，进行VEGF₁₂₁同种型RT-PCR。用10ng/mL TGFβII处理泳道2-11中的样品以上调VEGF的产量。

VEGF₁₂₁mRNA在泳道6(25nM bevasiranib)中被下调，如通过与泳道3中的对照相比较更浅的条带所证明的。

最后，如图22中所示，进行VEGF_165b同种型RTPCR。

用10ng/mL TGFβII处理泳道2-11中的样品以上调VEGF的产量。作为初始事件，大于600bp的双重条带被确定为人工假象。然而，VEGF_165bmRNA被bevasiranib(泳道6)下调，如通过与泳道3的对照相比较更弱的条带显示的。相比之下，OPK-HVB-004(泳道7)和OPK-HVB-010(泳道8)的条带不比泳道3的对照弱。因此这类siRNA构建体保持VEGF_165b表达，同时还能够抑制多种其它VEGF同种型。因此，可合成不抑制VEGFA_165b的siRNA，其比敲低所有VEGF-A同种型的siRNA更有效。不抑制VEGF_165b的siRNA可以是用于治疗眼新血管形成的有力的治疗剂候选物。

实施例13-用siRNA处理后的细胞因子谱

在用聚肌苷酸-聚胞苷酸钠盐[Poly(I:C)](dsRNA类似物)处理后，测定ARPE19细胞的细胞因子分泌谱。进行进一步的测试，以确定siRNA是否如Poly(I:C)一样，引起细胞产生相同的细胞因子。

方法。将ARPE19细胞接种在24孔板中(50,000个细胞/孔)。24小时后，除去培养基，用在无血清DMEM/F12(1:1)(Invitrogen,Carls bad,CA)中制备的Poly(I:C)；0-1000mg/mL(Sigma,St.Louis,MO)或聚脱氧肌苷酸-脱氧胞苷酸钠盐[Poly(d I:dC)；50mU/mL-800mU/mL](Sigma)处理细胞。处理后48小时，从细胞收集培养基，按照制造商的方案，通过ELISA(对于IFN-γ、IL-8、IL-6、TNFa、ICAM、IL-12和MCP-1，使用Immunoassays，R&D Systems,Minneapolis,MN；对于IFN-α和IFN-β，使用VeriKine^TMELISA试剂盒，PBL Biomedical Laboratories,Piscataway,NJ)分析IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-8、IL-6、TNFα、ICAM、IL-12和MCP-1。

用bevasiranib、OPK-HVB-004、OPK-HVB-009、OPK-HVB-010和OPK-HVB-012(Dhamacon/Thermo Scientific,Chicago,IL)转染ARPE19细胞。将细胞接种在24孔板中(40,000个细胞/孔)。24小时后，按照制造商的方案，使用RiboJuice^TM转染试剂(Novagen/EMD,SanDiego,CA)用25nM siRNA转染细胞。转染后24小时，用10ng/mL人重组TGFβII(R&D Systems)处理细胞。转染后48小时(即TGFbII处理后24小时)，收集培养基，如上所述分析细胞因子水平。此外，通过ELISA(R&D Systems)分析培养基的hVEGF。结果示于图23中。

结论。基于先前的内容，已显示(ii)ARPE19细胞响应Poly(I:C)(dsRNA类似物)而产生几种炎性细胞因子，但不产生3种至关重要的介体IFN-、IFN-β或IFN-γ；(ii)ARPE19细胞可用于研究dsRNA例如siRNA的炎性潜能和特定作用；和(iii)OPK-HVB-009、OPK-HVB-010不引起ARPE19细胞分泌任何测试的细胞因子，这表明它们可具有低炎性潜能。

实施例14:剂量响应曲线显示siRNA的特异性

使用不同的siRNA(21聚体)产生剂量响应曲线，如图26和27中显示的。对于某些siRNA观察到剂量响应，这表明对所使用的siRNA的特异性响应。也产生OPK-HVB-009的剂量响应曲线，如图25和26中显示的。如实施例12和13中所述，处理和转染细胞。将细胞接种在24孔板中(40,000个细胞/孔)。此外，当制备50μl转染混合物时，使用不同浓度，从而相应调整OPTI-MEM、RiboJuice^TM和siRNA的体积。

实施例15:siRNA的稳定性

用已在不同条件下贮存(如图28、29、30、31和32中显示的)的siRNA转染ARPE19细胞。如实施例12和13中所述，转染细胞。已发现，siRNA分子在如图28、29、30、31和32中显示的不同条件下是稳定的。例如，将7.5μM siRNA等分入3个管中，将每一个管在不同的温度(37℃、室温、4℃)下贮存达到8周。在预定的时间点(24小时、48小时和随后每周)收集每一个管的等分试样。收集后，将等分试样于-80℃下贮存。随后测试每一个等分试样在ARPE19细胞中的功效，以观察siRNA在不同的环境条件下是否维持它们的稳定性。使用实施例12中描述的方法(其中每孔接种40,000个细胞)，将siRNA转染入ARPE19细胞。

实施例16:VEGF的跨物种下调

将C6细胞接种在24孔板中(P12,40,000个细胞/孔)。接种后18至24小时，细胞达到50-70%汇合，将其用于转染。按照制造商的方案，使用RiboJuice^TM siRNA转染试剂(Novagen)，利用OPK-HVB-004、OPK-HVB-009、OPK-HVB-010和OPK-HVB-012转染细胞。简而言之，对于单个孔，用移液器将无血清OPTI-MEM(40.5μL-47μL)转移至eppendorf管中，随后将2μL RiboJuice^TM添加入OPTI-MEM(Gibco)。通过轻轻涡旋混合溶液，然后短暂离心以在管底收集内容物，将其在室温下温育5分钟。将siRNA(0.3μL-7.5μL的100nM或1μM原液)添加至RiboJuice^TM/培养基混合物，轻轻混合，短暂离心以在管底收集内容物。将混合物在室温下温育15分钟。在温育期间，从细胞除去培养基，用250μL新鲜C6生长培养基(F-12Kaighn's,2.5%胎牛血清；15%马血清,1%青霉素/链霉素)替代。在15分钟的温育后，将siRNA/RiboJuice^TM/培养基混合物(50μL)逐滴添加至细胞。轻轻摇动板以确保复合物均匀地分散在整个孔中。siRNA在300μL体积中的终浓度为250pM、500pM、1nM、5nM或25nM。将细胞在37℃,5%CO2下维持24小时。将所有体积按比例放大，以便在每一个浓度上以一式三份测试每一种siRNA。转染后24小时，除去转染混合物，用500μL的新鲜C6生长培养基或用补充有10ng/mL人重组TGFβII的新鲜C6生长培养基处理细胞。将细胞返回至37℃,5%CO₂，进行另外24小时。之后，从细胞移取培养基，利用ELISA(Quantikine rat VEGF ELISA试剂盒,R&D Systems)分析蛋白质表达。

将NIH3T3细胞接种在24孔板中(P2-P6,40,000个细胞/孔)。在接种后18至24小时，细胞达到50-70%的汇合，将其用于转染。按照制造商的方案，使用Lipofectamine^TM试剂2000(Invitrogen)，用siRNA转染细胞。简而言之，对于单个孔，将siRNA(1μM或7.5μM)在eppendorf管中稀释于50μL OPTI-MEM中，轻轻混合并且涡旋。在第二个eppendorf管中，将1μL Lipofectamine 2000与49μLOPTI-MEM组合。将混合物轻轻混合，涡旋，在室温下温育5分钟。5分钟后，将稀释的siRNA(50μL体积)添加至稀释的Lipofectamine2000(50μL)中。将内容物轻轻混合，在室温下温育20分钟。在20分钟的温育过程中，从细胞除去培养基，用500μL新鲜NIH3T3生长培养基(DMEM,10%胎牛血清)替代。20分钟后，将siRNA-Lipofectamine 2000复合物(100μL)逐滴添加至细胞中。将板轻轻摇动以确保复合物均匀地分散在整个孔中。随后将细胞在37℃,5%CO₂下温育24小时。siRNA在500μL体积中的终浓度为1nM、5nM或25nM。转染后24小时，除去转染混合物，用500μL新鲜DMEM或用补充有10ng/mL人重组TGFβII的新鲜DMEM处理细胞。将细胞返回至37℃,5%CO₂，进行另外24小时。之后，从细胞移取培养基，利用ELISA分析蛋白质表达(Quantikine mouse VEGF ELISA试剂盒,R&D Systems)。

实验的结果示于图34、35和39中。OPK-HVB-004和OPK-HVB-009能够抑制C6细胞分泌VEGF，如图34中显示的。在小鼠细胞(NIH3T3)中进行类似实验，OPK-HVB-004、OPK-HVB-009和OPK-HVB-010能够抑制小鼠VEGF的分泌，如图35和39中显示的。

实施例17:不同siRNA的比较

将包含悬突的21聚体siRNA与19聚体平端对应物相比较。如实施例12、13和14中所述，用不同siRNA转染ARPE19细胞，测量VEGF的产量。已发现，平端对应物与所述21聚体同样有效地敲低ARPE19细胞中的VEGF产生，如图36中显示的。例如，包含SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120的bevasiranib的平端形式在敲低VEGF产生上同样有效，如图36中显示的。

实施例18:能够抑制VEGF产生的包含17bp和悬突的19聚体的筛选

如实施例12、13和14中所述，将包含17聚体和dTdT悬突的siRNA转染入ARPE19细胞。已发现，几种siRNA抑制VEGF产生，如图37中显示的。

实施例19:siRNA的剂量响应

如图38中显示的，以不同剂量将包含平端的19聚体或悬突19聚体(17bp+dTdT悬突)转染入ARPE19细胞。如实施例12、13和16中所述，通过测量VEGF分泌来产生剂量响应曲线。观察到的剂量响应表明，对siRNA的响应特异于siRNA并且不由非特异性siRNA响应产生。结果可见于图38中。在NIH3T3细胞中测试的平端siRNA显示特异性剂量响应(参见图39)。

实施例20:siRNA对VEGF mRNA表达的影响

用siRNA(终浓度siRNA=25nM)转染ARPE19细胞。用10ng/mL TGF

βII处理细胞以上调hVEGF的产量。从细胞分离RNA，进行逆转录PCR以扩增GAPDH(图40A；472bp片段)、VEGF₁₆₅(图40B；284bp片段)和VEGF_165b(图40C；199bp片段)。Cy3-GAPDH siRNA(图40A，泳道4)沉默GAPDH信使，然而其它处理没有影响。OPK-HVB-004、OPK-HVB-009和OPK-HVB-010(图40B，泳道6、7和8)和OPK-HVB-004be、OPK-HVB-009be和OPK-HVB-010be(图40B，泳道10、11和12)沉默VEGF₁₆₅信使。Bevasiranib(图40C，泳道4)沉默VEGF_165b，然而OPK-HVB-004、OPK-HVB-009、OPK-HVB-004be和OPK-HVB-009be(图13C，泳道5、6、8和9)保持VEGF_165b的水平(参见图40)。

实施例21:siRNA在大鼠C6细胞中的效力

用siRNA(终浓度siRNA=25nM)转染大鼠C6细胞。用10ng/mL TGF

βII处理细胞以上调大鼠VEGF的产量。通过ELISA测量培养基中总的分泌的VEGF的水平。百分比敲低反映，相对于用RiboJuice^TM处理的细胞，由细胞产生的VEGF的水平。OPK-HVB-004和OPK-HVB-004be在降低大鼠VEGF的水平中最有效。

Claims

1.一种包含有义RNA链和反义RNA链的分离的siRNA，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与人VEGF mRNA中的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，其中所述有义RNA链包含由SEQ ID NO:119组成的核苷酸序列，并且反义链包含由SEQ ID NO:120组成的核苷酸序列。

2.权利要求1的siRNA，其中形成RNA双链体的第一和第二RNA链通过单链发夹共价连接。

3.权利要求1的siRNA，其中所述siRNA还包含非核苷酸材料。

4.权利要求1的siRNA，其中第一和第二RNA链经稳定以抗核酸酶降解。

5.一种包含有效量的分离的siRNA的药物组合物，所述分离的siRNA包含有义RNA链和反义RNA链，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含由SEQ ID NO:119组成的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含由SEQ ID NO:120组成的核苷酸序列。

6.权利要求5的药物组合物，其中第一和第二RNA链经稳定以抗核酸酶降解。

7.一种治疗受试者的血管生成疾病的方法，包括：给受试者施用有效量的包含有义RNA链和反义RNA链的短干扰核糖核酸(siRNA)，其中所述有义和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA中的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA链包含由SEQID NO:119组成的核苷酸序列，并且所述反义链包含由SEQ ID NO:120组成的核苷酸序列，以便与血管生成疾病相关的血管生成被抑制。

8.权利要求7的方法，其中所述血管生成疾病包括与癌症相关的肿瘤。

9.权利要求8的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、头颈癌、脑癌、腹部癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胃肠癌、神经胶质瘤、肝癌、舌癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、Wilm's肿瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、淋巴瘤和血癌。

10.权利要求7的方法，其中所述血管生成疾病选自糖尿病视网膜病变、老年性黄斑变性和炎性疾病。

11.权利要求10的方法，其中所述炎性疾病为银屑病或类风湿性关节炎。

12.权利要求7的方法，其中所述血管生成疾为老年性黄斑变性。

13.权利要求7的方法，其中将所述药物组合物与用于治疗血管生成疾病的药剂联合施用，所述药剂与所述短干扰核糖核酸(siRNA)不同。

14.权利要求7的方法，其中所述血管生成疾病为癌症，并且所述药剂包括化学治疗剂。

15.权利要求14的方法，其中所述化学治疗剂选自顺铂、卡铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔红霉素和他莫昔芬。

16.权利要求7的方法，其中将所述组合物与另一种经设计用以治疗血管生成疾病的治疗方法组合施用给受试者。

17.权利要求7的方法，其中所述血管生成疾病为癌症，并且将所述药物组合物与放射疗法、化学疗法或手术组合施用。

18.一种抑制人血管内皮生长因子(VEGF)的表达的方法，包括：给受试者施用有效量的包含有义RNA链和反义RNA链的短干扰核糖核酸(siRNA)，其中所述有义RNA链和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA中的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA链包含由SEQ ID NO:119组成的核苷酸序列，并且所述反义链包含由SEQ ID NO:120组成的核苷酸序列。

19.权利要求18的方法，其中所述有效量包括约1nM至约100nM的短干扰核糖核酸(siRNA)。

20.权利要求18的方法，其中所述药物组合物还包含递送试剂。

21.权利要求18的方法，其中所述递送试剂选自lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子和脂质体。

22.权利要求21的方法，其中所述递送试剂为脂质体。

23.权利要求22的方法，其中所述脂质体包含将脂质体靶向血管生成位置上或其附近的细胞的配体。

24.权利要求23的方法，其中所述配体结合肿瘤细胞或血管内皮细胞上的受体。

25.权利要求23的方法，其中所述配体包含单克隆抗体。

26.权利要求22的方法，其中用调理素作用-抑制部分修饰所述脂质体。

27.权利要求26的方法，其中所述调理素作用-抑制部分包含PEG、PPG或其衍生物。

28.权利要求18的方法，其中所述短干扰核糖核酸(siRNA)是从重组质粒表达的。

29.权利要求18的方法，其中所述短干扰核糖核酸(siRNA)是从重组病毒载体表达的。

30.权利要求29的方法，其中所述重组病毒载体包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或疱疹病毒载体。

31.权利要求30的方法，其中利用来自水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒或莫科拉病毒的表面蛋白假型化所述重组病毒载体。

32.权利要求29的方法，其中所述重组病毒载体包括腺伴随病毒载体。

33.权利要求18的方法，其中通过经肠施用途径施用所述药物组合物。

34.权利要求33的方法，其中所述经肠施用途径选自口服、经直肠和鼻内施用途径。

35.权利要求18的方法，其中通过胃肠外施用途径施用所述药物组合物。

36.权利要求35的方法，其中所述胃肠外施用途径选自血管内施用、组织旁和组织内注射、皮下注射或沉积、皮下输注和在新血管形成的位置上或其附近的直接施用。

37.权利要求35的方法，其中血管内施用选自静脉内快速浓注、静脉内输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注。

38.一种降解人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的方法，包括：给受试者施用有效量的包含有义RNA链和反义RNA链的短干扰核糖核酸(siRNA)，其中有义RNA链和反义RNA链形成RNA双链体，并且其中所述有义RNA链包含与人血管内皮生长因子(VEGF)mRNA中的约19至约25个连续核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有义RNA链包含由SEQ ID NO:119组成的核苷酸序列，以及所述反义链包含由SEQ ID NO:120组成的核苷酸序列。