CN102787157A - 一种壁虎类毒素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
壁虎类毒素的制备方法，涉及一种药品原料的制备方法。鉴于壁虎作为药材时具有毒副作用，本发明的壁虎类毒素的制备方法是通过以下技术案实现的：1、以壁虎科动物无蹼壁虎或多疣壁虎或蹼趾壁虎的全体为原料，经粉碎处理后酶解；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。本发明制备的壁虎类毒素是以中药材壁虎或壁虎干为原料制备的一种类毒素，制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产工艺简单，节能、无环境污染，工艺过程易于控制，制备的壁虎类毒素成分明确，成本较低，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种药品原料的制备方法，尤其是一种壁虎类毒素的制备方法。
背景技术
一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质—细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原性，称之为类毒素。类毒素是一种自动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。
现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱毒后形成类毒素。目前非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱类毒素等产品。
CN101869704A公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法，其特征是：由破伤风类毒素通过静电作用后载在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制得；CN87104279公开了类毒素制备新方法，包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其免疫性，此后从中获得灭活的毒素；CN1798548公开了基于含吸附类毒素或含多糖抗原微球体的免疫原性组合物，该发明是将类毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。
壁虎是一种爬行动物，生活在阴暗潮湿、环境条件极其恶劣，为适应环境抵御外界细菌、病菌及病毒的侵淫，壁虎机体内外产生大量抗性应答物质，包括与马蜂毒相似的有毒物质组织胺类物。
壁虎是一种中药材，为壁虎科动物无蹼壁虎、多疣壁虎、蹼趾壁虎的全体。壁虎含有与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类，其脂肪油中含甘油硬脂酸、胆固醇、硬脂酸。
壁虎的药理表明，壁虎有镇静催眠作用。体外实验表明，壁虎水溶液可抑制人体肝癌细胞的呼吸，揭示其有抗肿瘤作用，有一定的抗血栓作用，有降低血压的作用，对结核菌及常见致病性真菌有一定的抑制作用。
李雯等人对中药壁虎的化学成分进行研究；钱玉燕等人研究多疣壁虎血管活性肠肽基因的克隆及表达；孙超等人给出了壁虎抗肿瘤作用的研究进展；韩进庭给出了壁虎抗肿瘤药理作用与临床应用研究进展。
CN101172120公开了一种抗肝癌的壁虎藤梨根复方制剂，将壁虎和藤梨根的粉末水提，大孔树脂吸附分离得复方制剂；CN1010499326公开了一种用于治疗肝癌的壁虎藤梨根水提取物，用水提壁虎藤梨根而得；CN101875661A公开了从壁虎中提取的抗肿瘤化合物及其制备方法和应用，以生理盐水提取壁虎化合物成分；ZL200410013742.4公开了“采用中药培育蟾蜍蛆虫的方法”，采用本方法可以批量工业化生产蟾蜍蛆虫。
前述的有关壁虎药用都是采用壁虎机体作为原料，由于壁虎含有蜂毒样的有毒物质及组胺等成分，壁虎作为药材时有中毒现象或过敏反应，因此如何扩展壁虎的药用范围，消除毒副作用是一个长期以来需解决的问题。
发明内容
鉴于壁虎作为药材时具有毒副作用，本发明提供一种壁虎类毒素的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术案实现的：1、以壁虎科动物无蹼壁虎或多疣壁虎或蹼趾壁虎的全体为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；2、分离机固液分离；3、脱毒；4、化学法或物理法灭活；5、微滤过滤除杂及超滤法浓缩；6、超声驻波液相制备色谱纯化；7、稳定化处理。具体步骤如下：
（1）以壁虎科动物无蹼壁虎或多疣壁虎或蹼趾壁虎的全体为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；
（2）用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液；
（3）调节收集液体pH=5.8-8.0，控制温度25-45℃，加H2O2溶液或甲醛进行脱毒处理，成为壁虎类毒素粗品液相；
（4）壁虎类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理；
（5）用膜孔径0.2-5μm微孔过滤机过滤，并且用膜孔径10-100nm超滤机超滤处理，收集超滤液；
（6）超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频率2450-5000kHz，声强0.2-1.5kw，流量0.2-1.0L/min，紫外分光光度检测器波长260nm；
（7）稳定化处理：分离纯化壁虎类毒素中加入稳定剂，在20-30℃条件下吸附10-24h，成为稳定性壁虎类毒素。
本发明制备的壁虎类毒素是以中药材壁虎或壁虎干为原料制备的一种类毒素，其相对分子量为32×104Da，制品振摇后为乳黄色均匀悬浮液，pH=6.6-7.4，氢氧化铝含量少于2.5mg/mL，游离甲醛含量小于0.02%（g/mL）。通过氨基酸组成分析，壁虎类毒素与壁虎毒素比较，其氨基酸序列之间只差7个氨基酸残基，其中6个Cys形成3对二硫键，小鼠急性毒性实验表明，壁虎毒素的LD50为0.8±0.2mg/kg，壁虎类毒素的LD50为50±0.5mg/kg。本发明的制备过程不涉及传统类毒素生产的菌种和培养基筛选，生产工艺简单，节能、无环境污染，工艺过程易于控制，制备的壁虎类毒素成分明确，成本较低，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
（1）选用新鲜中药材壁虎放入绞肉机绞碎壁虎机体，用高压匀浆破碎法进一步破碎机体，调节压力100000kpa，流速至70cm/ml，重复破碎2-5次，以离心机1250-3000r/min固液分离，收集液相；
（2）收集液相1000ml加入2000-10000ml纯净水混合均匀后加入0.5-10g胃蛋白酶，保持温度20-50℃，酶解6h-48h；
（3）用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液，收集液体用0.2mol/LNa2HPO4-0.2mol/LNaH2PO4组成的缓冲液调节pH=5.8-8.0，控制温度25-45℃，加10-100gH2O2溶液脱毒处理15-45d，成为壁虎类毒素粗品液相；
（4）1L壁虎类毒素粗品液相置于微波炉中，在功率0.5-2kw加热1-10min进行灭活；
（5）将100ml壁虎类毒素粗品液相加入0.2mol/LNa2CO3-0.2mol/LNaHCO3缓冲溶液调pH=8-12，再加入50-100gNa2SO4及20-200g活性白土，在10-30℃条件下生成沉淀并放置10h-24h；
（6）上述物料用膜孔径0.2-5μm微孔过滤机过滤，并且用膜孔径10-100nm超滤机超滤处理，收集超滤液；
（7）收集的1L超滤液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L的三氟乙酸，水相中加入1-5mmol/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强0.2-1.5kw，流量0.2-1.0L/min，紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
（8）分离纯化壁虎类毒素1000L加入200-1000L含量为5-20g/L Al(OH)3溶液中，在20-30℃条件下吸附10h-24h，成为稳定性壁虎类毒素。
实施例2：
（1）1000g壁虎干品用粉碎机以275-500r/min连续粉碎，并用100-200目筛子筛选，收集粉末；
（2）将1000g粉末放入微波炉中以功率0.5-2kw，加热10-20min杀菌处理，然后自然冷却至25-30℃；
（3）上述杀菌处理后壁虎干品粉末加入1-10L纯净水混合均匀后，加入1.5-50g胰蛋白酶，保持温度25-50℃，酶解5-48h；
（4）用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用0.2mol/L Na2CO3-0.2 mol/LNaHCO3组成的缓冲溶液调pH=5.8-8，控制温度25-45℃，加10-100g甲醛脱毒处理30-45d，成为壁虎类毒素粗品；
（5）1000ml壁虎类毒素粗品用10000-15000高斯磁感强度处理2-5min，处理3-5次灭活；
（6）将1Kg壁虎类霉素粗品加入氨水调整pH=7-9，加入100-300g(NH4)2SO4及150-500g沸石，常温条件下生成沉淀并吸10-24h；
（7）上述脱毒液用膜孔径0.2-10μm微滤机过滤再用膜孔径10-100nm超滤机超滤浓缩，收集浓缩液。
（8）1L浓缩液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成的溶剂体系中，其中有机相中加入10-30mmol/L三氟乙酸，水相中加入1-5mmol/L氨水，泵入超声驻波液相制备色谱中，超声驻波频率2450-5000kHz，声强0.2-1.5kw，流量0.5-1.0L/min， 紫外分光光度检测器波长260nm，连续分离纯化；
（9）分离纯化的1L壁虎类毒素加入20.0-50.0L含量为10-20g/LCa3(PO4)2溶液中，在20-30℃条件下吸附10-24h，成为稳定性壁虎类毒素。
Claims (5)
1.壁虎类毒素的制备方法，其特征在于所述制备方法如下：
（1）以壁虎科动物无蹼壁虎或多疣壁虎或蹼趾壁虎的全体为原料，经粉碎处理后加入蛋白酶进行酶解反应；
（2）用分离机以3000-15000r/min分离上述酶解液；
（3）收集液体进行脱毒处理，成为壁虎类毒素粗品液相，控制pH=5.8-8.0，温度25-45℃；
（4）壁虎类毒素粗品液相采用化学法或物理法进行灭活处理；
（5）用膜孔径0.2-5μm微孔过滤机过滤，并且用膜孔径10-100nm超滤机超滤处理，收集超滤液；
（6）超滤液溶于溶剂体系中，泵入超声驻波液相制备色谱中连续分离纯化，超声驻波频率2450-5000kHz，声强0.2-1.5kw，流量0.2-1.0L/min，紫外分光光度检测器波长260nm；
（7）稳定化处理：分离纯化壁虎类毒素中加入稳定剂，在20-30℃条件下吸附10-24h，成为稳定性壁虎类毒素。
2.根据权利要求1所述的壁虎类毒素的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的壁虎类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的体积比组成。
4.根据权利要求3所述的壁虎类毒素的制备方法，其特征在于所述溶剂体系的有机相中加入10-30mmol/L三氟乙酸，水相中加入1-5mmol/L氨水。
5.根据权利要求1所述的壁虎类毒素的制备方法，其特征在于所述稳定剂为Al(OH)3溶液或Ca3(PO4)2溶液。
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