CN102766640B

CN102766640B - 一种制备甲型流感病毒全长m2蛋白的方法

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Publication number: CN102766640B
Application number: CN 201210241084
Authority: CN
Inventors: 吕宏亮; 张澍; 徐明伟
Original assignee: BEIJING JIANXIANG HEMU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Bi Wei Antai Technology Co., Ltd.
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: CN102766640A

Abstract

本发明公开了一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，属于生物技术领域。本发明采取原核表达系统，融合了纯化标签，结合了不同裂解剂的性质进行抽取，通过规模表达、提取和亲和纯化，使M2蛋白纯度达98%以上并具有生物活性（非包涵体形式，可溶性），采用15升的发酵罐进行发酵可得1~1.5mg的M2蛋白，可满足M2蛋白结构与功能的研究，如X-ray、质谱，也满足M2蛋白为基础的生物制备研究，如疫苗、治疗性抗体、诊断试剂等。

Description

一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白的制备方法，特别涉及一种甲型流感病毒全长M2蛋白的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

M2蛋白是甲型流感病毒的非糖基化跨膜蛋白，由97个氨基酸组成，并且形成一个同源四聚体，具有离子通道、调节pH、帮助病毒脱壳的作用。

M2蛋白通常在病毒中含量少，而在感染的细胞中大量存在，相比于流感病毒的血凝素、神经氨酸酶的变异性，M2蛋白在所有甲型流感病毒中高度保守，几乎所有的流行株M2蛋白的序列同源性一样。经过10年的研究证实，M2蛋白的抗体可限制流感病毒的复制，减少动物的患病率、死亡率，以M2蛋白作为抗原研制的疫苗经动物实验表明安全有效（吕宏亮，刘松友，董小曼等.干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫的佐剂作用[J].医学研究杂志，2008，37(11):97-99；Tompkins S M,ZhaoZ S,Lo C Y，et al.Matrix protein 2 vaccination and protection against influenza viruses,including subtype H5N1[J].Emerg Infect Dis,2007,13(3):426-435.）。

M2蛋白由于其高度疏水，且在流感病毒中含量甚微，所以提取或制备难度大，尚无全长M2蛋白制备的报道，为研究M2蛋白的抗原性、结构以及免疫学作用，本发明提出了全长流感病毒M2蛋白的制备方法及由制备得到的M2蛋白进一步获得多克隆抗体。

流感的预防、控制，无论季节性、大流行出现的变异，需要每年更换疫苗株，以疫苗株制备的诊断、预防、治疗的生物制品则需要长达6~8个月的周期。

甲型流感病毒M基因编码的M2蛋白在各亚型之间高度保守，以四聚体的形式存在。甲型流感病毒M2蛋白在甲型流感病毒H1、H3、H5、H5、H7、H9亚型上高度保守。

甲型流感病毒的M2蛋白胞外区域M2蛋白单独或联合NP免疫，据报道能够诱导动物保护性反应。还有和载体蛋白结合的疫苗、多抗原肽、昆虫杆状细胞表达的M2蛋白、M2质粒疫苗，均能在动物上产生保护性免疫。

发明内容

在流感病毒中由于M2蛋白的含量少以及疏水性，其表达多采用真核系统进行表达，且其表达、提取、纯化的难度大，成本比较高。针对以上问题，本发明采取原核表达系统，融合了纯化标签，结合了不同裂解剂的性质进行抽取，通过规模表达、提取和亲和纯化，使M2蛋白纯度达98%以上并具有生物活性（非包涵体形式，可溶性），采用15升的发酵罐进行发酵可得1~1.5mg的M2蛋白，可满足M2蛋白结构与功能的研究，如X-ray、质谱，以M2蛋白为基础的生物制备研究，如疫苗、治疗性抗体、诊断试剂。

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因；

（2）基因合成后，插入克隆质粒；

（3）根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因序列，设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物，在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列，以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因，产物与用同样酶切后的pMAL-p2X表达质粒片段连接；

（4）连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL-p2X MBP-M2-6×His重组质粒；

（5）重组质粒pMAL-p2X MBP-M2-6×His接种LB培养基，按1:2000~1:300（V/V）转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养4~6h，菌液OD600达到0.5~0.6时，接种浓度0.5~0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物25~30g；

（6）细菌膜蛋白提取和纯化

a细菌膜蛋白提取

将步骤（5）得到的细菌培养物在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液中，超声破碎后以100,000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%（w/v）以便于后续纯化；

其中，所述的层析平衡液含有：20mmol/LTris,0.2mol/L NaCl,1mmol/L2-巯基乙醇，1mmol/L EDTA,20-120ml/L蛋白酶抑制剂，pH8.0；

其中，所述的裂解剂为1%Triton-X100;

b麦芽糖结合蛋白-M2纯化

在4℃条件下，10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含1.0%（v/w）Triton-X100平衡液平衡，以1ml/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱床体积含1.0%（v/w）Triton-X100平衡液冲洗，再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗，用含10mmol麦芽糖的平衡液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度和活性；

c酶切和纯化

按75-100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36-48h，使酶切程度达到90-95%，酶切后样品经缓冲液1(50mmol Sodium phosphate pH8.0,0.3mmolNaCl)充分透析，移入15ml离心管和已经平衡Ni+介质2ml在4℃条件下旋转混合4h，在常温以4000r/min离心1min除去上清，用缓冲液1充分洗涤，含0.25mmol/L咪唑的缓冲液1洗脱，即得。

在本发明中，优选的，所述的甲型流感病毒全长M2蛋白基因包括甲型流感病毒的所有型别，可以是来源于人、禽、猪、马等的甲型流感病毒疏水跨膜M2蛋白基因。

所述的甲型流感病毒全长M2蛋白基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示。

在本发明中，优选的，所述的克隆载体为pcDNA3.1。

在本发明中，优选的，步骤（3）中所述的引物为：

上游引物：5‘GGATCCCCCACGGCCACTGCTA-3’

下游引物：5‘-CTACTGGCTGACACCACCACCACCACCACAAGCTT-3′。

本发明还提供了由以上任一项所述的方法制备得到的甲型流感病毒全长M2蛋白。

进一步的，本发明还提供了所述的甲型流感病毒全长M2蛋白在制备甲型流感病毒全长M2蛋白抗体中的应用。及在制备预防甲型流感病毒引起的疾病的药物中的应用。

更进一步的，本发明还提供了抗所述的甲型流感病毒全长M2蛋白的抗体。及所述的抗体在制备预防甲型流感病毒引起的疾病的药物中的应用。

本发明应用大肠杆菌原核系统进行表达和制备，并被验证符合生物安全和GMP的规定。全长M2蛋白可以应用于疫苗、治疗性抗体的制备以及用于动物疾病防控监察。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1甲型流感病毒H1N1全长M2蛋白的制备

1、甲型流感病毒H1N1全长M2蛋白基因的人工合成与表达

（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因，所合成的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）基因合成后，插入克隆质粒pcDNA3.1；

（3）根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因，设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物，在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列，以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因，产物与用同样酶切后的pMAL-p2X表达质粒片段连接；

上游引物：5‘GGATCCCCCACGGCCACTGCTA-3’

下游引物：5‘-CTACTGGCTGACACCACCACCACCACCACAAGCTT-3′。

（4）连接产物转化大肠杆菌Nova-Blue，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL-p2XMBP-M2-6×His重组质粒；

（5）重组质粒pMAL-p2X MBP-M2-6×His接种LB培养基（含0.2%的葡萄糖，100μg/ml的氨苄），按1∶1000（V/V）转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养5h，菌液OD600达到0.6时，接种浓度0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物30g；

2、M2蛋白的提取、纯化

（1）细菌膜蛋白提取

将细菌培养物约60g在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液（20mmolTris,pH8.0,0.2mol NaCl,1mmol2-巯基乙醇，1mmolEDTA,20-120ml蛋白酶抑制剂）中，超声破碎后以100000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入裂解剂（1%Triton-X100）；在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例。提取物以100000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%（w/v）以便于后续纯化。

（2）麦芽糖结合蛋白-M2纯化

在4℃条件下，10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含1.0%（w/v）Triton-X100平衡液平衡，以1ml/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱床体积含1.0%（w/v）Triton-X100平衡液冲洗，再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗，用含10mmol/L麦芽糖的平衡液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度和活性。

（3）酶切和纯化

按75-100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36-48h，使酶切程度达到90-95%。酶切后样品经缓冲液1(50mmol Sodium phosphate pH8.0,0.3mmolNaCl)充分透析,移入15ml离心管和已经平衡Ni+介质2ml在4℃条件下旋转混合4h，在常温以4000r/min离心1min除去上清，用缓冲液1充分洗涤，含0.25mmol咪唑的缓冲液1洗脱，洗脱收集液用12%SDS-PAGE电泳分析。

实施例2蛋白印迹检测表达与抽取、纯化

细菌裂解液（100mM Tris-HCl，pH7.2，1mM EDTA，2%Triton-X100，0.5M KCl）、膜抽取物、MBP亲和层析纯化产物、Ni²⁺离子亲和纯化产物经12%SDS-PAGE电泳，转到CAPS（10mM3-cyclohexy（amino）-1-propanesulfonic acid（CAPS），pH10.5，0.5%W/V DTT，15%V/V methanol）缓冲液PVDF膜（Milliporo，0.45μm）上，电压65V，时间1h。PVDF膜在4℃用Superbolk PBS（Pierce产品，含0.05%Tween20）封闭过夜，用PBST（PBS含0.05%Tween20）洗涤3次。一抗为鼠抗M2e-HBcAg纯化多克隆抗体，用PBS稀释5000或10000倍，和PVDF膜室温下一起反应1h，再用PBST洗涤3次，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（1:10000稀释）室温下反应1h，HRP（辣根过氧化物酶）用ECL（Enhanced chemiluminescence）试剂检测，检测结果显示，大肠杆菌、抽取物、纯化产物均有M2蛋白，M2蛋白分子量约为15~18kD。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示

实施例3纯化全长M2多克隆抗血清的制备

可采用两种免疫策略进行动物免疫，获取高免血清。第一种采用含M2基质的真核表达质粒进行初免，加强免疫采用纯化的M2蛋白进行免疫，初免一周后，在2、3、4周进行免疫，4周以后的10天进行采血，分离血清，-20℃备用。第二种用MBP-M2融合蛋白进行初免，在2、3、4周进行加强免疫，4周后静脉采血，分离血清，-20℃备用。首免采用弗氏完全佐剂，后续免疫用弗氏不完全佐剂。

实施例4静脉注射抗体的纯化

1抗血清缓慢加入饱和硫酸铵使其终浓度为50%，轻轻搅拌。

24℃10000~12000rpm离心20min，弃掉上清，沉淀用适量PBS进行溶解，用饱和硫酸铵反复沉淀3次以上，用适量PBS溶解，4℃用30~50倍体积的PBS透析过夜，期间4~5h换液1次，共换液3~4次。

3根据抗体的注射方式（肌肉或静脉注射），可用1%的缓冲液（2.8mM二巯基乙醇，50mM醋酸钠）（W/W）在37℃、pH4.5消化20~24h，调节pH至8.0，获取抗体与Fc段。

4用GE公司的蛋白A亲和层析柱纯化，柱子用3~5倍柱床体积的结合缓冲液平衡，上样，再用3~5倍柱体积的结合缓冲液洗柱，用2~5倍洗脱液洗脱得到M2蛋白纯化多克隆抗体（Fab）₂段。

5用3~5倍柱体积PBS洗涤M2蛋白亲和层析柱（用Sepharose 4 B和纯化M2蛋白偶联而成），上样，冲洗（结合缓冲液），再用1~2倍洗脱液洗脱抗体（Fab）₂段。

实施例5 以全长M2蛋白为基础的疫苗免疫原性

1疫苗的配制

10μgM2蛋白（实施例1制备得到）+1000IUα类干扰素

15μgM2蛋白（实施例1制备得到）+0.7mg Al（OH）₃

5μgM2蛋白（实施例1制备得到）+等体积的兽用油佐剂进行乳化

2实验动物的选择，可根据疫苗的最后用途，选择小鼠、鸡、猪进行。

3免疫程序

实验动物根据体重和体积，分别肌肉或腹腔免疫疫苗20、30、50μg，3周后加强免疫一次，最后免疫的14天采血。

4攻毒试验

采用鼻腔攻击，根据实验动物种属和易感性，攻击毒选择致死性H1N1株，攻击量5~50LD₅₀，收集动物肺、气管，检测病毒感染、死亡情况。

5相对于M2e为抗原制备的疫苗，M2蛋白免疫原性更强，保护率更高。

实施例6 M2多克隆抗体的抗病毒作用

1实验动物分组，注射M2纯化多克隆抗体（由实施例3、4制备得到）。

22h后鼻腔感染高致病性的甲型流感病毒H5N1（国家流感中心提供）。

3相比于对照组、空白组，实验组90%产生保护没有发病死亡，而对照组（注射PBS）、空白组死亡率分别为90%、80%。

4M2纯化抗体的50%有效剂量PD50在小鼠、鸡、猪上分别是15、10、150μg。

5以上试验，在动物上证明是安全有效的，为流感的防控提供了有力的手段。

实施例7 感染与免疫动物的区别

对禽流感、猪流感、马流感的预防，免疫是有效、经济的手段，尽管传统的全病毒动物流感疫苗在流感预防、野毒传播方面发挥了重大作用，但免疫影响了流行病学调查和国际贸易，有必要区别自然感染和免疫动物以及持续感染的动物，标准的血清学方法ELISA、琼脂糖胶沉淀、血凝抑制（HI）等方法不能区分感染动物和免疫动物。由于根据M2蛋白的分布和含量特征以及全病毒免疫的特征，对动物的M2抗体检测而区分免疫动物和自然感染动物。

实验材料来源：

1鸡、鸭、猪、马等动物在动物安全三级条件下饲养，进行检疫和流感病毒检测，受试动物要求无流感病毒抗体。

2攻击毒株：A/chicken/china/2003，H5N1、H7N1、H9N2等，来源于国家流感中心或国家参考实验室。

3疫苗株H5N1、H5N9分别来自国家参考实验室;

4动物免疫：按疫苗说明书免疫动物，鸡的免疫程序。

对照组与免疫组分别接种疫苗、PBS，用100μl含107EID50的强毒口腔或肌肉攻击，2周后，测定HI抗体以及M2e抗体。

M2蛋白溶于纯水，使得M2蛋白的浓度达5μg/ml，加100μl于96孔板37℃过夜，用含10%马血清的PBS在4℃封闭2h，洗涤3次，加入100μl的1:500稀释液、动物待测血清在室温下作用1h，用PBST洗涤3次，再用HRP标记的抗动物IgG（1∶1000~1:5000稀释）室温下反应1h，加入HRP底物，反应20min，用1M磷酸终止反应，OD值大于未免疫动物抗血清平均值为阳性。用HI法、M2ELISA法测定比较不同组的动物的血清。结果发现，经本发明原核表达制备得到的M2蛋白可特异性地与M2抗体结合，能够对血清中M2抗体的含量进行检测，且灵敏度高，说明本发明的M2蛋白能够用于区分免疫动物和自然感染动物。

实施例8流感病毒免疫染色

MDCK细胞长成单层后（10⁷个细胞，75cm²的细胞瓶），感染10MOI的流感病毒PR8，37℃孵育15h，用PBS洗涤3次，用细胞铲轻轻刮下细胞重悬于1.2~1.5ml的PBS中。

预先用MDCK细胞吸收的抗M2、抗PR8血清纯化多克隆抗体，感染后的细胞分组，分别加入未稀释、10倍稀释的抗M2多克隆抗体，用FITC标记的鼠抗马抗体染色。结果表明本发明的未稀释、10倍稀释的抗M2多克隆抗体均能够与流感病毒PR8抗原结合。

实施例9甲型流感病毒H5N1全长M2蛋白的制备

1、甲型流感病毒H5N1全长M2蛋白基因的人工合成与表达

（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因，所合成的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

（2）基因合成后，插入克隆质粒pcDNA3.1；

（3）根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因，设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物，在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列，以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因，产物与用同样酶切后的pMAL-p2X表达质粒片段连接；所述的引物为：

上游引物：5‘GGATCCCCCACGGCCACTGCTA-3’

下游引物：5‘-CTACTGGCTGACACCACCACCACCACCACAAGCTT-3'。

（5）重组质粒pMAL-p2X MBP-M2-6×His接种LB培养基（含0.2%的葡萄糖，100μg/ml的氨苄），按1∶1500（V/V）转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养5h，菌液OD600达到0.5时，接种浓度0.5mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物25g；

2、M2蛋白的提取、纯化

（1）细菌膜蛋白提取

将细菌培养物约40g在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液（20mmolTris,pH8.0,0.2mol NaCl,1mmol2-巯基乙醇，1mmolEDTA,20-120ml蛋白酶抑制剂）中，超声破碎后以100000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例。提取物以100000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%（w/v）以便于后续纯化。

（2）麦芽糖结合蛋白-M2纯化

在4℃条件下，10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含1.0%（w/v）Triton-X100平衡液平衡，以1ml/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱床体积含1.0%（w/v）Triton-X100平衡液冲洗，再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗，用含10mmol麦芽糖的平衡液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度和活性。

（3）酶切和纯化

甲型流感病毒H5N1全长M2蛋白多克隆抗体的制备和纯化可按照制备和纯化甲型流感病毒H1N1全长M2蛋白的多克隆抗体的方法进行，不再赘述。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因，所述的甲型流感病毒全长M2蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示；

（2）基因合成后，插入克隆质粒pcDNA3.1；

所述的引物为：

上游引物：5‘GGATCCCCCACGGCCACTGCTA-3’

下游引物：5‘-CTACTGGCTGACACCACCACCACCACCACAAGCTT-3'；

（5）重组质粒pMAL-p2X MBP-M2-6×His接种LB培养基，按体积比1:2000～1:300转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养4～6h，菌液OD600达到0.5～0.6时，接种浓度0.5～0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物25～30g；

（6）细菌膜蛋白提取和纯化

a细菌膜蛋白提取

将步骤（5）得到的细菌培养物在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液中，超声破碎后以100,000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的质量体积百分比浓度为1.0%以便于后续纯化；

其中，所述的层析平衡液中含有20mmol/L Tris,0.2mol/L NaCl,1mmol/L2-巯基乙醇，1mmol/L EDTA以及20-120ml/L蛋白酶抑制剂，pH8.0；

其中，所述的裂解剂为1%Triton-X100;

b麦芽糖结合蛋白-M2纯化

在4℃条件下，10ml Amylose介质装柱、用三倍柱床体积含体积质量百分比浓度为1.0%Triton-X100平衡液平衡，以1ml/min的速度进行虹吸上样，上样后用10倍柱床体积含体积质量百分比浓度为1.0%Triton-X100平衡液冲洗，再用三倍柱床体积不含裂解剂的平衡液冲洗，用含10mmol麦芽糖的平衡液洗脱，分步收集，测定蛋白含量、纯度和活性；

c酶切和纯化

按75-100ug蛋白加入1单位的Xa因子常温反应36-48h，使酶切程度达到90-95%，酶切后样品经缓冲液1充分透析，移入15ml离心管和已经平衡Ni+介质2ml在4℃条件下旋转混合4h，在常温以4000r/min离心1min除去上清，用缓冲液1充分洗涤，含0.25mmol/L咪唑的缓冲液1洗脱，即得；

其中，所述的缓冲液1含有50mmol磷酸钠，0.3mmolNaCl，pH8.0。