CN102791725A

CN102791725A - 调节tau水平的方法和组合物

Info

Publication number: CN102791725A
Application number: CN2010800609170A
Authority: CN
Inventors: 李赣
Original assignee: J David Gladstone Institutes
Current assignee: J David Gladstone Institutes
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2012-11-21
Also published as: CA2990678C; EP2496594B1; IL219445A0; WO2011056300A1; KR20120101053A; CA2778234C; US9040521B2; BR112012010587A2; US20120225864A1; ZA201202923B; US9585907B2; US20160015733A1; EP2496594A1; CA2778234A1; CA2990678A1; JP2013510086A; MX2012005300A; JP5851409B2; EA201290194A1; AU2010315780A1

Abstract

本发明提供了一种降低细胞内乙酰化Tau多肽水平的方法和试剂。还提供了一种治疗个体Tau病变的方法。还提供了一种诊断个体认知损伤性疾病的方法。也提供了一种鉴定适于治疗Tau病变的试剂的方法。

Description

调节TAU水平的方法和组合物

交叉引用

本申请要求2009年11月6日申请的美国临时专利申请No.61/258,822的优先权，此申请在此全文参考并入。

背景技术

神经退行性疾病表示患有遗传性和获得性神经疾病的异质性群体，其导致生命的中期至后期出现严重的和进行性的认知和运动损伤。导致痴呆的最常见原因为阿尔茨海默氏症。仅有5%以下阿尔茨海默氏症的致病原因涉及遗传因素，其余病例为散发性的。

Tau蛋白在中枢神经系统中表达，其通过稳定细胞内微观网络而在神经结构中起关键作用。截断、高度磷酸化或扰乱六种天然存在的Tau亚型之间的平衡会使Tau蛋白的生理功能受损，导致神经纤维缠结（NFT）、营养障碍性神经炎和神经毡细丝的形成。这些结构代表了阿尔茨海默氏症（AD）超微结构的标志。这些结构的主要蛋白亚基为与蛋白Tau相关的微管。在AD患者尸体解剖中发现，NFT的量与包括智力减退在内的临床症状相关。因此，Tau蛋白在AD病理学过程中起着关键作用。与额颞痴呆疾病相关的Tau基因和与染色体17（FTDP-17）相关的帕金森氏病的特定突变共分离的最新发现确证了Tau蛋白的某些异常可能是导致受累个体出现神经退行性病变和痴呆的主要原因。

本领域需要治疗Tau病变的方法。

文献

U.S.专利公开号2009/0117543；U.S.专利公开号2008/0194803；U.S.专利公开号2006/0025337。

发明概述

提供了一种降低细胞内乙酰化Tau多肽水平的方法和试剂。还提供了一种治疗个体Tau病变的方法。还提供了一种诊断个体认知损伤性疾病的方法。还提供了一种鉴定适于治疗Tau病变的试剂的方法。

附图的简要说明

图1A-G描述了Tau体外和体内的乙酰化。图1B描述了SEQ ID NO:1。

图2A-E描述了利用p300乙酰转移酶进行的Tau乙酰化。

图3A-I描述了在体外细胞培养中利用SIRT1、SIRT2、和HDAC6进行的Tau脱乙酰化。

图4A-F描述了在体外神经元和体内内SIRT1介导的Tau乙酰化的降低。图4D描述了SEQ ID NO:52。

图5A-C描述了SIRT1与Tau的相互作用。

图6A-K描述了Tau更新和Tau泛素化对乙酰化的影响。

图7A-D描述了在病理条件下Tau乙酰化升高。

图8A-D描述了降低Tau乙酰化对p-Tau的影响。

图9A-D描述了人Tau亚型氨基酸序列的氨基酸序列比对。

图10展示了大鼠、小鼠、和人Tau（亚型2）氨基酸序列的氨基酸序列比对。

定义

本文所用术语“治疗”、“治疗的”及类似术语是指获得目标药理学和/或生理学作用。从完全或部分预防疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”包括在哺乳动物，例如人中进行的任何疾病治疗，包括：（a）在可能易患该疾病但尚未诊断患有该疾病的对象中防止该疾病的发生；（b）抑制疾病，即阻滞其发展；以及（c）缓解疾病，例如使疾病消退，例如完全或部分消除疾病的症状。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以提供治疗所需治疗疾病状态或提供目标效应（例如，诱导有效的免疫应答、降低慢性免疫活动过度等）的剂量。准确剂量随多种因素而改变，如对象相关变量（例如，体重、年龄等）、疾病、和进行的治疗。

术语“个体”、“宿主”、“对象”、和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于，鼠类、兔类、非人灵长类动物、人等。在某些实施方式中，个体是人。在某些实施方式中，个体是啮齿类动物（例如，小鼠、大鼠等）或兔类。

“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”、和“药学上可接受的辅助剂”是指用于制备药物组合物的通常安全、无毒且无生物学上或其它方面不期望作用的赋形剂、稀释剂、载体、和辅助剂，包括兽用药物及人用药物可接受的赋形剂、稀释剂、载体、和辅助剂。在说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和辅助剂”包括一种及一种以上所述赋形剂、稀释剂、载体、和辅助剂。

如本文所使用的，“药物组合物”是指包括适于给予对象，如哺乳动物，例如人，的组合物。一般情况下，“药物组合物”是无菌的，且不含可在对象中诱发令人不适应答的污染物（例如，药物组合物中的化合物为药用级）。可以将药物组合物设计为通过包括口服、含服、直肠、胃肠外、腹膜内、皮内、气道内等多种不同给药途径给药至需要的对象或患者。在某些实施方式中，组合物适于使用二甲亚砜（DMSO）以外的渗透增强剂通过透皮途径给药。在其它实施方式中，药物组合物适于通过透皮给药以外的其它途径给药。在某些实施方式中，药物组合物包括化合物和药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，药学上可接受的赋形剂不是DMSO。

如本文所使用的，本发明化合物的“药学上可接受的衍生物”包括盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、缩醛、缩酮、原酸酯、半缩醛、半缩酮、酸、碱、溶剂化物、水合物或其前药。本领域技术人员采用制备此类衍生物的已知方法就可以很容易地制备此类衍生物。可以将制备的化合物给予动物或人，其不具有实质性的毒性作用，且具有药物活性或是前药。

化合物的“药学上可接受的盐”指母体化合物药学上可接受的并具有目标药理学活性的盐。所述盐包括：（1）酸加成盐，与无机酸形成如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成如乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-（4-羟基苯甲酰基）苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-二乙磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘酚磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、葡萄糖庚酸、4,4’-亚甲基-（3-羟基-2-烯-1-羧酸）、3-苯基丙酸、叔戊酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸或类似物；或（2）母体化合物中存在的酸质子被金属离子所取代形成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子、或铝离子；或与有机碱配位形成的盐，有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。

在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。还应理解，本文所用术语的目的只是描述具体实施方式，不应为限制性，因为本发明范围仅受所附权利要求书的限制。

给出数值范围时，应理解该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它标成或间插数值均包括在本发明范围内，除非文中另有明确说明。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，除去这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。本文所述的所有发表物通过引用纳入本文，从而公开或描述与所引用发表物有关联的方法和/或材料。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“一种Tau多肽”包括多种这类Tau多肽，提到“这种试剂”包括本领域技术人员已知的一种或多种试剂和其等同物，等等。还注意到，可将权利要求书撰写为排除任何可选元素。如果这样，该声明应作为使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等以及引用权利要求元素，或使用“负”限制的前提基础。

本文讨论的发表物仅仅是为了提供早于本申请申请日的公开内容。本文中的讨论不可被解释为承认本发明不能凭借先有发明而享受早于这些发表物的发明日。另外，所提供发表物的日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独验证。

发明详述

进行了以下观察：1）Tau乙酰化；2）在早期阿尔茨海默氏症（例如，轻度认知损伤）患者中Tau乙酰化增加；3）在疾病过程中Tau乙酰化先于Tau磷酸化；4）组蛋白脱乙酰基酶（例如，SIRT1、SIRT2、HDAC6)）可以使Tau脱乙酰化；以及5）组蛋白乙酰基转移酶（例如，p300）可以使Tau乙酰化。抑制Tau乙酰化的试剂和使乙酰化的Tau脱乙酰化的试剂适于降低细胞中乙酰化Tau的水平，例如，神经元或神经胶质细胞，所述细胞可产生Tau。所述试剂可用于治疗个体的Tau病变。

乙酰化Tau的水平可以作为认知损伤性疾病的诊断指标，可以作为Tau病变治疗应答的标记物。因而，提供了可用于多种诊断检测的乙酰化Tau特异性抗体。

可以通过鉴别提高乙酰化Tau脱乙酰化的试剂，或通过鉴别抑制Tau乙酰化的试剂来鉴定用于治疗Tau病变的候选试剂。因而，本发明公开了鉴定适于治疗Tau病变的试剂的方法。

在神经元细胞中降低乙酰化TAU多肽水平的方法

本发明公开了一种在细胞中（例如，正常产生Tau的细胞，例如，神经元或神经胶质细胞）降低乙酰化Tau（Ac-Tau）多肽水平的方法。该方法通常涉及使细胞（例如，神经元或神经胶质细胞）与在细胞内降低Ac-Tau多肽水平的试剂接触，例如，在细胞内提高Ac-Tau多肽脱乙酰化的多肽活性的试剂；在细胞内降低Tau多肽乙酰化的多肽活性的试剂；等等。本发明公开了一种治疗个体Tau病变的方法。所述方法包括给予所需个体治疗有效量的降低个体细胞（例如，神经元或神经胶质细胞）内Ac-Tau水平的试剂。

Tau氨基酸序列是本领域已知的。参见，例如下列氨基酸序列（括号内为GenBank登录号）：人Tau转录变体1mRNA（NM_016835.3）和亚型1蛋白（NP_058519.2）；人Tau转录变体2mRNA（NM_005910.4）和亚型2蛋白（NP_005901.2）；人Tau转录变体3mRNA（NM_016834.3）和亚型3蛋白（NP_058518.1）；人Tau转录变体4mRNA（NM_016841.3）和亚型4蛋白（NP_058525.1）；人Tau转录变体5mRNA（NM_001123067.2）和亚型5蛋白（NP_001116539.1）；以及人Tau转录变体6mRNA（NM_001123066.2）和亚型6蛋白（NP_001116538.1）。

图9A-D（分别为SEQ ID NOs:1-6）中描述了示例性的Tau氨基酸序列，其中图9A-D的序列为：智人Tau亚型2（GenBank登录号NP_005901；SEQ IDNO:1）；智人Tau亚型3（GenBank登录号NP_058518；SEQ ID NO:2）；智人Tau亚型4（GenBank登录号NP_058525；SEQ ID NO:3）；智人Tau亚型5（GenBank登录号NP_001116539；SEQ ID NO:4）；智人Tau亚型1（GenBank登录号NP_058519；SEQID NO:5）；以及智人Tau亚型6（GenBank登录号NP_001116538；SEQ ID NO:6）。在图9A-D中对SEQ ID NOs:1-6所示的氨基酸序列进行了比对。

图10描述了对人Tau亚型1（SEQ ID NO:1）、大鼠Tau（SEQ IDNO:7）、和小鼠Tau（SEQ ID NO:8）氨基酸序列的比对。

Tau多肽可以包含与SEQ ID NOs:1-6所示任一氨基酸序列中约350个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。Tau多肽可以包含与SEQ ID NO:2（智人Tau亚型3）所示氨基酸序列中约350个至383个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。Tau多肽可以包含与SEQ ID NO:4（智人Tau亚型5）所示氨基酸序列中约350个至约412个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。Tau多肽可以包含与SEQ ID NO:1（智人Tau亚型2）所示氨基酸序列中约350个至约400个或约400个至约441个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。Tau多肽可以包含与SEQ ID NO:5（智人Tau亚型1）所示氨基酸序列中约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约758个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。Tau多肽可以包含与SEQ ID NO:6（智人Tau亚型6）所示氨基酸序列中约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约776个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

图1B提供了Tau 型2多肽（SEQ ID NO:1）的氨基酸序列。SEQ IDNO:1所示以及图1B中显示的氨基酸序列的微管蛋白结合区域包括氨基酸243-274、氨基酸275-305、和氨基酸337-368。其它Tau多肽的相应微管蛋白结合区域可以很容易地通过实验确定，或利用图12A-D所示的氨基酸序列比对检验。

Tau亚型2多肽（例如，如图1B所述和SEQ ID NO:1所示）的可能磷酸化位点包括下述氨基酸：46、50、69、111、123、153、175、181、195、198、199、202、205、208、210、212、214、217、231、235、237、238、258、262、293、305、320、324、352、356、373、394、396、400、404、409、412、413、416、和422。例如，Tau多肽的一个或多个丝氨酸残基46、199、202、235、262、396、404、和422和/或一个或多个苏氨酸残基50、69、111、153、175、181、205、212、217、和231可以被磷酸化。其它Tau多肽的相应磷酸化位点可以很容易地通过实验确定，或利用图9A-D和图10所示的氨基酸序列比对检验。

Tau多肽的长度可以为约350个氨基酸至约780个氨基酸，例如，约350个氨基酸至约385个氨基酸，约385个氨基酸至约415个氨基酸，约415个氨基酸至约445个氨基酸，约445个氨基酸至约760个氨基酸，或约760个氨基酸至约780个氨基酸。在某些实施方式中，Tau多肽的长度为352个氨基酸、383个氨基酸、412个氨基酸、441个氨基酸、758个氨基酸、或776个氨基酸。

Tau多肽中的一些赖氨酸（Lys）残基可以被乙酰化。例如，Tau亚型2的一个或多个氨基酸可以被乙酰化，包括但不限于，Lys-163、Lys-174、Lys-180、Lys-190、Lys-267、Lys-274、Lys-281、Lys-369、和Lys-385（例如，图1B中所述的和SEQID NO:1所示的氨基酸序列）。其它Tau多肽的相应乙酰化位点可以很容易地通过实验确定（例如，实施例中所描述的），或利用图9A-D所示的氨基酸序列比对检验。例如，如图9A-D所示，Tau亚型2中的Lys-163与Tau亚型3中的氨基酸105、Tau亚型4中的氨基酸105、Tau亚型5中的氨基酸134、Tau亚型6中的氨基酸480、和Tau亚型1中的氨基酸580对应。

在某些实施方式中，乙酰化Tau多肽为Tau亚型2多肽的Lys-163、Lys-174、Lys-180、Lys-190、Lys-267、Lys-274、Lys-281、Lys-369、和Lys-385的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、或九个残基或不同Tau亚型相应赖氨酸残基乙酰化。在某些实施方式中，乙酰化Tau多肽包括Tau亚型2多肽的乙酰化的Lys-163、乙酰化的Lys-174、和乙酰化的Lys-190或不同Tau亚型的相应的乙酰化的赖氨酸残基。在某些实施方式中，乙酰化Tau多肽包括Tau亚型2多肽的乙酰化的Lys-163、乙酰化的Lys-174、乙酰化的Lys-180、乙酰化的Lys-190、乙酰化的Lys-267、乙酰化的Lys274、乙酰化的Lys-281、乙酰化的Lys-369、和乙酰化的Lys-385或不同Tau亚型的相应的乙酰化的赖氨酸残基。

在正常产生Tau的细胞（例如，神经元细胞；神经胶质细胞）内降低乙酰化Tau多肽水平的试剂包括与不存在该试剂时细胞内乙酰化Tau多肽的水平相比使细胞内乙酰化Tau多肽的水平降低至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上的试剂。

细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽的水平降低可以导致磷酸化Tau水平降低和/或总Tau水平降低。因此，在某些实施方式中，降低细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽水平的试剂也可以降低细胞内磷酸化Tau多肽的水平。在某些实施方式中，在正常产生Tau的细胞内（例如，神经元细胞；神经胶质细胞）降低乙酰化Tau多肽水平的试剂使细胞内磷酸化Tau的水平与不存在该试剂时细胞内磷酸化Tau的水平相比降低至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上。

细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽的水平降低可以导致总Tau水平降低。这样，在某些实施方式中，降低细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽水平的试剂也可以降低细胞内总Tau多肽的水平。在某些实施方式中，在正常产生Tau的细胞内（例如，神经元细胞；神经胶质细胞）降低乙酰化Tau多肽水平的试剂使细胞内总Tau的水平与不存在该试剂时细胞内总Tau的水平相比降低至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上。

细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽水平的降低可以导致Tau多肽生物学活性的增加。这样，在某些实施方式中，降低细胞内（例如，在正常产生Tau的细胞内，如神经元或神经胶质细胞）乙酰化Tau多肽水平的试剂也可以增加细胞内Tau多肽的生物学活性。在某些实施方式中，在正常产生Tau的细胞内（例如，神经元细胞；神经胶质细胞）降低乙酰化Tau多肽水平的试剂使细胞内Tau多肽的活性水平与不存在该试剂时细胞内Tau多肽的活性水平相比增加至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约5倍、至少约7倍、至少约10倍、或10倍以上。Tau生物学活性包括例如微管的稳定化作用。

增加Tau脱乙酰化的试剂

增加Tau脱乙酰化的试剂包括使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂。使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽包括，例如组蛋白脱乙酰基酶、SIRT1、SIRT2、HDAC6等。使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂包括，例如使SIRT1、SIRT2、和HDAC6中的一种或多种活性增加的试剂。使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂还包括使此类多肽蛋白水平增加的试剂，例如包含编码SIRT1、SIRT2、HDAC6等核苷酸序列的核酸。

SIRT1

SIRT1（也称为（沉默交配型信息调节因子2同源体）1（啤酒酵母））基因编码去乙酰化酶蛋白家族成员，其与酵母Sir2蛋白同源。去乙酰化酶家族成员特征为，具有去乙酰化酶核心结构域，共分为四类。该基因编码的蛋白属于去乙酰化酶家族中的第I类。选择性剪接产生多个转录变体。转录变体1（NM_012238.4）代表较长的转录，其编码较长的亚型a（NP_036370.2）。转录变体2（NM_001142498.1）编码亚型b（NP_001135970.1）。

SIRT1多肽包括在产生Tau的细胞中（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽，其包含与SEQ ID NO:9（GenBankAAH12499；智人SIRT1）所示氨基酸序列中约400个至约450个、或约450个至约555个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。SIRT1多肽包括在产生Tau的细胞中（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽，其包含与SEQ ID NO:10（GenBank NP_036370；智人SIRT1亚型a）所示氨基酸序列中约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约747个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。SIRT1多肽包括在产生Tau的细胞中（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽，其包含与SEQ ID NO:11（GenBankNP_001135970；智人SIRT1亚型b）所示氨基酸序列中约300个至约400个、或约400个至约452个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

SIRT1活化剂

很多SIRT1活化剂均是本领域已知的。适宜的SIRT1活化剂可以使SIRT1多肽的酶活性（例如，在神经元或神经胶质细胞中SIRT1多肽使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的酶活性）增强至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、或20倍以上。在某些实施方式中，SIRT1活化剂是SIRT1-选择性活化剂。

适宜的SIRT1活化剂可以增加SIRT1的酶活性，其EC₅₀（半数最高有效浓度）为约1nM至约1mM，例如，约1nM至约10nM、约10nM至约15nM、约15nM至约25nM、约25nM至约50nM、约50nM至约75nM、约75nM至约100nM、约100nM至约150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约450nM、约450nM至约500nM、约500nM至约750nM、约750nM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、约75μM至约100μM、约100μM至约250μM、约250μM至约500μM、或约500μM至约1mM。

适用于主题方法的SIRT1活化剂的例子包括，但不限于，白藜芦醇（（E）-5-（p-羟基苯乙烯基）间苯二酚（E）-5-（4-羟基苯乙烯基）苯-1,3-二醇）；或3,5,4’-三羟基-反式-二苯乙烯）；紫铆因（3,4,2',4'-四羟基查尔酮）；白皮杉醇（3,5,3',4'-四羟基-反式-二苯乙烯）；异甘草素（4,2',4'-三羟基查尔酮）；非瑟酮（3,7,3',4'-四羟基黄酮）；鲸蜡素（3,5,7,3',4'-五羟基黄酮）；美国专利号7,345,178描述的SIRT1活化剂；美国专利公开号2008/02555382描述的SIRT1活化剂；以及美国专利公开号2009/0012080描述的SIRT1活化剂。上述SIRT1活化剂的任意药学上可接受的盐也适用于本主题方法。

例如，适宜的SIRT1活化剂是美国专利号7,345,178中所描述的式I-XXVIII中的任意一个化合物，其取代基如美国专利号7,345,178中所描述，或如美国专利号7,345,178中所描述的式I-XXVIII中的任意一个化合物的药学上可接受的盐，其均提供了具有SIRT1活性的化合物。例如，适宜的SIRT1活化剂包括美国专利号7,345,178表4中所示的化合物。

例如，适宜的SIRT1活化剂如下表1所示。

表1

适宜的SIRT1活化剂的非限制性示例包括，例如，

其它适宜的SIRT1活化剂包括，例如，

SRT1720、SRT1460、和SRT2183是选择性的SIRT1活化剂。参见，例如，Milne et al.(2007)Nature 450:712。

喹喔啉化合物也适于作为SIRT1活化剂。适宜的喹喔啉SIRT1活化剂包括，例如3-苯磺酰基-1-（4-氟-苯基）-1H-吡咯[2,3-b]喹喔啉-2基胺；2-氨基-1-（2-乙基-苯基）-1H-吡咯[2,3-b]喹喔啉-3-羧酸（四羟基-呋喃-2-基甲基）-胺；2-氨基-1-（3-甲氧基-丙基）-1H-吡咯[2,3-b]喹喔啉-3-羧酸环戊酰胺。参见，例如，Nayagam et al.(2006)J.Biolmolec.Screening 11:959。

其它适宜的SIRT1活化剂包括，例如二苯乙烯化合物，例如白藜芦醇的酯类似物，例如美国专利公开号2008/0255382中所描述的。例如，适宜的SIRT1活化剂包括，例如3,5,4’-三羟基-反式-二苯乙烯的酯类似物。

酯类似物包括下式所示的化合物：

其中各个Y和各个Z独立地为–O（醚）、-O-C=O；-C=O-O（酯）；-O-C=O-O（碳酸酯）；-O-C=O-NH；-O=O-NR；-NH-C=O-O；-NR-C=O-O（氨基甲酸酯）；-NH-C=P；-NR-C=O；-C=O-NH；-C=O-NR（伯氨和仲氨）-NH；-NR（伯胺和仲胺）；-N（杂环）；-S（硫醚）；以及卤素；

其中各个n和各个m独立地为1、2、3、4、或5；

其中各个A和各个B独立地为H、R、或无；

其中各个V和各个W独立地为H、含1至6个碳原子的直链或支链烷基、含3至8个碳原子的环烷基、烷氧基、苯基、苯甲基、或卤素，

以及其中R为至少含一个碳原子的烷基、芳基、或芳烷基。

适宜的SIRT1活化剂包括，例如4’-乙酰氧基-3,5-二（甲氧基甲氧基）二苯乙烯；4’-乙酰氧基-3,5-二羟基二苯乙烯；3,5-二乙酰氧基-4’-氯乙酰氧基二苯乙烯；3,5-二乙酰氧基-4’-羟基二苯乙烯；3,4’-二乙酰氧基-5-羟基二苯乙烯；3-乙酰氧基-4’5-二羟基二苯乙烯；以及3,4,5’-三乙酰氧基二苯乙烯。

适宜的SIRT1活化剂包括具有美国专利公开号2009/0012080所述的式I-VI中的任何结构的化合物。例如，适宜的SIRT1活化剂是具有下式结构的化合物：

例如，适宜的SIRT1活化剂是4-甲基-N-（2（3-吗啉基甲基）咪唑并[2,1-b]噻唑-6-yl）苯基）-2-（吡啶-3-基）噻唑-5-甲酰胺，或其药学上可接受的盐。

在某些情况下，使Ac-Tau水平降低的试剂不是SIRT1活化剂。

HDAC6

组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）（EC编号3.5.1）是一类能够从组蛋白的s-N-乙酰基赖氨酸氨基酸上除去乙酰基的酶。HDAC6（mRNA GenBank登录号：NM_006044.2，蛋白GenBank登录号：NP_006035.2）是与细胞质、微管相关的酶。HDAC6脱乙酰基微管蛋白、Hsp90、和皮层肌动蛋白与其它伴侣蛋白形成复合物。

如本文所述，HDAC6使Tau脱乙酰基。HDAC6过表达降低Ac-Tau的水平。增加HDAC6活性的试剂，例如包含编码HDAC6核苷酸序列的核酸，适用于本主题方法。适宜的HDAC活化剂的非限制性示例包括，例如茶碱（3,7-二氢-1,3-二甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮）；茶碱类似物；等等。

SIRT2

如本文所述，SIRT2使Tau脱乙酰基。增加SIRT2活性的试剂，例如包含编码SIRT2核苷酸序列的核酸，适用于本主题方法。

编码SIRT2多肽的核苷酸序列为本领域已知的。参见，例如，GenBank登录号NM_012237（智人）；GenBank登录号NM_022432（小家鼠）；NM_001008368.1（褐家鼠）；以及GenBank登录号XM_001168375.1（黑猩猩）。

抑制Tau乙酰化的试剂

抑制Tau乙酰化的试剂包括抑制使Tau多肽乙酰化的多肽活性的试剂。使Tau多肽乙酰化的多肽包括乙酰基转移酶，例如组蛋白乙酰基转移酶，例如p300。抑制Tau多肽乙酰化的多肽活性的试剂包括抑制p300活性的试剂。在某些情况下，在Tau乙酰化过程中该试剂特异性抑制p300的活性，例如该试剂并不会直接抑制任意其它的乙酰基转移酶如血清素N-乙酰基转移酶，或组蛋白乙酰基转移酶如pCAF、GCN5（例如，GenBank登录号AAC50641）、Rtt109、Sas、和MOZ。

p300

p300也称为E1A结合蛋白p300（EP300）。p300（mRNA，GenBank登录号NM_001429.3；蛋白，GenBank登录号NP_001420.2）起着组蛋白乙酰基转移酶的作用。如实施例部分所述，p300还可以使Tau乙酰化。

p300多肽包括使Tau乙酰化的多肽，其包含与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列中约1800个至约2000个、约2000个至约2200个、或约2200个至约2414个连续的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

p300抑制剂

如本文所述，p300使Tau乙酰化并且使Tau的稳定性增加，结果导致处于稳定状态的Tau水平增加。适用于本主题方法的抑制p300活性的试剂包括，但不限于，基于异噻唑啉酮的组蛋白乙酰基转移酶（HAT）抑制剂；Lys-CoA；包含与赖氨酸共价连接的长度为约5个氨基酸至约20个氨基酸的多肽的Lys-CoA衍生物；姜黄素；漆树酸；称为山竹子素的聚异戊二烯酯苯甲酮；p300特异性siRNA；美国专利号6,369,030中描述的化合物；美国专利公开号2009/0076155中描述的p300抑制剂；Maiet al.(2009)Bioorg.Med.Chem.Lett.19:1132中描述的4-羟基喹啉化合物；等等。Lys-CoA的结构见Zheng et al.(2005)J.Am.Chem.Soc.127:17182中的化合物1（见下文）。在某些实施方式中，适宜的p300抑制剂是选择性p300抑制剂。在某些实施方式中，适宜的p300抑制剂是可透过细胞的。适于使用的可透过细胞的选择性p300抑制剂包括Zheng et al.(2005)J.Am.Chem.Soc.127:17182中所描述的那些抑制剂。

例如，适宜的p300抑制剂包括化合物1-8，其母体结构式为：

其中

在化合物1中，R=OC2H5和R1=CH3；

在化合物2中，R=OH和R1=CH3；

在化合物3中，R=OC2H5和R1=C6H11；

在化合物4中，R=OC2H5和R1=C10H21；

在化合物5中，R=OH和R1=C10H21；

在化合物6中，R=OC2H5和R1=C15H31；以及

在化合物7中，R=OH和R1=C15H31。

参见，例如，Mai et al.(2009)Bioorg.Med.Chem.Lett.19:1132。

例如，适宜的p300抑制剂包括如下文所示的化合物2-6，其结构式为：

其中

在化合物1中(Lys-CoA)，X＝H；

在化合物2中，X=YGRKKRRQRRR-CO2H(SEQ ID NO:13)；

在化合物3中，X=YGRKKRRQRRRGYK-NH2(SEQ ID NO:14)；

在化合物4中，X=Ahx-R-Ahx-RR-Ahx-RR-Ahx-RR-Ahx-K-NH2(SEQID NO:15)；

在化合物5中，X=GRRRRRRRRRRGK-NH2(SEQ ID NO:16)；以及

在化合物6中，X=Ahx-RRRRRRRRRR-NH2(SEQ ID NO:17)；

以及其中Ahx为6-氨基己酸。

很多p300抑制剂均是本领域已知的。适宜的p300抑制剂可以使p300多肽的酶活性（例如，p300多肽使Tau多肽乙酰化的活性）与不存在抑制剂时的p300多肽活性相比降低至少约5%、至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上。

适宜的p300抑制剂可以抑制p300酶活性，其IC50（半数最高抑制浓度）为约1nM至约1mM，例如约1nM至约10nM、约10nM至约15nM、约15nM至约25nM、约25nM至约50nM、约50nM至约75nM、约75nM至约100nM、约100nM至约150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约450nM、约450nM至约500nM、约500nM至约750nM、约750nM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、约75μM至约100μM、约100μM至约250μM、约250μM至约500μM、或约500μM至约1mM。

适宜的p300抑制剂包括化合物如C646、C375、和C146。C646、C375、和C146的结构如下所示。

适宜的p300抑制剂包括N-烷基-和N-芳基-取代异噻唑啉酮；此类化合物已被鉴定为p300的抑制剂（在35μmol/L时抑制35-90%）（Stimson et al.(October 1,2005)Mol Cancer Ther 4:1521）。这些基于N-取代异噻唑啉酮的化合物见表2和表3。

表2：

母体结构：

化合物

R¹

R²

R³

R⁴

R⁵

R⁶

1

NO₂

H

2

H

NO₂

H

3

H

NO₂

H

4

H

NO₂

H

Cl

5

H

NO₂

Cl

H

6

OMe

H

7

H

OMe

H

8

Cl

H

9

H

Cl

H

10

H

Cl

H

11

Cl

H

Cl

H

12

Cl

H

Cl

H

Cl

13

Cl

H

Cl

H

14

Cl

H

15

CH₃

H

16

H

CH₃

H

17

H

CH₃

H

18

CO₂Et

H

19

H

CO₂Et

H

20

H

CO₂Et

H

21

CF₃

H

22

H

CF₃

H

23

H

CF₃

H

Cl

24

H

CF₃

F

H

25

H

CF₃

F

H

Cl

26

H

Cl

CH₃

H

27

H

OPh

H

表3：

母体结构：

化合物	R⁷	R⁸
			28	iPr	H
29	环丙基	H

30	苯甲基	H
			31	Et	H
32	Et	Cl
			33	癸基	H
34	CH₂CH₂OPh	H
			35	CH₂CH₂OPh	Cl

CBP

在某些实施方式中，该主题方法包含使用CREB结合蛋白（CBP）抑制剂。在某些实施方式中，p300抑制剂还能够抑制CBP多肽。

CBP多肽是本领域已知的。例如，GenBank登录号NP_004371.2为智人CBP的氨基酸序列；GenBank登录号XP_523285.2提供了黑猩猩CBP的氨基酸序列；GenBank登录号XP_001095225.1提供了猕猴CBP的氨基酸序列；GenBank登录号NP_596872.3提供了褐家鼠CBP的氨基酸序列；以及GenBank登记号NP_001020603.1提供了小家鼠CBP的氨基酸序列。GenBank登记号NP_004371.2的氨基酸序列在本文中表示为SEQ ID NO:53。

治疗Tau病变的方法

本发明公开了一种治疗个体Tau病变的方法。该方法包括给予所需个体有效量的降低细胞内乙酰化Tau水平的试剂，例如抑制乙酰化转移酶（使Tau多肽乙酰化）的乙酰化转移酶活性的试剂，增加脱乙酰基酶（使乙酰化Tau多肽脱乙酰化）的脱乙酰基酶活性的试剂，等等。

Tau病变是一种特征为，至少部分特征为，Tau蛋白病理性聚集的神经退行性病变，例如神经纤维缠结。Tau病变的例子包括额颞叶痴呆、阿尔茨海默氏症、进行性核上性麻痹、皮层基底节变性、唐氏综合征、拳击手痴呆、内涵体肌炎、以及颞叶性病变（也称为皮克病）。Tau病变的例子包括：表现为Tau和淀粉样病变共存的疾病，例如阿尔茨海默氏症、克雅氏病、拳击手痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-

病、内涵体肌炎、以及朊病毒蛋白脑淀粉样血管病；没有明显淀粉样病变的疾病，例如肌萎缩性侧索硬化症/复合帕金森氏病-震颤麻痹、嗜银颗粒性痴呆、皮层基底节变性、伴钙化的弥散性神经纤维缠结、伴与染色体17关联的帕金森氏病的额颞叶痴呆、哈-斯二氏综合征、多系统萎缩、C型尼曼匹克症、皮克病、进行性皮层下胶质细胞增生症、进行性核上性麻痹、亚急性硬化性全脑炎、以及以缠结为主的阿尔茨海默氏症。

在某些实施方式中，该主题方法涉及给予抑制Tau多肽乙酰化的试剂。如上文所阐述的，降低Tau乙酰化的试剂包括使Tau多肽乙酰化的多肽的活性抑制的试剂。使Tau多肽乙酰化的多肽包括组蛋白乙酰基转移酶，例如p300。若干抑制p300活性的试剂已在上文中公开，例如表2。

在某些实施方式中，该主题方法涉及给予使Ac-Tau多肽脱乙酰作用增强的试剂。如上文所讨论的，使Tau脱乙酰化增强的试剂包括使Ac-Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂。使Tau脱乙酰化的多肽包括，例如SIRT1、SIRT2、HDAC 6，等等。使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂包括，例如使SIRT1活性增加的试剂。若干SIRT1活化剂已列于上文，例如表1。使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂包括，例如使SIRT2活性增加的试剂。使乙酰化Tau多肽脱乙酰化的多肽活性增加的试剂包括，例如使HDAC6活性增加的试剂。

在某些实施方式中，该主题方法涉及给予抑制Tau多肽乙酰化的试剂和增加Ac-Tau多肽脱乙酰化的试剂。除了单独给予增加Ac-Tau多肽脱乙酰化的试剂和降低Tau多肽乙酰化的试剂以外，还可以采用联合疗法治疗Tau病变。例如，SIRT1活化剂（或SIRT2活化剂或HDAC6活化剂）和p300（或CBP）抑制剂的组合可以作为治疗Tau病变的联合疗法。在某些实施方式中，与Tau-脱乙酰基酶多肽或Tau-乙酰基转移酶抑制剂单独使用相比，联合疗法在治疗Tau病变方面更为有效。在本文中将抑制Tau多肽乙酰化的试剂和/或使Ac-Tau多肽脱乙酰化增加的试剂称为“活性剂”。在某些实施方式中，当给予抑制Tau多肽乙酰化的试剂和使Ac-Tau多肽脱乙酰化增加的试剂联合治疗时，可提供协同效应。

治疗个体Tau病变的主题方法一般涉及给予有效量的在神经元细胞中抑制Tau多肽乙酰化的试剂和/或使个体的产生Tau的细胞（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）的Ac-Tau多肽脱乙酰化增加的试剂。在某些实施方式中，该主题方法涉及单药治疗，例如给予有效量的单一活性剂，例如在产生Tau的细胞（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）中使Tau多肽乙酰化抑制的试剂。在某些实施方式中，该主题方法包括单药治疗，例如给予有效量的单一活性剂，例如在产生Tau的细胞（例如，神经元细胞和/或神经胶质细胞）中使Ac-Tau多肽脱乙酰化增加的试剂。在某些实施方式中，该主题方法涉及联合给药治疗，例如联合给予有效量的抑制细胞内（例如，神经元；神经胶质细胞）Tau多肽乙酰化的试剂和在细胞内（例如，神经元；神经胶质细胞）使Ac-Tau多肽脱乙酰化增加的试剂。

活性剂的有效量为可以有效改善Tau病变至少一种症状的剂量，例如针对Tau病变所致的损伤缓解其不良症状和/或增加其正常功能。例如，在某些实施方式中，活性剂的有效量为有效降低Tau病变个体脑部神经纤维损伤数量的剂量。当采用的主题方法涉及联合治疗时，活性剂的联用有效量为联合使用时有效降低Tau病变个体脑部神经纤维损伤数量的剂量。在某些实施方式中，活性剂的有效量为有效增加个体认知功能的剂量。当采用的主题方法涉及联合治疗时，活性剂的联用有效量为联合使用时有效增加个体认知功能的剂量。

制剂、剂量、和给药途径

可以将活性剂（例如，抑制Tau多肽乙酰化的试剂；增加Ac-Tau多肽脱乙酰化的试剂）加入用于治疗给药的多种制剂中。更具体地，可以通过与适宜的药学上可接受的载体或稀释剂联用将活性剂制成药物组合物，可以将活性剂制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如粉剂、颗粒剂、溶液剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、水凝胶、微球，等等。这样，可以通过不同途径给予活性剂，包括局部给药，如递送至受累组织、口服给药、导管导入、鞘内给药、含服给药、胃肠外给药、腹腔给药、皮内给药、透皮给药、气管给药，等等。活性剂给药后可以全身分布，也可以通过采用局部给药、肌内给药的方式使其局部分布，或通过采用植入的方式使活性剂保留在植入部位。

在某些实施方式中，活性剂配制为可穿过血脑屏障（BBB）。使药物递送通过血脑屏障（BBB）的一个策略为破坏BBB，可以通过渗透压法实现如甘露醇或白三烯，或通过利用血管活性物质如缓激肽通过生物化学法实现。当血管内注射给予组合物时，可以将BBB破坏试剂与活性剂共同给药。通过BBB的其它策略可以是使用内源性转运系统，包括载体介导的转运体如葡萄糖和氨基酸载体、受体介导的胰岛素或转铁蛋白的细胞摄入、以及活性外排转运体如p-糖蛋白。还可以将活性转运体部分与活性剂偶联用于本文公开的方法，以便于输送通过血管上皮壁。可选地，可以直接在颅骨上通过鞘内递送的疗法绕过BBB递送药物，如通过Ommaya储液囊。

根据目标剂型，药物组合物中可以包括药学上可接受的、无毒的稀释剂载体，将其定义为常用于制备供动物或人给药的药物组合物的溶剂。需选择对组合物的生物活性不会造成影响的稀释剂。所述稀释剂的例子为蒸馏水、缓冲水、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、林格氏溶液、右旋糖溶液、以及Hank's液。此外，药物组合物或制剂中可以包含其它载体，辅助剂，或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂、赋形剂等等。组合物中还可以包含使其接近生理条件的其它物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和去垢剂。

关于适于不同类型给药制剂的进一步说明，参见Remington'sPharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.(1985)。对药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

可以给予该药物组合物用于预防和/或治疗。可依据细胞培养和/或实验动物方面的标准药物规程确定活性剂的毒性和治疗有效性，包括，例如确定LD50（群体的50%致死剂量）和ED50（群体的50%治疗有效剂量）。将毒性剂量与治疗有效剂量的比率称为治疗指数，可以将其表示为LD50/ED50的比率。优选治疗指数较高的化合物。

从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可以用于制定人用剂量范围。活性剂典型的剂量范围在包括较低毒性的ED50的循环浓度范围内。在此范围内可以根据所使用的剂型和给药途径不同而改变给药剂量。

制备药物组合物时优选使用高纯度且基本不含潜在有害杂质（例如，至少为国家食品（NF）级、一般至少为分析纯级、以及更典型的至少为药用级）的组分。此外，供体内使用的组合物通常是无菌的。对于使用前必须已合成的给定化合物，产物一般几乎不含任何潜在的有毒物质，特别是任何内毒素，其可能存在于合成或纯化过程中。供胃肠外给药的组合物也应是无菌的、基本上等渗的且需在药品生产质量管理规范（GMP）规定的条件下制备。

给予特定患者的活性剂的有效量与多种因素有关，其中的若干因素在不同患者之间存在差异。胜任的医师能够确定给予患者有效量的活性剂以治疗Tau病变。利用在动物中的LD50数据及其它可获得的抑制剂信息，医师可以根据给药途径不同确定给予个体的最高安全剂量。例如，考虑到静脉给药时，治疗组合物给药后将进入更多体液中，静脉给药的剂量可能高于鞘内给药的剂量。类似地，组合物在机体内会被迅速清除的可以给予较高剂量或重复给药，以维持其治疗浓度。利用本领域的普通技术知识，胜任的医师能够在常规临床试验过程中确定针对特定治疗的最佳剂量。

制剂

为实现本主题治疗方法（例如，在个体细胞（例如，神经元；神经胶质细胞）内降低乙酰化Tau多肽的水平；治疗Tau病变），可以采用能够达到目标生理效应（例如，在个体神经元细胞和/或神经胶质细胞中降低乙酰化Tau多肽水平；增加认知功能；降低神经纤维缠结损伤；降低Tau病变的不良影响；等等）的任何适宜的方法给予主体活性剂。因此，可以将试剂加入供治疗给药的多种制剂中。更具体地，可以通过与适宜的药学上可接受的载体或稀释剂联用将活性剂制成药物组合物，可以将活性剂制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。

在药物剂型方面，活性剂可以以其药学上可接受盐的形式给药，或者活性剂也可以单独或以适当形式组合使用，以及与其它药物活性化合物联用。下述方法和赋形剂仅为示例性的，其不具有限制作用。

对于口服制剂而言，活性剂可以单独使用或与适宜添加剂联用，以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂联用，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或土豆淀粉；与粘合剂联用，如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂联用，如玉米淀粉、土豆淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂联用，如滑石粉或硬脂酸镁；以及如有需要，还可以与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和矫味剂联用。

可以通过在水性或无水溶剂如植物或其它类似的油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇中溶解、悬浮或乳化活性剂的方法将活性剂制成注射剂型；如有需要，还可以加入常规添加剂如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

可以将活性剂制成气雾剂通过吸入方式给药。可以将本发明的化合物在可加压的推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中制剂。

此外，可以通过与多种基质，如乳化基质或水溶性基质，混合将活性剂制成栓剂。可以利用栓剂将活性剂直肠给药。栓剂中可以包含赋形剂如可可脂、碳蜡和聚乙二醇，其在体温时融化，但在室温时为固体。

可以提供口服或直肠给药用的单元型制剂如糖浆剂、酏剂、和混悬剂，其中各剂量单元，例如，一茶匙容量、一汤匙容量、一片片剂或一枚栓剂包含预定量的含有一种或多种活性剂的组合物。类似地，供注射或静脉给药的单元性制剂可以以无菌水、生理盐水或其它药学上可接受载体溶液的形式在组合物中包含活性剂。

在本文中使用的术语“单元型制剂”是指适于作为供人或动物对象使用的单位剂量的物理上不连续的单元，各单元中均包含经计算足以产生目标效应的预定量的活性剂和药学上可接受的稀释剂、载体或溶剂。活性剂单元型制剂的规格与所加入的特定活性剂和所需达到的效果以及各活性剂在主体中的药效学作用有关。

本主题发明也可以采用其它给药方式。例如，可以将活性剂制成栓剂，以及在某些情况下，制成气雾剂和鼻用组合物。对栓剂而言，赋形剂组合物包含传统的粘合剂和载体如聚乙二醇、或甘油三酯。所述栓剂可以由含有范围在约0.5%至约10%（w/w）例如约1%至约2%的活性成分的混合物制成。

鼻用制剂中一般含有既不会导致鼻粘膜刺激又不会明显干扰纤毛功能的载体。可以加入稀释剂如水、水性盐溶液或其它已知物质。鼻用制剂中还可以含有防腐剂例如，但不限于，氯代丁醇和苯扎氯铵。还可以加入表面活性剂以增强鼻粘膜对活性剂的吸收。

活性剂可以通过注射给予。典型地，将可注射的组合物制成液体溶液或混悬液；也可以制成在注射前适于溶解或混悬于液体溶剂中的固体剂型。制剂还可以被乳化或将活性剂包覆于脂质体载体中。

适宜的赋形剂溶剂为，例如水、生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等或其组合物。此外，如有需要，赋形剂中还可以含有少量的辅助性物质如润湿或乳化剂或pH缓冲剂。制备此类剂型的实际方法是已知的或本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985。在任何情况下，所给予的组合物或制剂中均包含足以使治疗对象达到目标状态的活性剂的量。

药学上可接受的赋形剂如溶剂、辅助剂、载体或稀释剂均为公众易于获得的。此外，药学上可接受的辅助性物质如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、润湿剂等均为公众易于获得的。

口服制剂

在某些实施方式中，将活性剂制成用于经口服递送至需要此类试剂的个体的制剂。

对于口服递送，含有活性剂的制剂在某些实施方式中包含肠溶性包衣材料。适宜的肠溶性包衣材料包括乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯（HPMCAS）、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP）、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯（CAP）、聚乙烯邻苯二甲酸乙酸酯（PVPA）、Eudragit^TM（丙烯酸树脂）、和虫胶。

作为适宜的口服制剂的一个非限制性例子，如美国专利号6,346,269中所描述的，将活性剂与一种或多种药用赋形剂一起制剂并使用肠溶性衣材包衣。例如，将含有活性剂和稳定剂的溶液包覆于含有药学上可接受的赋形剂的核上以形成活性剂包衣核；将底衣层应用于活性剂包衣核上，再在之上包覆肠溶性包衣层。一般地，核包括药学上无活性的物质如乳糖、淀粉、甘露醇、羧甲基纤维素钠、羧基乙酸淀粉钠、氯化钠、氯化钾、色素、海藻酸盐、滑石粉、二氧化钛、硬脂酸、硬脂酸盐、微晶纤维素、甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、丙基三乙酸酯、磷酸二氢钙、磷酸三钠、硫酸钙、环糊精、和蓖麻油。活性剂的适宜溶剂包括水性溶剂。适宜的稳定剂包括碱金属和碱土金属、磷酸盐和有机酸盐的碱以及有机胺。底衣层包含一种或多种粘合剂、增塑剂、和抗粘剂。适宜的抗粘剂包括滑石粉、硬脂酸、硬脂酸盐、硬脂酰富马酸钠、山嵛酸甘油酯、高岭土和气相二氧化硅。适宜的粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明胶、羟乙基纤维素（HEC）、羟丙基纤维素（HPC）、羟丙基甲基纤维素（HPMC）、乙烯基乙酸酯（VA）、聚乙烯醇（PVA）、甲基纤维素（MC）、乙基纤维素（EC）、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP）、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯（CAP）、黄原胶、海藻酸、海藻酸盐、Eudragit^TM（丙烯酸树脂）、甲基丙烯酸/甲基异丁烯酸与聚乙烯邻苯二甲酸乙酸酯（PVAP）的共聚物。适宜的增塑剂包括甘油、聚乙二醇、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、丙基三乙酸酯和蓖麻油。适宜的肠溶性包衣材料包括乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯（HPMCAS）、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP）、乙酸纤维素邻苯二甲酸酯（CAP）、聚乙烯邻苯二甲酸乙酸酯（PVPA）、Eudragit^TM（丙烯酸树脂）、和虫胶。

适宜的口服制剂还包括活性剂与下述任意一种材料的制剂：微粒（参见，例如美国专利号6,458,398）；生物可降解大分子单体（参见，例如美国专利号6,703,037）；生物可降解水凝胶（参见，例如Graham and McNeill(1989)Biomaterials5:27-36）；生物微粒载体（参见，例如美国专利号5,736,371）；生物可吸收内酯聚合物（参见，例如美国专利号5,631,015）；缓释蛋白聚合物（参见，例如美国专利号6,699,504；Pelias Technologies,Inc.）；聚（丙交酯-共-乙交酯/聚乙二醇）嵌段共聚物（参见，例如美国专利号6,630,155；Atrix Laboratories,Inc.）；包含生物相容性聚合物和分散于聚合物中的金属阳离子稳定剂颗粒的组合物（参见，例如美国专利号6,379,701；Alkermes Controlled Therapeutics,Inc.）；以及微球（参见，例如美国专利号6,303,148；Octoplus,B.V.）。

适宜的口服制剂还包括活性剂与下述任意一种材料的制剂：载体如

（Emisphere Technologies,Inc.）；TIMERx，由黄原胶和刺槐豆胶组成的亲水性基质，在存在右旋糖的情况下，在水中形成强粘合剂凝胶（Penwest）；Geminex^TM（Penwest）；Procise^TM（GlaxoSmithKline）；SAVIT^TM（Mistral PharmaInc.）；RingCap^TM（Alza Corp.）；（Smartrix Technologies,Inc.）；SQZgel^TM（MacroMed,Inc.）；Geomatrix^TM（Skye Pharma,Inc.）；

Tri-layer（Alza Corporation）；等等。

适于使用的制剂还有美国专利号6,296,842（Alkermes ControlledTherapeutics,Inc.）；美国专利号6,187,330（Scios,Inc.）；等等中所描述的那些。

适于本文使用的制剂还包括肠内吸收增强剂。适宜的肠内吸收增强剂包括，但不限于，钙螯合剂（例如，柠檬酸、乙二胺四乙酸）；表面活性剂（例如，十二烷基硫酸钠、胆盐、棕榈酰肉碱、和脂肪酸的钠盐）；毒素（例如，闭合小带毒素）；等等。

控释制剂

在某些实施方式中，将活性剂制成控释制剂。

可以采用的适于使用的控释制剂是指多种延长释放制剂中的任意一种。出于本文公开的目的，可以认为下述术语与控释实质上相同：连续释放、控制释放、延迟释放、储库、逐级释放、长期释放、程序性释放、延长释放、成比例释放、拖延释放、仓库、推迟、缓慢释放、间隔释放、持续释放、定时包衣、定时释放、延时作用、延长作用、分层定时作用、长程作用、长效、重复作用、减速作用、持续作用、持续作用药物、以及延期释放。对这些术语的进一步讨论可参见Lesczek Krowczynski,Extended-Release Dosage Forms,1987(CRC Press,Inc.)。

多种控制释放技术涵盖了非常广泛的药物剂型。控制释放技术包括，但不限于物理系统和化学系统。

物理系统包括，但不限于，带有速率控制膜的储库系统，如微囊、大包囊、和膜系统；不带有速率控制膜的储库系统，如中空纤维、超微孔纤维素三乙酸酯、和多孔聚合物基质和泡沫体；单片系统，包括物理上溶于无孔、聚合、或弹性体基质（例如，非可侵蚀性、可侵蚀性、环境介质可进入的、和可降解的）中的系统，以及物理上分散于无孔、聚合、或弹性基质（例如，非可侵蚀性、可侵蚀性、环境介质可进入的、和可降解的）中的材料；层状结构，包括与外部控释层具有化学相似性或相异性的储库层；以及其它物理材料，如渗透泵、或吸附于离子交换树脂。

化学系统包括，但不限于，化学侵蚀性聚合物材料（例如，异质性、或均质性侵蚀），或生物侵蚀性聚合物材料（例如，异质性、或均质性）。针对控释系统分类的其他讨论可以参见Agis F.Kydonieus,Controlled Release Technologies:Methods,Theory and Applications,1980(CRC Press,Inc.)。

已将多种控释药物制剂开发成口服剂型。其包括，但不限于，渗透压控制胃肠道递送系统；水动力压控制胃肠道递送系统；膜渗透控制胃肠道递送系统，其包括微孔膜渗透控制胃肠道递送设备；胃液耐受性肠靶向控释胃肠道递送设备；凝胶扩散控制胃肠道递送系统；以及离子交换控制胃肠道递送系统，其包括阳离子和阴离子药物。与控释药物递送系统有关的其它信息可参见Yie W.Chien,Novel DrugDelivery Systems,1992(Marcel Dekker,Inc.)。现在将对这些制剂中的某些进行更加详细的讨论。

将肠溶性包衣应用于片剂可以阻止药物在胃内释放，既可以降低令人不悦的副作用的风险又可以维持暴露于胃环境中易于降解的药物的稳定。大部分用于此目的的聚合物为聚合酸，其功能的实施或事实上其在水性基质中的溶解度具有pH依赖性，且其溶解所需条件为pH高于正常胃内的pH值。

口服控释结构的一个典型例子为肠溶性包衣的固体或液体制剂。肠溶性包衣设计为在肠液中崩解以易于吸收。与肠溶性包衣一起整合为制剂的活性剂吸收延迟取决于转移通过胃肠道的速率，这样胃排空速率就是一个重要因素。某些研究者报道了多单元型制剂，如颗粒，可能优于单一单元型。因此，在一个示例性的实施方式中，可以将活性剂加入肠溶性包衣的多单元型制剂。在一个示例性的实施方式中，通过在惰性核材料上包覆活性剂-肠溶性包衣材料固体分散体获得喷雾包衣颗粒制备活性剂制剂。这些颗粒可以使药物吸收延迟且具有较好的生物利用度。

典型的肠溶性包衣剂包括，但不限于，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯和乙酸纤维素邻苯二甲酸酯。Akihiko Hasegawa,Application of solid dispersions of Nifedipine with entericcoating agent to prepare a sustained-release dosage form,Chem.Pharm.Bull.33:1615-1619(1985)。可以根据使从头设计的肠溶性包衣制剂的溶出时间、包衣厚度和径向压碎强度达到最佳组合的检测选择多种肠溶性包衣材料。S.C.Porter et al.,The Properties ofEnteric Tablet Coatings Made From Polyvinyl Acetate-phthalate and Cellulose acetatePhthalate,J.Pharm.Pharmacol.22:42p(1970)。

另一种类型的有效口服控释结构为固体分散。可以将固体分散定义为通过熔融（融合）、溶剂、或熔融-溶剂法将一种或多种活性成分分散于呈固态的惰性载体或基质中。Akihiko Hasegawa,Super Saturation Mechanism of Drugs from SolidDispersions with Enteric Coating Agents,Chem.Pharm.Bull.36:4941-4950(1998).还可以将固态分散称为固态分散。术语“共沉淀”也可以用于指通过溶剂法获得的制剂。

载体的选择会对分散活性剂的溶出特性造成一定影响，因为在多组分混合物中，某种组分的表面溶出速率可能受到其它成分的影响。例如，水溶性载体可以使活性剂从基质中快速释放，而水溶性较差或不溶性的载体可能导致活性剂从基质中的释放减慢。通过与载体之间的某些相互作用也可以增加活性剂的溶解度。

在固体分散剂中有用的载体的例子包括，但不限于，水溶性聚合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、和羟丙基甲基纤维素。可选的载体包括磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱是一种两性的、不溶于水的液体，其可以改善无定性状态的其它不溶性活性剂在磷脂酰胆碱固体分散剂中的溶解度。

其它载体包括聚氧乙烯氢化蓖麻油。可以将水溶性较差的活性剂加入含有肠溶性聚合物的固体分散体中，如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羧甲基乙基纤维素，以及非肠溶性聚合物，羟丙基甲基纤维素。其它固体分散剂型包括将活性剂加入按不同比例混合的乙基纤维素和硬脂酸中。

有多种制备固体分散剂的公知方法。其包括，但不限于，熔融法、溶剂法和熔融-溶剂法。

另一种控释剂型为离子交换树脂与活性剂的复合物。离子交换树脂药物复合物用于制备酸性和碱性药物的持续释放制剂。在一个示例性实施方式中，在离子交换树脂药物复合物粒子表面包覆聚合物薄膜衣，使药物从这些粒子中扩散控制释放。参见Y.Raghunathan et al.,Sustained-released drug delivery system I:Coded ion-exchange resin systems for phenylpropanolamine and other drugs,J.Pharm.Sciences 70:379-384(1981)。

可注射微球是另外一种控释剂型。可以采用非水相分离技术和喷雾干燥技术制备可注射微球。可以使用聚乳酸或共聚（乳酸/乙二醇酸）制备微球。Shigeyuki Takada,Utilization of an Amorphous Form of a Water-Soluble GPIIb/IIIaAntagonist for Controlled Release From Biodegradable Micro spheres,Pharm.Res.14:1146-1150(1997)，以及乙基纤维素，Yoshiyuki Koida,Studies on DissolutionMechanism of Drugs from Ethyl Cellulose Microcapsules,Chem.Pharm.Bull.35:1538-1545(1987)。

其它可以采用的控释技术包括，但不限于，可以从Elan PharmaceuticalTechnologies中获得的SODAS（球状口服药物吸收系统）、INDAS（不溶性药物吸收系统）、IPDAS（肠保护药物吸收系统）、MODAS（多孔口服药物吸收系统）、EFVAS（起泡药物吸收系统）、PRODAS（程控口服药物吸收系统）、和DUREDAS（双重释放药物吸收系统）。SODAS是一种利用控释小球的多粒子剂型。INDAS是设计为增加溶解性较差药物溶解度的药物递送技术家族。IPDAS一种利用高密度控释小球和立即释放颗粒组合的多粒子片剂剂型。MODAS是控释单一单元剂型。各片剂的y由内核组成，所述内核被用于控制药物释放速率的半透多孔膜包绕。EFVAS是一种起泡药物吸收系统。PRODAS是一种利用立即释放和控释袖珍片组合的多粒子制剂家族。DUREDAS是一种在一个剂型中提供双重释放速率的双层片剂。尽管这些剂型均为本领域技术人员已知的，但是现在还将对这些剂型中的某些进行更加详细的讨论。

开发INDAS主要是为了改善水溶性较差药物的溶解度和吸收特性。溶解度和特别是在胃肠道液体中的溶出度是确定水溶性较差药物总体口服生物利用度的关键因素。通过增加溶解度，可以增加药物的总体生物利用度，结果降低给药剂量。

IPDAS是一种多粒子片剂技术，其可以增加对具有潜在刺激性和致溃疡性药物的胃肠道耐受性。IPDAS制剂的多粒子性质促使对肠道的保护，其促进具有刺激性的硫辛酸分散体通过胃肠道。个体小球的控释特性可以避免在局部释放和吸收系统中活性剂浓度太高。这两种方式的组合物使活性剂的潜在损害降至最低，结果给患者带来益处。

IPDAS由多个高密度的控释小球组成。各小球均可以通过两步工艺生产，其涉及嵌入活性剂的微基质的初始生产以及随后使用聚合物溶液对该微基质进行包衣以形成在体内的限速半透膜。一旦摄入IPDAS片，其可以在胃内崩解并释放小球。这些小球随后可以进入十二指肠并沿胃肠道通行，例如，以控释和逐级释放的方法，其不依赖于进食状态。活性剂通过微基质，随后通过速率控制半透膜上的孔以扩散方式释放。可以对IPDAS片的释放速率进行定制，以递送与最佳临床益处相关的药物特定吸收特征。如果需要迅速开始释放药物活性，则可以在片剂中引入立即释放颗粒。如果个体采用滴定法时需要降低给药剂量，则可以在给药前破坏片剂，其基本上不会导致药物释放。

MODAS是一种可以用于控制水溶性试剂吸收的药物递送系统。在物理上，MODAS不是崩解片剂型，其利用体内形成的半透膜通过限速扩散的方法控制药物释放。该扩散方法基本上受胃肠液中药物存在比率的指示，这样对摄入机体的量进行控制。由于最低限度的使用赋形剂，因而MODAS更适于制备小剂量规格剂型。各MODAS片均从含有活性药物加赋形剂的核开始。使用不溶性聚合物和可溶性赋形剂的溶液对核包衣。一旦摄入该片剂，则胃肠道中的液体可以溶解外层包衣中的可溶性赋形剂，基本上留下不溶性聚合物。其结果为形成微小的网络，通过狭窄的通道使胃肠道中的液体与含水溶性药物的内部药核相接触。液体通过这些通道进入核，溶解药物，结果得到的药物溶液可以以受控方式向外扩散。该方法可以允许受控溶出和吸收。该系统的优点为片剂的药物释放孔基本上分布于整个片剂表面。其促进药物均匀吸收，降低激进的单向药物递送。MODAS是一种非常灵活的剂型，可以改变其内核和外部的半透膜，以适应药物的个体递送需求。具体地，在内核中加入辅料可能有助于在片剂中形成微环境，使得更易于预计释放和吸收速率。可以加入立即释放外层包衣以开发组合产品。

此外，还可以使用PRODAS递送活性剂。PRODAS是一种基于粒径范围以直径计为1.5至4mm的袖珍控释片产品的多粒子药物递送技术。PRODAS技术是多粒子和亲水性基质片剂方法的杂合，其可以掺入同一剂型中，以同时获得这两种药物递送系统的益处。

在其最基本的形式中，PRODAS涉及采用立即释放颗粒直接压片以生产含有活性剂的单个袖珍片剂。随后将这些袖珍片剂加入硬凝胶和代表最终剂型的胶囊剂中。这种技术更为有益的用途为生产控释制剂。在这种情况下，在颗粒中掺入多种聚合物的组合可以推迟药物从各个袖珍片剂中的释放速率。随后可以采用控释聚合物溶液对这些袖珍片剂进行包衣以提供额外的延迟释放特性。在高水溶性药物或药物可能具有胃肠道刺激的情况下附加包衣可能很有必要，其可以推迟制剂的释放直至其到达胃肠道的更远端区域。PRODAS技术的一个价值在于制剂的内在灵活性，可以将不同释放速率的袖珍片剂组合加入一个剂型中。不但使在一个特定时间段内允许控制吸收成为可能，其还可以允许在胃肠道的特定吸收部位靶向递送药物。还可能使用不同活性成分的袖珍片剂制备组合产品。

DUREDAS是一种可以用于活性剂制剂的双层压片技术。研发DUREDAS以提供两种不同的释放速率，或者在一个剂型中使某种药物双重释放。术语双层是指在压片过程中发生了两个单独的直接压片事件。在一个示例性的实施方式中，首先立即释放颗粒被压片，随后加入控释成分，再将其压制在该初始片剂上。其可以在最终制剂中引入双层特性。

可以利用亲水性聚合物的组合提供控释性质。在某些情况下，可能需要活性剂的迅速释放，以便于治疗迅速起效。因此可以将片剂的一层制成立即释放粒子。而相反的，片剂的另一层可以以控释方法释放药物，例如通过使用亲水性聚合物。这种控释可以通过利用亲水性聚合物基质造成的扩散和侵蚀的组合获得。

DUREDAS技术的进一步扩展为生产控释组合制剂。在这个例子中，可以将两种不同的活性剂加入双层片中并从各层控制释放药物，以使得其组合达到最大疗效。

可以将活性剂加入上述任意控释剂型或其它常规剂型之一。可以对各制剂中活性剂的含量进行调整，以使其符合各位患者和适应症的需要。本领域技术人员在阅读本文公开的内容后能够很容易知晓如何调整活性剂的水平以及控释制剂的释放速率以优化活性剂的递送及其生物利用度。

吸入制剂

在某些实施方式中，活性剂通过吸入途径的药物递送系统给予患者。可以将活性剂制成适宜通过吸入给药的剂型。吸入途径给药的优点为吸入药物能够绕过血脑屏障。所述药物递送系统是一种适于通过将活性剂递送至支气管内衬的呼吸治疗的系统。可以通过依赖于加压气体的动力将活性剂从容器中排出的系统递送活性剂。气雾剂或加压包装均可以用于此目的。

如本文所使用的，术语“气雾剂”使用的是其常规含义，指在压力下抛射气体将极细液体或固体粒子负载至治疗应用部位。当本发明中使用药用气雾剂时，气雾剂中含有活性剂，其可以溶解、悬浮、或乳化于液体载体和抛射剂的混合物中。气雾剂可以被制成溶液剂、混悬剂、乳剂、粉剂、或半固体制剂。在本发明中使用气雾剂的目的是为了通过呼吸道将细微的、固体粒子或雾状液体给予患者。本领域技术人员已知的多种类型的抛射剂均可以使用。适宜的抛射剂包括，但不限于，烃或其它适宜气体。在加压气雾剂中，通过递送的计量值可以确定剂量单位。

还可以将活性剂制成通过喷雾器递送，这种仪器能够在气体中产生粒径基本均一的极细液体粒子。例如，含有活性剂的液体分散成小液滴。气流可以负载小液滴通过喷雾器的出口管。得到的水雾弥漫进入患者的呼吸道。

可以将含有活性剂，含有或不含润滑剂、载体、或抛射剂的粉末组合物给予需要治疗的哺乳动物。该实施方式可以通过对吸入给予的粉状药物组合物给药的常规设备实施。例如，活性剂和基于，如乳糖或淀粉，的适宜粉末的粉末混合物可以存在于，例如胶囊或药筒例如明胶或水泡眼包装的单元剂型中，通过吸入器的协助对粉末进行给予。

有若干种不同类型的吸收方法，其均可以用于本发明中。基本上可以将活性剂制成三种不同类型的吸入制剂。首先，活性剂可以与低沸点的抛射剂进行配制。此类制剂通常使用常规的定量吸入器（MDI）给予。但是，可以对常规MDI进行改进，以通过利用如美国专利5,404,871和5,542,410中所讨论的测定患者吸气体积和流速的技术增加重复给药的能力。

可选地，可以将活性剂制成水性或醇溶液并通过常规喷雾器递送。在某些实施方式中，此类溶液制剂采用如美国专利5,497,763；5,544,646；5,718,222；和5,660,166中公开的设备和系统喷雾。

可以将活性剂制成干粉制剂。可以通过将粉末制成烟雾后简单吸入该干粉制剂的方式给予此类制剂。1998年7月7日发布的美国专利5,775,320和1998年4月21日发布的美国专利5,740,794描述了实施这种方式的技术。

剂量

尽管剂量将根据所要达到的临床目的而改变，但是适宜的剂量范围为含有至多约1μg至约1,000μg或约10,000μg的活性制剂，且其可以单剂量给予。可选地，可以将活性剂的目标剂量大致确定为在给予试剂后的最初24-48小时宿主血液样品中约0.1-1000μM、约0.5-500μM、约1-100μM、或约5-50μM的范围。

本领域技术人员容易理解剂量水平可以根据特定化合物的功能、症状的严重程度和对象对副作用的敏感性而改变。本领域技术人员可以通过多种方法容易地确定给定化合物的优选剂量。

给药途径

可以采用任意可用的方法和适于药物递送的途径给予个体活性剂，包括体内和离体方法，以及全身和局部给药途径。

常规的和药学上可接受的给药途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、真皮、局部应用、静脉、直肠、鼻用、口服和其它肠内以及胃肠外给药途径。可以对给药途径进行组合，如有需要，或根据试剂和/或目标作用进行调整。活性剂可以单剂量或多剂量给药。在某些实施方式中，活性剂口服给药。在其它特定实施方式中，活性剂通过吸入途径给药。在某些实施方式中，活性剂鼻内给药。

可以采用任意可用的常规方法以及递送常规药物的适宜途径给予宿主活性剂，包括全身或局部途径。一般而言，本发明关注的给药途径包括，但不仅限于，肠内、非胃肠道、和吸入途径。

吸入给药以外的非胃肠道给药途径包括，但不仅限于，局部、透皮、皮下、肌内、眼眶内、囊内、脊椎内、胸骨内、和静脉途径，即通过消化道以外的任意其它途径给药。进行非胃肠道给药可以实现向全身或局部递送试剂。当需要全身递送时，典型的给药方式包括药物制剂侵袭性或全身吸收的局部或粘膜给药。

活性剂还可以通过肠内给药向对象递送。肠内给药途径包括，但不仅限于，口服和直肠（例如，使用栓剂）递送。

通过皮肤或粘膜给予活性剂的方法包括，但不仅限于，适宜药物制剂的局部应用、透皮输送、注射和表皮给药。对于透皮输送而言，吸收促进剂或离子导入法是适宜方法。离子导入法输送可以通过采用可商品化购得的“贴片”完成，其可以在若干天或更长时间段内通过电脉冲将其产品连续的递送通过未破损的皮肤。

由于治疗意味着至少改善折磨宿主的病理状况相关的症状，其中改善使用的是其广义上的含义，指至少是参数强度上的降低，例如与所治疗的病理状况相关的症状，如Tau病变。这样，治疗还包括病理状况或至少是与其相关的症状完全抑制，例如阻止其发生、或停止的情况，例如终止，以致于宿主无需再忍受病理状况，或者至少是病理状况的特征性症状。

多种对象（其中术语“对象”在本文中可以替换为术语“个体”、“宿主”、和“患者”）是依据本主题方法可治疗的。一般而言此类对象是“哺乳动物”或“哺乳动物的”，其中这些术语用于概括地描述分类为哺乳类的有机体，包括食肉动物目（例如，犬和猫）、啮齿目（例如，小鼠、豚鼠、和大鼠）、以及灵长目（例如，人、黑猩猩、和猴）。在多个实施方式中，对象将是人。

治疗的适用对象

适于使用主题治疗方法治疗的个体包括已被诊断为Tau病变的个体；出现Tau病变、已使用本文讨论的试剂以外的其它试剂治疗且对此类治疗无应答或开始有应答但随后复发的个体。

诊断方法

本文提供了一种诊断个体认知损伤病症的方法。该方法通常包括检测来自个体生物样本中的乙酰化Tau多肽水平。当乙酰化Tau多肽水平高于正常对照的水平时，提示个体出现认知损伤病症。本发明还提供了一种确定个体将发展成认知损伤病症的风险的方法。该方法通常包括检测来自个体生物样本中的乙酰化Tau多肽水平。当乙酰化Tau多肽水平高于正常对照的水平时，提示个体发展成认知损伤病症的风险高于正常人群。

与正常对照水平相比，生物样品中（例如，包含神经元细胞和/或神经胶质细胞的生物样品；源自神经元细胞和/或神经胶质细胞（例如，神经元细胞裂解物；神经胶质细胞裂解物）的生物样品；等等）乙酰化Tau多肽的水平至少升高约10%、至少升高约15%、至少升高约20%、至少升高约25%、至少升高约50%、至少升高约2倍、至少升高约5倍、至少升高约10倍、或升高10倍以上时，提示获得生物样品的个体患有认知损伤病变比一般人群的风险要高。

轻度认知损伤（MCI，也称为早期痴呆，或孤立的记忆损伤）是对认知损伤已超出其年龄和受教育程度但未对日常活动造成明显干扰的个体的诊断。MCI被认为是正常衰老和痴呆之间的界限或过渡阶段。尽管MCI可能存在多种症状，但是当记忆丧失为主要症状时，将其称为“健忘性MCT”，通常将其看成是阿尔茨海默氏症的风险因素。研究提示患有健忘性MCI的个体可能发展成阿尔茨海默氏症的比率为每年约10%至15%。此外，当个体在记忆以外的区域出现损伤时将其分类为非健忘性单区域或多区域MCI，据信这些个体更加可能转化为其它痴呆（例如，路易氏体痴呆）。

由于MCI是阿尔茨海默氏症的风险因素，因而对MCI的诊断指引对早期阿尔茨海默氏症的诊断。对MCI的诊断需要相当多的临床判断，和广泛的临床评估，包括临床观察、神经影像、血液检测和神经心理学。当Ac-Tau多肽的水平高于正常对照的水平时，提示个体出现认知损伤病症。这样，对Ac-Tau多肽的检测可以用于检测和诊断MCI和Tau病变，如阿尔茨海默氏病。

可以采用特异性针对Ac-Tau的试剂确定Ac-Tau多肽的水平，如识别乙酰化Tau但不识别非乙酰化Tau多肽的抗体（例如，下文所述的抗-Ac-Tau：Ab708）。可以采用标准的免疫学方法生产Ac-Tau特异性抗体。例如，可以使用在一个或多个赖氨酸残基（例如，Tau亚型2的Lys-163、和/或Lys-174、和/或Lys-190）乙酰化的Tau多肽免疫适宜的宿主动物（例如，家兔、山羊、绵羊等）。在第二次加强免疫约10天后，可以采用ELISA法确定抗体滴度。通常两次加强免疫后就足以获得较高的抗体滴度。

可采用多种生物样品用于检测Ac-Tau水平。例如，脑脊液、血浆、血清、尿液、脑组织活检样品均可以用于确定个体中的Ac-Tau水平。在收集样品时或收集样品后可以在获得的样品中加入酶抑制剂以防止Tau蛋白改变（碎裂、脱磷酸化、脱乙酰化等）或样品中的血液凝结。可以利用的酶抑制剂包括：磷酸酶抑制剂，如EDTA、EGTA、冈田酸、焦磷酸、磷酸盐、氟化钠、β-甘油磷酸、和环孢素A；以及蛋白酶抑制剂，如抑肽酶、抗痛素、胃酶抑素、亮肽素、EDTA、EGTA、PMSF（苯甲基磺酰氟）、和TLCK（甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基化酮）。可以获得样品并立刻检测或者也可以在测定Ac-Tau水平前将其贮存。样品可以保存在例如4°C或以下例如-20°C或以下。

将年龄匹配的非痴呆个体的相应生物样品例如认知能力正常的个体作为对照。此外，可以参考归一化对照对Ac-Tau的水平进行归一化，例如已知存在水平在MCI患者和正常个体之间具有可比性的蛋白，如GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、HPRT1（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶-1）。

可以使用抗-Ac-Tau抗体检测Ac-Tau水平，例如在免疫检测中，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射性免疫检测（RIA）、蛋白印迹（Western印迹）检测等。在示例性的实施方式中，可以使用三明治ELISA。如果采用三明治ELISA法或类似方法测定Ac-Tau蛋白，则与Ac-Tau蛋白特异性抗体联合使用的抗体为能够识别任意亚型和乙酰化状态的Tau蛋白抗体（在下文中，也将其称为“非特异性抗-Tau蛋白抗体”）。非特异性抗-Tau蛋白抗体的特定例子包括抗-Tau蛋白单克隆抗体HT7（与Tau蛋白的氨基酸159-163结合）和BT2（与Tau蛋白的氨基酸193-198结合），其均可以从Innogenetics商品化购得。

筛选方法

本发明公开了一种用于鉴别适于治疗Tau病变的候选试剂的方法。该主题筛选方法通常为体外方法，其可以在体外细胞中实施，也可以在体外无细胞检测系统中实施。

在某些情况下，该方法涉及：a）将样品与待测试剂接触，其中样品包含：i）使乙酰化Tau脱乙酰化的酶；和ii）乙酰化Tau多肽；和b）确定待测试剂对Tau多肽乙酰化程度的影响。增加Tau多肽脱乙酰化的待测试剂是用于治疗Tau病变的候选试剂。该方法可以在体外基于细胞的检测中实施，例如使用产生使乙酰化的Tau脱乙酰化的酶的细胞和乙酰化的Tau多肽，其中该方法包括将细胞与待测试剂接触。该方法可以在体外无细胞检测系统中实施，例如在无细胞系统中将使乙酰化的Tau脱乙酰化的酶和乙酰化的Tau多肽与待测试剂接触。

在其它情况下，该方法涉及：a）将样品与待测试剂接触，其中样品包含：i）使Tau多肽乙酰化的酶；和ii）非乙酰化Tau多肽；和b）确定试剂对Tau多肽乙酰化程度的影响。抑制Tau多肽乙酰化的待测试剂是用于治疗Tau病变的候选试剂。该方法可以在体外基于细胞的检测中实施，例如使用产生使Tau多肽乙酰化的酶的细胞和非乙酰化Tau多肽，其中该方法包括将细胞与待测试剂接触。该方法可以在体外无细胞检测系统中实施，例如在无细胞系统中将使Tau乙酰化的酶和非乙酰化Tau多肽与待测试剂接触。

该主题筛选方法通常包括适宜的对照，例如无待测试剂的对照样品。通常将多个检测混合物平行地与不同试剂浓度进行检测，以获得对多个浓度的不同应答。典型地，将这些浓度之一作为阴性对照，即零浓度或低于检测水平。

在筛选检测中还可以包括多种其它试剂。其包括试剂如盐、中性蛋白例如白蛋白、去垢剂等，其用于促进达到最佳的蛋白-蛋白结合和/或降低非特异性或背景相互作用。可以使用增强检测效率的试剂，如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌剂等。检测混合物的成分可以产生必要的结合或其它活性的任意顺序加入。孵育可以在任意适宜温度下进行，典型地在4C至40C之间。对孵育时间进行选择以达到最佳活性，但也可以优化从而有助于进行快速的高通量筛选。通常在0.1至1小时之间就足够了。

如本文所使用的，术语“确定”指定量和定性测定，这样术语“确定”在此处可以与“测定”、“检测”等互换使用。

术语“候选试剂”、“待测试剂”、“试剂”、“物质”和“化合物”在本文可以互换使用。候选试剂包含多种化学类别，包括合成的、半合成的、和天然存在的无机或有机分子。候选试剂包含在大型合成或天然化合物库中发现的那些试剂。例如，从Maybridge Chemical Co.（Trevillet,Cornwall,UK）、ComGenex（SouthSan Francisco,CA）、和MicroSource（New Milford,CT）商品化购得的合成化合物库。少数化学库是从Aldrich（Milwaukee,Wis.）获得的，且也可以使用。可选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物文库从Pan Labs（Bothell,WA）获得或者是易于生产的。

候选试剂可以是分子量高于50道尔顿且低于约2,500道尔顿的有机或无机小分子化合物。候选试剂可以包含与蛋白结构相互作用所必需的官能团，例如氢键，以及至少可以包含胺、羰基、羟基或羧基，以及可以包含至少两个化学官能团。候选试剂可以包含取代上述官能团中的一个或多个的环状碳或杂环结构和/或芳香或聚芳香结构。候选试剂还可以在生物分子包括肽、糖类、脂肪酸、甾类、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合中寻找。

待测试剂可以是小分子。待测分子可以是挑选的单个小分子或者在某些情况下，小分子待测试剂是从组合文库中被筛选出来的，即通过化学合成或生物合成将多个化学“构造块”组合生产出的多种多样化学化合物的集合。例如，线性组合化学文库如多肽文库通过将一系列称之为氨基酸的化学构造块在给定化合物长度条件下（即，多肽化合物中的氨基酸数目）利用每种可能途径组合形成。通过将化学构造块进行此类组合混合能够合成数百万的化学化合物。的确，理论上将100个可互换的化学构造块全部组合混合结果能够合成1亿个四聚体化合物或100亿个五聚体化合物。参见，例如，Gallop et al.,(1994),J.Med.Chem.,37(9),1233-1251。制备和筛选组合化学文库是本领域所熟知的。组合化学文库包括，但不限于：diversomers如乙内酰脲、苯二氮卓类、和二肽，如例如Hobbs et al.,(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:6909-6913中所描述的；小化合物文库的类似物有机合成，如Chen et al.,(1994),J.Amer.Chem.Soc.,116:2661-2662中所描述的；寡聚氨基甲酸酯，如Cho,et al.,(1993),Science,261:1303-1305中所描述的；肽基磷酸酯，如Campbell et al.,(1994),J.Org.Chem.,59:658-660中所描述的；以及含有例如噻唑啉酮和metathiazanone（美国专利号5,549,974）、吡咯烷（美国专利号5,525,735和5,519,134）、苯二氮卓类（美国专利号5,288,514）的小有机分子库。

多种组合文库可以从例如ComGenex（Princeton,N.J.）；Asinex（Moscow,Russia）；Tripos,Inc.（St.Louis,Mo.）；ChemStar,Ltd.（Moscow,Russia）；3D Pharmaceuticals（Exton,Pa.）；和Martek Biosciences（Columbia,MD）商业获得。

基于细胞的体外检测

如上文所述，在某些实施方式中，该主题筛选方法是基于细胞的体外检测。如上文所述，在某些实施方式中，该主题筛选方法包括将产生脱乙酰基酶的细胞和乙酰化Tau多肽与待测试剂接触；确定待测试剂在细胞中对Ac-Tau多肽水平的影响。如上文所述，在某些实施方式中，该主题筛选方法包括将产生使Tau多肽乙酰化的酶的细胞和非乙酰化Tau多肽与待测试剂接触；确定待测试剂在细胞中对Ac-Tau多肽水平的影响。

当与不含待测试剂时细胞内的乙酰化Tau多肽水平相比，待测试剂使细胞内的乙酰化Tau水平降低至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上时，认为其可以作为治疗Tau病变的候选试剂。

可以使用多种不同类型的细胞，例如，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）；原代神经元培养物如皮层神经元；神经元细胞系（例如，永生化神经元细胞系）；等等。在某些情况下，采用原代神经元培养物进行筛选，其中神经元来自人类捐赠者、非人灵长类动物、啮齿类动物等。在可选的实施方式中，神经元通过胚胎干细胞、或神经元细胞系，如PC12、或神经母细胞瘤细胞系等的分化获得。

适宜的细胞系包括，但不限于，人神经胶质瘤细胞系，例如SVGp12（ATCC CRL-8621）、CCF-STTG1（ATCC CRL-1718）、SW 1088（ATCC HTB-12）、SW 1783（ATCC HTB-13）、LLN-18（ATCC CRL-2610）、LNZTA3WT4（ATCC CRL-11543）、LNZTA3WT11（ATCC CRL-11544）、U-138MG（ATCCHTB-16）、U-87MG（ATCC HTB-14）、H4（ATCC HTB-148）、和LN-229（ATCCCRL-2611）；人成神经管细胞瘤衍生细胞系，例如D342Med（ATCC HTB-187）、Daoy（ATCC HTB-186）、D283Med（ATCC HTB-185）；人肿瘤衍生神经元样细胞，例如PFSK-1（ATCC CRL-2060）、SK-N-DZ（ATCCCRL-2149）、SK-N-AS（ATCC CRL-2137）、SK-N-FI（ATCC CRL-2142）、IMR-32（ATCC CCL-127），等等；小鼠神经元细胞系，例如BC3H1（ATCC CRL-1443）、EOC1（ATCC CRL-2467）、C8-D30（ATCC CRL-2534）、C8-S（ATCC CRL-2535）、Neuro-2a（ATCCCCL-131）、NB41A3（ATCC CCL-147）、SW10（ATCC CRL-2766）、NG108-15（ATCC HB-12317）；大鼠神经元细胞系，例如PC-12（ATCC CRL-1721）、CTXTNA2（ATCC CRL-2006）、C6（ATCC CCL-107）、F98（ATCC CRL-2397）、RG2（ATCC CRL-2433）、B35（ATCC CRL-2754）、R3（ATCC CRL-2764）、SCP（ATCC CRL-1700）、OA1（ATCC CRL-6538）。

脱乙酰基酶、乙酰基转移酶、和Tau（乙酰化或非乙酰化）中的一种或多种对筛选中使用的细胞可以是内源性的。在某些实施方式中，脱乙酰基酶、乙酰基转移酶、和Tau（乙酰化或非乙酰化）中的一种或多种是外源性的，例如通过采用包含编码一种或多种多肽的核苷酸序列的核酸（例如，表达构建）对宿主细胞进行遗传修饰；将经遗传修饰的宿主细胞与待测试剂接触。当外源性提供时，脱乙酰基酶可以是已知的将Ac-Tau脱乙酰化的脱乙酰基酶，以及乙酰基转移酶可以是已知的使非乙酰化的Tau乙酰化从而生成Ac-Tau的乙酰基转移酶。

在某些实施方式中，乙酰基转移酶是p300多肽（mRNA GenBank登录号：NM_001429.3，蛋白GenBank登录号N_ 001420.2）。在某些情况下，将包含编码p300多肽的核苷酸序列的核酸（例如，表达构建子）引入宿主细胞，其中编码p300多肽的核苷酸序列使Tau多肽乙酰化，且其包含与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列中约1800个至约2000个、约2000个至约2200个、或约2200个至约2414个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。在这些实施方式中，宿主细胞被p300多肽-编码表达构建子遗传性修饰。

在某些情况下，将包含编码脱乙酰基酶核苷酸序列的核酸（例如，表达构建子）引入宿主细胞，其中核苷酸序列编码SIRT1多肽，所述多肽i）使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化和ii）包含与SEQ ID NO:9（GenBank AAH12499；智人SIRT1）所示氨基酸序列中约400个至约450个、或约450个至约555个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码SIRT1多肽，所述多肽i）使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化和ii）包含与SEQ ID NO:10（GenBankNP_036370；智人SIRT1亚型a）所示氨基酸序列中由约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约747个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码SIRT1多肽，所述多肽i）使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化和ii）包含与SEQ ID NO:11（GenBank NP_001135970；智人SIRT1亚型b）所示氨基酸序列中由约300个至约400个、或约400个至约452个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。在这些实施方式中，宿主细胞被SIRT1多肽编码表达构建子遗传性修饰。

在某些情况下，将包含编码Tau多肽的核苷酸序列的核酸（例如，表达构建子）引入细胞，其中编码Tau多肽的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:1-6所示任意一个氨基酸序列中约350个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码的Tau多肽包含与SEQ ID NO:2（智人Tau亚型3）所示氨基酸序列中约350个至约383个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码的Tau多肽包含与SEQ IDNO:4（智人Tau亚型5）所示氨基酸序列中由约350个至约412个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码的Tau多肽包含与SEQ ID NO:1（智人Tau亚型2）所示氨基酸序列中由约350个至约400个、或约400个至约441个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码的Tau多肽包含与SEQ ID NO:5（智人Tau亚型1）所示氨基酸序列中由约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约758个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或其中核苷酸序列编码的Tau多肽包含与SEQ IDNO:6（智人Tau亚型6）所示氨基酸序列中由约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约776个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

编码例如乙酰基转移酶（例如，p300多肽）、和/或Tau多肽、和/或脱乙酰基酶（例如，SIRT1多肽）的核苷酸序列可以引入适宜的表达载体。将表达载体引入适宜的宿主细胞。表达载体通常在启动子序列附近具有常规的限制性位点，以供多核苷酸序列嵌入。可以制备包含转录起始区、编码多肽的核苷酸序列（例如，乙酰基转移酶（例如，p300多肽）、Tau多肽、或脱乙酰基酶（例如，SIRT1多肽））、和转录终止区的转录盒。可以将转录盒引入多种载体，例如质粒；逆转录病毒，例如慢病毒；腺病毒；等等。其中载体能够瞬时或稳定地维持于细胞中，通常维持时间至少约一天，更通常维持时间至少约数天至数周。

Tau多肽可以是融合蛋白，例如包含Tau和融合伴侣的多肽。适宜的融合伴侣包括增强体内稳定性（例如，延长在血清中的半衰期）；使易于纯化，例如(His)n，例如6His等；使融合蛋白从细胞中分泌；提供表位标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、红细胞凝集素（HA；例如CYPYDVPDYA；SEQ ID NO:18）、FLAG（例如，DYKDDDDK；SEQ ID NO:19）、c-myc（例如，CEQKLISEEDL；SEQ IDNO:20）等；提供可检测信号，例如产生可检测产物的酶（例如，β-半乳糖苷酶，荧光素酶），或其自身可检测的蛋白，例如绿色荧光蛋白等；提供多聚化，例如多聚化结构域，如免疫球蛋白的Fc部分的肽和多肽等。

多种产生表达构建子的操作可以在体外实施或者可以在适当的宿主细胞例如大肠杆菌（Escherichia coli）中进行。各次操作后，结果得到的构建子可以被克隆，将载体分类，对DNA进行筛选或测序以确保构建子的正确性。可以通过限制性分析、测序等方法对序列进行筛选。

确定待测试剂的作用一般通过确定细胞内乙酰化Tau多肽的水平实现。可以采用针对Ac-Tau的特异性抗-Ac-Tau抗体（“抗-Ac-Tau抗体”）检测Ac-Tau水平，例如，在免疫检测中，如ELISA、RIA、蛋白印迹（Western印迹）等。抗-Ac-Tau抗体可以包含可检测标记，可以通过检测所述标记确定抗-Ac-Tau抗体与乙酰化Tau的结合情况。可选地，可以采用与抗-Ac-Tau抗体结合的可检测的标记二抗对抗-Ac-Tau抗体与乙酰化Tau的结合情况进行检测。可以将细胞在包含放射性标记乙酰化供体化合物的液体培养基中培养，这样细胞的任何乙酰化Tau产物均包含放射性标记的乙酰基，通过检测放射性标记的乙酰化Tau就可以确定乙酰化Tau的水平。可以在完整的细胞中，或细胞裂解产物中，或使用从细胞中分离的Ac-Tau检测Ac-Tau的水平。

无细胞体外检测

如上文所述，在某些实施方式中，在体外无细胞检测系统中实施该主题筛选方法。如上文所述，在某些实施方式中，该主题筛选方法涉及i）使乙酰化Tau脱乙酰化的酶；和ii）乙酰化的Tau多肽与待测试剂在无细胞系统中接触。如上文所述，在某些实施方式中，该主题筛选方法包括i）使Tau多肽乙酰化的酶；和ii）非-乙酰化的Tau多肽与待测试剂在无细胞系统中接触。

可以纯化使用的多肽（例如，使乙酰化的Tau脱乙酰化的酶和乙酰化的Tau多肽；或使Tau多肽乙酰化的酶和非乙酰化的Tau多肽），例如其中多肽的纯度为至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、或至少约99%，例如不含其它大分子和/或杂质。可以通过重组法生产多肽，然后再进行纯化；可以从天然来源的多肽中纯化多肽；或者多肽可以是合成的（例如，使用无细胞化学合成法）。

与不含待测试剂时乙酰化Tau多肽水平相比，待测试剂使乙酰化Tau水平降低至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、或80%以上的认为其是治疗Tau病变的候选试剂。

使乙酰化Tau脱乙酰化的适宜的酶如上文所述。例如，适宜的酶是在神经元细胞中使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽，其包含与SEQ ID NO:9（GenBankAAH12499；智人SIRT1）所示氨基酸序列中约400个至约450个、或约450个至约555个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者是在神经元细胞中使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽，且其包含与SEQ ID NO:10（GenBank NP_036370；智人SIRT1亚型a）所示氨基酸序列中约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约747个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者是在神经元细胞中使乙酰化的Tau多肽脱乙酰化的多肽，且其包含与SEQ ID NO:11（GenBank NP_001135970；智人SIRT1亚型b）所示氨基酸序列中约300个至约400个、或约400个至约452个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

使Tau多肽乙酰化的适宜的酶包括乙酰化Tau的乙酰基转移酶，其包含与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列中约1800个至约2000个、约2000个至约2200个、或约2200个至约2414个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列。

适宜的Tau多肽包括包含与SEQ ID NO:1-6所示的任意一个氨基酸序列中约350个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者包含与SEQ ID NO:2（智人Tau亚型3）所示氨基酸序列中约350个至约383个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者包含与SEQ ID NO:4（智人Tau亚型5）所示氨基酸序列中约350个至约412个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者包含与SEQ IDNO:1（智人Tau亚型2）所示氨基酸序列中约350个至约400个、或约400个至约441个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者包含与SEQ ID NO:5（智人Tau亚型1）所示氨基酸序列中约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约758个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列；或者包含与SEQ IDNO:6（智人Tau亚型6）所示氨基酸序列中约350个至约400个、约400个至约500个、约500个至约600个、约600个至约700个、或约700个至约776个连接的氨基酸组成的氨基酸序列具有至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性的氨基酸序列的多肽。

乙酰化的Tau多肽可以通过重组法生成，例如在神经元细胞系中生成Tau多肽和使Tau多肽乙酰化的酶。乙酰化的Tau多肽还可以通过在体外使非乙酰化的Tau多肽进行化学乙酰化的方法生成。

确定待测试剂的作用一般通过确定乙酰化Tau多肽的水平实现。可以采用针对Ac-Tau的特异性抗-Ac-Tau抗体（“抗-Ac-Tau抗体”）检测Ac-Tau水平，例如，在免疫检测中，如ELISA、RIA、蛋白印迹（Western印迹）等。抗-Ac-Tau抗体可以包含可检测标记，可以通过检测该标记确定抗-Ac-Tau抗体与乙酰化Tau的结合情况。可选地，可以采用与抗-Ac-Tau抗体结合的可检测的标记二抗对抗-Ac-Tau抗体与乙酰化Tau的结合情况进行检测。在某些实施方式中，乙酰化的Tau多肽通过在包含放射性标记乙酰基供体的液态培养基中培养的细胞生成，从而使细胞生产的乙酰化Tau包含一个、两个、三个、或更多个放射性标记的乙酰基。在这些情况下的测定步骤可以通过测定放射活性标记的Tau多肽的量实现。

体内筛选

可以在体内神经元和/或神经胶质细胞中对经上文所述的体外筛选检测鉴定的候选试剂降低Ac-Tau多肽水平的能力进行检测。可选地，可以在体内对降低Ac-Tau多肽水平的待测试剂进行评估。

可以使用认知损伤的非人类模型对待测试剂进行筛选以便对降低Ac-Tau多肽水平的候选试剂进行鉴定。示例性的非人类模型包括阿尔茨海默氏症的转基因动物模型；过表达人类Tau的转基因动物模型，表现为认知损伤和/或Tau-阳性神经纤维缠结的转基因动物模型。多种此类非人类动物模型是本领域已知的。转基因非人类动物模型指含有与人神经退行性疾病如Tau病变有关的转基因的非人类动物（例如，啮齿类动物），其表现为痴呆，如阿尔茨海默氏症，包括下述示例性的非人类转基因动物：LID小鼠（Yakar S,et al,1999,Proc Natl Acad Sci USA 96;7324-7329），携带早老蛋白和β-淀粉样蛋白突变的转基因动物（Hock B J,Jr,Lamb B T,2001,Trends Genet 17:S7-12），携带其它突变和改变的动物（US20030229907，患有进行性神经疾病的转基因非人类哺乳动物；US20030145343，表达人p25的转基因动物；US20030131364，带有已调节表型的转基因动物模型的生产方法及由此方法生产出的动物；US20030101467，阿尔茨海默氏症转基因动物模型；US200030093822，神经退行性疾病转基因动物模型；U.S.专利号6,717.031，选择阿尔茨海默氏症转基因小鼠模型的方法；U.S.专利号6,593,512，表达人Tau基因的转基因小鼠；U.S.专利号6,563.015，表达突变人APP和形成刚果红染色斑的转基因小鼠；U.S.专利号6.455,757，表达人APP和TGF-β且出现脑血管淀粉样沉淀的转基因小鼠；U.S.专利号6.452,065，在天然早老蛋白1空白背景下表达非天然野生型和家族性阿尔茨海默氏症突变早老蛋白1蛋白的转基因小鼠；W003053136，阿尔茨海默氏症的三重转基因模型：WO03046172。一般而言，Ac-Tau和/或Tau高于正常水平的任意Tau病变动物模型均可用于体内筛选检测，以鉴定使Tau和/或Ac-Tau水平降低的化合物。

除了用于确定在非人类动物模型中存在的Ac-Tau水平以外，这些非人类动物模型还可以用于评估通过体外筛选方法确定的候选试剂的效能。可以在MCI动物模型中对候选试剂的效能进行检测，例如，通过评估Tau病变相关症状的改善，如认知。

实施例

提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不应限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有和仅有的实验。努力保证所用数值（例如，数量、温度等）的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度以摄氏度为单位，以及压力是大气压或接近大气压。可采用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹腔内；s.c.，皮下；wt，野生型；等等。

实施例1：Tau的乙酰化反应抑制其降解并促进Tau病变

实验程序

化学药品和试剂

C646来自Chembridge（San Diego,CA）。C37（C646的无活性类似物）是合成得到的。EX527（Tocris Bioscience,Ellisville,MO）、白藜芦醇（EMDChemicals,Gibbstown,NJ）、MG-132（Sigma,St.Louis,MO）、环己酰亚胺（Sigma）、Aβ42肽（rPeptide,Bogart,GA）、和重组Tau（rPeptide）均购买获得。Aβ42寡聚物如Chen et al.(2005)J.Biol.Chem.280:40364中所描述的方法制备。

一抗

两只家兔的多克隆抗-ac-tau抗血清是针对两个乙酰化的Tau肽产生的（Abgent,San Diego,CA）。PHF1抗体是赠送得到的。将其它抗体制成所示浓度使用：Tau 5（1:5000；Abcam,Cambridge,MA）、抗-p300（1:500；Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA）、抗-GAPDH（1:10000；Sigma）、抗-微管蛋白（1:10000；Sigma）、抗-FLAG（1:2000；Sigma）、用于p-tau的AT8（1:500；Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL）、抗-Sir2（1:2000；Millipore,Billerica,MA）、抗-红细胞凝集素（抗-HA）（1:1000；Cell Signaling Technology,Danvers,MA）。二抗：过氧化物酶连接的山羊抗-家兔和抗-小鼠IgG（1:2000；GE Healthcare,Piscataway,NJ）。

表达质粒

在HEK293T细胞中表达时，将编码hTauwt、hTau2KR（K174R、K180R）、hTau3KR（K163R、K174R、K180R）、p300、SIRT1、H363Y（SIRT1）、SIRT2、HDAC5、HDAC6、和HA-泛素的cDNA克隆进入pcDNA3.1载体（Invitrogen）。在细菌中表达蛋白时，将hTauwt cDNA克隆进入pGEX4T-1载体，以供GST-融合蛋白表达。在原代神经元中表达时，将编码hTauwt、hTau3KR、hTauP301、和cre重组酶的cDNA克隆进入慢病毒FUGW载体。

小鼠

所有涉及动物的程序均符合加利福尼亚大学（San Francisco）动物饲养和使用委员会的规定。PS19小鼠来自Jackson Laboratory（Bar Harbor,ME）。hT-PAC-N细胞系是赠送得到的。SIRT-空白和SIRT1^F/F小鼠由Fred Alt（Harvard MedicalSchool）提供。

细胞培养和瞬时转染

HEK293T细胞和MEF置于37°C条件下，在添加了10%胎牛血清、100U/ml青霉素、和100μg/ml链霉素的经Dulbecco改良的Eagles培养基（DMEM）中培养。为了获得过表达，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染。对于siRNA寡核苷酸转染而言，将HEK 293T细胞以1x10⁵个细胞/孔的密度接种于12-孔培养板中。12h后，按照生产厂商提供的方案，使用10nM ON-TARGETplus SMARTpool siRNA（Thermo Scientific-Dharmacon,Chicago,IL）和Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Invitrogen）对细胞进行转染。使用SIRT1 siRNA（L-094699-01）、SIRT2 siRNA（L-004826-00）、HDAC6 siRNA（L-003499-00）、p300 siRNA（L-003486-00）、和PCAF siRNA（L-005055-00）靶向特异性细胞基因；使用siControl Non-TargetingsiRNA#1（Dharmacon）作为阴性对照。siRNA转染约48h后，将质粒pcDNA3.1-hTauwt转入相同的培养板。24h后收集细胞用于实时RT-PCR或western印迹分析。

原代神经元培养和慢病毒感染

利用Sprague-Dawley大鼠幼崽（Charles River Laboratories）或出生后0或1天SIRT1^F/F小鼠的皮层制备原代培养物。将纯化细胞以160,000个细胞/ml的密度接种于含添加了B27（Invitrogen）的神经细胞培养基且包被了聚鸟氨酸的培养皿中。除另有说明外，否则所有处置均在7-13DIV于添加了N2（Invitrogen）的神经细胞培养基中进行。

按照上文中Chen et al.(2005)所描述的，生成、纯化慢病毒，并将其用于感染。通过将穿梭载体（FUGW）、两个辅助质粒、Δ8.9包装载体、和VSV-G包膜载体共转染进入293T细胞的方法生产重组慢病毒，通过超速离心法对其进行纯化。在Gladstone-UCSF的临床病毒学实验室采用p24酶联免疫吸附试验对病毒滴度进行检测。

细胞和组织匀浆以及Western印迹分析

使用含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）、1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma）、磷酸酶抑制剂混合物（Roche）、和HDAC抑制剂包括5mM烟碱（Sigma）和1μM曲古霉素A（Sigma）的RIPA缓冲液对细胞或人或小鼠的脑组织进行裂解。超声处理后，将人或小鼠的脑组织裂解产物在4°C条件下170,000g离心15分钟，18,000g离心10分钟。收集上清液进行Western印迹分析。对免疫印迹条带采用增强的化学发光法（Pierce）进行直观分析，采用光密度测定法和Quantity One 4.0软件（Bio-Rad,Hercules,CA）进行定量分析。

体外乙酰化检测

按照Pagans et al.(2005)PLoS Biol 3:e41中所描述的进行反应。简言之，在30°C持续振荡条件下，将1μg人重组Tau、2nM乙酰化的CoA（Sigma）、和1μl纯化的GST-p300在乙酰化反应缓冲液（50mM HEPES，pH 8.0,10%甘油，1mM二硫苏糖醇（DTT），和10mM丁酸钠）中培养30min。加入2X LDS上样缓冲液（Invitrogen）终止反应，随后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和western印迹进行分析。

MALDI-TOF分析

将体外乙酰化反应的样品进行SDS-聚丙烯凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色。切下约65kDa的条带，送至斯坦福质谱实验室进行分析。采用Promega MS级胰酶胶内消化过夜。消化前，将胶片切成约1mm x 1mm的小方块，使用5mM二硫苏糖醇（DTT）还原，使用丙烯酰胺烷基化。在复溶和分析前，对肽进行提取并使用真空离心浓缩系统（speed-vac）干燥。

使用Eksigent 2D nanoLC（Eksigent,Dublin,CA）以及由0.1%甲酸水溶液组成的缓冲液A和由0.1%甲酸乙腈溶液组成的缓冲液B进行纳米反相高效液相色谱（HPLC）检测。使用填充Duragel C18（Peeke,Redwood City,CA）基质的熔融二氧化硅柱，在80min时间段内其线性梯度为5%B至40%B，流速为450nl/min。纳米HPLC与提供纳米电喷雾离子化进入质谱仪的Advion Nanomate（Ithaca,NY）相连接。质谱仪为LCQ Deca XP Plus（Thermo Scientific），将其设为数据依赖型获取模式以获得最强三个离子的MS/MS，将动力学排除设为2。从原始数据中提取DTA文件，使用Mascot进行系统性搜索。至少有两个肽（概率>95%）是蛋白归属所需的。

体外脱乙酰化检测

该反应为对上文所述的Pagans et al.(2005)中已建立的方法进行改良后得到。使用人FLAG标记SIRT1质粒或空白质粒利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）对HEK293T细胞进行转染。24h后，使用裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5mM EDTA，0.5%NP-40，150mM NaCl，和磷酸酶抑制剂混合物）裂解细胞。4°C条件下13,000rpm离心10min后，使用FLAG M2琼脂糖小球（Sigma）将等量的上清液蛋白在4°C条件下免疫沉淀3h。在裂解缓冲液中将经免疫沉淀的小球洗涤两次，在脱乙酰化缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 9.0，4mM MgCl2，和0.2mM DTT）中洗涤一次，将其在体外与ac-tau在脱乙酰化缓冲液中30°C条件下孵育3h，同时持续振摇。加入2X LDS上样缓冲液（Invitrogen）终止反应，并进行western印迹分析。

体内泛素化检测

该方法为对已经公开的Oh et al.(2009)Nat Cell Biol 11:295进行改良后得到的。使用编码FLAG-标记人Tau和HA-泛素的带有或不带有Myc-SIRT1（野生型或H363Y突变）的表达载体对HEK293T细胞进行转染。孵育2h后，在经Dulbecco改良的Eagle培养基中使用EX527、白藜芦醇、或二甲基亚砜（DMSO）处理细胞，培养20h。加入MG-132（20μM）培养4h。使用泛素化缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 7.5，0.1mM EDTA,，0.2%Triton X-100，150mM NaCl，蛋白酶抑制剂混合物）裂解细胞。使用FLAG M2琼脂糖小球（Sigma）将上清液蛋白在4°C条件下免疫沉淀3h。使用泛素化缓冲液将反应产物至少洗涤三次，进行SDS-PAGE分析，使用抗-HA抗体（Cell Signaling Technology）进行western印迹分析。

GST融合蛋白的纯化和相互作用检测

将编码人Tau的全长cDNA亚克隆至pGEX-4T-1细菌表达载体（Sigma）并转化进入BL21（DE3）菌株。与100μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷共同培养后，收获细菌细胞，在含1mM EDTA、0.5% Triton X-100、和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的磷酸盐缓冲液中超声处理。使用谷胱甘肽-琼脂糖小球（GenScript）对谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-标记的人Tau或GST蛋白进行纯化。

在GST钓饵检测中，将小球结合形式的纯化GST-tau与未转染（与内源性的SIRT1相互作用）或转染了FLAG-标记的人SIRT1的HEK293T细胞裂解产物共同培养。使用含有Triton X-100或Nonidet-40的裂解缓冲液至少洗涤小球三次，进行SDS-PAGE分析，使用抗-SIRT1抗体（Millipore）或抗-FLAG抗体（Sigma）进行western印迹分析。

在免疫共沉淀检测中，使用pcDNA3.1-hTau-FLAG转染HEK293T细胞。将经Triton X-100溶解的裂解产物在4°C条件下与FLAG M2琼脂糖小球一起培养3h。使用含有Triton X-100（0.5%）的裂解缓冲液至少洗涤小球三次，进行SDS-PAGE分析，使用抗-SIRT1抗体（Millipore）或抗-FLAG抗体（Sigma）进行western印迹分析。

对选择性p300抑制剂C646的表征

通过计算对接筛选，将C646鉴定为p300假定抑制剂之一。Bowers et al.(2010)Chem Biol 17:471。进行一项常规的分光光度检测以验证其是p300抑制剂（Kimet al.(2000)Anal Biochem 280:308），随后再进行一系列次级检测。在偶联分光光度检测中，乙酰基转移酶反应产物CoASH作为α酮戊二酸脱氢酶的底物，其使NAD转化为NADH，导致340nm处的UV吸收增加。见上文所述的Kim et al.(2000)。随后进行一项放射活性p300HAT检测，以直接测定C646的IC50。再进一步检测C646对比其它乙酰基转移酶对p300的特异性抑制作用。这些乙酰基转移酶包括血清素N-乙酰基转移酶及HATs pCAF、GCN5、Rtt109、Sas、和MOZ。

数据分析

使用Graphpad Prism进行统计学分析。当评估某个变量多个（≥3）均值之间的差异时，对其进行单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc检验。采用配对或非配对双侧t检验对两个平均值之间的差异进行评估。当P<0.05时认为具有显著性差异。

结果

在体外和体内的Tau乙酰化

为证明Tau乙酰化，将重组的Tau与重组乙酰基转移酶p300或pCAF（p300/CBP-辅因子）和¹⁴C-乙酰基-辅酶A共同培养。与p300而非pCAF培养后，导致Tau乙酰化，同时与预期结果一致，p300和pCAF均具有将乙酰基转移至组蛋白的活性（图1A）。经基质辅助激光解吸/电离时间飞行（MALDI-TOF）质谱鉴定，在体外p300使多个赖氨酸乙酰化。在Tau序列（2N4R，441个氨基酸）的383个残基（覆盖率为~86.8%；表4）中，共检测到23个推测的乙酰化赖氨酸。在N-和C-末端区域有少数推测的乙酰化赖氨酸；在微管蛋白结合结构域有13个（图1B和表4）。在所有质谱（MS）分析中，推测的乙酰化N-末端赖氨酸（例如，赖氨酸163、174、和180）均被乙酰化。在一个MS分析子集中，那些位于微管蛋白结合结构域的赖氨酸被乙酰化，提示在体外这些位点为可变的乙酰化（表4）。

表4描述了在存在p300的情况下人Tau多肽的推测修饰。仅列出了带有赖氨酸的肽。在三次独立分析中，总覆盖率为383/441（86.8%）。推测的乙酰化赖氨酸用粗体和下划线表示。列出了各肽在多个观察结果中的最高SEQUEST XCorr评分。XCorr评分的截断值为2.5。还观察到了赖氨酸为非乙酰化的。

为检测体内Tau乙酰化情况，使用含有在位点163和174和180乙酰化的赖氨酸的合成Tau多肽（2N4R tau亚型中的氨基酸160-182；见图10中带下划线的部分）生产多克隆抗体（抗-ac-tau，Ab708）。使用带有非乙酰化赖氨酸的相同多肽生产对照抗体（抗-tau，Ab707）。为检测Ab708对ac-tau的特异性，将重组人Tau（441；2N4R亚型）与单独的谷胱甘肽S-转移酶（GST）或GST-p300共同培养。在与GST-p300共同培养后，针对Ab708的免疫印迹检测到了较强的Tau信号，与单独的GST培养无此结果（图1C）。相反的，与GST或GST-p300共同培养后，采用Ab707或Tau 5抗体检测到相似水平的总Tau（t-tau）（图1C）。这样，在无细胞条件下，Ab708能够特异性地识别p300催化的Tau乙酰化。在使用Tau转染的HEK293T细胞中，p300过表达能够显著升高利用Ab708检测的ac-tau水平而仅适度升高t-tau水平，提示在培养的细胞中Ab708优先识别p300-诱导的ac-tau（图1D）。在HEK293T细胞中，赖氨酸163、174和180（Tau3KR）的突变降低ac-tau相对于t-tau的水平（图1E）。当两个赖氨酸在Tau2KR（K174R/K180R）中突变时，仍观察到了略少但仍具有显著性的降低（图1E）。这些发现提示，Ab708在位点163、174或180以及Tau上其它可能的乙酰化赖氨酸上识别人乙酰化Tau，而不是非乙酰化的Tau。

为了在体内检测ac-tau，使用来自表达带有P301S突变（P19）的人TaucDNA（1N4R）的转基因小鼠（Yoshiyama et al.(2007)Neuron 53:337）或来自表达带有0N3R和0N4R两个最主要的Tau亚型的完整人野生型MAPT（hT-PAC-N）的转基因小鼠（McMillan et al.(2008)J Comp Neurol 511:788）的脑裂解产物进行western印迹检测。在用于生产Ab708和Ab707的区域中，人和小鼠的Tau存在三个不同的位点（图10）。在P19和hT-PAC-N小鼠的裂解产物中Ab708检测到了特异性信号，但在其非转基因（NTG）同窝中未检测到（图1F）。这些发现提示，Ab708识别人ac-tau的多种亚型，而非小鼠的ac-tau。识别人t-tau的对照Ab707也不识别小鼠的Tau。使用Tau 5抗体检测NTG小鼠的内源性Tau（图1F）。

对于用于生产Ab708的区域，大鼠的Tau相比小鼠的Tau更接近人的Tau（图10）。在大鼠的原代皮层神经元中，Ab708检测到内源性的ac-tau（图1G）。在体外5-12天（DIV）随着神经元的成熟ac-tau/t-tau水平逐渐增加，提示Tau乙酰化受发育调节（图1G）。但是，利用Ab708检测的大鼠Tau亚型仍有待确定。

图1A-G.在体外和体内的Tau乙酰化.（A）放射性自显影检测显示，在无细胞条件下，p300而非pCAF使h-tau（2N4R）乙酰化。（B）经MALDI-TOF质谱鉴定的在体外利用p300使h-tau中出现的ac-赖氨酸。红色：带乙酰基的赖氨酸（K）。下划线：MS分析覆盖的序列。蓝色框：微管结合结构域。（C-E）Ab708特异性识别ac-tau。（C）Ab708仅识别利用GST-p300的重组Tau，而非利用单独的GST的非乙酰化Tau。利用Ab707和Tau 5抗体检测到了类似的t-tau水平。（D）在HEK293T细胞中，过表达p300显著增加利用Ab708检测的ac-tau。利用Tau 5检测的t-tau水平，在存在或不存在p300的情况下相似。印迹为>5次实验的典型结果。（E）Ab708识别的推测乙酰化赖氨酸位点。将HEK293T细胞中表达的野生型Tau的Ac-tau/t-tau水平设为1。n=4.*,P=0.012；**P=0.003；***,P=0.0003（单因素ANOVA分析结合Tukey-Kramer posthoc分析）。（F）Ab708识别PS19或hT-PAC-N转基因小鼠而非其非转基因（NTG）同窝小鼠脑中的人ac-tau。使用Ab707抗体检测人t-tau；使用Tau 5抗体检测人和小鼠的t-tau。人、小鼠和大鼠Tau的序列相似性参见图10。（G）在培养过程中（DIV=5-12）随着原代大鼠神经元成熟，在其中的Ab708-阳性ac-tau的水平升高。n=2-7，来自于2-3次独立实验。***,P<0.001（DIV5vs.DIV8或DIV12）；**,P<0.01（DIV5vs.DIV9–11）。值以平均值±SEM表示（E,G）。

利用p300乙酰基转移酶的Tau乙酰化

为了确定内源性p300或pCAF在Tau乙酰化过程中的作用，用p300或pCAF靶向的siRNA转染表达人Tau cDNA的HEK293T细胞（2N4R）（图2A），并评估其对ac-tau或t-tau的作用。抑制p300显著降低ac-tau水平，而非t-tau水平（图2B，2C）。而相反的，抑制pCAF没有影响（图2B，2C）。这些发现与体外研究的结果一致（图1A）。然后，使用C646处理原代神经元，C646为含吡唑啉酮的p300小分子抑制剂，其Ki值为400nM。见上文所述的Bowers et al.(2010)。在无细胞条件下，10μM的C646就可以以具有较高选择性的方式抑制p300（86%抑制vs.六种其它的乙酰基转移酶<10%）。见上文所述的Bowers et al.(2010)。在8h内，C646（20μM）对p300的抑制作用能够彻底地降低原代神经元中ac-tau的水平。t-tau的水平保持不变（图2D）。p300是一种转录共活化剂。Goodman and Smolik (2000)Genes Dev 14:1553。然而，根据实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的定量结果，C646处理8h不会抑制Tau转录。因此，对p300的短期（8h）抑制使Tau脱乙酰化而不影响t-tau水平。使用C646长期处理20h后，ac-tau相对于t-tau的水平（ac-tau/t-tau）降低，但是t-tau的水平也降低（图2E）。

图2A-E.利用p300乙酰基转移酶的Tau乙酰化.（A-C）在HEK293T细胞中，抑制p300，而非pCAF，降低ac-tau。（A）通过siRNA转染抑制p300或pCAF的表达。将对照siRNA-转染细胞中p300/GAPDH或pCAF/GAPDH的水平设为1。***,P=0.0006（p300vs.对照）或P<0.0001（pCAF vs.对照）。（B）典型western印记（来自三次实验）显示在转染了对照siRNA（CTRL）或p300或pCAF靶向siRNA的细胞中p300或pCAF、ac-tau、t-tau、和GAPDH的水平。（C）抑制p300，而非pCAF，降低ac-tau水平。将对照si-RNA转染细胞中的ac-tau/GAPDH或t-tau/GAPDH水平设为1。n=5–6**,P=0.008（配对t检验）。（D）在原代大鼠皮层神经元中，使用C646急性抑制p300（20μM作用8h）消除ac-tau而不影响t-tau水平。左图：来自三次实验的典型western印记。右图：将溶剂处理细胞的ac-tau/t-tau水平设为1。n=3***,P=0.0001（非配对t检验）。（E）在原代皮层神经元中，使用C646长期处理（20μM作用20h）降低t-tau水平。印记为两次实验的典型结果。值以平均值±SEM表示（A，C-E）。

在培养物中利用SIRT1的Tau脱乙酰化

为研究使Tau脱乙酰化的酶，将编码FLAG-标记的SIRT1、SIRT2、HDAC5、或,HDAC6的表达载体转染进入表达人Tau的HEK293T细胞中。所有HDAC均在较高水平表达（图3A）。尽管表达水平低于SIRT1和SIRT2，但HDAC6消除了微管蛋白的乙酰化（Hubbert et al.(2002)Nature 417:455），提示其已充分表达（图3B）。SIRT1过表达降低Ab708-阳性ac-tau的水平。SIRT2和HDAC6过表达也能够降低ac-tau的水平，但其程度略低（图3B，3C）。在SIRT1和HDAC6过表达的细胞中，t-tau的水平也降低。尽管如此，当SIRT1过表达时，ac-tau/t-tau的比率显著降低（图3D）。HDAC6或SIRT2过表达诱导ac-tau/t-tau适度降低，但不具有统计学意义（图3D）。

为考察内源性HDAC对ac-tau的作用，使用siRNA抑制SIRT1、SIRT2、或HDAC6的表达（图3E）。与对照siRNA相比，靶siRNA能够显著降低SIRT1、SIRT2、和HDAC6的水平。尽管存在适度抑制，但是HDAC6增加ac-微管蛋白水平（图3F）。然而，仅SIRT1的抑制增加ac-tau水平，提示在Tau脱乙酰化过程中涉及内源性SIRT1（图3G）。观察到了一致性结果，SIRT1过表达减少t-tau，SIRT1抑制导致t-tau出现增加趋势（图3G）。尽管如此，SIRT1的抑制，而非SIRT2或HDAC6的抑制，显著增加ac-tau相对于t-tau的水平（ac-tau/t-tau）（图3H）。这些结果为在Tau脱乙酰化过程中涉及SIRT1提供了直接的支持。到目前为止，我们的研究结果尚不支持SIRT2或HDAC6在Tau脱乙酰化过程中起显著作用，其均使得微管蛋白脱乙酰化（见上文所述的Hubbert et al.(2002)；North et al.(2003)Mol.Cell 11:437）。然而，尚不能排除其作用，因为siRNA转染仅能使SIRT2或HDAC6部分沉默。

为进一步考察SIRT1在Tau脱乙酰化中的作用，使用人Tau cDNA对带有（SIRT1^+/+）或不带有SIRT1（SIRT1^-/-）的低代数小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）进行转染。删除SIRT1可以显著升高ac-tau水平。t-tau的增加未达到统计学意义，提示在MEF中SIRT1使Tau脱乙酰化。在HEK293T细胞中，当赖氨酸163、174、180突变成精氨酸时（Tau3KR），ac-tau水平显著降低（图3I）。在TauWT细胞中SIRT1过表达降低ac-tau，但是在TauKR细胞中该降低作用减弱较多（图3I）。这些结果暗示SIRT1使赖氨酸163、174、和180脱乙酰化。然而，与TauWT细胞相比，在Tau3KR细胞中SIRT1使ac-tau降低水平略低，提示除了位点163、174、和180以外，SIRT1还能够使其它的赖氨酸残基脱乙酰化（图3I）。

图3A-I.在培养物中利用SIRT1的Tau脱乙酰化.（A-D）在HEK293T细胞中，SIRT1过表达降低ac-tau水平。（A）Western印记显示使用抗-FLAG抗体时FLAG-标记的SIRT1、SIRT2、HDAC5、或HDAC6的表达。印记为2-3次实验的典型结果。（B）Western印记显示在过表达SIRT1、SIRT2、HDAC5、或HDAC6的细胞中ac-tau、t-tau、微管蛋白、和ac-微管蛋白的水平。印记为2-3次实验的典型结果。（C）SIRT1、SIRT2或HDAC6过表达显著降低ac-tau/GAPDH的水平。SIRT1和HDAC6过表达还降低了t-tau的水平。n=9–18，来自6-10次独立实验。***,P<0.001（Mock vs.SIRT1或Mock vs.HDAC6）；**,P<0.01（Mock vs.SIRT2）（双因素ANOVA分析和Bonferroni posthoc检验）。（D）SIRT1过表达显著降低ac-tau/t-tau。n=9–18，来自6-10次独立实验，***,P<0.001（Mock vs.SIRT1）（单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc检验）。（E-H）在HEK293T细胞中，SIRT1的抑制使ac-tau升高。（E）SIRT1、SIRT2、或HDAC6的表达抑制由siRNA转染介导。n=4–6，来自2-3次实验。**,P=0.0015；***,P=0.0001（SIRT2vs.对照）或P=0.001（HDAC6vs.对照）（配对t检验）。（F）Western印记显示在转染了对照siRNA或SIRT1、SIRT2、或HDAC6靶向siRNA的细胞中ac-tau、t-tau、微管蛋白、和ac-微管蛋白的水平。印记为2-3次实验的典型结果。（G-H）SIRT1抑制显著升高ac-tau/GAPDH（G）或ac-tau/t-tau（H）的水平。n=4–6，来自2-3次实验。*,P<0.05（配对t检验）。将在对照siRNA转染细胞中脱乙酰基酶/GAPDH（E）、ac-tau或t-tau/GAPDH（G）、和ac-tau/t-tau（H）的水平设为1。（I）利用SIRT1的Tau3KR脱乙酰化。左图：显示ac-tau、t-tau、FLAG-标记SIRT1、和GAPDH水平的典型western印记。右图：将表达野生型Tau的空白转染细胞中ac-tau/t-tau的水平设为1。n=10–20，来自4-10次独立实验。***,P<0.001；ns，无显著性（单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc分析）。值以平均值±SEM表示（CE，GI）。

SIRT1在原代神经元和体内降低Tau乙酰化

在原代神经元中，ac-tau/t-tau随着神经元的成熟而增加（图1G），但全长SIRT1的水平降低（图4A）。与SIRT1使Tau脱乙酰化的概念一致，在发育阶段的原代神经元细胞中，SIRT1的水平与ac-tau/t-tau的水平呈负相关（图4B）。为了考察在神经元中SIRT1是否负向调节Tau乙酰化，利用表达cre重组酶（Lenti-cre）的慢病毒载体感染来自SIRT1条件敲除小鼠（SIRT1^F/F）（Chua et al.(2005)Cell Metab 2:67）的神经元删除的神经元的SIRT1（图4C）。对照使用空载体（Lenti-con）感染。还使用表达人Tau的慢病毒载体感染SIRT1^F/F神经元。删除SIRT1使乙酰化人Tau相对于t-tau的水平显著升高（图4C），表明在神经元中SIRT1使Tau脱乙酰化。

为考察SIRT1删除对小鼠体内Tau乙酰化的作用，开发了另外一个ac-tau-特异性抗体靶向微管蛋白-结合区域（264-287），其在小鼠和人之间100%保守（图4D）。将重组Tau与p300共同培养以诱导乙酰化。与Ab708类似，抗体9AB利用GST-p300识别乙酰化的重组Tau，而非与单独的GST培养的Tau，提示9AB与非-ac-tau无交叉反应。在HEK293T细胞中，p300过表达显著升高利用9AB检测得到的ac-tau水平，但仅适度升高t-tau水平。因此，在培养细胞中9AB也能够优选地识别p300诱导的ac-tau（图4E）。在小鼠脑中，9AB检测到了低水平的ac-tau，其在tau^-/-小鼠中不存在。为了删除SIRT1，对SIRT1^+/-小鼠做了远交背景杂交，以此部分挽救了近交背景中因SIRT1空白所致的胚胎死亡。Chen et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:10794。删除SIRT1使脑内ac-tau水平显著升高，这为体内利用SIRT1对Tau进行脱乙酰化提供了直接证据（图4F）。

图4A-F.SIRT1在神经元中和体内降低Tau乙酰化.（A）Western印记显示培养物成熟过程中（DIV 5-11）在原代皮层神经元中SIRT1的表达。印记为2-3次独立培养的典型结果。（B）在原代大鼠神经元培养物中（DIV 5-9）内源性ac-tau相对于t-tau的水平与SIRT1的水平呈负相关。将DIV=5时SIRT1或ac-tau/t-tau的水平设为1。n=20次独立检测。P=0.0007，Pearson相关系数r²=0.4791。（C）在神经元中删除SIRT1使ac-tau相对于t-tau的水平升高。使用对照病毒或表达cre重组酶（Lenti-cre）的病毒感染来自SIRT1^F/F小鼠的培养神经元。还使用表达h-tau的慢病毒载体感染这两种培养物。n=8，P=0.001（非配对t检验）。（D）乙酰基特异性抗体（9AB）利用GST-p300识别乙酰化Tau，但不识别非-ac-tau。还显示了用于生产9AB的抗原序列。（E）在HEK293T细胞中p300过表达增强9AB-阳性ac-tau。在存在或不存在p300过表达的情况下，利用Tau 5检测得到的t-tau水平接近。印记为三次独立实验的典型结果。（F）在脑中删除SIRT1后ac-tau水平相对于t-tau升高。左图：显示ac-tau、t-tau、和GAPDH水平的典型western印记。右图：在SIRT1^+/+、SIRT1^+/-、和SIRT1^-/-的脑中ac-tau/t-tau的水平。n=3-6只小鼠/表型。*,P=0.02（SIRT1^+/-vs.SIRT1^-/-）（单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc检验）。值以平均值±SEM表示（C，F）。

SIRT1与Tau的直接相互作用

尽管主要位于核中，SIRT1还是能够穿梭至细胞质。为确定是否SIRT1直接导致了Tau脱乙酰化，进行了体外脱乙酰化检测。将p300乙酰化的重组Tau与从SIRT1过表达HEK293T细胞中免疫沉淀得到的SIRT1共同培养。当存在免疫沉淀得到的SIRT1时，ac-tau/t-tau的水平显著降低（图5A）。为确证SIRT1在体内直接与Tau发生相互作用，进行了GST钓饵检测。小球结合的GST-tau，而非单独的GST，与HEK293T细胞中表达的FLAG-SIRT1或非转染细胞中的内源性SIRT1发生相互作用（图5B）。而且，在免疫共沉淀检测中，在表达FLAG-标记的Tau的HEK293T细胞中，与抗-FLAG抗体免疫沉淀后，使用抗-SIRT1抗体检测内源性的SIRT1，使用混合-Tau抗体检测Tau（图5C）。

图5A-C.SIRT1与Tau的相互作用.（A）SIRT1在体外直接使ac-tau脱乙酰化。将不存在免疫沉淀得到的SIRT1时的ac-tau/t-tau的水平设为1。使用Ab708抗体检测ac-tau。n=5来自两次实验。**,P=0.0063（非配对t检验）。（B）GST钓饵检测。将GST-tau蛋白（7-9道）或单独的GST（4-6道）与转染了FLAG-标记的SIRT1细胞或非转染细胞的裂解产物共同培养。第1、4和7道：0.1%Triton X-100；第2、5和8道：0.5%Triton X-100；第3、6和9道：0.5%NP-40。显示的数据为两次实验的代表性结果。下面的条带可能表示此前观察到的SIRT1的裂解产物。Ohsawa and Miura (2006)FEBS Lett 580:5875。（C）免疫共沉淀检测。用编码FLAG-标记人Tau的质粒转染HEK293T细胞。24h后收集细胞裂解产物，使用抗-FLAG抗体进行免疫沉淀，使用Tau 5或抗-SIRT1抗体进行免疫印记检测。第1-2道：内参；第3道：无一抗；第4道：抗-FLAG抗体。值以平均值±SEM表示（A）。

SIRT1缺乏使Tau乙酰化增加并且抑制p-Tau的降解

作为第III类赖氨酸脱乙酰基酶，SIRT1支持和促进多种有机体的存活。除了调节内分泌和对热量限制性的行为应答以外，SIRT1还与神经退行性疾病密切相关。Gan and Mucke (2008)Neuron 58:10。在AD脑中，SIRT1水平显著降低，该降低与Tau的累积和聚集相关。因此，SIRT1活性不足可能导致Tau病变。在原代神经元中，使用特异性抑制剂EX527抑制SIRT1（Napper et al.(2005)J Med Chem 48:8045）使ac-tau、AT8-阳性p-tau、以及t-tau显著增加（图6A）。经EX527处理后，ac-tau或p-tau相对于t-tau的水平显著增加（图6A）。因此，在原代神经元中SIRT1缺乏诱导的ac-tau的增加伴随着病理性p-tau的累积。在小鼠脑中，删除SIRT1使ac-tau升高，其同时使AT8-阳性p-tau增加（图6B）。

Tau乙酰化增加是如何导致p-tau水平升高的呢？赖氨酸乙酰化可以防止其泛素化，并且稳定蛋白，所述蛋白一般被UPS包括p53、Runx3、β-catenin、和其它调节因子所降解。由于Tau的泛素化和Tau的降解，特别是p-tau的降解涉及蛋白酶体介导的通路，因此假设乙酰化防止Tau泛素化并抑制其降解。

为检验该假设，对调节蛋白更新中涉及的乙酰化赖氨酸进行了评估。比较了人野生型Tau（hTauwt）和人tau3KR（hTau3KR）的更新率。使用Lenti-hTauwt和Lenti-hTau3KR感染原代皮层神经元，使用CHX对其进行处理（图6C）。与Lenti-hTauwt相比，感染Lenti-hTau3KR的结果使Ab708-阳性信号减弱，其进一步为Ab708识别赖氨酸163、174、和180的乙酰化反应提供了支持。将这三个赖氨酸突变为精氨酸可以显著延长Tau的半衰期，这可能是通过永久性的阻止这三个位点的泛素化实现的（图6D）。这些结果均支持乙酰化的赖氨酸可以被泛素化的观点。

为直接检验是否增强乙酰化反应可以阻止泛素化，使用编码Tau和红细胞凝集素（HA）-标记的泛素的表达质粒转染HEK293T细胞，然后用EX527处理以抑制SIRT1，并使用MG132阻断蛋白酶体介导的降解。使用抗-FLAG抗体对泛素化的Tau进行免疫沉淀并使用抗-HA抗体进行检测。EX527以剂量依赖的方式阻止Tau的聚泛素化，提示通过增强乙酰化反应抑制了Tau泛素化（图6E）。EX527也如预期地升高ac-tau水平（图6F）。而相反的，SIRT1-介导的脱乙酰化反应增强了Tau泛素化。使用白藜芦醇处理，其可以间接地活化SIRT1，在转染了野生型SIRT1的细胞中其可以显著增强Tau泛素化，而在转染了H363Y突变的细胞中则不能。

之后直接检验了增强Tau的乙酰化是否可以减慢内源性Tau的更新。使用EX527处理原代神经元以增强Tau的乙酰化，使用环己酰亚胺（CHX）处理以抑制新蛋白的翻译。在原代神经元中内源性大鼠Tau的半衰期为约5h。使用EX527抑制SIRT1减缓了Tau的更新并以剂量依赖性的方式增加t-tau的半衰期（图6G，6H）。与此观点一致，ac-tau的降解比t-tau更慢。在原代神经元中，5h后CHX就能够显著降低t-tau的水平，而8h后ac-tau的水平才仅略有降低。而且，使用10μM EX527对SIRT1的抑制作用能够阻断ac-tau的更新，导致其出现累积（图6I，6J）。更高剂量的EX527（50μM）导致ac-tau出现更加显著的累积（图6I）。使用EX527处理也能够以剂量依赖的方式阻止AT8-阳性p-tau的降解（图6K）。

图6A-K.乙酰化通过抑制Tau泛素化延缓其更新。（A）在大鼠原代神经元中（DIV=10），EX527（50μM）抑制SIRT1使ac-tau和p-tau升高。左图：典型的western印迹。使用AT8检测p-tau。右图：将溶剂对照细胞中ac-tau/t-tau或p-tau/t-tau的水平设为1。n=6次独立实验。***,P<0.001;*,P<0.05（配对t检验）。（B）脑中SIRT1的删除使AT8-阳性p-tau升高。n=3-4只小鼠/基因型。*,P<0.05（SIRT1^+/+vs.SIRT1^-/-）（单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc检验）。（C和D）在原代神经元中Tau3KR比野生型Tau更稳定。使用Lenti-hTauwt或Lenti-hTau3KR感染细胞，在感染4天后（DIV=9）使用CHX处理8-32h。（C）显示ac-tau、t-tau、和GAPDH的两次实验的典型western 印迹。（D）在表达Tau3KR的细胞中t-tau的更新减慢。将在0时刻收集的细胞中t-tau/GAPDH的水平设为1。n=3–5，来自两次实验。*,P=0.04（8h），P=0.015（24h）；***,P<0.0001（32h）（各时间点分别进行非配对t检验）。（E和F）SIRT1抑制剂EX527（1–50μM）抑制Tau泛素化并使ac-tau以剂量依赖性方式升高。印迹为3次实验的典型结果。（G-K）在大鼠原代神经元中（DIV=8）SIRT1抑制剂EX527以剂量依赖性方式增加Tau的半衰期。在存在或不存在EX527（10-50μM）的条件下，使用CHX处理神经元0-8h。3次实验的典型western印迹显示存在或不存在EX527的情况下，神经元中t-tau（G）、ac-tau（I）、或p-tau（K）的更新。（H和J）经EX527处理后，t-tau（H）或ac-tau（J）的更新显著减慢。将在0时刻收集的细胞中t-tau/微管蛋白或ac-tau/微管蛋白的水平设为1。n=3**,P<0.01;***,P<0.001（双因素ANOVA分析，EX527处理vs.溶剂处理）。值以平均值±SEM表示（A-B，D，G，I）。

在病理条件下Tau乙酰化的评估

由于乙酰化减缓了Tau的降解，因而假设乙酰化是使p-tau累积的关键早期事件，p-tau一般通过蛋白酶体介导的通路降解。在原代神经元中，使用低水平的淀粉样β（Aβ）寡聚物（AD关键病原体）处理，可以以剂量依赖性的方式增加ac-tau水平（图7A）。在表达携带FTD连接的突变（hTauP301L）的人Tau的原代神经元中观察到ac-tau的水平高于表达水平与之接近的hTauwt（图7B）。这些发现提示Tau乙酰化在应激状态下升高，如Aβ累积，或FTD-连接的突变。

在多种程度的Tau病变患者的额叶皮层中，对Tau乙酰化进行了检测。Braak and Braak(1991)Neuropathol.Berl.82:239。与Braak 0级的患者相比，Braak 1–2或3–4患者脑裂解产物的可溶性部分中ac-tau的水平显著升高（图7C）。在过表达人Tau的转基因小鼠中，Ab708可以识别多种人Tau的亚型（图1D）。然而，与可以识别所有亚型的Tau 5不同，Ab708优选地检测在AD脑中的某些亚型（图7C）。使用PHF-1（图1D）或AT8检测的过度磷酸化Tau仅在5-6级患者中可以观察到，其与早期Braak分级患者的额叶皮层中缺乏显著的NFT一致（见上文所述的Braak and Braak(1991)）。因此，这些发现支持Tau的乙酰化增强先于Tau的过度磷酸化和NFT形成的观点。然而，在伴有额叶皮质出现NFT的Braak 5-6级患者中，特别是6级患者中，ac-tau的水平略低于轻度至中度级别的患者。可以将该末期阶段的减少解释为神经元的严重丢失，或在NFT中ac-tau的隔离，这样使其仍存在于裂解产物的不溶性部分。

图7A-D.在病理条件下Tau乙酰化升高。（A）在原代皮层神经元中（DIV=11）加入低水平的Aβ寡聚物使Tau乙酰化增加。n=5，来自3次实验。**,P=0.003（单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc检验）。（B）在原代神经元中（DIV=13），Tau乙酰化与家族性MAPT突变相关。将感染Lenti-hTauwt的神经元中Ac-tau/t-tau的水平设为1。n=9，来自三次实验。*,P=0.013（非配对t检验）。（C）显示在不同Braak阶段（0-5）的人脑（Bm-22，颞上回）中ac-tau、t-tau、和过度磷酸化Tau水平的典型western印迹。（D）在Tau病变轻度（Braak 1-2级）至中度（Braak 3-4级）水平的患者中ac-tau水平升高。n=8–18个病例/Braak范围。*,P<0.05;**,P<0.01，单因素ANOVA分析和Tukey-Kramer posthoc分析。值以平均值±SEM表示（A，B，D）。

降低Tau乙酰化消除FTD-连接的突变导诱导的p-Tau

为检验Tau乙酰化与p-tau累积有关的假设，确定抑制Tau乙酰化是否能够消除p-tau并且针对Tau病变起到保护作用。在原代神经元中使用小分子C646抑制p300消除ac-tau但不影响t-tau水平（图8A）。引人注意的是使用C646处理2h也可以消除丝氨酸202磷酸化的致病性Tau，其通过AT8抗体检测。其无活性的类似物C37无效（图8B）。这些结果提示，脱乙酰化作用优选增强p-tau的降解，其与在选择性地通过UPS通路降解的p-tau类型中观察到的结果一致。在表达hTauP301L的原代神经元中，其为Tau病变的细胞模型，经C646处理也会使AT8-阳性p-tau减少（图8C）。在AD和FTDP-17（Roberson et al.(2007)Science 316:750；和Santacruz et al.(2005)Science309:476）小鼠模型中，Tau减少改善认知功能并且具有保护不受兴奋性毒性的损害（如上文所述的Roberson et al.(2007)）。这些结果暗示可以将调节赖氨酸的乙酰化作为神经退行性Tau病变中降低Tau水平，特别是p-tau致病型水平的一种新治疗策略。

图8A-D.降低Tau乙酰化消除p-Tau.（A）在原代皮层神经元中（DIV=9）2h内C646（20μM）使ac-tau和AT8-阳性p-tau消除。两次实验的典型western印迹。（B）C646（20μM）消除p-tau。将未处理细胞中p-tau/GAPDH的水平设为1。n=4***,P<0.0001（非配对t检验）。（C）在表达hTauP301L的原代神经元中（DIV=12），C646（20μM）消除AT8-阳性p-tau。左图，两次实验的典型western印迹。右图，将使用对照化合物（C37）处理的细胞的p-tau/GAPDH的水平设为1。n=7***,P=0.0001（非配对t检验）。（D）Tau乙酰化是如何参与Tau介导的神经退行性病变的假设模型。虚线和用灰色表示的因素为尚未检测的通路。值以平均值±SEM表示（B–C）。

虽然参照具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解，可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。