CN102781454A - 用于治疗性治疗肿瘤疾病的来源于成体干细胞的微泡（mv） - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤的治疗性治疗的领域。本发明人已经发现，当给予患有肿瘤疾病的患者时，来源于成体干细胞的微泡发挥显著的抗肿瘤作用。优选的微泡来源于骨髓间质干细胞、肾小球间质干细胞或非卵肝干细胞。

Description

用于治疗性治疗肿瘤疾病的来源于成体干细胞的微泡(MV)
本发明涉及肿瘤疾病的治疗性治疗（治疗性处理，therapeutictreatment）。
已知造血干细胞移植在患有实体瘤的患者中发挥肿瘤抑制作用，以及在转移性乳腺癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌中发挥抗肿瘤作用。
证明了人类骨髓间质干细胞（BM-MSC）有助于多种器官的修复和组织修复，且实验性研究表明，MSC的移植可对包括心脏、肝脏和肾的几种器官的功能和结构恢复具有有益的作用。
干细胞微环境通过提供抑制增殖和促进分化的信号，似乎在预防癌发生中起到重要作用。
然而，由于已经报道了这种干细胞治疗的潜在的致瘤的风险，干细胞在治疗适应症中的应用是不太可取的（Amariglio N et al.Donor-derivedbrain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxiatelangiectasia patient.PLoS Med.2009 Feb 17;6(2)）。
细胞来源的微泡（microvesicle，MV）是通过表达细胞特有的抗原的细胞而释放的小泡，其中它们起源于细胞且携带细胞膜和细胞质成分，且已经被描述为细胞通讯的新的机制。最近，本发明的发明人已经证明了，来源于人类内皮祖细胞（endothelial progenitor cells）（EPC）、BM-MSC和肝脏的肝干细胞的微泡可用作遗传材料（mRNA）的转移的媒介物，其中所述遗传材料能重编程靶分化细胞，如内皮细胞、管状上皮细胞（小管上皮细胞，tubular epithelial cell）和肝细胞（Deregibus MC et al.Endothelialprogenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program inendothelial cells by a horizontal transfer of mRNA.Blood.2007 Oct1;110(7):2440-8;Bruno S et al.Mesenchymal stem cell-derived microvesiclesprotect against acute tubular injury.J Am Soc Nephrol.2009May;20(5):1053-67;Herrera MB et al.Human liver stem cell-derivedmicrovesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats.J CellMol Med.2009Jul 24），且有助于组织再生和修复。
国际专利申请WO2009/087361公开通过将诱导物应用于未分化细胞的第一群（落）而生产分化的细胞，然后从分化的细胞分离微泡。参见WO2009/087361第30页上那个方面中的第一完整段落。未分化的细胞的第一个群是例如骨髓间质干细胞。然而，WO2009/087361没有公开直接从未分化的细胞获得微泡。
本发明的发明人现在已经发现，来源于成体干细胞，优选来源于骨髓或肾小球间质干细胞（glomerular mesenchymal stem cell）或来源于非卵肝干细胞（non-oval liver stem cells）的微泡，在体内和体外表现显著的抗肿瘤活性，因此代表用于癌症的治疗性治疗的相应的整个干细胞范围内有利的可替换物。在体外通过测量微泡在多种人类癌细胞系的增殖和凋亡上以及它们在毛细管样结构的形成上的作用，证明依照本发明来源于成体干细胞的微泡的抗肿瘤活性。在体内小鼠模型中通过测量MV治疗（处理）对肿瘤生长的作用也证实了微泡的抗肿瘤活性。
在现有技术上，完全想不到来源于成体干细胞的微泡的观察到的抗肿瘤活性。实际上已知间质干细胞（MSC）的制剂对某些组织发挥再生作用。例如，已知骨髓来源的MSC通过分泌许多营养分子自然地支持造血作用，所述营养分子包括可溶解的细胞外基质糖蛋白、细胞因子和生长因子。此外，在WO2009/050742中显示来源于内皮干细胞的微泡在体外和体内促进血管生成和抵抗凋亡。在WO2009/057165中，已知来源于干细胞的微泡诱导受损的组织或器官的内皮和上皮再生。
在WO2009/105044中，推测性地说来源于间质干细胞的微泡适合于用于多数和多种疾病的治疗。没有提供关于癌症治疗的实验证据、理论解释和具体方法。
因此，本发明的第一方面是用于治疗性治疗（治疗性处理，therapeutictreatment）肿瘤疾病的来源于成体干细胞的微泡。
关于这一点，应该理解，微泡不一定来源于应该将微泡给予他们的相同患者的成体干细胞。更确切地，它们可来源于不同的受试者，以药剂的形式制备和维持，然后给予需要其的患者。这是所谓的异源的途径。
在优选的实施方式中，成体干细胞是人类间质干细胞（humanmesenchymal stem cell）或人类肝干细胞。优选的人类肝干细胞是表达在WO 2006/126219中公开的间质和胚胎干细胞标记的人类非卵肝干细胞（human non-oval liver stem cell）（HLSC）。这种细胞系具体的表征是，它是从成体组织分离的非卵人类肝多能性祖细胞系，其中所述成体组织表达肝细胞标记且能够分化成成熟的肝细胞、胰岛素生产细胞、骨原细胞和上皮细胞，且优选地表达选自包含白蛋白、α-胎蛋白、CK18、CD44、CD29、CD73、CD146、CD105、CD90的组的标记，且优选不表达选自包含CD133、CD117、CK19、CD34、细胞色素P450的组的标记。
在另一个优选的实施方式中，人类间质干细胞来源于人类成体骨髓（BM-MSC）。在另一个优选的实施方式中，人类间质干细胞来源于人类成体去被膜的肾小球（human adult decapsulated glomeruli）（Gl-MSC），如欧洲专利申请号08425708.8中公开的。此外，这些细胞的表征是，它们是CD133阴性的、CD146阳性的和CD34阴性的且它们能够分化成足细胞（podocyte）、内皮细胞和系膜细胞（mesangial cell），且它们也优选表达选自包含CD24、Pax-2、CD31、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、nanog（一种干细胞转录因子）、musashi（一种转录抑制因子）、波形蛋白、巢蛋白的组的标记，且优选地不表达选自包含α-SMA、Oct-4、CD45、细胞角蛋白、CD80、CD86、CD40的组的标记。
依照本发明的一个实施方式，肿瘤疾病选自由肝肿瘤（例如，肝细胞瘤）、上皮性肿瘤（例如，卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma））、乳腺肿瘤（breasttumor）（例如，乳腺癌）、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤（gastric tumour）、结肠肿瘤（colon tumour）和卵巢肿瘤组成的组。
本发明的另一个方面是如上述限定的来源于成体干细胞的微泡在制备用于如上述定义的肿瘤疾病的治疗性治疗的药剂中的应用。
在一个实施方式中，治疗性治疗包括一种或多种细胞毒素剂或细胞抑制剂的给予。适当的细胞毒素剂和细胞抑制剂包括，例如，紫杉醇、来那度胺（Lenalidomide）、泊马度胺（Pomalidomide）、表柔比星（Epirubicin）、5FU、舒尼替尼（Sunitinib）、拉帕替尼（La-patinib）、卡奈替尼（Canertinib）、环磷酰胺、多柔比星（doxorubicin）、来那度胺/地塞米松（Lenalidomiden/Dexamethason）、泊马度胺/地塞米松（Po-malidomide/Dexamethasone）、卡铂（Carboplatin）、雷帕霉素（Rapamycin）、米托蒽醌（mitoxantron）、奥沙利铂（oxaliplatin）、多西紫杉醇（多西他赛，docetaxel）、长春瑞滨（vinorelbin）、长春新碱（vincristine）和它们的任何组合。高度优选的是给予多柔比星和/或长春新碱与来源于成体干细胞的MV的组合，因为已经显示了这样的组合发挥协同效应（参见图13）。
局部地或系统地（全身性地，systemically）将微泡给予需要其的患者。适于局部的和系统给药的药物剂型是例如可注射的剂型。借助于实例，在实体瘤中通过局部的肿瘤内（i.t.）注射，或在实体瘤和转移性肿瘤的两种情况中，通过静脉内注射或灌输给予微泡。待给予的适当的MV剂量取决于多种因素，但是通常包含在0.1至200微克/kg接受者体重之间，优选1-150微克/kg接受者体重，甚至更优选地3-120微克/kg接受体体重。
如本文中使用的表述“来源于成体干细胞的微泡（MV）”涉及至少部分来源于成体干细胞的膜颗粒。依次，术语“成体干细胞”包括能够增殖（自我更新（self-renewal））和分化（可塑性）的任何未分化或部分未分化的细胞，因此替代已经达到它们的生命周期的末端的特定的细胞谱系的成熟细胞。如本说明书中使用的术语“成体干细胞”包括具有无限的自我更新能力和多能性可塑性的两种干细胞、和具有多能可塑性（multipotentplasticity）且在某些情况中有限的更新能力能力的祖细胞。在优选的实施方式中，具有多能性或多能可塑性的“成体干细胞”意味着，它们能够分化成至少两个、更优选至少三个不同类型专门的完全分化的成熟细胞。
在本说明书的背景内，与从胚泡的内细胞团分离的“胚胎干细胞”形成对比，表述“成体干细胞”用于指从成体组织分离的干细胞。成体干细胞（adult stem cell）也称为“体干细胞（somatic stem cell）”。
在本说明书的背景内，表述“来源于成体干细胞的微泡（MV）”用于指微泡直接来源于未分化的干细胞。
在本说明书的背景内，表述“直接”是指微泡来源于在获得微泡之前没有进行或发生任何分化步骤的未分化的成体干细胞。
本发明中使用的来源于成体干细胞的微泡在外形上通常是球形且具有在100nm至5μm范围内的直径，更典型地在0.2至1μm之间的直径。如果颗粒在外形上不是球形，则上述提及的值是指颗粒的最大尺寸。
如本说明书的实验部分中描述的，可以分离从其获得用于本发明中微泡的干细胞。然后，例如，如本说明书的实验部分中公开的通过超速离心法，可从分离的干细胞的上清液获得微泡（MV）。然后，在具有一种或多种低温防护剂（cryoprotecting agent）的悬浮液中，在非常低的温度下，例如，在-80°C下，通过冷冻存储分离的MV，直到使用。适当的低温防护剂是例如二甲亚砜（DMSO）和甘油。使用细胞悬浮液的体积的1%的浓度的DMSO保证细胞的良好的保存、和对再灌输患者的有限的毒性作用。可称作低温防护剂的其他物质是细胞外低温防护剂，即，在细胞表面上担当形成减少细胞内脱水作用的紧密屏障（tight barrier）的高分子量物质。
从下列实施例将更加清晰地看出本发明的进一步的目的和优势，所述实施例仅为了说明而提供。在实施例中，参考下列附图。
图1A和B显示，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用不同剂量的微泡（MV）对HepG2细胞（图1A）和KS细胞（图1B）的孵育显著地抑制了增殖。在利用经RNA酶（RNase）预处理或不经RNA酶预处理的来自BM-MSC或来自G1-MSC的不同剂量的MV（1、10和30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法（BrdU incorporation assay）评价HepG2和KS细胞的增殖。以3次实验的平均值±SD表示结果。
图2A和B显示，与利用单独的媒介物和以同样方式的多柔比星刺激孵育对照相比，利用MV对HepG2和KS细胞的孵育显著地促进凋亡。以在利用（经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的）来自BM-MSC或Gl-MSC的不同剂量的MV的孵育24小时和/或48小时后，凋亡细胞的百分数，通过Tunel法评价HepG2和KS细胞的凋亡。以3次实验的平均值±SD表示结果。
图3A和3B显示，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用来自BM-MSC的30μg/ml MV对MCF-7细胞（图3A）和SKOV-3细胞（图3B）孵育48小时显著地抑制增殖。在利用来自BM-MSC或来自Gl-MSC的30μg/ml MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价MCF-7和SKOV-3细胞的增殖。以3次实验的平均值±SD表示结果。
图4显示，来自BM-MSC的MV诱导G0/G1阶段细胞的增加，特别是SKOV-3细胞。在利用10%FCS、耗尽FCS（饥饿（缺乏，starvation））和在有30μg/ml的MV存在的情况下培养24小时的SKOV-3细胞中测量DNA含量。观察在有MV存在的情况下G0/G1阶段中的细胞数目的增加。
图5A和5B显示进行评价MV对体外血管生成的作用的实验结果。评价HUVEC和TEC在基质膜（基质胶，Matrigel）内形成毛细管样结构的能力。
图6显示进行评价MV对体外凋亡的作用的实验结果。以在利用不同剂量的MV孵育48小时之后凋亡细胞的百分比，通过Tunel法评价HUVEC和TEC的凋亡。
图7显示进行评价MV对TEC的增殖作用的实验结果。在利用经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的来自BM-MSC的不同剂量的MV（10和30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价TEC的增殖。以2次实验的平均值±SD表示结果。
图8显示，肿瘤内给予具有HepG2异种移植肿瘤的SCID小鼠，经RNA酶处理或不经RNA酶处理的MV的体内抗肿瘤活性。通过植入物的两个垂直的直径的测径法每周测定肿瘤块（tumor mass）。以肿瘤块的增量的百分比显示结果：按照惯例将在第一次治疗的肿瘤块（在HepG2注射之后的1周）固定为100%值。
图9显示来源于BM-MSC的MV减少体内肿瘤生长。A）利用（右侧）或不利用（左侧）来自BM-MSC的MV治疗的具有HepG2肿瘤的小鼠的典型实例。B）利用（右侧）或不利用（左侧）来自BM-MSC的MV治疗的离体的HepG2肿瘤的典型实例。C）利用（右侧）或不利用（左侧）来自BM-MSC的MV治疗的HepG2肿瘤的苏木精和曙红染色。
图10显示具有RNA酶的MV的预处理取消来源于BM-MSC的MV的抗肿瘤活性。A）利用MV-RNA酶处理的离体的HepG2肿瘤的典型实例。B）利用MV-RNA酶处理的HepG2肿瘤的苏木精和曙红染色。
图11是显示HepG2上的BrdU-基础的增殖实验的结果的图。在单独的DMEM中或利用来源于HLSC的不同剂量的MV补充的DMEM中培养HepG2。在3天后，利用BrdU掺入法量化HepG2增殖。
图12是显示在HepG2细胞上凋亡实验的结果的图。在只有DMEM中，或在具有10%FCS和利用长春新碱（100ng/ml）、或MV-HLSC（30μg/ml）、或MV-HLSC（利用RNA酶预处理的，30μg/ml）补充的DMEM中培养HepG2细胞。在24小时之后进行分析。
图13是显示在基础条件下的HepG2细胞，或利用长春新碱、多柔比星、MV-HLSC、或利用长春新碱加MV-HLSC以及多柔比星加MV-HLSC处理的HepG2细胞上凋亡实验的结果的图。
图14是显示在MV-HLSC（n＝3）、媒介物（n＝2）或MV-HLSC（n＝3）RNA酶处理、i.t.处理之后，在小鼠处死时，通过测量重获的HepG2肿瘤的肿瘤体积获得的数据的图。每周通过利用测径器测量植入物的两个垂直直径来测定肿瘤体积。
图15显示了示出通过HLSC-MV治疗的体内肿瘤生长的抑制和诱导的肿瘤内凋亡的显微照片。A）显示在4周之后重获的HepG2肿瘤的凋亡、PCNA和苏木精和曙红染色的典型的显微照片。B）显示来自MV治疗的小鼠重获的HepG2肿瘤的凋亡、PVNA和苏木精和曙红染色的典型的显微照片。C）显示来自MV-RNA酶处理的小鼠重获的HepG2肿瘤的凋亡、PVNA和苏木精和曙红染色的典型的显微照片。
图16是显示通过利用不同浓度的HLSC-MV孵育MCF-7细胞进行体外增殖试验的结果的图。在利用来源于HLSC细胞的2、10、15和30μg/ml的MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价MCF-7细胞的增殖。一式三份进行实验。P<0.05。
图17显示通过利用不同浓度的HLSC-MV孵育卡波西细胞（Kaposicell）（KS）进行体外增殖试验的结果的图。在利用来源于HLSC细胞的2、10、15和30μg/ml的MV孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价卡波西细胞的增殖。一式三份进行实验。P<0.05。
图18是显示通过利用HLSC-MV孵育MCF-7细胞和卡波西细胞进行体外凋亡试验的结果的图。以在利用不同剂量的MV（2；10；15；和30μg/ml和30μg/ml的RNA酶处理的MV）孵育48小时之后凋亡细胞的百分比，通过TUNEL法评价凋亡。多柔比星用作凋亡诱导的阳性对照。在阴性对照中，利用单独的媒介物处理MCF-7细胞和卡波西细胞。一式三份进行实验。P<0.05。
1.来自间质干细胞（MSC）的微泡（MV）
1.1MSC的分离和表征
在蔗聚糖（Ficoll）梯度上将骨髓细胞分层（密度：1022g/ml；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO），且在1500rpm下离心30分钟。在有间质干细胞基础培养基（MSCBM,Lonza）存在的情况下培养单核的细胞。在培养5天后，更换培养基。为了展开分离的细胞，在37°C下通过胰酶处理5分钟分离粘连的单层，在15天用于第一次传代和每隔7天用于后续的传代。以10,000个细胞/cm2的密度接种细胞，且使用不晚于传代6次的细胞。
如在Bruno S et al.Isolation and characterization of residentmesenchymal stem cells in human glomeruli.Stem Cells Dev.2009;18:867-880中描述的，从外科去除的肾的皮层的正常部分获得来自肾小球的MSC群（Gl-MSC）。在皮层解剖之后，利用标准建立的技术收集肾小球悬浮液：在通过分级系列的网眼（60目和120目）之后，在120网眼筛的顶部重获肾小球。然后在通过自发的沉淀（室温下10分钟）在圆锥管的底部收集肾小球，且通过利用10ml吸液管吸入/排出的几个循环机械地且通过利用胶原酶I（Sigma,St.Louis,MO）消化2分钟酶促地剥离肾小囊（Bowman’s capsule）的脏层。然后在通过自发沉淀以便去除细胞和肾小囊的圆锥管的底部收集肾小球，和将其转移到纤连蛋白涂覆的T25烧瓶中（Falcon,BD Bioscience,Two Oak Park,Bedford,MA）。在有间质干细胞基础培养基（MSCBM,Lonza）存在的情况下培养肾小球。使细胞静置，以便在传代之前达到汇合；传代之间的间隔不同（3-7天）直到传代4次，从那时起其在约7天建立。
在每一次传代，对细胞计数且通过细胞荧光测定分析（cytofluorimetricanalysis）和免疫荧光对免疫表型进行分析。利用下列抗体进行细胞荧光测定分析，结合：抗-CD105、-CD29、-CD31、-CD146、-CD44、-CD90（Dakocytomation,Copenhagen,Denmark）；-CD73、-CD34、-CD45、-CD80、-CD86、-CD166、HLA-I（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen,San Jose,CA）；-CD133（Miltenyi Biotec,Auburn）；KDR（R&D Systems,Abington,U.K.）；-HLA-II（Chemicon International Temecula,CA）；-CD40（Immunotech,Beckman Coulter）、-CD154（Serotec,Raleigh,NC USA）单克隆抗体的所有的藻红蛋白（PE）或异硫氰酸荧光素（FITC）。小鼠IgG同型对照来自Dakocytomation。在4°C上，在含有0.1%牛血清蛋白和0.1%叠氮化钠的100μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行所有的孵育。对于每一个样品，在FACSCalibur细胞计数器（BD Biosciences Pharmingen）上分析10,000个细胞。基于阴性对照构造选通（gating）且所有进行的分析中都包括补偿对照。利用Cell Quest软件（BD Biosciences Pharmingen）产生关于每次实验的选通群的群百分比和数目。
在腔室载玻片（Nalgen Nunc International,Rochester,NY，USA）上培养的、在含有2%蔗糖的4%多聚甲醛中固定的且如果需要利用Hepes-Triton X 100缓冲液（Sigma,St.Louis,MO）渗透的MSC上进行间接的免疫荧光。使用下列抗体：小鼠单克隆抗波形蛋白（Sigma）和兔多克隆抗血管假性血友病因子（anti-von Willebrand factor）（Dakocytomation）。在适当的情况下，排除初级抗体或利用非免疫的兔或小鼠IgG的代替用作对照。Alexa Fluor 488抗兔和抗小鼠德克萨斯红（Texas Red）（Molecular Probes,Leiden，荷兰）用作第二抗体。利用ZeissLSM 5 Pascal Model Confocal Microscope（Carl Zeiss International,Germany）进行共聚焦显微镜法分析。添加Hoechst 33258染料（Sigma），用于核染色。
BM-MSC和GL-MSC制剂不表达造血标记如CD45、CD14和CD34。它们两者都不表达共刺激分子（co-stimulatory molecules）（CD80、CD86和CD40）和内皮标记（CD31、血管假性血友病因子、KDR）。在培养的不同传代上的所有的细胞制剂表达典型的MSC标记：CD105、CD73、CD44、CD90、CD166和CD146。它们也表达HLAI类。
如在Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and theirpotential as cardiac therapeutics.Circ.Res 2004;95:9-20中描述的测定MSC的脂肪形成、成骨形成和软骨形成的分化能力。简单地说，利用AdipogenicMedium（Lonza）培养MSC 3周。为了评价分化，利用4%多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟，且利用在甲醇（Sigma）中的0.5%Oil Red O（Sigma）在室温下将细胞染色20分钟。
通过在Osteogenic Medium（Lonza）中培养的MSC评估成骨形成的分化。每周更换培养基两次持续3周。为了评价分化，利用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，且利用Alizarin Red，pH 4.1（Lonza）在室温下染色细胞20分钟。
对于成骨形成分化，在15-ml圆锥形的聚丙烯管（Falcon BDBioscience）中，以150g将2.5×105MSC离心5分钟，且利用DMEM洗涤两次。在利用10ng/ml转移生长因子β3（Lonza）补充的软骨形成培养基（Chondrogenic medium）（Lonza）中培养（细胞）球粒（沉淀物，pellets）。每隔3天更换培养基，持续28天。在4%多聚甲醛中固定粒料过夜，和利用0.1%番红精O（Sigma）对石蜡包埋的切片（paraffin-embedded section）染色糖胺聚糖，和利用1%阿尔蓝（alcian blue）染色硫酸化蛋白多糖。
1.2来源于MSC的MV的分离和表征
从BM-MSC或GL-MSC的上清液中获得微泡（MV），其中在缺少FCS的RPMI和利用0.5%的BSA（Sigma）补充的RPMI中培养如上述描述获得的BM-MSC或GL-MSC。以2,000g离心过滤20分钟以便去除碎片之后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机）在4°C下将无细胞的上清液离心1小时，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid）（HEPES）25mM（Sigma）的无-血清的培养基199中洗涤，且在相同的条件下进行第二次离心。通过鲎试验（Limulus test）根据制造商的说明（Charles RiverLaboratories,Inc.,Wilmington,MA,USA）排除MV的内毒素污染物，且将MV贮藏在-80°C。
在选择性实验中，利用1U/ml RNA酶（Ambion Inc.,Austin,TX,USA）在37°C将MV处理1小时，通过添加10U/ml RNA酶抑制剂（Ambion Inc.）终止反应，且通过超速离心洗涤MV。
1.3利用来源于MSC的MV进行的体外实验
癌细胞系培养。在含有10%的胎牛血清（FCS,Euroclone）、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1%谷氨酰胺（所有的都来自Sigma）的低葡萄糖DMEM（Euroclone）中培养人肝癌细胞系（HepG2）、人乳腺癌细胞系（MCF-7）和人卵巢癌细胞系（SKOV-3），且维持在具有5%CO2的潮湿气氛的37°C的培养箱中。从在免疫抑制治疗下的具有肾异源移植的患者的皮肤伤口中获得卡波西肉瘤细胞（KS细胞）的初级培养，且在利用10%FCS、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链霉素补充的RPMI 1640培养基中培养。
肿瘤内皮细胞(TEC)：分离和培养。利用MACS系统（Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA），使用通过磁性细胞分选耦合到磁性珠上的抗-CD105Ab，从透明细胞类型肾细胞癌的样本中分离TEC。建立TEC细胞系，且维持在利用表皮生长因子（10ng/ml）、氢化可的松（1mg/ml）、牛脑提取物（所有的都来自Lonza）和10%FCS补充的内皮基础完全培养基（EBM）中。通过形态学、关于vWF抗原、CD105、CD146和血管内皮细胞钙依粘连蛋白（血管内皮钙黏蛋白，vascular endothelial-cadherin）的阳性染色、和关于细胞角蛋白和结蛋白阴性染色将TEC表征为内皮细胞（Bussolati Bet al.Altered angiogenesis and survival in endothelial cells derived from renalcarcinoma.FASEB J 2003;17:1159-1161）。
人脐静脉内皮细胞(Humbelical Vein Endothelial Cells）(HUVEC)：分离和培养。如先前描述的（Bussolati B et al.Vascular endothelial growthfactor receptor-1 modulates vascular endothelial growth factor-mediatedangiogenesis via nitric oxide.Am J Pathol.2001Sep;159(3):993-1008），从脐静脉获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），且维持在EBM和10%FCS中。在第二次或第三次传代的HUVEC上进行实验。
细胞增殖。以2,000或4,000个细胞/孔将HepG2、MCF-7、SKOV-3、KS细胞或HUVEC接种到96孔板中，其中所述96孔板处在具有经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的不同浓度的微泡的缺乏FCS的DMEM（Sigma）中。在培养48小时之后以将5-溴-2’-脱氧-尿苷（BrdU）掺入到细胞DNA中的方式，探测DNA合成。然后利用0.5M乙醇/HCl固定细胞和利用核酸酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU过氧化物酶-结合的mAb探测到DNA的BrdU掺入，且利用可溶解的发色体基质（Roche AppliedScience,Mannheim,Germany）显现。利用ELISA读取器在405nm处测量光学密度。
细胞周期分析。利用30μg/ml的MV的不同制剂刺激人类癌细胞系24小时，通过胰酶分离且在冷的80%乙醇中固定。将细胞维持在-20°C至少24小时，然后在PBS中洗涤。然后，在含有RNA酶（200μg/ml）（Sigma）和0.5%的诺乃洗涤剂P40（Nonidet P40）（Sigma）的溶液中，利用碘化丙啶（50μg/ml）（Sigma），在室温下孵育细胞1小时，以便染色DNA。对于每个样品，在FACSCalibur血细胞计数器（BD Biosciences Pharmingen）上分析50,000个细胞。
凋亡试验。将HepG2、MCF-7、SKOV-3、KS细胞、HUVEC或TEC以8,000个细胞/孔接种到96孔板中，其中所述96孔板处在具有10%FCS和存在多柔比星（100ng/ml，Sigma）或经或不经RNA酶预处理的不同浓度的MV（10和30μg/ml）的DMEM（Sigma）中。通过TUNEL法评估凋亡（ApopTag Oncor,Gaithersburg,MD,USA）。在处理24小时或48小时后，利用PBS洗涤细胞，在pH 7.41%多聚甲醛中在4°C下将细胞固定15分钟，在PBS中洗涤两次，然后在预冷的乙醇-乙酸2:1在-20°C下将细胞后固定5分钟。利用酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）处理样品。然后利用热的结合荧光素的抗地高辛（anti-digoxigenin）处理细胞，且在室温下孵育30分钟。在含有1μg/ml的碘化丙啶的培养基中制作样品，且通过免疫荧光分析细胞。以绿色荧光发射细胞（凋亡的细胞）相对于红色荧光发射细胞（总的细胞）的百分比表示结果。
体外血管形成。在4°C下利用生长因子-诱导的基质膜（BDBiosciences）涂覆24孔板，且在37°C，5%CO2，潮湿的气氛中孵育30分钟。以5×104个细胞/孔的密度，在存在或在缺少经RNA酶处理或不经RNA酶处理的不同浓度的MV的情况下，将HUVEC或TEC接种在处在具有5%FCS的RPMI或EBM中的基质膜涂覆的孔上。在孵育6小时之后，在尼康倒置的显微镜（Nikon）下观察细胞，且记录实验结果。以利用缩微图像分析系统（Cast Imaging）测量，以任意单位表达且在3个不同实验的副本孔中20×放大倍率下在5个不同的视场中评价的管状长度的平均值表示结果。
统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有数据。在适当的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较试验的ANOVA进行统计分析。
1.4体外结果
1.4.1来源于肿瘤细胞系上的BM-MSC和GL-MSC的MV的体外生 物学效应
在体外通过测量它们对于HepG2、MCF-7、SKOV-3和KS细胞系的抑制增殖和诱导凋亡的能力，评估来源于人类BM-MSC的MV的抗肿瘤活性。
图1显示了与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比利用不同剂量的MV对HepG2细胞（图1A）和KS细胞（图1B）孵育48小时显著地抑制增殖。
图2显示了与利用单独的媒介物和以相同方式的多柔比星刺激的孵育对照细胞相比利用MV对HepG2细胞（图2A）和KS细胞（图2B）孵育24小时和48小时显著地促进凋亡。
当利用RNA酶孵育MV以便诱导有MV运输（shuttle）的RNA的完全的降解时，减少由MV引出的对HepG2和KS细胞的抗增殖和促凋亡作用（图1和图2）。MV的RNA酶的处理本身不干扰由多柔比星诱导的癌细胞系的凋亡（图2）。
相反，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用来自BM-MSC的30μg/ml MV对MCF-7细胞和SKOV-3细胞孵育48小时显著地抑制增殖（图3A和3B），但是不促进凋亡。在这两种肿瘤细胞系中，发明人还已经利用碘化丙啶染色技术研究了细胞周期，以便与S和G2阶段中的细胞的比较，评价G0/G1阶段中的细胞百分比。发明人已经观察到，来自BM-MSC的MV诱导G0/G1阶段中的细胞的增加，特别是在SKOV-3细胞中（图4），其可解释利用BrdU掺入观察的增殖的抑制。
发明人还检验了来源于Gl-MSC的MV对肿瘤细胞系的增殖和凋亡的作用。Gl-MSCs不影响HepG2细胞系的增殖和凋亡。相反，来源于Gl-MSC的MV抑制KS细胞的增殖和诱导凋亡（图1和图2）。此外，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用来源于Gl-MSC的30μg/mlMV对MCF-7和SKOV-3细胞孵育48小时抑制增殖（图3），但是不促进凋亡。
1.4.2来源于人成纤维细胞的MV
来源于人成纤维细胞的MV不抑制不同的癌细胞系的增殖且不诱导凋亡（数据没有示出）。
1.4.3来源于BM-MSC的MV对内皮细胞的体外作用
发明人也已经研究了，来源于BM-MSC的MV对HUVEC和肿瘤内皮细胞（TEC）的增殖、凋亡和毛细管样（capillary-like）形成的体外作用。
MV处理不影响HUVEC的增殖（数据没有示出）和毛细管样形成能力（图5A）。另外，利用不同剂量的MV对HUVEC孵育48小时不诱导凋亡（图6）。
相反，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用不同剂量的MV对TEC孵育48小时显著地抑制增殖（图7）和促进凋亡（图6）。在利用经RNA酶预处理或不经RNA酶预处理的来自BM-MSC的不同剂量的MV（10和30μg/ml）孵育48小时之后，通过BrdU掺入法评价TEC的增殖。以2次实验的平均值±SD表示图7中的结果。
当利用RNA酶孵育MV时，显著地减少通过MV引出的对TEC的凋亡作用。利用不同剂量的MV，对接种在基质膜上的TEC的孵育显著地抑制TEC在体外形成管状结构的能力。利用RNA酶的MV的预处理取消了MV对细管形成的抑制作用（图5B）。
1.5利用来源于MSC的MV的体内试验
肿瘤形成。收集3×106个HepG2细胞且皮下地植入SCID小鼠（CharlesRiver,Jackson Laboratories,BarHarbor,ME）。利用胰酶-EDTA收获的培养细胞，利用PBS洗涤，在微型血细胞计数器腔室中计数，且在100μl DMEM和100μl基质膜基质（Matrigel Matrix）（Becton Dickinson）中重悬。在冰上冷冻细胞，且通过26号针利用1-ml注射器皮下地注入SCID小鼠的左后方。每天监视动物的活性和身体状态，且每隔3天进行体重的测定和肿瘤块的测量。以植入物的两个垂直的直径通过测径器测量法测定肿瘤块，且利用式1/2ax b2计算肿瘤块，其中a是长直径，和b是短直径（Hou J etal.Experimental therapy of hepatoma with artemisin and its derivatives:in vitroand in vivo activity，chemosensitization and mechanism of action.Clin CancerResearch.2008;14:5519-5530)）。在1周后，当植入的肿瘤达到大约15mm3体积时，发明人开始每周一次的MV的肿瘤内注射。第一次治疗利用100μgMV（经或不经RNA酶处理），以20μl的最大体积进行；随后的肿瘤内注射利用50μg的MV（经或不经RNA酶处理），以20μl的最大值进行。在对照小鼠中，发明人肿瘤内注射相同体积的单独的媒介物。将小鼠随机化分成三个治疗组：a）利用MV肿瘤内注射的组（n＝8）；b）利用经RNA酶处理的MV肿瘤内注射的组（n＝8）；和c）利用相同体积的单独的媒介物注射的对照组（n＝5）。在基质膜注射三周之后，处死小鼠，且重获肿瘤，且处理肿瘤用于组织学。
1.6体内结果
1.6.1来源于BM-MSC的MV对HEPG2肿瘤生长的体内生物学效应
在SCID小鼠中，通过来源于BM-MSC的MV抑制肿瘤形成和生长。为了测定来源于BM-MSC的MV在体内对肿瘤形成和生长的作用，在有基质膜存在的情况下利用HepG2皮下地注射SCID小鼠。在注射后一周，当肿瘤的体积大约是15mm3时，发明人开始利用MV（经RNA酶处理或不经RNA酶处理），以20μl的最大体积，每周一次地对小鼠肿瘤内注射。第一次治疗利用100μg的MV；随后的肿瘤内注射利用50μg的MV。在对照的小鼠中，发明人肿瘤内注射20μl单独的媒介物。
在基质膜注射三周后，重获所有的肿瘤且进行分析。在HepG2异种移植模型中，MV肿瘤内注射显示对肿瘤生长的抑制剂作用（图8）。在利用MV治疗的SCID小鼠中肿瘤的大小和体积显著更小（图9A和B），组织学分析显示利用MV治疗的HepG2肿瘤中的坏死的区域（图9C）。利用经RNA酶预处理的MV注射的肿瘤在大小和组织学方面与对照肿瘤没有不同（图10A和B）。
2.来自肝干细胞的微泡（MV）
2.1成人肝干细胞（HLSC）的分离和表征
从来自Cambrex Bio Science Verviers S.p.r.l.（Verviers,Belgium）获得的人类冷藏保存的正常肝细胞分离HLSC，将其培养在利用L-谷氨酰胺（5mM）、Hepes（12mM，pH 7.4）、青霉素（50IU/ml）、链霉素（50μg/ml）（所有都来自Sigma，St.Louis）、FCS（10%）补充的最小的基本培养基/内皮细胞基础培养基-1中（α-MEM/EBM）（3:1）（Gibco/Cambrex）。将展开的细胞转移到T-75烧瓶中，且当它们接近汇合（confluence）时进行分析。
在含有10%胎牛血清（FBS）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）（低葡萄糖）中培养肝瘤细胞系HepG2。
2.2来源于HLSC的MV的分离
从在利用2%胎牛血清（FBS）补充的MEM-α中培养的HLSC的上清液中获得MV。通过台盼蓝拒染法（trypan blue exclusion）探测在没有血清的情况下孵育过夜的细胞的生存能力。在以2000g离心20分钟以便去除碎片后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机）在4°C下将无细胞的上清液离心1h，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）25mM（Sigma）的无血清培养基199中洗涤，且在相同的条件下进行第二次超速离心。为了跟踪在体外和体内通过荧光显微镜法或FACS分析的MV，利用插入脂质双分子层PKH26染料（Sigma）的红色荧光脂肪族发色团标来自干细胞的MV。在标记之后，洗涤MV，且以100,000g在4°C下超速离心1h。在培养基199中悬浮MV粒料，且通过布拉德福德方法（BioRad,Hercules,CA）量化蛋白质含量。通过鲎试验根据制造商的说明（Charles River Laboratories,Inc.,Wilmington,MA）排除MV的内毒素污染物，且将MV贮藏在-80°C。在利用碘化丙啶着色之后，在MV悬浮液上进行形态学分析，不显示凋亡小体的存在。
在选择性试验中，利用1U/ml RNA酶（Ambion Inc.,Austin,TX），在37°C将来自HLSC的MV处理1h，通过加入10U/ml RNA酶抑制剂（Ambion Inc.）来终止反应，且通过超速离心洗涤MV。在利用TRIZOL试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA）进行RNA提取之后，通过总的抽出的RNA的分光光度计分析评价RNA酶处理的功效（未处理的：1.3±0.2μg RNA/mg蛋白质MV；RNA酶处理的：<0.2μg RNA/mg蛋白质MV）。另外，通过寡dT驱动的逆转录（retrotranscription）标记从经RNA酶处理的和未经RNA酶处理的MV提取的RNA，且在0.6%琼脂糖凝胶上分析，以便显示通过RNA酶处理的RNA的完全的降解。作为对照，利用1U/ml DNA酶（Ambion Inc.）在37°C将MV处理1h。
2.3利用从HLSC分离的MV进行的体外实验
增殖分析。根据制造商的说明，利用酶联免疫吸附测定试剂盒（Chemicon,Temecula,CA），以将5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入到细胞DNA中的方式，探测DNA合成。简要地，在洗涤之后，利用10mol/l BrdU在37°C、5％CO2、潮湿的气氛中将细胞孵育6至12小时，利用0.5mol/L乙醇/HCl固定细胞，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗BrdU过氧化物酶结合的单克隆抗体探测掺入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的发色基质显现。利用酶联免疫吸附测定读取器在405nm下测量光学密度。
凋亡分析。利用终端dUTP缺口末端标记实验（terminal dUTP nickendlabeling assay）（ApoTag;Oncor,Gaithersburg,MD）评价凋亡。在96孔板中培养细胞（8×103/孔），在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中悬浮细胞，且在pH7.4的PBS中的1%多聚甲醛中在4°C将细胞固定15分钟，接着通过预冷却的乙醇/乙酸（2:1）在-20°C下固定5分钟。利用终端脱氧核苷酸转移酶处理细胞，且在潮湿的腔室中在37°C下孵育1小时，然后利用加温的异硫氰酸荧光素-结合的抗地高辛（antidigoxigenin）在室温下处理30分钟。在洗涤之后，在含有1g/ml的碘化丙啶的培养基中制作样品，且通过免疫荧光法分析细胞。
统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有的数据。在适当的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较检验的ANOVA进行统计分析。
2.4体外结果
2.4.1来源于HLSC的MV对HepG2肝瘤细胞系增殖的影响
发明人评价来源于HLSC的MV对HepG2增殖的影响。简要地，利用原样或经RNA酶处理3天的不同剂量（10、20和30μg/ml）的HLSC来源的MV孵育HepG2细胞。在孵育的最后，对HepG2培养物计数，或在0.5M乙醇/HCl中固定，且利用核酸酶孵育以便消化DNA。利用抗-BrdU过氧化物酶-结合的mAb探测掺入到DNA中的BrdU，且利用可溶解的发色基质显现。利用ELISA读取器在405nm下测量光学密度。如图11显示的，来源于HLSC的MV能够显著地抑制HepG2增殖。这也适用于RNA酶处理的MV。
2.4.2来源于HLSC的MV对HepG2肝瘤细胞系凋亡的影响
评价HLSC来源的MV诱导HepG2凋亡的能力。简要地，以8,000个细胞/孔的密度将HepG2接种到处在具有10%FCS的DMEM中的96孔板中，且在没有FCS的情况下通过培养，通过利用长春新碱（100ng/ml），或多柔比星（50ng/ml），在癌症化学疗法中使用的两个有丝分裂抑制剂处理，或通过MV处理（30μg/ml）诱导凋亡。作为对照，也利用1U/mlRNA酶18（Ambion,Austin,TX）在37°C将MV处理1小时，以便评价对于癌细胞生长的抑制的贡献是否依赖于通过MV传递给癌细胞的mRNA的横向转移。在24和72小时下，利用TUNEL法分析评价凋亡。如图12显示的，与通过长春新碱诱导的相比，来源于HLSC的MV能够诱导HepG2凋亡。相反，RNA酶处理不能诱导凋亡。另外，如图13示出的，利用长春新碱加MV-HLSC或多柔比星加MV-HLSC的HepG2的处理导致累加效应（additive effect）。
2.5利用从HLSC分离的MV进行体内实验
细胞培养。在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链霉素补充的DMEM中培养人类肝瘤细胞HepG2，且维持在37°C下具有5%CO2的潮湿气氛的培养箱中。
在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、和100μg/ml链霉素补充的α-MEM/EBM(3:1)中培养人类肝干细胞（HLSC）。利用hEGF（人类上皮生长因子）、氢化可的松（Hydrocortisone）、GA（庆大霉素）、BBE（脑牛提取物）重新构建EBM。
来自HLSC的微泡(MV）的分离。从在利用2%胎牛血清补充的α-MEM培养基中培养的HLSC的上清液中获得MV。以2,000g离心20分钟以便去除碎片后，以100,000g在4°C下将无细胞的上清液离心1h，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）25mM的无血清培养基199中洗涤，且在相同的条件下经受第二次超速离心。在0.1%的DMSO中的培养基199中悬浮MV粒料，且利用布拉德福德（Bradford）方法量化蛋白质含量。
实验设计。从Charles River实验室获得雌性4至5个月大的SCID小鼠。所有的小鼠都住在干净的设施中且保持1周，以便使其适应新环境。在第0天，进行3×106个HepG2肿瘤细胞的两次注射，其中所述肿瘤细胞重悬在1:1的比率的具有基质膜基础膜基质的无血清的DMEM中。将细胞悬浮液以0.2ml的总体积注入SCID小鼠的左腹股沟区域。将所有的小鼠随机地分成三个治疗组：20μl肿瘤内（i.t.）MV注射（n＝3）；20μl i.t.PBS注射（n＝2）和20μl i.t.MV-RNA酶处理的注射（n＝3）。在第7天，开始后肿瘤细胞移植处理。从第7天时起肿瘤成为可觉察的；在肿瘤移植之后7、12、14、和18天，注射悬浮在利用0.1%DMSO补充的M199中的50或100μgMV。当肿瘤漂洗大约15mm3的体积时开始处理。每天监视动物的行动和身体状态，且每隔3天做出体重的测定和肿瘤块的测量。
利用测径器测量肿瘤。通过测径器探测肿瘤块，在移植物的两个垂直的直径中测量，且利用式1/2a x b2计算，其中a是长直径和b是短直径。在第28天处死动物，且收集肿瘤用于进一步的分析。
形态学研究。在10%缓冲的中性福尔马林中固定肿瘤，常规地进行处理，包埋在石蜡中，以5μm切割，且利用H&E染色，以便微观检查。利用抗PCNA单克隆抗体进行用于增殖探测的免疫组织化学。封闭切片且利用抗小鼠HRP二抗（1:300稀释）标记。省略初级抗体或利用非免疫的小鼠IgG的取代用作对照。在石蜡包埋的肿瘤切片中通过TUNEL评价凋亡。在630X放大倍率下计算十个非连续的切片的凋亡阳性的肿瘤细胞。添加Hoechst 33258染料，用于核染色。
统计分析。以平均值±SD表示不同的实验进程的所有的数据。在适当的情况下，通过具有Newmann-Keuls多重比较检验的ANOVA进行统计分析。
2.6体内结果
2.6.1通过来源于SCID小鼠中肝细胞瘤异体移植模型中的HLSC的 MV抑制肿瘤生长和增殖
为了确定来源于HLSC的MV对体内肿瘤生长的作用，利用人类肝癌细胞系HepG2皮下植入SCID小鼠。在注射HepG2后的一周和两周，当肿瘤体积是大约15mm3时，利用MV的肿瘤内注射（50或100μg），以最大量20μl的体积治疗小鼠。在对照小鼠中，利用20μl单独的媒介物对肿瘤注射。在HepG2注射的三周和四周之后，重获所有的肿瘤且进行分析。在这种异体移植模型中，MV的肿瘤内注射（图14）显示对肿瘤生长的抑制剂作用。另外，组织学分析显示利用MV治疗的肿瘤中坏死的区域（图15B），和利用PCNA染色观察抗增殖作用（图15B）。
2.6.2通过来源于SCID小鼠中的肝细胞瘤异体移植模型中的HLSC 的MV的凋亡的诱导
为了确定在肿瘤内凋亡中的作用，通过TUNEL分析来自利用MV治疗的肿瘤的石蜡切片。与利用单独的媒介物处理的肿瘤相比，MV治疗诱导凋亡（图15A）。
2.7来源于HLSC的MV对MCF-7乳腺癌和卡波西肉瘤（KS）细胞 的体外生物学效应
2.7.1材料和方法
细胞培养。在利用10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的α-MEM/EBM（3:1）中培养人类非卵肝干细胞（HLSC）。利用hEGF（人上皮生长因子）、氢化可的松、GA（庆大霉素）、BBE（脑牛提取物）重新构建EBM。
从American Type Culture Collection（Manassas,VA）获得MCF-7乳腺癌细胞系，且在利用10%FCS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的DMEM中培养MCF-7乳腺癌细胞系，且维持在37°C下具有5%CO2的潮湿的气氛的培养箱中。
从在免疫抑制力治疗下的具有肾异源移植的患者的皮肤伤口中获得卡波西肉瘤细胞（KS细胞）的初级培养，且在利用10%FCS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素补充的RPMI 1640培养基中培养。
MV的分离。从在利用2%胎牛血清（FBS）补充的MEM-α中培养18个小时的HLSC的上清液中获得MV。在选择性的实验中，在没有FBS存在的情况下收集MV。通过台盼蓝拒染法探测在2%的FBS和没有血清时过夜孵育的细胞的生存能力（大于90%，数据没有显示）。在以2,000g离心20分钟以便去除碎片后，以100,000g（Beckman Coulter Optima L-90K超速离心机）在4°C将无细胞的上清液离心1h，在含有N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）25mM的无血清培养基199中洗涤，且在相同的条件下进行第二次超速离心。在培养基199中悬浮MV粒料，且通过布拉德福德方法量化蛋白质含量。将MV贮藏在-80°C。在利用碘化丙啶染色之后，在MV悬浮液上进行形态学分析，不显示凋亡小体的存在。
RNA酶处理。在选择性实验中，利用1U/ml RNA酶在37°C下将来自HLSC的MV处理1h。通过加入10U/ml的RNA酶抑制剂而终止反应，且通过超速离心法洗涤MV。
细胞增殖。为了研究来源于HLSC的MV是否对来源于各种肿瘤的细胞系发挥它们的抗肿瘤活性，将MCF-7乳腺癌细胞和卡波西肉瘤细胞以8,000个细胞/孔接种到分别处于DMEM和RPMI中的96孔板中，具有不同的MV浓度（2；10；15；和30μg/ml和30μg/ml RNA酶处理的MV）。在培养48小时之后以将5-溴-2’-脱氧-尿苷（BrdU）掺入到细胞DNA中的方式，探测DNA合成。然后利用0.5M乙醇/HCl固定细胞和利用核酸酶孵育，以便消化DNA。利用抗BrdU过氧化物酶-结合的mAb探测到DNA的BrdU掺入，且利用可溶解的发色基质显现。利用ELISA读取器在405nm处测量光学密度。
凋亡实验。将MCF-7和KS细胞以8,000个细胞/孔接种到处于具有10%FCS的低葡萄糖DMEM中且在存在多柔比星（100ng/ml）或不同浓度的MV（2；10；15；和30μg/ml和30μg/ml的RNA酶处理的MV）的96孔板中。利用TUNEL法评价凋亡。
2.7.2结果：来源于HLSC的MV抑制MCF-7细胞和KS细胞的体外 增殖
与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用2、10、15和30μg/ml的来源于HLSC-6B细胞的MV（图16和17），对MCF-7乳腺癌细胞和卡波西肉瘤细胞孵育48小时显著地抑制细胞增殖。这些结果显示，组织固有的干细胞的抗肿瘤作用并非特异性地对抗来源于相同组织的肿瘤。此外，与利用单独的媒介物孵育的对照细胞相比，利用2、10、15和30μg/ml的来源于HLSC-6B细胞的MV（图18），对MCF-7乳腺癌细胞和卡波西肉瘤细胞孵育48小时可诱导凋亡，具有类似于多柔比星，一种化学治疗药物的作用。这进一步证实，组织固有的干细胞的抗肿瘤作用并非特异性地对抗来源于相同组织的肿瘤。

Claims (20)

1.一种来源于成体干细胞的微泡（MV），用于治疗性治疗肿瘤疾病。
2.根据权利要求1所述的微泡（MV），其中，所述成体干细胞选自由间质干细胞和肝干细胞组成的组。
3.根据权利要求2所述的微泡（MV），其中，所述成体干细胞选自由来源于骨髓的人类间质干细胞（BM-MSC）、来源于去被膜的肾小球的人类间质干细胞（Gl-MSC）和人类非卵肝干细胞（HLSC）组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的微泡（MV），其中，所述肿瘤疾病选自由肝肿瘤、上皮肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤和卵巢肿瘤组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微泡（MV），其中，肿瘤疾病的治疗性治疗包括给予需要其的患者MV剂量，所述MV剂量包括在0.1至200微克/kg患者体重之间，优选1-150微克/kg患者体重，甚至更优选3-120微克/kg患者体重。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微泡（MV），所述微泡处于适合于局部或系统给药的药物剂型。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微泡（MV），其中，所述治疗性治疗包括一种或多种细胞毒素剂和/或细胞抑制剂的给予。
8.根据权利要求7所述的微泡（MV），其中，所述细胞毒素剂和/或细胞抑制剂选自由紫杉醇、来那度胺、泊马度胺、表柔比星、5FU、舒尼替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、环磷酰胺、多柔比星、来那度胺/地塞米松、泊马度胺/地塞米松、卡铂、雷帕霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、多西紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱和它们的任何组合组成的组。
9.根据权利要求8所述的微泡（MV），其中，所述细胞毒素剂和/或细胞抑制剂是多柔比星或长春新碱。
10.一种治疗性治疗肿瘤疾病的方法，包括给予需要其的患者治疗有效量的来源于成体干细胞的微泡。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述成体干细胞是间质干细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述成体干细胞是来源于骨髓的人类间质干细胞（BM-MSC）或来源于去被膜的肾小球的人类间质干细胞（Gl-MSC）。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述成体干细胞是肝干细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述肝干细胞是非卵肝干细胞（HLSC）。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤疾病选自由肝肿瘤、上皮肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、前列腺肿瘤、胃肿瘤、结肠肿瘤和卵巢肿瘤组成的组。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤疾病的治疗性治疗包括给予需要其的患者MV剂量，所述MV剂量包括在0.1至200微克/kg患者体重之间，优选1-150微克/kg患者体重，甚至更优选3-120微克/kg患者体重。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述微泡（MV）通过局部或系统途径给予。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述治疗性治疗还包括一种或多种细胞毒素剂和/或细胞抑制剂的给予。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述细胞毒素剂和/或细胞抑制剂选自由紫杉醇、来那度胺、泊马度胺、表柔比星、5FU、舒尼替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、环磷酰胺、多柔比星、来那度胺/地塞米松、泊马度胺/地塞米松、卡铂、雷帕霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、多西紫杉醇、长春瑞滨、长春新碱和它们的任何组合组成的组。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述细胞毒素剂和/或细胞抑制剂是多柔比星或长春新碱。
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