CN102762728A - 用于制备产生期望的多肽的抗体生产细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目标是提供将编码期望的氨基酸序列的DNA导入到抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域中的方法。本发明人研发了用于将编码期望的氨基酸序列的DNA高效地导入DT40-SW的抗体可变区基因座的方法，DT40-SW是DT40鸡B细胞系的突变株，具有自发导入突变的能力。这允许诱变所导入的DNA，以修饰多肽使其具有更好的功能。特别是，本发明人揭示了DT40细胞系的抗体H链可变区基因座的核苷酸序列。基于该发现，本发明人成功地构建了打靶载体，所述打靶载体允许高效地利用编码期望的多肽的基因取代DT40细胞系的抗体H链可变区基因座。

Description

用于制备产生期望的多肽的抗体生产细胞的方法

技术领域

本申请要求于2009年11月19日提交的日本专利申请号2009-264398以及于2009年11月20日提交的美国临时专利申请号61/263,285的优先权，其完整内容通过引用并入到本文中。

本发明涉及将编码期望的多肽的DNA导入到抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域中的方法。本发明还涉及用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，以及用于产生导入了突变的多肽的方法。本发明还涉及用于上述方法中的细胞和基因打靶载体。

背景领域

响应抗原刺激而产生的抗体的亲和力在体内随时间而升高。这被称为“亲和力成熟”。在活化后活跃分裂的抗原特异性B细胞中，在抗体可变区基因中高频率地发生体细胞突变。亲和力成熟通过从不同的突变B细胞的群体中严格地选择高亲和力的B细胞克隆来进行。基于该原则，常规上通过重复地免疫动物和制备杂交瘤来生产单克隆抗体。但是，制备抗体需要大量的劳动和时间，且制备出的抗体的抗原特异性和亲和力不能改变。然而，在许多情况下，为了制药或诊断试剂的用途，需要进一步改善制备出的抗体的特异性和亲和力。出于该目的，目前通常使用噬菌体展示方法，这是一种体外技术。在噬菌体展示方法中，可以比杂交瘤方法更快速地实施选择抗体的方法。但是，已知噬菌体展示方法存在问题。例如，抗体的成功产生在很大程度上依赖于文库的质量，由于Fv结构域是作为重组svFv展示在噬菌体上的，因而当从scFv制备完整抗体并表达时，特异性经常改变。特别是对于该方法而言关键性的突变文库的制备需要大量的工作和先进的DNA重组技术。

认为如果利用体外培养细胞系统来重现体内抗体生产系统，可以快速高效地生产抗体。具有向抗体基因导入突变的能力的DT40鸡B细胞系适用于该目的，理由如下：

(1)由于它们自发地导入突变的能力，可以通过简单地培养DT40细胞而生产多种抗体文库；

(2)因为DT40细胞在细胞表面上表达抗体并将它们分泌到培养上清液中，所以可以基于抗原结合来选择特定克隆；

(3)由于非常高的同源重组效率，因而可以通过基因敲除等方便地修饰DT40细胞的功能。

本发明人建立了DT40-SW细胞系，其中DT40的一种突变特征(mutationfeature)可以任意开启和关闭。然后，本发明人开发了用于在体外使用DT40-SW生产抗体的方法(专利文件1和非专利文件1)。使用该方法，本发明人通过开启突变特征并培养，成功的从抗体文库中制备了抗各种抗原的抗体，包括难以通过常规方法获得的抗体(非专利文件2和3)。此外，该方法允许通过进一步导入突变到制备出的抗体生产细胞中以产生多种多样的抗体，并重复进行抗体选择，而实现抗体亲和力成熟(专利文件2)。通过该方法制备的抗体是鸡IgM抗体，亲和力成熟仅对于通过该方法制备的这些抗体是可能的。因此，如果该方法可以应用于通过杂交瘤方法、噬菌体展示方法等制备的抗体，则将是非常有用的技术，因为它可以用于改善积累的单克隆抗体的特异性和亲和力。

改善通过杂交瘤方法获得的抗体的性质需要使用体外系统，例如噬菌体展示方法。但是，基于噬菌体展示的抗体功能改变不一定是简单的技术。同时，对于具有突变能力的细胞系(例如DT40)，已通过向其自身的抗体基因导入突变而将其作文库(非专利文件2、4和5)。但是，尚未有关于使用此类细胞系修饰外源抗体基因的报道。

引用列表

专利文献

PTL1：日本专利申请公开号(JP-A)2006-109711(未审查，已公开的日本专利申请)

PTL2：JP-A(Kokai)2009-60850

PTL3：WO2007/026661

非专利文献

NPL1：

Kanayama,N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.327,70-75

Todo,K.等人，J.Biosci.Bioeng.102,478-481(2006)

Kanayama,N.等人，YAKUGAKU ZASSHI 129,11-17(2009)

Cumbers,S.J.等人，Nat.Biotechnol.20,1129-1134(2002)

Seo,H.等人，Nat.Biotechnol.23,731-735(2005)

Fawell等人，Characterization and colocalization of steroid binding anddimerization activities in the mouse estrogen receptor.Cell(1990)，第60卷，(6)第953-62页

Danielian等人，Identification of residues in the estrogen receptor that conferdifferential sensitivity to estrogen and hydroxytamoxifen.Mol Endocrinol(1993)，第7卷，(2)，第232-40页

Littlewood等人，A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as animproved switch for the regulation of heterologous proteins.Nucleic Acids Res(1995)，第23卷，(10)，第1686页

Zhang等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stemcells.Nucleic Acids Res(1996)，第24卷，(4)，第543-8页

发明概述

技术问题

如果可以将编码包含期望的氨基酸序列的多肽的基因导入到抗体生产细胞(例如DT40)的抗体基因座中，则可以利用抗体生产细胞的导入突变的能力来修饰DNA。但是，用于将外源DNA导入到抗体生产细胞的抗体基因座中的有效技术尚未被研发出来。

本发明是鉴于上述情况实现的。本发明的一个目标是提供将编码期望的氨基酸序列的DNA导入到抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域中的方法。

本发明的另一个目标是提供用于制备产生多肽的抗体生产细胞的方法，用于产生多肽的方法，用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，和用于产生导入了突变的多肽的方法。

本发明的另一个目标是提供用于上述方法中的细胞和包含所述细胞的试剂盒。

本发明的另一个目标是提供用于上述方法的基因打靶载体，以及包含所述载体的细胞和试剂盒。

本发明的另一个目标是提供包含编码鸡抗体重链可变区的DNA的DNA，包含所述DNA的载体，和包含所述DNA或载体的细胞。

解决问题的手段

本发明人开发了用于将编码期望的氨基酸序列的DNA高效地导入到DT40-SW的抗体可变区基因座中的方法，DT40-SW是源自DT40鸡B细胞系的突变细胞系，具有自发导入突变的能力。该方法允许通过突变所导入的DNA而修饰多肽，使其具有更好的功能。特别是，本发明人揭示了DT40细胞系的抗体重链可变区基因座的核苷酸序列。藉此，本发明人成功的构建了能够用编码期望的氨基酸序列的DNA高效地取代DT40细胞系的抗体重链可变区基因座的打靶载体。

本发明是基于上述发现的，并涉及以下内容：

[1]将DNA构建体与抗体生产细胞的编码包含抗体可变区的DNA的区域同源重组的方法，包括将包含DNA构建体的打靶载体导入抗体生产细胞中的步骤，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

[2][1]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包括在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

[3]选择细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞。

[4][3]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶而从DNA构建体中被去除。

[5]一种制备产生多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA。

[6][5]的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

[7][5]的方法，其中步骤(a)至(c)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从该细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

[8][5]至[7]中任一项的方法，其中所生产的多肽被展示在细胞的表面上，和/或被分泌到细胞外。

[9][4]、[6]和[7]中任一项的方法，其中利用所述标记基因的表达作为指标来选择所述细胞。

[10][3]、[4]、[6]、[7]和[9]中任一项的方法，其中利用内源性抗体表达在所述抗体生产细胞中的缺失作为指标来选择所述细胞。

[11]一种制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向表达AID基因的抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA。

[12][11]的方法，其中步骤(a)至(c)定义如下：

(a)通过向表达AID基因的抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从所述细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

[13]一种制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述抗体生产细胞中AID基因表达可以人为开启和关闭，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA；

(d)开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

[14][13]的方法，权利要求13的方法，其中步骤(a)至(e)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，其中所述打靶载体包含DNA构建体，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除，其中该抗体生产细胞中的内源性AID基因被功能性破坏，且抗体生产细胞包含这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA，

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够被位点同一性重组酶倒位，并包含外源性AID基因；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从所述细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而使位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA转位，以开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

[15][13]的方法，其中步骤(a)至(e)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，

其中抗体生产细胞中内源性AID基因被功能性破坏，且该抗体生产细胞包含：

DNA构建体，其包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA，和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够通过位点特异性重组酶转位，并包含外源性AID基因，和

包含在细胞中执行功能的启动子DNA和编码位点特异性重组酶的DNA的DNA构建体，

其中在所述抗体生产细胞中，位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，在没有胞外刺激的条件下不活化，

其中所述打靶载体包含DNA构建体，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过对步骤(b)中选择的细胞的胞外刺激活化位点特异性重组酶的活性，使所述位点特异性重组酶在所述细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，藉此从所述细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过对步骤(b)中选择的细胞的胞外刺激活化位点特异性重组酶的活性，使所述位点特异性重组酶在所述细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，藉此使所述位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA转位，以开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

[16][11]至[15]中任一项的方法，其中所产生的导入了突变的多肽被展示在细胞表面上和/或分泌到细胞之外。

[17][11]至[16]中任一项的方法，其中在步骤(b)中利用标记基因的表达作为指标选择细胞。

[18][11]至[17]中任一项的方法，其中在步骤(b)中利用抗体生产细胞中内源性抗体表达的缺失作为指标选择细胞。

[19][15]的方法，其中所述位点特异性重组酶是位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的蛋白质的融合蛋白；且其中能够结合雌激素结合结构域的配体充当胞外刺激。

[20][19]的方法，其中雌激素受体或其雌激素结合结构域是小鼠突变型雌激素受体，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突变型雌激素结合结构域；且其中能够结合雌激素结合结构域的配体是4-羟泰米芬。

[21][11]至[20]中任一项的方法，其中抗体生产细胞具有下列特性：

(a)在该抗体生产细胞中，XRCC3基因的两个等位基因中仅一个是失活的；和

(b)与具有XRCC3基因的两个等位基因的细胞相比，导入点突变的频率是升高的。

[22][21]的方法，其中在XRCC3基因的两个等位基因的任一个中，第6个外显子是失活的。

[23][11]至[22]中任一项的方法，其中抗体生产细胞是B细胞。

[24][23]的方法，其中B细胞源自鸡。

[25][2]、[4]、[6]、[7]、[9]、[10]、[12]、[14]和[15]中任一项的方法，其中位点特异性重组酶和位点特异性重组酶识别序列的组合是下列(i)或(ii)：

(i)位点特异性重组酶是Cre重组酶，且位点特异性重组酶识别序列是loxP序列；

(ii)位点特异性重组酶是FLP重组酶，且位点特异性重组酶识别序列是FRT序列。

[26][1]至[25]中任一项的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

[27][26]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

[28][1]至[25]中任一项的方法，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

[29]一种用于产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA的方法，包括下述步骤：

(a)通过[5]-[8]和[11]-[24]中任一项的方法制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；

(b)从步骤(a)制备的抗体生产细胞中分离编码多肽或导入了突变的多肽的DNA。

[30]一种用于产生编码多肽或导入了突变的多肽的方法，包括下述步骤：

(a)通过[5]-[8]和[11]-[24]中任一项的方法制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；

(b)从步骤(a)生产的抗体生产细胞中或从来自所述细胞的分泌产物中分离所述多肽或导入了突变的多肽。

[31]产生编码多肽或导入了突变的多肽的方法，包括下述步骤：

(a)通过[29]的方法产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA；

(b)分离由步骤(a)生产的DNA编码的多肽。

[32]抗体生产细胞，其中包含编码抗体可变区的DNA的区域与DNA构建体同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

[33][32]的细胞，其中(3)的DNA是这样的DNA：其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

[34][32]或[33]的细胞，其中所述抗体生产细胞表达AID基因。

[35][32]或[33]的细胞，其中所述抗体生产细胞是其中AID基因表达可以被人为开启和关闭的细胞。

[36][35]的细胞，其中内源性AID基因被功能性破坏，且细胞包括这样的DNA构建体，所述构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够通过位点特异性重组酶转位，并且包含外源性AID基因。

[37][36]的细胞，其中所述抗体生产细胞还包含如下所述的DNA构建体，该构建体包含在细胞中执行功能的启动子DNA和编码位点特异性重组酶的DNA，其中该位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少胞外刺激的条件下不活化。

[38][37]的细胞，其中位点特异性重组酶是位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的蛋白质的融合蛋白。

[39][38]的细胞，其中雌激素受体或其雌激素结合结构域是小鼠突变型雌激素受体，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突变型雌激素结合结构域。

[40][32]至[39]中任一项的细胞，其中所述抗体生产细胞具有下列特性：

(a)在抗体生产细胞中，XRCC3基因的两个等位基因中仅一个是失活的；和

(b)与具有XRCC3基因的两个等位基因的细胞相比，导入点突变的频率是升高的。

[41][40]的细胞，其中在XRCC3基因的两个等位基因的任一个中，第6个外显子是失活的。

[42][32]至[41]中任一项的细胞，其中抗体生产细胞是B细胞。

[43][42]的细胞，其中B细胞源自鸡。

[44][33]和[36]-[39]中任一项的细胞，其中位点特异性重组酶和位点特异性重组酶识别序列的组合是下列(i)或(ii)：

(i)位点特异性重组酶是Cre重组酶，且位点特异性重组酶识别序列是loxP序列；

(ii)位点特异性重组酶是FLP重组酶，且位点特异性重组酶识别序列是FRT序列。

[45][32]至[44]中任一项的细胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

[46][45]的方法，其中期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

[47][32]至[44]中任一项的细胞，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

[48]包含[32]至[47]中任一项的细胞的试剂盒。

[49]一种包含DNA构建体的基因打靶载体，所述构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)包含克隆位点的DNA；和

(3)如下所述的DNA：其能够从DNA构建体中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生；

其中所述基因打靶载体用于同源重组所述DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域。

[50][49]的载体，其中(3)的DNA是如下所述的DNA：其能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生，且其位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，并包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因。

[51][49]或[50]的载体，其中编码期望的氨基酸序列的DNA被插入到克隆位点中。

[52][49]-[51]中任一项的载体，其中包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

[53][52]的载体，其中期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

[54][49]-[51]中任一项的载体，其中包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

[55]包含[49]-[54]中任一项的打靶载体的细胞。

[56]包含[49]-[54]中任一项的打靶载体的试剂盒。

[57]包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA。

[58]包含[57]的DNA的载体。

[59]包含[57]的DNA或[58]的载体的细胞。

发明的有益效果

本发明提供了用于将编码期望的氨基酸序列的DNA导入抗体生产细胞的抗体可变区基因座中的打靶载体。

根据本发明，可以通过将编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA导入抗体生产细胞的抗体可变区基因座中，在特定条件下产生期望的多肽。

此外，可以利用抗体生产细胞导入突变的能力来产生导入了突变的多肽。

本发明可用于多肽的功能性修饰。

附图简介

图1：图1展示了导入外源抗体可变区基因和可变区被取代了的嵌合抗体的示意图。A显示了抗体基因座和用于导入外源抗体可变区基因的方法的示意图。通过基因打靶，用外源抗体可变区基因取代鸡抗体可变区基因来修饰DT40细胞基因组的抗体基因座，使得细胞表达包含外源抗体可变区和鸡抗体恒定区的嵌合抗体。B显示了可变区被取代了的嵌合抗体的示意图。由于可变区基因的取代，抗体被表达为外源抗体可变区和鸡抗体恒定区的嵌合体。

图2：图2展示了产生包含外源抗体可变区和鸡抗体恒定区的嵌合抗体的DT40的制备方法的示意图。A显示了打靶载体的结构。B显示了打靶后细胞的抗体基因座结构。C显示了在通过Cre重组酶去除药物抗性基因后的抗体基因座结构，所述Cre重组酶在打靶后用4-羟泰米芬处理细胞而激活。D显示了制备导入了外源抗体可变区基因的DT40细胞的示例性示意图。

图3：图3显示了抗体重链可变区基因的限制性酶切图。用星号(*)标记的限制性位点源自λDASH II。

图4：图4展示了VH打靶载体1中的限制性位点的位置的示意图。A显示了鸡抗体重链可变区基因的序列，和外源抗体可变区基因所插入的限制性位点的位置。B显示了向VH打靶载体1中插入外源抗体可变区基因的方法。带箭头的虚线分别指示编码信号肽、VH和JH的区域。垂直的箭头指示信号肽的切割位点。

图5：图5显示了构建VH打靶载体的示意图。A显示来自鸡抗体重链基因的XbaI-NotI片段，该片段被用于构建VH打靶载体。B至E显示了用于构建VH打靶载体的示意图。F显示了VH打靶载体2的结构。

图6：图6展示了VH打靶载体2中的限制性位点的位置的示意图。A显示了鸡抗体重链可变区基因的序列，和外源抗体可变区基因所插入的限制性位点的位置。B显示了向VH打靶载体2中插入外源抗体可变区基因的方法。带箭头的虚线分别指示编码信号肽、VH和JH的区域。垂直的箭头指示信号肽的切割位点。

图7：图7展示了VL打靶载体1中的限制性位点的位置的示意图。A显示了鸡抗体轻链可变区基因的序列，和外源抗体可变区基因所插入的限制性位点的位置。B显示了向VL打靶载体1中插入外源抗体可变区基因的方法。带箭头的虚线分别指示编码信号肽、VL和JL的区域。垂直的箭头指示信号肽的切割位点。

图8：图8显示了构建VL打靶载体的的示意图。A显示了在鸡抗体轻链基因周围的片段，该片段被用于构建VL打靶载体。B和C显示了用于构建VL打靶载体1的的示意图。D显示了VL打靶载体2的结构。

图9：图9展示了VL打靶载体2中的限制性位点的位置的示意图。A显示了鸡抗体轻链可变区基因的序列，和外源抗体可变区基因所插入的限制性位点的位置。B显示了向VL打靶载体2中插入外源抗体可变区基因的方法。带箭头的虚线分别指示编码信号肽、VL和JL的区域。垂直的箭头指示信号肽的切割位点。

图10：图10展示了小鼠VHT基因打靶的示意图和照片。A显示了一种小鼠VHT基因打靶载体的结构，以及在打靶后鸡抗体重链可变区基因周围的基因组结构。B显示了实施验证打靶后的内源性抗体重链基因的PCR结果。VHT是其中小鼠VHT基因被打靶的克隆，发现在该克隆中缺少对应于重排链的条带。SW指没有打靶的DT40-SW。C显示了为验证打靶后的内源性抗体重链基因的结构而实施的Southern印迹结果。SW是没有打靶的DT40-SW，而C2和C3是通过PCR发现缺少对应于重排链的条带的克隆。左侧的C2和C3对显示了在4-羟泰米芬处理前的结果，而右侧的对显示了在4-羟泰米芬处理后的结果。

图11：图11展示了图表，该图表显示在小鼠VHT基因被打靶的细胞中的抗体表达。A显示了细胞表面上的IgM抗体表达的流式细胞术分析结果。在小鼠VHT基因成功被打靶的VHT细胞中，细胞表面的抗体表达缺失。B显示了在4-羟泰米芬处理后的IgM抗体表达的流式细胞术分析结果。4-羟泰米芬处理恢复了A的细胞中的细胞表面抗体表达。C显示了VHT表达的流式细胞术分析结果。如B所示的恢复了抗体表达的细胞表达了导入的小鼠抗体基因(VHT)。D显示了在4-羟泰米芬处理后，在克隆的细胞(C2和C3)中的抗体表达的流式细胞术分析结果。在4-羟泰米芬处理后，在克隆的细胞中也观察到了稳定的抗体表达。

图12A：图12A显示了诱变后的突变分析的结果。该结果是通过对DT40-SW进行突变分析获得的。饼图表示克隆总数和突变克隆数。

图12B：图12B显示了诱变后的突变分析的结果。该结果是通过对C2进行突变分析获得的。下划线表示VHT的CDR结构域。饼图表示具有突变的克隆数。表格显示了突变的核苷酸。

图12C：图12C显示了诱变后的突变分析的结果。该结果是通过对C3进行突变分析获得的。下划线表示VHT的CDR结构域。饼图表示具有突变的克隆数。表格显示了突变的核苷酸。

图13：图13用展示了小鼠λ1基因打靶的示意图和照片。A显示了一种小鼠λ基因打靶载体的结构，以及在打靶后鸡抗体轻链可变区基因周围的基因组结构。B显示了为了验证打靶后的内源性抗体轻链基因的结构而实施的PCR的结果。VHT-λ1-B4是一个基因被打靶的克隆。SW指没有打靶的DT40-SW。C显示为了验证打靶载体插入到鸡抗体轻链基因中而实施的PCR的结果。

图14：图14显示了小鼠VHT和λ1基因被打靶、且改变了抗体表达的细胞的制备流程图。

图15：图15的示意图显示了在小鼠VHT和λ1基因被打靶的细胞中的嵌合抗体表达。显示抗体在小鼠VHT和λ1基因被打靶的细胞(VHT-λ1克隆B4)中有表达。VHT-λ1克隆B4、DT40-SW细胞(阴性对照)和QM小鼠脾细胞(阳性对照)在用或不用抗小鼠VHT的抗体(α-Id)或抗小鼠λ轻链的抗体(α-λ1、2、3)染色之后，通过流式细胞术进行分析。

图16：图16显示为了评估在小鼠VHT和λ1基因被打靶的细胞(VHT-λ1B4)中的抗体轻链基因表达而实施的PCR的示意图和照片。

图17：图17显示为了评估在小鼠VHT和λ1基因被打靶的细胞(VHT-λ1B4)中的抗体表达而实施的ELISA的结果。A显示了对IgM抗体表达水平的评估。B显示了对抗体特异性的评估。

图18：图18显示了在小鼠λ1基因被打靶的细胞中，小鼠λ1抗体中导入的突变的频率。

图19：图19显示了抗体重链可变区的上游区域一个片段的序列(SEQ IDNO:4)。该示意图显示了通过DNA步行方法鉴别的抗体重链可变区基因上游区域的序列。该序列只包括新鉴别出的部分。

图20：图20显示了在DT40的抗体重链可变区基因周围的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。该序列包括图3中显示了限制性酶切图谱的抗体重链可变区基因的完整核苷酸序列。下划线(第1-3120位和第3882-7891位)显示了新鉴别的核苷酸序列。第1-3223位：5’上游区；第3224-3269和3453-3463位：编码信号肽的序列(第3270-3452位的序列是内含子，通过剪接去除；第3224-3269和3453-3463位的序列连接在一起形成信号肽序列)；第3464-3839位：抗体重链可变区基因的区域，不包括信号肽；第3840-7931位：3’下游区。实施例中描述的VH打靶载体是使用第1829-3223位(从BamHI位点至紧邻在起始密码子之前的核苷酸)和第3869-6548位(从紧邻在JH编码区之后的SacII位点至XhoI位点)的序列作为臂，以及第3224-3463位的序列作为信号肽制备的。

图21：图21显示了VH打靶载体1的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。该序列包括图5E中显示的结构的完整核苷酸序列，但不包括载体骨架部分。单下划线指示信号肽序列，双下划线指示loxP序列。

图22：图22显示了VH打靶载体2的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。该序列包括图5F中显示的结构的完整核苷酸序列，但不包括载体骨架部分。下划线指示信号肽序列，双下划线指示loxP序列。

图23：图23显示了VL打靶载体1的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)。该序列包括图8C中显示的结构的完整核苷酸序列，但不包括载体骨架部分。下划线(第1869-1914和2040-2056位)指示信号肽序列，双下划线指示loxP序列。与鸡抗体轻链基因周围的序列同源的臂区域位于第1-1868(不包括信号肽序列)和第5011-6870位。

图24：图24显示了VL打靶载体2的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)。该序列包括图8D中显示的结构的完整核苷酸序列，但不包括载体骨架部分。下划线(第1869-1914和2040-2056位)指示信号肽序列，双下划线指示loxP序列。与鸡抗体轻链基因周围的序列同源的臂区域位于第1-1868(不包括信号肽序列)和第5002-6861位。

图25：图25显示了一种突变雌激素受体的他莫昔芬结合位点的序列(SEQID NO:40)。突变位点用下划线表示。由于G变为C的核苷酸取代，密码子编码的氨基酸从甘氨酸(G)变为精氨酸(R)。

图26：图26显示了被用作AID表达盒的鸡AID cDNA核苷酸序列。下划线部分(第6-597位)显示了编码蛋白质的区域。

图27：图27显示了用于与突变雌激素受体融合的修饰的Cre重组酶基因的核苷酸序列。融合蛋白中消除了末端的终止密码子。下划线部分(第4-21位)显示了源自SV40大T抗原的核转位信号。

图28：图28展示了鸡VL基因打靶的示意图和照片。A显示了鸡VL基因打靶载体的结构，和打靶后鸡抗体轻链可变区基因周围的基因组结构。B显示为了评估打靶后的内源性抗体轻链基因的结构而实施的PCR的结果。cVL-C4是打靶的克隆。C显示为了评估打靶载体在鸡抗体轻链基因中的插入而实施的PCR的结果。

图29：图29展示了靶向鸡VL基因表达的位移图解。

图30：图30显示了导入到打靶的鸡VL基因中的突变频率。

实施方案的说明

本发明涉及将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的方法，包括将包含DNA构建体的打靶载体导入抗体生产细胞中的步骤，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

在本文中，打靶载体也被称为“基因打靶载体”。

将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的方法也被称为“用于向抗体生产细胞的抗体可变区基因的基因座中导入编码期望的氨基酸序列的DNA的方法”。

抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域也可以称为“抗体基因的基因座中的DNA”、“编码抗体可变区的DNA周围的区域”、“包含编码抗体可变区的DNA和位于其5’侧的启动子区的区域”、“包含编码抗体可变区的DNA和在其5’侧的DNA的区域”、“包含编码抗体可变区的DNA和其3’侧的DNA的区域”、“包含编码抗体可变区的DNA和位于所述DNA的5’和3’侧翼的DNA”等等。

本发明的打靶载体除上述(1)至(3)的DNA以外，还可以包含与抗体基因的基因座中的DNA同源的DNA。与抗体基因的基因座中的DNA同源的DNA也可以称为“包含与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的周围的区域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA 5’侧的启动子区的5’侧的区域同源的核苷酸序列的DNA”、“包含与编码抗体可变区的DNA的3’侧的区域同源的核苷酸序列的DNA”、“与编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA”、“与编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA”、“包含与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’和3’侧侧翼的DNA区域同源的核苷酸序列的DNA”等等。

在本文中，“5’侧的DNA”也可以称为“5’侧上游区域的DNA”，而“3’侧的DNA”也可以称为“3’侧下游区域的DNA”。

当本发明的载体被导入到抗体生产细胞中时，在包含与编码抗体可变区的DNA周围的区域同源的核苷酸序列的DNA与抗体生产细胞的基因组中的编码抗体可变区的DNA周围的区域之间发生同源重组。其结果是，抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域被包含上述(1)至(3)的DNA的DNA构建体取代。

当上述(1)的DNA是位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的启动子时，上述(1)的DNA也可以称为“包含与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA周围的区域同源的核苷酸序列的DNA”。此外，包含与编码抗体可变区的DNA周围的区域同源的核苷酸序列的DNA也可以称为“包含与编码抗体可变区的DNA的5’和3’侧侧翼的DNA区域同源的核苷酸序列的DNA”。在此情况下，本发明的方法也可以将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的方法，包括将包含DNA构建体的打靶载体导入抗体生产细胞中的步骤，所述DNA构建体包含：

(1)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

“包含与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA周围的DNA区域同源的核苷酸序列的DNA”也可以被称为“载体臂”或“臂”。特别地，“与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA”也可以称为“上游臂”、“5’侧臂”或“左臂”。此外，“与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA”也可以称为“下游臂”、“3’侧臂”或“右臂”。一般认为较长的臂是优选的；但是，臂仅需要具有基因打靶通常使用的长度(A.Joyner,"Gene Targeting″,IRL Press Practical Approach series,Oxford Univ.Press)。例如而非限制，右臂和左臂的长度可以是1kb或更长，总长度可以是3kb或更长。同时，载体的全长优选是12kbp或更短，但并不限于此(J.-M.Buesrstedde和S.Takeda编著，Subcellular Biochemistry第40卷：Reviews andProtocols in DT40 Research,Springer(2006))。

在本发明中，“与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA”包括具有位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的启动子的DNA和不具有所述启动子的DNA。

当“与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA”不具有位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的启动子时，所述DNA也可以称为“包含与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的启动子区的5’侧区域同源的核苷酸序列的DNA”。

在本发明中，“与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA”包括具有抗体生产细胞的抗体恒定区编码DNA的DNA和不具有所述编码DNA的DNA。

在本发明中，臂或载体臂的核苷酸序列不必与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA周围的DNA区域完全同源(相同)，只需要具有允许同源重组的一定程度的相似性。

可以根据抗体生产细胞的类型，恰当地选择在抗体生产细胞中发挥功能的功能性启动子DNA。在抗体生产细胞中发挥功能的启动子DNA包括但不限于鸡β肌动蛋白启动子和人延伸因子1α(EF-1α)启动子(Yang,S.Y.等人，J.Exp.Med.203:2919-2928(2006))。病毒启动子DNA的实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(Kanayama,N.等人，Nucleic Acids Res.34,e10(2006))和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(Arakawa,H.等人，Nucleic Acids Res.36,e1(2008))。

在抗体生产细胞中发挥功能的启动子DNA包括源自抗体生产细胞的启动子和位于编码抗体可变区的DNA的5’侧的抗体基因启动子DNA。

在本文中，“编码期望的氨基酸序列的DNA”也可以称为“编码人工氨基酸序列的DNA”或“编码目的氨基酸序列的DNA”。

期望的氨基酸序列包括但不限于抗体可变区的氨基酸序列(抗体重链可变区和抗体轻链可变区)、酶的氨基酸序列、受体的氨基酸序列和人工肽序列。

当编码期望的氨基酸序列的DNA不含信号肽编码DNA时，可以将编码信号肽的DNA插入到基因打靶载体中编码期望的氨基酸序列的DNA的5’侧，以便增强由编码期望的氨基酸序列的DNA编码的多肽的细胞表面表达或分泌。信号肽编码DNA可以插入到这样的位点，所述位点使得在从信号肽编码DNA和编码期望的氨基酸序列的DNA转录的mRNA中两个肽编码区合框相连。例如，可以在信号肽编码DNA和编码期望的氨基酸序列的DNA之间插入内含子。或者，如下所述，上述(3)的DNA可以插入到信号肽编码DNA和编码期望的氨基酸序列的DNA之间。对信号肽编码DNA没有限制，只要它具有在抗体生产细胞的表面上表达多肽或从抗体生产细胞分泌多肽的能力。信号肽编码DNA包括源自抗体生产细胞的和编码位于抗体可变区的5’侧的信号肽的DNA。

此类信号肽包括但不限于鸡抗体重链或轻链的信号肽、哺乳动物(例如人和小鼠)的抗体重链或轻链的信号肽，和鸟类或哺乳动物的分泌到细胞外的细胞因子或生长因子的信号肽。

编码期望的氨基酸序列的DNA可以来自任何物种。DNA可以源自与抗体生产细胞来源相同的物种，或者源自不同的物种。此外，DNA可以是编码人为修饰的多肽，例如嵌合多肽的DNA。

“包含期望的氨基酸序列的多肽”包括但不限于包含期望的氨基酸序列与抗体恒定区的氨基酸序列的多肽。

“包含期望的氨基酸序列的多肽”包括但不限于包含下列氨基酸序列的多肽(嵌合多肽)：

抗体可变区(抗体重链可变区或抗体轻链可变区)的氨基酸序列和抗体恒定区(抗体重链恒定区或抗体轻链恒定区)的氨基酸序列；

酶的氨基酸序列和抗体恒定区的氨基酸序列(抗体重链恒定区或抗体轻链恒定区)；或

受体的氨基酸序列和抗体恒定区的氨基酸序列(抗体重链恒定区和抗体轻链恒定区)。

在本文中，“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生的DNA”指通过在存在所述DNA的条件下阻断任何下列步骤，来抑制包含期望的氨基酸序列的多肽的正常产生的DNA：

编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的转录；

含有编码包含期望的氨基酸序列的多肽的区域的mRNA的剪接；

mRNA的翻译；和

包含期望的氨基酸序列的多肽的加工(例如，折叠)。

上述(3)的DNA也可以称为“抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，所述DNA包括在细胞内执行功能的启动子DNA和标记基因，并能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除”。

本发明的标记基因优选在其3’末端含有多聚A(腺苷酸)附加序列。多聚A附加序列终止标记基因的转录。

本领域技术人员可以想到各种启动子，并选择恰当的启动子。此类启动子包括但不限于例如β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、CAG启动子和EF1α启动子。

选择标记基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸转移酶基因、灭瘟素S脱氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰转移酶基因、组氨醇脱氢酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；荧光蛋白基因，例如GFP和DsRed；以及生色酶的基因，例如β-半乳糖苷酶(lacZ)和β-内酰胺酶。

优选的将启动子和标记基因可操作地连接在一起，使得标记基因可以通过启动子表达。

在本文中，“可操作地连接”意指标记基因与在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA连接，使得转录因子与启动子DNA的结合诱导标记基因的表达。因而，当标记基因与另一个基因连接并形成与它的基因产物的融合蛋白时，由于转录因子与标记基因的启动子区域结合，融合蛋白的表达被诱导，这也包括在“可操作地连接”的含义中。

位点特异性重组酶和位点特异性重组酶识别序列的组合包括Cre重组酶和loxP的组合，以及FLP重组酶和FRT的组合，但不限于此。在本发明中，位点特异性的重组酶识别序列可以是突变序列，只要它被位点特异性的重组酶识别。

对于loxP序列，参见下列文件：

Hoess等人，P1 site-specific recombination:nucleotide sequence of therecombining sites.Proc Natl Acad Sci USA(1982)79卷(11)第3398-402页

Hoess和Abremski,Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Crewith the recombining site loxP.Proc Natl Acad Sci USA(1984)第81卷(4)第1026-9页

对于FLP重组酶的序列，参见下列文件：

Hartley和Donelson,Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature(1980)第286卷(5776)第860-865页

对于FRT序列，参见下列文件：

Hartley和Donelson,Nucleotide sequence of the yeast plasmid.Nature(1980)第286卷(5776)第860-865页

Andrews等人，The FLP recombinase of the 2 micron circle DNA of yeast:interaction with its target sequences.Cell(1985)第40卷(4)第795-803页

Gronostajski和Sadowski,Determination of DNA sequences essential forFLP-mediated recombination by a novel method.J Biol Chem(1985)第260卷(22)第12320-7页

Senecoff等人，The FLP recombinase of the yeast 2-micron plasmid:characterization of its recombination site.Proc Natl Acad Sci USA(1985)第82卷(21)第7270-4页。

对本发明的基因打靶载体没有限制，只要它们允许在上述的DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间的同源重组。本发明的基因打靶载体包括例如下文(A)和(B)的载体。

(A)用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中该载体包含所述DNA构建体，该DNA构建体从载体DNA链的5’端至3’端包含下文(1)至(3)的DNA：

(1)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(3)编码期望的氨基酸序列的DNA。

(A)的载体可在编码期望的氨基酸序列的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。在此情况下，载体可以在(2)的DNA和(3)的DNA之间具有信号肽编码DNA。或者，载体可以在(1)的DNA和(2)的DNA之间具有信号肽编码DNA。但是，载体不限于该实例。

(B)用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中该载体包含所述DNA构建体，该DNA构建体包含，从载体DNA链的5’端至3’端，下文(1)至(3)的DNA：

(1)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

(B)的载体还可在编码期望的氨基酸序列的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。在此情况下，载体可以在(1)的DNA和(2)的DNA之间具有信号肽编码DNA。但是，载体不限于该实例。

(A)的载体还可以描述为用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，该构建体包含，从载体DNA链的5’至3’端，下述(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的5’侧区域同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的3’侧区域同源的DNA的DNA，

其中(i)的DNA从载体DNA链的5’至3’端包含下列(α)和(β)：

(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

上述基因打靶载体可在(ii)的DNA的5’侧(更上游)具有编码信号肽的DNA。更具体而言，基因打靶载体可在(α)的DNA和(β)的DNA之间，或者在(β)的DNA和(ii)的DNA之间具有信号肽编码DNA。但是，载体不限于这些实例。

(iii)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

(i)的同源DNA可以与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA重组。当基因打靶载体的靶标是重链可变区时，5’侧的DNA包括但不限于，例如这样的DNA片段：其起自鸡抗体重链基因座中编码抗体重链可变区的信号肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始点上游(5’侧)DNA区域的第一个BamHI，或第一个XhoI，或第一个XbaI位点。

或者，当基因打靶载体的靶是轻链可变区时，5’侧的DNA包括但不限于，例如这样的DNA片段：其起自鸡抗体轻链基因座中编码抗体轻链可变区的信号肽的DNA的5’末端核苷酸，并延伸直到位于起始点上游(5’侧)DNA区域的第一个SacI或第一个BamHI位点。

当使用编码抗体可变区的信号肽的DNA作为起点制备5’侧的DNA时，抗体基因启动子已包括在5’侧的DNA内。在此情况下，不必向载体中插入启动子DNA。

此外，(iii)的同源DNA可以与抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA重组。当基因打靶载体的靶标是重链可变区时，3’侧的DNA包括但不限于，例如这样的DNA片段：其起自鸡重链抗体基因座中编码抗体重链可变区的DNA的3’末端核苷酸，并延伸直到位于起始点下游(3’侧)DNA区域的第一个XhoI或第一个ClaI位点。

或者，当基因打靶载体的靶标是轻链可变区时，3’侧的DNA包括但不限于，例如这样的DNA片段：其起自鸡轻链抗体基因座中编码抗体轻链可变区的DNA的3’末端核苷酸，并延伸直到位于起始点下游(3’侧)DNA区域的第一个ClaI或第一个EcoRI位点。

上述(A)的基因打靶载体还可以描述为用于将DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，所述载体包含DNA构建体，该DNA构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下述(i)至(v)的DNA：

(i)与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的5’侧区域同源的DNA；

(ii)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(iii)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(iv)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(v)与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的3’侧区域同源的DNA。

上述基因打靶载体可在(iv)的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。

(v)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

本发明的靶向重链可变区的基因打靶载体可以基于下面列举的DNA片段来设计，其中每个片段都含有鸡抗体重链基因的基因座周围的区域。但是，基因打靶载体不限于这些实例。

BamHI-XhoI片段

BamHI-ClaI片段

XhoI-XhoI片段

XhoI-ClaI片段

XbaI-XhoI片段

XbaI-ClaI片段

本发明的靶向轻链可变区的基因打靶载体可以基于下面列举的DNA片段设计，其中每个片段都含有鸡抗体轻链基因的基因座周围的区域。但是，基因打靶载体不限于这些实例。

SacI-ClaI片段

BamHI-EcoRI片段

SacI-ClaI片段

BamHI-EcoRI片段

在本发明中，限制性位点不限于天然存在于鸡抗体基因的基因座中的位点。可以使用添加有期望的限制性位点的引物，通过PCR扩增获得含有限制性位点的DNA片段。本发明的限制性位点还包括因此产生的位点。

本发明的靶向重链可变区的基因打靶载体也可以描述为包含这样的DNA构建体的基因打靶载体，所述DNA构建体包含：

包含从抗体可变区的编码区的5’侧的BamHI位点至紧邻于鸡重链抗体基因座中的起始密码子之前的核苷酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)的DNA片段；

在抗体可变区的编码区的3’侧包含SacII-XhoI片段(SEQ ID NO:45)的DNA片段；和

包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:44的DNA片段包括但不限于包含更多的5’侧区域的DNA片段。包含SEQ ID NO:45的DNA片段包括但不限于包含更多的3’侧区域的DNA片段。

本发明的靶向轻链可变区的基因打靶载体也可以描述为包含这样的DNA构建体的基因打靶载体，所述DNA构建体包含：

包含从SacI位点至紧邻于鸡轻链抗体基因座中的起始密码子之前的核苷酸核苷酸序列(SEQ ID NO:46)的DNA片段；

包含SEQ ID NO:47的核苷酸序列的DNA片段；和

包含上述(ii)的DNA的DNA片段。包含SEQ ID NO:46的DNA片段包括但不限于包含更多的5’侧区域的DNA片段。包含SEQ ID NO:47的DNA片段包括但不限于包含更多的3’侧区域的DNA片段。

本发明的基因打靶载体可具有所有的上述特征。上述(A)的本发明的基因打靶载体可以描述为靶向重链可变区的基因打靶载体，具体而言是用于将DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体重链可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，该DNA构建体包含，从载体DNA链的5’至3’端，下述(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体重链可变区的DNA的5’侧同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体重链可变区的DNA的3’侧同源的DNA的DNA，

其中(i)的DNA从载体DNA链的5’至3’端包括下列(α)和(β)：

(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

上述(A)的本发明的基因打靶载体可以描述为靶向轻链可变区的基因打靶载体，具体而言是用于将DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体轻链可变区的DNA的区域的同源重组基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，该构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下述(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体轻链可变区的DNA的5’侧同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体轻链可变区的DNA的3’侧同源的DNA的DNA，

其中(i)的DNA从载体DNA链的5’至3’端包括下列(α)和(β)：

(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

上述靶向重链或轻链可变区的基因打靶载体可在(ii)的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。更具体而言，载体可在(α)的DNA和(β)的DNA之间，或者可以在(β)的DNA与(ii)的DNA之间具有信号肽编码DNA。但是，载体不限于这些实例。

(iii)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

上述(B)的基因打靶载体也可以称为用于将DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，所述DNA构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下文(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的5’侧同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的3’侧同源的DNA的DNA，

其中(i)的DNA包含(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(iii)的DNA包含(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(α)的DNA与(ii)的DNA可操作地连接。

(i)和(iii)的同源DNA如上所述。

上述基因打靶载体可在(ii)的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。更具体而言，基因打靶载体可在(α)的DNA和(ii)的DNA之间具有信号肽编码DNA。但是，载体不限于这些实例。

(iii)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

上述(B)的基因打靶载体也可以称为用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，所述DNA构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下文(i)至(v)的DNA：

(i)与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的5’侧同源的DNA；

(ii)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(iii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iv)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(v)与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体可变区的DNA的3’侧同源的DNA。

上述基因打靶载体可在(iii)的DNA的5’侧具有编码信号肽的DNA。

(v)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

在上述(B)中描述的基因打靶载体也可以称为靶向重链可变区的基因打靶载体，具体而言，称为用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体重链可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，所述DNA构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下文(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体重链可变区的DNA的5’侧同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体重链可变区的DNA的3’侧同源的DNA的DNA。

其中，(i)的DNA包含(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(iii)的DNA包含(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(α)的DNA与(ii)的DNA可操作地连接。

在上述(B)中描述的基因打靶载体也可以称为靶向轻链可变区的基因打靶载体，具体而言，称为用于将DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体轻链可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中载体包含DNA构建体，所述DNA构建体从载体DNA链的5’至3’端包含下文(i)至(iii)的DNA：

(i)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体轻链可变区的DNA的5’侧同源的DNA的DNA；

(ii)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(iii)包含与抗体生产细胞基因组DNA中的编码抗体轻链可变区的DNA的3’侧同源的DNA的DNA。

其中，(i)的DNA包含(α)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；和

(iii)的DNA包括(β)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(α)的DNA与(ii)的DNA可操作地连接。

上述靶向重链或轻链可变区的基因打靶载体可在(ii)的DNA的5’侧具有信号肽。更具体而言，所述载体可在(α)的DNA和(ii)的DNA之间具有编码信号肽的DNA。但是，所述载体不限于该实例。

(iii)的DNA可具有编码抗体恒定区的DNA。

上述(B)的载体可额外地在编码期望的氨基酸序列的DNA的3’侧包含剪接供体共有序列。此类剪接供体共有序列包括但不限于“AG GTRAGT”(R指A或G；下划线部分是内含子序列)。

当剪接供体共有序列与编码期望的氨基酸序列的DNA连接时，需要在剪接供体共有序列之前恰当地添加或删除核苷酸，以使得编码期望的氨基酸序列的区域与编码抗体恒定区的区域在剪接后的mRNA中合框连接。

在上述(B)的载体中，编码期望的氨基酸序列的DNA((ii)的DNA)优选尽可能地靠近抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生、且能够从DNA构建体中被去除的DNA((β)的DNA)。此外，当(β)的DNA包括标记基因时，优选在标记基因的3’侧具有多聚A附加序列。

本发明提供了上述基因打靶载体。本发明还提供了在上述打靶载体中具有克隆位点代替编码期望的氨基酸序列的DNA的打靶载体。更具体而言，本发明提供了用于将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的基因打靶载体，其中该载体包含这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)包含克隆位点的DNA；和

(3)抑制由插入到(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从DNA构建体中被去除的DNA。

(3)的DNA还可以被描述为能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生的DNA，该DNA位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，并包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因。

标记基因可以在其3’侧具有多聚A序列。

编码期望的氨基酸序列的DNA可以插入到本发明的基因打靶载体的克隆位点中。

此类克隆位点包括但不限于多克隆位点。

下文显示了上述(B)的载体中编码期望的氨基酸序列的DNA被克隆位点取代的载体实例。但是，本发明的载体不限于这些实例。

SEQ ID NO:10(图21)是本发明的靶向重链可变区的基因打靶载体的核苷酸序列的实例。具体而言，本发明提供了包括这样的DNA构建体的打靶载体，所述DNA构建体包含SEQ ID NO:10(特别是第1-7277位的核苷酸序列)。

在图21(SEQ ID NO:10)中，第1-1395位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA序列(到编码抗体可变区的DNA的起始密码子紧邻前方为止的含有启动子的序列)；

第1396-1441位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1442-1624位的核苷酸对应于内含子DNA；

第1625-1635位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1671-1704位的核苷酸对应于loxP_RE的DNA序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO:37))；

第1711-2697位的核苷酸对应于包含标记物的多聚A附加序列的DNA；

第2720-3142位的核苷酸对应于标记基因的DNA序列；

第3186-4527位的核苷酸对应于标记基因的启动子序列；

第4555-4588位的核苷酸对应于loxP_LE的DNA序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO:38))；

以及第4598-7277位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA序列；

第1442-1624位的核苷酸(内含子DNA)通过剪接被去除，由此第1397-1441位的核苷酸与第1625-1635的核苷酸相连而形成信号肽序列。

作为实例，上述打靶载体使用突变的loxP序列(Albert H.,等人，Plant J.7:649(1995)；Araki K.,等人，Nucleic Acids Res.25:868(1997))。

本发明使用用于DT40的标记基因(Arakawa H.,BMC Biotechnol.1:7(2001))。用于DT40的标记基因描述如上。

在上述载体中，编码期望的氨基酸序列的DNA被插入编码信号肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之间。

此外，本发明的靶向重链可变区的基因打靶载体的核苷酸序列的一个实例显示在SEQ ID NO:13(图22)中。具体而言，本发明提供了包含这样的DNA构建体的打靶载体，所述DNA构建体包含SEQ ID NO:13(特别是第5-7266位的核苷酸序列)。

在图22(SEQ ID NO:13)中，

第5-1399位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA序列(到编码抗体可变区的DNA的起始密码子紧邻前方为止的含有启动子的序列)；

第1400-1445位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1446-1628位的核苷酸对应于内含子DNA；

第1629-1639位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1660-1693位的核苷酸对应于loxP_RE的DNA序列(TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT(SEQ ID NO:37))；

第1700-2686位的核苷酸对应于包含标记基因的多聚A附加序列的DNA；

第2709-3131位的核苷酸对应于标记基因序列的DNA序列；

第3175-4516位的核苷酸对应于标记基因的启动子序列；

第4544-4577位的核苷酸对应于loxP_LE的DNA序列(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA(SEQ ID NO:38))：

以及第4587-7266位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA序列。

第1446-1628位的核苷酸(内含子DNA)通过剪接被去除，因而第1400-1445位的核苷酸与第1629-1639位的核苷酸相连形成信号肽序列。

在上述载体中，编码期望的氨基酸序列的DNA插入编码信号肽的DNA和loxP_RE的DNA序列之间。

此外，本发明的靶向轻链可变区的基因打靶载体的核苷酸序列的实例显示在SEQ ID NO:18(图23)中。具体而言，本发明提供了包含这样的DNA构建体的打靶载体，所述DNA构建体包含SEQ ID NO:18(特别是第1-6870位的核苷酸序列)。

在图23(SEQ ID NO:18)中，

第1-1868位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA序列(到编码抗体可变区的DNA的起始密码子紧邻前方为止的含有启动子的序列)；

第1869-1914位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1915-2039位的核苷酸对应于内含子DNA；

第2040-2056位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第2085-2118位的核苷酸对应于loxP_LE的DNA：

第2146-3487位的核苷酸对应于标记基因的启动子序列；

第3531-3953位的核苷酸对应于标记基因的DNA；

第3976-4962位的核苷酸对应于包含标记基因的多聚A附加序列的DNA；

第4969-5002位的核苷酸对应于loxP_RE的DNA序列；

以及第5011-6870位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA序列。

第1915-2039位的核苷酸(内含子DNA)通过剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸与第2040-2056位的核苷酸连接形成信号肽序列。

在上述载体中，编码期望的氨基酸序列的DNA被插入编码信号肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之间。

此外，本发明的靶向轻链可变区的基因打靶载体的核苷酸序列的一个实例显示在SEQ ID NO:20(图24)中。具体而言，本发明提供了包含这样的DNA构建体的打靶载体，所述DNA构建体包含SEQ ID NO:20(特别是第1-6861位的核苷酸序列)。

在图24(SEQ ID NO:20)中，

第1-1868位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的5’侧的DNA同源的DNA序列(到编码抗体可变区的DNA的起始密码子紧邻前方为止的含有启动子的序列)；

第1869-1914位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第1915-2039位的核苷酸对应于内含子DNA；

第2040-2056位的核苷酸对应于编码抗体可变区的信号肽的DNA；

第2076-2109位的核苷酸对应于loxP_LE的DNA序列：

第2137-3478位的核苷酸对应于标记基因的启动子序列；

第3522-3944位的核苷酸对应于标记基因的DNA序列；

第3967-4953位的核苷酸对应于标记基因的多聚A附加序列的DNA序列；

第4960-4993位的核苷酸对应于loxP_RE的DNA序列：

以及第5002-6861位的核苷酸对应于与位于抗体生产细胞的编码抗体可变区的DNA的3’侧的DNA同源的DNA序列。

第1915-2039位的核苷酸(内含子DNA)通过剪接被去除，因而第1869-1914位的核苷酸与第2040-2056位的核苷酸相连形成信号肽序列。

在上述载体中，编码期望的氨基酸序列的DNA被插入编码信号肽的DNA和loxP_LE的DNA序列之间。

对用于将本发明的打靶载体导入细胞中的方法没有任何特别的限制。本领域技术人员可以根据所选择的抗体生产细胞选择恰当的基因转移方法。当抗体生产细胞是例如哺乳动物细胞时，方法的实例包括但不限于例如磷酸钙沉淀方法、核微注射、原生质体融合、DEAE-葡聚糖方法、细胞融合、Lipofectamine(GIBCO BRL)方法、脂质体转染方法、使用FuGENE6试剂(Boehringer-Mannheim)的方法，和电穿孔。

本发明的抗体生产细胞可以是任何细胞类型和源自任何动物物种，只要其可以产生抗体。可以使用例如源自人、小鼠、绵羊、大鼠、兔和鸡，及其细胞系和突变细胞系的抗体生产细胞。抗体生产细胞还包括但不限于B细胞、人伯基特氏淋巴瘤细胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B细胞系18-81，和小鼠未成熟B细胞系WEHI-231。抗体生产细胞优选包括源自鸡的B细胞，例如源自鸡抗体生产细胞的DT40和DT40-SW细胞系。DT40细胞系是源自B淋巴瘤的细胞系，其特征是2号染色体三体性(Baba,T.W.,Giroir,B.P.和Humphries,E.H.,Virology 144:139-151,1985)。此外，可以使用野生型DT40细胞系或由本发明人建立的DT40-SW细胞系，后者的抗体突变特征可以通过可逆地开启和关闭控制突变特征的AID基因的表达来调控(开和关)(细节描述在Kanayama,N.,Todo,K.,Reth,M.,Ohmori,H.Biochem.Biophys.Res.Commn.327:70-75(2005)和JP-A(Kokai)2006-109711中)。

本发明的抗体生产细胞还包括通过基因操作而被人为赋予抗体生产能力的细胞。此类具有人为赋予的抗体生产能力的细胞不必能够生产完整的抗体分子。细胞可以具有产生包含抗原结合必需的抗体可变区的抗体片段的能力。细胞可以生产嵌合抗体、人源化抗体或能够结合抗原的非天然分子，或所述分子的片段。

本发明的抗体生产细胞可具有下述特征。

本发明还涉及选择如下所述的细胞的方法，在所述细胞中DNA构建体和抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已经发生了同源重组，其中所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码的期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

可以通过上述方法实现同源重组。发生了重组的细胞可以例如使用标记基因表达作为指标来加以选择。或者，可以利用抗体生产细胞中内源性抗体表达的缺失作为指标来选择细胞。可选的，可以通过组合上述两种指标来选择细胞。但是，选择方法不限于上述实例。

在DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间发生了同源重组的细胞变得不能产生内源性抗体。因此，可以使用细胞表面有无内源性抗体表达作为指标来选择发生了同源重组的细胞。在本发明中，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列的多肽的产生。更具体而言，上述(3)的DNA的存在抑制了包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的多肽的产生。出于该理由，即使当信号肽与包含期望的氨基酸序列的多肽连接以将多肽展示在细胞表面时，只要存在上述(3)的DNA，则包含多肽和抗体恒定区的多肽不会被展示在细胞表面。因此，可以以细胞表面上的抗体分子的有无作为指标，使用抗抗体恒定区的抗体进行检测，来高效地选择发生了同源重组的细胞。利用细胞表面上的抗体分子的有无作为指标的细胞选择可以通过例如流式细胞仪、固定有抗体的磁珠(该抗体特异性结合抗体生产细胞所生产的抗体)等来实施。但是选择方法不限于这些实例。

上述(3)的DNA优选包括药物抗性基因作为标记基因来对细胞生长施加选择压力。此类药物抗性基因包括但不限于，例如抗生素抗性基因，如新霉素磷酸转移酶基因、灭瘟素S脱氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰转移酶基因、组氨醇脱氢酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因。

本发明还涉及用于制备产生多肽的抗体生产细胞的方法。可以通过使用本文描述的方法获得重组细胞，并使用下文所述方法从细胞的基因组DNA中去除下述DNA来制备生产多肽的抗体生产细胞。必要时，所述方法可包括选择已去除了下文所述DNA的细胞的步骤。可以使用多肽的产生作为指标选择已去除了下文所述DNA的细胞。

在本文中，将被去除的DNA是：

抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；更具体而言，

抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

本发明还涉及用于制备产生多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体，允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)通过使位点特异性重组酶在所述细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

在本发明的用于制备产生多肽的抗体生产细胞的方法中，位点特异性重组酶与抗体生产细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列反应，由此，从抗体生产细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA抑制编码期望的氨基酸序列的DNA和编码抗体恒定区的DNA两者或其中一种的转录，从而抑制编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的转录物的正常产生。或者，位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA抑制编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的正常转录剪接，或者抑制所述翻译产物的翻译或加工(例如，折叠)，从而抑制编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA的转录物的正常产生。因此，通过去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，恢复包含期望的氨基酸序列的多肽的产生。当包含期望的氨基酸序列的多肽连接于信号肽时，该多肽被展示在细胞表面或分泌到细胞外。在此情况下，基于细胞表面展示的多肽的有无，评估位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA是否已经被去除。此外，可以通过细胞表面上展示多肽的存在来评估对编码抗体可变区的区域的成功打靶。

在本发明的用于制备产生多肽的抗体生产细胞的方法中，当信号肽被连接于多肽或初始存在于多肽中时，肽被展示在细胞表面或分泌到细胞外。

在本发明的方法中，(i)可以将包含编码抗体重链可变区氨基酸序列作为期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶载体导入到抗体生产细胞中。

此外，(ii)可以将包含编码抗体轻链可变区氨基酸序列作为期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶载体导入到抗体生产细胞中。

在本发明的方法中，当将(i)的载体导入到抗体生产细胞中时，细胞生产这样的抗体，所述抗体包含内源性抗体轻链以及具有内源性抗体重链恒定区和插入到载体中的外源性抗体重链可变区的氨基酸序列的抗体重链。

或者，当将(ii)的载体导入到抗体生产细胞中时，细胞生产这样的抗体，所述抗体包含内源性抗体重链和具有内源性抗体轻链恒定区及插入到载体中的外源性抗体轻链可变区的氨基酸序列的抗体重链。

或者，当将(i)和(ii)的载体导入到抗体生产细胞中时，细胞生产这样的抗体，其包含抗体重链和抗体轻链，所述抗体重链具有内源性抗体重链恒定区的氨基酸序列和插入到(i)的载体中的外源性抗体重链可变区的氨基酸序列，所述抗体轻链具有内源性抗体轻链恒定区的氨基酸序列和插入到(ii)的载体中的外源性抗体轻链可变区的氨基酸序列。

本发明涉及用于制备产生上述抗体的抗体生产细胞的方法。

本发明还提供了用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向表达AID基因的抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体，允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并且能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA。

必要时，本发明的方法可进一步包括下述步骤：

(d)选择已去除了(3)的DNA的细胞。已去除了(3)的DNA的细胞可以使用多肽的产生作为指标来选择。

本发明的打靶载体除上述(1)至(3)的DNA以外，还可包括与抗体基因座的DNA同源的DNA。

此外，当编码期望的氨基酸序列的DNA没有信号肽编码DNA时，可以在基因打靶载体中编码期望的多肽的DNA的5’侧插入编码信号肽的DNA，以增强由该DNA编码的多肽的细胞表面表达或分泌。

“导入了突变的多肽”也可以称为“修饰的多肽”。

突变包括取代、插入、缺失、添加，及其组合。

在本发明的方法中，(i)可以将包含编码抗体重链可变区的氨基酸序列作为期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶载体导入到抗体生产细胞中。

此外，(ii)可以将包含编码抗体轻链可变区的氨基酸序列作为期望的氨基酸序列的DNA的基因打靶载体导入到抗体生产细胞中。

在本发明的方法中，当(i)的载体被导入到抗体生产细胞中时，细胞产生这样的抗体，所述抗体包含内源性抗体轻链，以及具有内源性抗体重链恒定区的氨基酸序列和插入到载体中的外源性抗体重链可变区的氨基酸序列的抗体重链。

或者，当(ii)的载体被导入到抗体生产细胞中时，细胞产生这样的抗体，所述抗体包含内源性抗体重链，以及具有内源性抗体轻链恒定区的氨基酸序列和插入到载体中的外源性抗体轻链可变区的氨基酸序列的抗体轻链。

或者，当(i)和(ii)的载体被导入到抗体生产细胞中时，细胞产生这样的抗体，所述抗体包含抗体重链和抗体轻链，所述抗体重链具有内源性抗体重链恒定区的氨基酸序列和插入到(i)的载体中的外源性抗体重链可变区的氨基酸序列，所述抗体轻链具有内源性抗体轻链恒定区的氨基酸序列和插入到(ii)的载体中的外源性抗体轻链可变区的氨基酸序列。

作为AID基因表达的结果，突变以一定的频率不仅导入到编码内源性抗体可变区氨基酸序列的DNA中，而且还导入到插入到(i)的载体中的编码抗体重链可变区氨基酸序列的DNA中，以及插入到(ii)的载体中的编码抗体轻链可变区氨基酸序列的DNA中。因此，细胞生成在期望的抗体可变区中导入了突变的抗体。

本发明涉及用于制备产生导入了突变的抗体的抗体生产细胞的方法。

在上述用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法中，步骤(a)中(3)的DNA还可以被描述为这样的DNA：其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除。

此外，步骤(c)还可以被描述为通过使位点特异性重组酶在细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

在本发明中，表达AID基因的细胞包括具有内源性AID基因并可以表达该基因的细胞。更具体而言，此类细胞包括鸡B细胞系DT40、人伯基特氏淋巴瘤细胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B细胞系18-81，和小鼠未成熟B细胞系WEHI-231，但不限于此。当细胞表达内源性AID基因时，通过重组向抗体可变区基因座中插入的编码期望的氨基酸序列的DNA中导入突变。

本发明还提供了用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体，允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并且能够从该DNA构建体中被去除的DNA，

其中，在抗体生产细胞中，AID基因表达可以人为地开启和关闭；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA；

(d)开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

在上述用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法中，步骤(d)还可以被描述为：选择细胞表面不展示内源性抗体的细胞的步骤，选择表达标记基因的细胞的步骤，或者选择表达标记基因并在细胞表面不展示内源性抗体的细胞的步骤。

本发明还涉及用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体，允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

其中抗体生产细胞中的内源性AID基因被功能性破坏，且抗体生产细胞包含这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，并且包含外源性AID基因，而且能够被位点特异性重组酶倒位的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过使位点特异性重组酶在所述细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，使位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA倒位，以开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

本发明还涉及用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体，允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够从该DNA构建体中被去除；

其中抗体生产细胞中的内源性AID基因被功能性破坏，且抗体生产细胞包含

DNA构建体，其包含

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间、并能够被位点同一性重组酶倒位、而且包含外源性AID基因的DNA；和

包含在细胞中执行功能的启动子DNA和编码位点特异性重组酶的DNA的DNA构建体，

其中在抗体生产细胞中，位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下被活化，而在缺少胞外刺激的条件下不活化；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过对细胞施加胞外刺激，活化位点特异性重组酶的活性，使位点特异性重组酶在细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，从而从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过应用胞外刺激于细胞，活化位点特异性重组酶的活性，使位点特异性重组酶在步骤(b)选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列反应，使位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA倒位，开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

在本发明的用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法中，当信号肽连接于或初始存在于多肽中时，肽被展示在细胞表面或分泌到细胞外。

在本发明的抗体生产细胞中，可以通过使位点特异性重组酶在细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，调控AID基因表达的有无(可开启和关闭AID基因表达)。因此，可以开始或终止向编码期望的氨基酸序列的DNA中导入突变。当AID基因表达被开启时，导入突变的功能活化，诱变在编码期望的氨基酸序列的DNA中以持续的方式发生。另一方面，当AID基因表达被关闭时，DNA诱变保持被阻断的状态。即，一旦关闭表达，突变的DNA在关闭后不能进一步突变，因此突变得以维持。

有时，在启动AID基因表达后，突变导入到DNA中需要时间。如果在开始AID基因表达后不立即开始DNA诱变，则优选培养细胞一定时间(例如，一个月)。培养条件可以是“40℃，在存在5%CO₂的条件下”，但不限于此。

通过开/关AID基因表达作为调控基因突变的机制，可以将突变导入到编码期望的氨基酸序列的靶DNA中。或者，可以在已经导入某些数量的突变后，阻止DNA中发生进一步的突变事件。

通过使位点特异性重组酶与抗体生产细胞反应，位于位点特异性重组酶识别序列之间的DNA被去除，由此恢复包含期望的氨基酸序列的多肽的产生。通过选择已发生上述过程的细胞，可以获得生产包含期望的氨基酸序列的多肽的抗体生产细胞。此外，通过选择此类细胞，可以获得包含期望的氨基酸序列的多肽和编码所述多肽的DNA。必要时，可以将与位点特异性重组酶反应的细胞培养一定时间，直到细胞产生导入了突变的多肽为止。

同时，本发明的表达AID基因的抗体生产细胞可以是这样的细胞，其中的AID基因表达的有无可以人为调控。此类细胞包括但不限于通过将外源性AID基因导入到不具有内源性AID基因的抗体生产细胞中而制备的细胞，和通过将外源性AID基因导入到具有失活的AID基因的抗体生产细胞中而制备的细胞。可以通过向抗体生产细胞中导入包含AID基因与在细胞内有功能的启动子可操作地连接的DNA的载体，获得导入了外源性AID基因的细胞。本领域技术人员能够想到各种启动子并选择合适的启动子。此类启动子包括但不限于，例如β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、CAG启动子和EF1a启动子。

此外，本发明的抗体生产细胞包括这样的细胞，其内源性AID基因被功能性破坏，并包含DNA构建体，所述DNA构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

包含外源性AID基因，并位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，

其中位于位点特异性重组酶识别序列之间的DNA可以通过位点特异性重组酶倒位。在本文中，DNA构建体有时被称为“外源性AID基因构建体”。

“被功能性破坏的基因”也可以称为“失活的基因”、“被删除的基因”或“被敲除的基因”。基因失活包括基因表达的完全和部分的抑制。

在本文中，基因失活意指基因表达被基因的核苷酸序列中的部分缺失、取代、插入、添加等抑制。“抑制基因表达”还包括表达基因但所产生的蛋白质不具有正常功能的情况。

在本发明中，因为两个等位基因中仅一个是失活的，故可以实现AID基因的杂合敲除(JP 2006-109711；Biochem.Biophys.Res.Commun.327:70(2005))。可以通过例如使用基因打靶载体进行同源重组，来实现AID基因敲除。同源重组是通过使染色体中的基因和外源DNA同源重组来修饰目的基因的方法。基因打靶载体可携带选择标记作为插入物，来鉴别已发生同源重组的细胞。此类选择标记基因包括但不限于抗生素抗性基因如新霉素磷酸转移酶基因、灭瘟素S脱氨酶基因、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因、组氨醇脱氢酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；荧光蛋白基因，例如GFP和DsRed；以及生色酶的基因，例如β-半乳糖苷酶(lacZ)和β-内酰胺酶。可以将多聚A附接于标记基因的3’侧。

本发明的外源性AID基因构建体优选整合到抗体生产细胞的基因组中。对外源性AID基因构建体在基因组中的整合位置没有特殊限定。但是，构建体可以整合到例如内源基因座的一个等位基因中的位置上(JP 2006-109711；Biochem.Biophys.Res.Commun.327:70(2005))。在此情况下，基于例如JP2006-109711的图3中的信息，构建包括这样的DNA构建体的AID基因打靶载体，所述DNA构建体包含这样的DNA，其中在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA与位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的外源AID基因(例如，SEQ ID NO:50(图26)，GeneBank登录号XM 416483)可操作地连接。将该载体导入到细胞中。结果在上述DNA构建体和抗体生产细胞的内源性AID基因之间发生同源重组。由此能够获得基因组中整合了外源性AID基因构建体的抗体生产细胞。

启动子包括但不限于上述启动子。

位于位点特异性重组酶识别序列之间的外源AID基因可以通过位点特异性重组酶的反应倒位。当外源AID基因与启动子DNA按相同的方向放置时，因为启动子DNA与外源AID基因是可操作地连接的，AID基因表达。同时，当外源AID基因相对于启动子DNA按相反的方向放置时，AID基因不表达。

如果内源性AID基因是无活性的，但细胞中存在外源性AID基因构建体，并使位点特异性重组酶与细胞反应，重组酶识别细胞中的位点特异性重组酶识别序列，并使位于两个位点特异性重组酶识别序列之间的区域倒位(即，AID基因相对于启动子的方向由相反的方向变为相同的方向，或由相同的方向变为相反的方向)。

因此，当AID基因相对于启动子的方向由相反的方向变为相同的方向时，AID基因表达从关闭变为开启。相反的，当AID基因相对于启动子的方向由相同的方向变为相反的方向时，AID基因表达从开启变为关闭。

更具体而言，当细胞含有外源性AID基因构建体，且启动子和AID基因在构建体中按相同的方向排列时，通过位点特异性重组酶与细胞的反应，将外源性AID基因的方向反转为相对于启动子相反的方向。这终止AID基因表达，因此停止向由已整合到抗体生产细胞基因组中的、编码期望的氨基酸序列的DNA表达的多肽中导入突变。

如果即使当位点特异性重组酶与细胞反应时，外源性AID基因构建体的外源性AID基因方向也没有反转，则由于AID基因与基因的启动子按相同方向排列，启动子将驱动AID基因构建体表达。

根据本发明，可以通过在位点特异性重组酶与细胞的反应后，选择启动子与AID基因按相同方向排列的细胞，获得产生包含期望的氨基酸序列的多肽的抗体生产细胞。本发明还允许产生包含期望的氨基酸序列的多肽和编码所述多肽的DNA。

或者，当细胞含有外源性AID基因构建体，且启动子和AID基因在构建体中按相反的方向排列时，通过使位点特异性重组酶与细胞反应，将外源性AID基因的方向反转为相对于启动子相同的方向。这启动AID基因表达，由此向由已整合到抗体生产细胞基因组中的、编码期望的氨基酸序列的DNA表达的多肽中导入突变。

如果即使当使位点特异性重组酶与细胞反应时，外源性AID基因构建体的外源性AID基因方向也没有反转，则AID基因仍然维持相对于基因启动子相反的方向排列，启动子介导的AID基因表达仍然终止。

根据本发明，可以通过在位点特异性重组酶与细胞的反应后，选择启动子与AID基因按相同方向排列的细胞，获得产生修饰的多肽的抗体生产细胞。本发明还允许产生编码所述修饰的多肽的DNA。

有利的是，设计含有两个标记基因的外源性AID基因构建体，所述标记基因之一与AID基因方向相同，另一个以相对于AID基因相反的方向插入，因为这允许使用标记基因之一进行选择，不论AID基因相对于启动子放置的方向是相同还是相反的。此类构建体包括具有下列特征的外源性AID基因构建体：

包含从5’至3’端含有下列序列的DNA序列的外源性AID基因构建体：

第一位点特异性重组酶识别序列，

正向的第一标记基因，

反向的第二标记基因，

反向的AID基因，和

第二位点特异性重组酶识别序列。

必须设计构建体使得任一标记基因仅当与启动子排列方向相同时才表达。例如，当使用GFP基因作为上述构建体中的第二标记基因时，优选在第二标记基因和AID基因之间插入IRES序列，以获得高水平的GFP基因表达。例如，可以使用从5’至3’端含有下列序列的DNA构建体：

正向的启动子，

第一位点特异性重组酶识别序列，

正向的第一标记基因，

正向的多聚A附加序列，

反向的多聚A附加序列，

反向的第二标记基因，

反向的IRES序列，

反向的AID基因，和

相对于第一位点特异性重组酶识别序列方向相反的第二位点特异性重组酶识别序列。

在备选的实施方案中，可以使用导入了DNA构建体的细胞，所述构建体中的AID基因位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间。在此情况下，通过位点特异性重组酶的作用切出AID基因，从而该细胞成为不可逆的AID缺陷。为了再次开启细胞中的AID基因表达，需要将AID基因重新导入细胞内，可以使用该方法，因其能够以100%的效率完全关闭AID基因。外源性AID基因构建体可具有多种类型的标记基因，以高效地选择AID基因按特定方向排列的克隆。此类选择标记基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸转移酶基因、灭瘟素S脱氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰转移酶基因、组氨醇脱氢酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；荧光蛋白基因，例如GFP和DsRed；以及生色酶的基因，例如β-半乳糖苷酶(lacZ)和β-内酰胺酶。

当在抗体生产细胞中执行功能的启动子和AID基因在外源性AID基因构建体中按相同方向排列，因而AID基因处于可表达的形式时，设计DNA构建体，将标记基因放置在与AID基因相同的方向，使得标记基因也可以表达。在此情况下，表达标记基因的抗体生产细胞也可以表达AID基因。因此，可以使用标记基因的表达作为指标(基于表型)选择表达AID基因的细胞。

另一方面，当在抗体生产细胞中执行功能的启动子和AID基因在外源性AID基因构建体中按相反方向排列，因而AID基因处于不可表达的状态时，设计DNA构建体，将标记基因放置在与AID基因相反的方向(将标记基因放置在与启动子相同的方向)，使得标记基因可以表达。在此情况下，表达标记基因的抗体生产细胞不表达AID基因。因此，可以使用标记基因的表达作为指标(基于表型)选择没有AID基因表达的细胞。

在本发明中，不论AID基因表达是处于开或者关的状态，都能够选出产生导入了突变的多肽的细胞。从分离的细胞中分离导入了期望的突变的多肽或者编码所述多肽的DNA，并测试看是否为期望的多肽或编码所述多肽的DNA。如果分离的多肽或DNA不是导入了期望的突变的多肽或者编码所述多肽的DNA，而细胞内AID基因表达处于开的状态，则可以进一步培养细胞。随着细胞培养更长的时间，多肽中积累更多的突变。因此，可以从进一步培养的细胞中分离多肽或者编码多肽的DNA，并测试其是否为导入了期望的突变的多肽或编码所述多肽的DNA。

另一方面，如果分离的多肽或DNA不是导入了期望的突变的多肽或者编码所述多肽的DNA，而细胞内AID基因表达处于关的状态，则开启细胞内的AID基因表达。这导致细胞产生进一步导入突变的多肽。可以从细胞中分离导入了突变的多肽或者编码所述多肽的DNA，并测试其是否为导入了期望的突变的多肽或编码所述多肽的DNA。

本发明的方法的实例描述如下。但是，方法不限于该实例。

(1)例如，将本发明的基因打靶载体导入到不表达AID基因的抗体生产细胞中(AID基因表达关闭了的抗体生产细胞)。成功导入了载体的细胞不表达内源性抗体分子。即使将本发明的基因打靶载体导入到表达AID基因的抗体生产细胞中(AID基因表达开启了的抗体生产细胞)，成功导入了载体的细胞也不表达内源性抗体分子。

(2)选择不表达内源性抗体分子的细胞。

(3)然后，使位点特异性重组酶与导入了载体的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列反应。通过重组酶去除位于位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，使细胞表达多肽(包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的嵌合蛋白)。此外，与细胞反应的位点特异性重组酶反转了AID基因在外源性AID基因构建体中的方向。AID基因的倒位导致基因表达(开启AID基因表达)。但是，在一些情况下，可能不发生AID基因的倒位。这导致AID基因的表达开启和关闭的细胞的混合物。

(4)之后，选择生产多肽(包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的嵌合蛋白)和表达AID基因的细胞。或者，选择产生多肽(包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的嵌合蛋白)但不表达AID基因的细胞。当选择后一种细胞时，使位点特异性重组酶与细胞进一步反应。选择通过该处理开启了AID基因表达的细胞。

(5)之后，从所选择的表达AID基因和多肽(包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的嵌合蛋白)的细胞中分离产生具有期望的性质的多肽的细胞。或者，培养所选细胞一定时间，然后从培养细胞中选择产生具有期望的性质的多肽的细胞。可以在分离细胞之前或之后，通过位点特异性重组酶与细胞的反应，关闭AID基因表达。

(6)当没有获得产生具有期望的性质的多肽(包含期望的氨基酸序列和抗体恒定区氨基酸序列的嵌合蛋白)的细胞时，可以在培养细胞一定时间后重复步骤(5)。如果AID基因表达在(5)中关闭，则在培养之前再次开启表达。

(7)可以从分离的细胞中分离DNA，以验证导入到DNA中的突变的存在。

可以使用下文描述的方法分离导入了突变的多肽或编码所述多肽的DNA。可以通过确定导入了突变的多肽的活性或者多肽编码DNA的核苷酸序列，评估导入了突变的多肽或编码所述多肽的DNA是否是感兴趣的。或者，当导入了突变的多肽是抗体、细胞因子或其他时，与抗原或配体的结合活性(特异性、亲和力等)可用作指标，或者当多肽是酶等时，可以使用酶活性作为指标，来测试导入了突变的多肽或编码所述多肽的DNA是否是感兴趣的。

使用上述方法，可以从制备得到的细胞群中分离出产生导入了突变的多肽的克隆。此外，可以通过在所获得的克隆中开启AID基因表达和重复进行诱变，获得产生导入了更多期望的突变的多肽的克隆。

通过使用在所生产的多肽中期望的性质的有无作为指标来筛选，可以选择产生具有期望的性质的多肽的克隆。此类筛选可以在从细胞中分离多肽后进行，或者使用没有分离多肽的细胞进行。在本文中，可以将编码信号肽的DNA插入到在抗体生产细胞中执行功能的DNA和编码期望的氨基酸序列的DNA之间，使得多肽展示在细胞表面或分泌到细胞外。当多肽分泌到细胞外时，可以使用培养上清液实施筛选。在如上所述选择细胞后，可以从细胞中分离DNA，来确定导入到核苷酸序列中的突变。

在本发明中，位点特异性重组酶可以通过例如下述方法与细胞反应。但是，方法不限于这些实例。

(1)将四环素、强力霉素等添加到含有这样的DNA构建体的细胞中，所述构建体中，连接有(或包含)核转位信号的编码位点特异性重组酶的DNA被置于受四环素、强力霉素等调控的启动子3’侧。

*Gossen,M.Bujard,H.(1992)Tight control of gene expression inmammalian cells by tetracycline responsive promoters.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551.

*Gossen,M.,Freundlieb,S.,Bende r,G.,Muller,G.,Hillen,W.Bujard,H.(1995)Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells.Science268:1766-1769.

*Urlinger,S.,Baron,U.,Thellmann,M.,Hasan,M.T.,Bujard,H.Hillen,W.(2000)Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptionalactivators:Novel mutations yield expanded range and sensitivity.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(14):7963-7968.

(2)将用于表达位点特异性重组酶的载体瞬时转染到细胞内。

(3)将连接(或包含)核转位信号的位点特异性重组酶导入到细胞内。

(4)向含有DNA构建体的细胞应用胞外刺激(例如，4-羟泰米芬)，所述构建体包含编码位点特异性重组酶的DNA，所述位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少刺激的条件下不活化。

本发明的抗体生产细胞可含有包含这样的DNA的DNA构建体，所述DNA中，在细胞内有功能的启动子DNA与编码位点特异性重组酶的DNA可操作地连接。在下文中，该DNA构建体有时被称为“位点特异性重组酶基因构建体”。

如上所述，在抗体生产细胞中执行功能的启动子包括但不限于β-肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、巨细胞病毒启动子、CAG启动子和EF1α启动子。

位点特异性重组酶可以是处于这样的形式：在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少刺激的条件下不活化。此类位点特异性重组酶包括，但不限于位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的多肽的融合蛋白。

在本发明的位点特异性重组酶基因构建体中，可将核转位信号插入到位点特异性重组酶的N末端。此外，优选将多聚A附加序列置于编码位点特异性重组酶、或者编码位点特异性重组酶与包含雌激素结合结构域的多肽的融合蛋白的DNA的3’端。

同时，本发明的位点特异性重组酶基因构建体可包括选择标记基因。此类选择标记基因包括但不限于抗生素抗性基因，例如新霉素磷酸转移酶基因、灭瘟素S脱氨酶基因、嘌呤霉素N乙酰转移酶基因、组氨醇脱氢酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因；荧光蛋白基因，例如GFP和DsRed；以及生色酶例如β-半乳糖苷酶(lacZ)和β-内酰胺酶的基因。多聚A可以附接到标记基因的3’端。

只要本发明的雌激素受体具有配体结合活性，则对其没有限制。雌激素受体包括野生型(例如，SEQ ID NO:52和53)和突变的雌激素受体。突变的雌激素受体包括只应答4-羟泰米芬而不应答真正的配体——雌二醇的受体。更具体而言，突变的雌激素受体包括但不限于在第525位包含甘氨酸的氨基酸取代的突变雌激素受体。

当雌激素作为抗体生产细胞来源的物种的性激素时，或者当抗体生产细胞对雌激素具有响应性时，优选使用雌激素结合活性受损的突变雌激素受体。当使用融合蛋白形式的受体时，可以将它的配体结合结构域与位点特异性重组酶融合。

本领域技术人员可以制备突变雌激素受体，例如根据下文所示文件(1)中描述的方法(该文件描述了多种类型的变体的制备)。同时，文件(2)报告了一种在其氨基酸序列的第525位包含精氨酸取代甘氨酸的突变雌激素受体只应答4-羟泰米芬而不应答真正的配体雌二醇。此外，文件(3)和(4)公开了以融合蛋白的形式使用突变雌激素受体的他莫昔芬结合结构域。本领域技术人员可以通过恰当地参考这些文件，制备位点特异性重组酶基因构建体。在本文描述的实施例中，使用Cre重组酶(例如，SEQ ID NO:51(图27))与突变雌激素受体的他莫昔芬结合结构域(SEQ ID NO:40和41(图25))融合的突变雌激素受体。用于实施例中的突变雌激素受体描述在文件(4)(例如，图1)中。

(1)Fawell等人，Characterization and colocalization of steroid binding anddimerization activities in the mouse estrogen receptor.Cell(1990)vol.60(6)pp.95-362

(2)Danielian等人，Identification of residues in the estrogen receptor thatconfer differential sensitivity to estrogen and羟泰米芬.Mol Endocrinol(1993)vol.7(2)pp.232-40

(3)Littlewood等人，A modified oestrogen receptor ligand-binding domainas an improved switch for the regulation of heterologous proteins.Nucleic AcidsRes(1995)vol.23(10)pp.1686

(4)Zhang等人，Inducible site-directed recombination in mouse embryonicstem cells.Nucleic Acids Res(1996)vol.24(4)pp.543-8

本发明的位点特异性重组酶基因构建体包括但不限于具有下文所述结构的构建体(对应于上述文件(4)的图1中示例的构建体)。

包含下列(1)和(2)的DNA的构建体，其中(1)的DNA与(2)的DNA可操作地连接(上述文件(4)的图1a中被称为“pANCreMer”的构建体)：

(1)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)其中下列(i)和(ii)的DNA合框连接的DNA；

(i)编码位点特异性重组酶的DNA，其包含紧邻于起始密码子之后的编码核转位信号的DNA片段；和

(ii)编码雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的多肽的DNA。

包含下列(1)和(2)的DNA的构建体，其中(1)的DNA与(2)的DNA可操作地连接(上述文件(4)的图1b中被称为“pANMerCreMer”的构建体)：

(1)在抗体生产细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)下列(i)和(ii)的DNA按(ii)-(i)-(ii)的顺序从载体DNA链的5’至3’端合框连接的DNA；

(i)编码位点特异性重组酶的DNA，其包含紧邻于起始密码子之后的编码核转位信号的DNA片段；和

(ii)编码雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的多肽的DNA。

优选的是，编码位点特异性重组酶的DNA在其3’端包含多聚A附加序列。

可以通过使用本领域技术人员已知的方法，将制备的位点特异性重组酶基因构建体导入到抗体生产细胞中，获得含有此类位点特异性重组酶基因构建体的细胞。优选地，导入的位点特异性重组酶基因构建体整合到基因组中。

位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少刺激的条件下不活化。

在本文中，“在存在胞外刺激的条件下活化”意指通过刺激，位点特异性重组酶表达成能够转位到细胞核中的活性形式，或者所表达的位点特异性重组酶转位到细胞核中。换言之，意味着位点特异性重组酶变为能够与细胞基因组中的位点特异性重组酶识别序列反应并特异性切割所述识别序列的状态。因此，位点特异性重组酶可以是任何形式，只要编码位点特异性重组酶的DNA响应于刺激而表达或者所述位点特异性重组酶响应于刺激而活化。本领域技术人员可以想到各种用于刺激-响应性表达或激活的调控系统，和从中选择恰当的系统。位点特异性重组酶构建体包括例如这样的DNA构建体，所述构建体中编码雌激素受体或包括其雌激素结合结构域的多肽的基因与位点特异性重组酶cDNA合框连接，使得位点特异性重组酶可以作为与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的多肽的融合蛋白表达(详细内容参见JP-A(Kokai)2006-109711的实施例)。在此情况下，当将胞外刺激施加于细胞时，位点特异性重组酶活化。因此，只有在施加时，位点特异性重组酶才活化(意味着上述融合蛋白转位到细胞核中，因此位点特异性重组酶可以与位点特异性重组酶识别序列反应)，从而使含有AID基因且位于位点特异性重组酶识别序列之间的区域倒位。与此同时，位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的含有启动子DNA和标记基因的DNA被去除。

胞外刺激包括但不限于对雌激素受体或其雌激素结合结构域的刺激。“对雌激素受体或其雌激素结合结构域的刺激”包括但不限于用雌激素(例如，雌二醇)及其衍生物(例如雌激素激动剂4-羟泰米芬)的刺激。

本发明的抗体生产细胞可具有下列(a)和(b)的特征。

(a)在抗体生产细胞中，XRCC3基因的两个等位基因中仅有一个是失活的。

(b)相比具有两个XRCC3基因的等位基因的细胞，导入点突变的频率升高。

对于编码源自抗体生产细胞的蛋白质的DNA，其AID基因介导的诱变主要通过被称为基因转变(conversion)的机制发生。也会发生由单核苷酸取代造成的点突变，但频率很低。同时，已报道了在基因转化突变占主导地位的DT40细胞中转变突变模式的方法，从基因转变(conversion)变为点突变。已知可以通过仅失活两个XRCC3等位基因之一而在细胞中诱导点突变(X射线修复互补缺陷修复，中华仓鼠细胞3中)(JP-A(Kokai)2009-60850)。因此，本发明还包括两个XRCC3等位基因中仅一个失活的抗体生产细胞。

XRCC3是维持染色体稳定性和修复受损DNA的基因，并参与细胞内的同源重组。鸡XRCC3基因具有8个外显子。鸡XRCC3基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:39。SEQ ID NO:39中8个外显子的位置显示如下：

外显子1，第1至215位；

外显子2，第216至284位；

外显子3，第285至422位；

外显子4，第423至635位；

外显子5，第636至790位；

外显子6，第791至1003位；

外显子7，第1004至1050位；和

外显子8，第1051至1935位。

在本发明的抗体生产细胞中，存在于细胞的同源染色体中的两个XRCC3等位基因中仅一个可以被失活。基因的失活如上所述。可以通过例如本领域技术人员已知的方法，如使用上述打靶载体的同源重组方法，来制备基因失活的细胞。

在本发明中，可以分隔鸡XRCC3基因的8个外显子中的任一个。可以分割多个外显子。优选分割第6个外显子。

用于本发明中的抗体生产细胞包括但不限于B细胞、人伯基特氏淋巴瘤细胞系(Ramos、BL2等)、小鼠前B细胞系18-81，和小鼠未成熟B细胞系WEHI-231。抗体生产细胞优选包括源自鸡的B细胞，例如源自鸡抗体生产细胞的DT40和DT40-SW细胞系。

本发明还涉及产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA的方法，包括下述步骤：

(a)通过本文所述的制备抗体生产细胞的方法，制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；和

(b)从步骤(a)的抗体生产细胞中分离编码多肽或导入了突变的多肽的DNA。

可以通过本领域技术人员已知的方法分离DNA。

本发明的产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞包括：

在细胞表面展示多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；

将多肽或导入了突变的多肽分泌到细胞外的抗体生产细胞；和

在细胞质中含有多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞。

本发明还涉及用于产生多肽或导入了突变的多肽的方法，包括下述步骤：

(a)通过本文所述的制备抗体生产细胞的方法，制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；和

(b)从步骤(a)的抗体生产细胞或其分泌材料中分离多肽或导入了突变的多肽。

当抗体生产细胞在细胞表面展示多肽或导入了突变的多肽时，可以通过在溶解膜级分后进行亲和层析来分离多肽。

或者，当抗体生产细胞将多肽或导入了突变的多肽分泌到细胞外时，可以在浓缩培养上清液后进行亲和层析来分离多肽。

或者，当抗体生产细胞的细胞质中含有多肽或导入了突变的多肽时，可以在制备无细胞提取物后通过亲和层析纯化等来分离多肽。

本发明还涉及用于产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA的方法，包括下述步骤：

(a)通过上述生产编码多肽或导入了突变的多肽的DNA的方法，产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA；和

(b)收集由步骤(a)生产的DNA编码的多肽。

一旦获得了编码期望的多肽的DNA，本领域技术人员可以通过公知的方法从DNA制备多肽。此类方法包括但不限于例如这样的方法：将携带DNA作为插入物的基因表达载体导入细胞中，以收集细胞分泌的多肽。

本发明还提供了抗体生产细胞，所述细胞中在包含编码抗体可变区的DNA的区域和DNA构建体之间已经发生了同源重组，其中所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

包含在本发明的细胞中的DNA构建体描述如上。

本发明的细胞可具有本文描述的所有特征。此类细胞包括但不限于下述细胞。

包含下列(a)至(c)或(a)至(d)的DNA构建体的抗体生产细胞，所述细胞中在包含编码抗体可变区的DNA的区域和下列(a)的DNA构建体之间已经发生了同源重组，且所述细胞的内源性AID基因被功能性破坏：

(a)DNA构建体，包括：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)DNA构建体，包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，且其能够通过位点特异性重组酶转位，并包含外源性AID基因；

(c)DNA构建体，包含在细胞中执行功能的启动子DNA和编码位点特异性重组酶的DNA，其中所述位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少刺激的条件下不活化；和

(d)包括这样的XRCC3基因的DNA构建体，其中所述基因的两个等位基因之一中的第6个外显子是失活的。

(c)的DNA构建体还可以被描述为这样的DNA构建体，其包含

在细胞中执行功能的启动子DNA，和编码位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的蛋白质的融合蛋白的DNA。

可以通过上述方法制备此类细胞。

含有上述(a)至(c)的DNA构建体的细胞包括但不限于DT40-SW细胞。

本发明还涉及包含本文中描述的细胞的试剂盒。所述试剂盒可用于例如将编码期望的氨基酸序列的DNA插入到抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域中。或者，所述试剂盒可用于制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞。

本发明的试剂盒除本文描述的细胞外，还可包含本文描述的打靶载体。

本发明还提供了本文描述的打靶载体。本发明还提供了包含本发明的打靶载体的细胞。本发明的细胞可用于例如制备产生导入了突变的多肽的细胞。此类细胞包括但不限于下文所述的细胞。

本发明还提供了包含本发明的打靶载体的试剂盒。本发明的试剂盒可用于让包含编码抗体生产细胞的抗体可变区的DNA的区域与DNA构建体之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

本发明的试剂盒可包括本文中描述的抗体生产细胞。

本发明还提供了包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA。此类DNA可用作构建本发明的基因打靶载体的材料，并可以从鸡来源的抗体生产细胞中分离，例如通过实施例中描述的方法。

本发明中新鉴别的序列是SEQ ID NO:7的核苷酸序列中的第1-3120位和第3882-7891位的核苷酸。

本发明还提供了插入了本发明的DNA的载体。例如，当使用大肠杆菌作为宿主时，对所述载体没有特殊的限制，只要本发明的载体具有供大肠杆菌中复制用的“起点(ori)”(例如，JM109、DH5α、HB101和XL1Blue)以允许在大肠杆菌等中大规模扩增和制备该载体，并且进一步具有用于选择转化的大肠杆菌的基因(例如，允许使用试剂(如青霉素、四环素、卡那霉素和氯霉素)区分的药物抗性基因)即可。此类载体包括例如M13载体、pUC载体、pBR322、pBluescript和pCR-Script。对于cDNA亚克隆和切出，除上述载体外，可以使用例如pGEM-T、pDIRECT和pT7。当使用载体产生由本发明的DNA编码的多肽时，表达载体是特别有效的。例如，当目标是在大肠杆菌中表达时，表达载体需要具有上述用于在大肠杆菌中扩增的性质。此外，当使用大肠杆菌(例如，JM109、DH5α、HB101和XL1-Blue)作为宿主时，载体需要具有用于在大肠杆菌中高效表达的启动子，例如，lacZ启动子(Ward等人，Nature 341,544-546,1989；FASEB J.6,2422-2427,1992)、araB启动子(Better等人，Science240,1041-1043,1988)或T7启动子。除上述载体外，此类载体包括pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(QIAGEN)、pEGFP和pET。

此外，载体可含有用于多肽分泌的信号序列。当产生多肽到大肠杆菌的周质空间中时，可使用pelB信号序列(Lei,S.P.等人，J.Bacteriol.169,4379,1987)作为用于多肽分泌的信号序列。可以通过例如氯化钙方法或电穿孔方法将载体导入到宿主细胞中。

除大肠杆菌载体外，用于表达本发明的DNA的载体包括例如源自哺乳动物(例如，pcDNA3(Invitrogen)、pEGF-BOS(Nucleic Acids Res.18(17),5322,1990)、pEF和pCDM8)、昆虫细胞(例如，“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO-BRL)和pBacPAK8)、植物(例如，pMH1和pMH2)、动物病毒(例如，pHSV、pMV和pAdexLcw)、逆转录病毒(例如，pZIPneo)、酵母(例如，“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11和SP-Q01)和枯草芽孢杆菌(例如，pPL608和pKTH50)的表达载体。

为了在动物细胞(例如CHO、COS和NIH3T3细胞)中表达，载体需要具有在此类细胞中表达必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，(1979)Nature 277:108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，(1990)Nucleic Acids Res.18:5322)或CMV启动子。更优选的，载体具有用于选择转化子的基因(例如，允许使用药物(例如，新霉素和G418)区分的药物抗性基因)。具有此类性质的载体包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。

可以通过本领域技术人员已知的方法，例如电穿孔方法，将本发明的DNA导入到细胞中。

本发明还提供了导入了本发明的DNA或载体的细胞。对导入了本发明的载体的宿主细胞没有特殊的限制。可以使用例如大肠杆菌和各种类型的动物细胞。本发明的宿主细胞可用作例如用于生产和表达本发明多肽的生产系统。多肽生产细胞包括体外和体内系统。此类体外生产系统包括使用真核细胞或原核细胞的系统。

真核细胞，例如动物细胞、植物细胞和真菌细胞，可用作宿主。已知的动物细胞包括例如哺乳动物细胞，例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108:945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa和Vero；两栖动物细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞(Valle等人，(1981)Nature 291,358-340)；和昆虫细胞，例如Sf9、Sf21和Tn5。特别是对于CHO细胞，优选使用DHFR基因缺陷的dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77:4216-4220)和CHO K-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60:1275)。在动物细胞中，CHO优选用于大规模表达。可以将载体导入到宿主细胞中，例如通过磷酸钙方法、DEAE-葡聚糖方法、使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法、电穿孔方法、脂质体转染方法等。

植物细胞包括例如烟草来源的细胞，已知作为多肽生产细胞。可以使用来自这些细胞的愈伤组织培养物。已知的真菌细胞包括酵母细胞，例如酵母属，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和丝状真菌，如曲霉属，包括黑曲霉(Aspergillus niger)。

使用原核细胞的生产细胞包括使用细菌细胞的系统。已知的细菌细胞包括大肠杆菌(例如，JM109、DH5alpha和HB101)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

本说明书引用的所有现有技术文件都通过引用整合到本文中。

实施例

在下文中，将参照实施例具体描述本发明，但本发明的技术范围不应视为局限于此。

本发明人和其他研究小组证实了当目标基因整合到DT40或Ramos细胞的抗体基因的基因座中时，目标基因被突变(Wang,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101,16745-16749(2004)；Kanayama,N.等人，Nucleic Acids Res.34,e10(2006)；Arakawa,H.等人，Nucleic Acids Res.36,e1(2008))。基于上述事实，本发明人认为如果建立用于导入外源基因到具有下列特征的DT40中的系统，可以使用基于DT40的抗体生产系统实现有效的外源抗体亲和力成熟。

(1)在导入的抗体基因中发生突变。

(2)由导入基因编码的抗体表达并展示在细胞表面。

(3)由导入基因编码的抗体表达并分泌到培养上清液中。

抗体基因的基因座包括启动子和下游各外显子，所述各外显子包括：编码前导肽的外显子，前导肽含有靶向内质网所需要的信号；编码可变区的外显子；和编码恒定区的外显子(图1)。在重链中，恒定区包括多个外显子。抗体是以分泌的形式还是以膜结合的形式表达取决于外显子的用法。因此，本发明人认为用于构建具有上述特征的系统的最有效的方法是用外源抗体基因的可变区取代鸡抗体基因座中的可变区外显子(图1A)。本发明人认为，通过用来源于外源抗体的可变区取代重链和轻链基因的可变区，可以制备出抓这样的DT40，其表达具有来源于外源抗体的可变区以及鸡来源的恒定区的嵌合抗体(图2)。

生产表达嵌合抗体的DT40要求如下：

(1)分离和结构解析鸡抗体基因；和

(2)构建用于取代鸡抗体基因座中的可变区外显子的打靶载体。随着基因组分析的进展，抗体轻链基因区域的核苷酸序列是已知的；但是，重链仅有部分信息可用。因此，本发明人分离和测序了未鉴别的抗体重链区域。基于所揭示的信息，本发明人构建了各种用于取代抗体可变区基因的打靶载体，并将它们导入DT40-SW细胞内。但是，发现具有目的修饰基因的细胞的获得效率低于常规的基因敲除。之后，本发明人发现了有效的解决方案，并发现可以只通过本发明的方法建立有效生产嵌合抗体的细胞。此外，本发明人尝试通过使用所制备的细胞的突变机制将突变导入外源抗体基因中，并成功地以可与野生型DT40-SW导入突变到其内源性抗体基因中相比较的效率，将突变导入到抗体基因中。

本发明的实施例详细示例如下。

(1)克隆和分析鸡抗体重链基因

可变区基因上游和下游的基因片段是构建可变区基因打靶载体必需的。对鸡抗体重链基因已进行了一定程度的分析(Reynaud,C-A.等人，Cell 59,171-183(1989)；Kitao,H.,Immunol.Lett.52,99-104(1996)；Kitao,H.等人，Int.Immunol.12,959-968(2000))。但是，对于在可变区基因周围的区域只有极少的信息。抗体重链基因被认为是非常不稳定的(Reynaud,C-A.等人，Cell59,171-183(1989))。但是，原因尚不清楚。在本发明中，鸡抗体重链可变区基因是从DT40制备的基因组DNA文库(由东京大学的Shunichi Takeda博士提供)中分离的。

为了制备探针，通过DNA步移方法分离在抗体重链可变区基因的上游区域。使用KOD-plus DNA聚合酶(TOYOBO)在25微升的反应混合物中进行PCR。在第一轮PCR中，使用针对JH下游区域的引物

(cJH1R1:5'-GGGGTACCCGGAGGAGACGATGACTTCGG-3'；SEQ IDNO:1)作为反义引物，而用不同的序列作为有义引物。使用DT40基因组DNA作为模板，如下进行PCR：进行15个循环的(94℃，15秒；68℃(-0.7℃/循环)，30秒；和68℃，4分)，再进行15个循环的(94℃，15秒；57℃，30秒；和68℃，4分)。第二轮PCR使用5微升的第一轮PCR混合物作为模板，反义引物

(cJH-R:5'-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3'；SEQ ID NO:2)

和与第一轮PCR相同的有义引物。

第二轮PCR进行30个循环的(94℃，15秒；62℃，30秒；和68℃，4分)。PCR使用TdT-2(5'-GGTTCAATGTAGTCCAGTCC-3'；SEQ ID NO:3)作为有义引物，产生约1kb的PCR产物。因此，将产品克隆到pCR-Blunt载体(Invitrogen)中。产品的序列分析揭示了它含有鸡抗体重链VDJ基因序列，以及一段可变区基因上游区域的已知序列((M30319；Reynaud,C-A.等人，Cell59,171-183(1989))，和一段464bp的更上游序列(图19；SEQ ID NO:4)。为了克隆在抗体重链可变区周围的区域中的基因，使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)与上述基因片段作为模板以及有义引物

(CHCupF-Xba:5'-GTGGCCATTCTAGAATTAATTGCACC-3；SEQ IDNO:5)，

和反义引物

(CHCupR-Bam:5'-GGAGGGATCCGGCTTCGTTAGC-3'；SEQ ID NO:6)一起制备DIG标记的探针。

使用上述探针，根据Roche提供的标准规程筛选插入了来自DT40基因组DNA的约20kb片段的λDASH II噬菌体文库。从噬菌体文库中获得了2个阳性克隆(200,000pfu)。将源自两个克隆之一的约20kb的NotI片段亚克隆到pBluescript II SK中。然后，从亚克隆获得含有重链可变区基因及其上游(约3.5kb)和下游(约4.0kb)区域的XbaI-NotI片段(共计约8kbp)。针对XbaI-NotI片段构建限制性酶切图(图3)，并分析序列。结果显示片段含有7891bp的鸡抗体重链基因(图20；SEQ ID NO:7)。发现整个区域，除了可变区基因周围761bp的区域(其包括Reynaud,C-A等人报道的序列(Cell 59,171-183(1989)))之外，是之前尚未报道过的新序列。使用该序列构建用于重链可变区基因的打靶载体。

(2)构建用于重链可变区的基因打靶载体

为了插入外源抗体可变区基因，在信号肽序列周围和JH下游的内含子中导入了限制性位点(图4-6、21和22)。构建了两种打靶载体，它们的导入到信号肽序列中的限制性位点不同。

(VH打靶载体1；图4、5和21)

修饰编码VH基因的第3和第4个氨基酸的密码子，构成PvuII位点(图4A)。这导致所编码的氨基酸对从苏氨酸/亮氨酸变为谷氨酰胺/亮氨酸。此外，用小鼠单克隆抗体中相对频繁使用的谷氨酸取代VH的第1个氨基酸。此外，在JH的下游导入一个SpeI位点。由于PvuII消化产生平末端，将待插入的外源抗体可变区基因的5’端设计为平末端。此外，在JH的3’端附接剪接供体共有序列和SpeI位点(5'-ggtgagtactagt-3'；SEQ ID NO:42)(图4B)。或者，代替SpeI位点，也可以连接AvrII、XbaI或NheI位点到外源抗体可变区基因上，因为用AvrII、XbaI或NheI消化产生与SpeI消化相同的粘性末端。上述设计允许插入多种抗体基因片段。

通过寡核苷酸接头将鸡抗体重链基因的XbaI-NotI片段插入到pBluescriptII SK载体中，所述载体事先用PvuII消化去除多克隆位点(图5A)。使用鸡抗体重链基因作为模板，以及靠近BamHI位点的有义引物

(CHFup 1k-Bam:5'-GTGGGATCCCTAATTAATGTTGGCG-3'；SEQ IDNO:8)

和靠近信号肽序列的反义引物

(CJH4R-PS S:5'-TATTCCGCGGACTAGTACGTCAGCTGAACCTCCGCCATCAGCCCTGTGGGGA-3'；SEQ ID NO:9)

一起制备PCR片段，所述片段含有PvuII、SpeI和SacII位点。用该PCR片段取代小鼠抗体重链基因的BamHI-SacII部分(图5B)。相继去除上游的XbaI-BamHI和下游的XhoI-NotI部分(图5C)。使用接头(5'-CAGATCTGGC-3'；SEQ ID NO:43)导入BglII位点(图5D)。

使用BamHI从pLoxBsr(Arakawa,H.等人，BMC Biotechnol.17(2001))切出含有位于loxP序列之间的β肌动蛋白启动子DNA、灭瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，并插入到BglII位点(图5E)。可以使用其他DNA构建体，只要它们含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因，例如药物抗性基因。对含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因的DNA构建体而言，其相对于靶基因的取向没有限制。对于该实施例中使用的载体，以与抗体重链基因的转录方向相反的方向插入灭瘟素S抗性基因。VH打靶载体1的序列显示在图21(SEQ ID NO:10)中。

(VH打靶载体2；图5、6和22)

为了允许在信号肽的紧邻后方插入外源抗体可变区基因，修饰信号肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位点(图6A)。JH侧的结构与VH打靶载体1的结构相同。当外源抗体基因在不改变结构基因区域的序列的条件下插入到载体中时，在基因的5’端附接上一个SphI位点和一个核苷酸“g”(5'-gcatgcg-3')，在3’末端附接上一段剪接供体共有序列和一个SphI位点(5'-ggtgagtactagt-3'；SEQ ID NO:42)，与VH打靶载体1的情况相同(图6B)。或者，代替SpeI位点，也可以附接AvrII、XbaI或NheI位点到外源抗体可变区基因上，因为用AvrII、XbaI或NheI消化产生与SpeI消化相同的粘性末端。

使用鸡抗体重链基因作为模板，以及用于上游区域的有义引物(VHupF2:5'-TTAGAAGGGGACAAATTAATGAGGAAACACGACTTTGG-3'；SEQ ID NO:11)

和具有SpeI和SphI位点的反义引物(VHupR2:5'-CGACTAGTCCGCATGCAGCCCTGTGGGGAAGGGCAGAGAGCGCTGAC-3'；SEQ ID NO:12)

一起制备基因片段。

在该片段的SfiI和SpeI位点消化片段，并取代VH打靶载体1的VH打靶载体1的片段(图5F)。对含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因的DNA构建体而言，其相对于靶基因的方向没有限制。对于该实施例中使用的载体，按相对于抗体重链基因的转录方向相反的方向插入灭瘟素S抗性基因。VH打靶载体2的序列显示在图22(SEQ ID NO:13)中。

(3)构建用于轻链可变区的基因打靶载体

与抗体重链的情况相同，为了插入外源抗体可变区基因，在信号肽序列周围和JL下游的内含子中导入了限制性位点(图7-9、23和24)。构建了两种打靶载体，它们的导入到信号肽序列中的限制性位点不同。

(VL打靶载体1；图7、8和23)

修饰编码VL基因的第2和第3个氨基酸的密码子，构成HpaI位点(图7A)。这导致所编码的氨基酸对从亮氨酸/苏氨酸变为缬氨酸/天冬氨酸。此外，如上关于VH打靶载体所述，在JL的下游导入SpeI位点。由于HpaI消化产生平末端，将待插入的外源抗体可变区基因的5’端设计为平末端。此外，在JL的3’端附接剪接供体共有序列和SpeI位点(5'-ggtgagtactagt-3'；SEQ ID NO:42)(图7B)。或者，代替SpeI位点，也可将AvrII、XbaI或NheI位点附接到外源抗体可变区基因上，因为用AvrII、XbaI或NheI消化产生与SpeI消化相同的粘性末端。上述设计允许插入多种抗体基因片段。

鸡轻链基因已经被克隆(Reynaud,C.-A.,等人，Cell 40,283-291(1985))，且已经通过基因组分析揭示了基因周围的核苷酸序列(International ChickenGenome Sequencing Consortium,Nature 432,695-716(2004))(图8A)。

因此，利用下述引物，使用从DT40细胞提取的基因组DNA作为模板，通过PCR制备基因片段。使用有义引物(IgLU53:5'-ACGACCCTGGCACCAACAGAGACCTGC-3'；SEQ ID NO:14)和具有HpaI和SpeI位点的反义引物(IgLU32:5'-ACTAGTTGGTTAACCGCTGCCTGCACCAGGGAACCTGGAG-3'；SEQ ID NO:15)扩增抗体轻链可变区基因的5’上游区域。使用具有SpeI和BamHI位点的有义引物(IgLD53:5'-ACTAGTCTCGGATCCTCTTCCCCCATCGTGAAATTGTGAC-3'；SEQ ID NO:16)

和反义引物

(IgLD34:5'-AGCGGGTGGAGCCATCGATGACCCAATCCACAGTCA-3'；SEQ ID NO:17)扩增3’下游区域。

将获得的PCR产物克隆到pCR-Blunt载体(Invitrogen)中。用SacI和SpeI切出5’侧片段，并将其作为插入物插入到含有3’侧片段的载体中(图8B)。使用BamHI切出含有位于loxP序列之间的β肌动蛋白启动子DNA、灭瘟素S抗性基因和多聚A附加序列的DNA片段，或者含有位于loxP序列之间的β肌动蛋白启动子DNA、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因和多聚A附加序列的DNA片段(Arakawa,H.等人，BMC Biotechnol.17(2001))，并插入到SpeI位点下游的BamHI位点中(图8C)。可以使用其他DNA构建体，只要它们含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因，例如药物抗性基因。对于含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因的DNA构建体，其相对于靶基因的方向没有限制。对于该实施例中使用的载体而言，按与抗体重链基因的转录方向相同的方向插入标记基因。VL打靶载体1的序列显示在图23(SEQ ID NO:18)中。

(VL打靶载体2；图8、9和24)

在与VH打靶载体2的情况相同，为了允许在信号肽的紧邻后方插入外源抗体可变区基因，修饰信号肽的末端核苷酸序列，使其具有SphI位点(图9A)。JL侧的结构与VL打靶载体1的结构相同。当外源抗体基因在不改变结构基因区域的序列的条件下插入到载体中时，一个SphI位点和核苷酸“a”(5'-gcatgca-3')被附接到5’端，而一段剪接供体共有序列和SphI位点(5'-ggtgagtactagt-3'；SEQ ID NO:42)被附接到3’端，与VL打靶载体1的情况相同(图9B)。或者，代替SpeI位点，可以将AvrII、XbaI或NheI位点附接到外源抗体可变区基因，因为用AvrII、XbaI或NheI消化产生与SpeI消化相同的粘性末端。

与VL打靶载体1的情况相同，使用DT40的基因组DNA作为模板，以及上述用于5’区域的上游有义引物和具有SpeI和SphI位点的反义引物(IgLU33:5'-GAACTAGTGCTGCATGCACCAGGGAACCTGGAGAGGGAG-3′；SEQID NO:19)一起通过PCR制备基因片段，然后将其克隆到pCR-Blunt载体中。用SacI和SpeI切出克隆的片段，并用它取代VL打靶载体1的SacI-SpeI片段(图8D)。对含有位于loxP序列之间的启动子DNA和标记基因的DNA构建体而言，其相对于靶基因的方向没有限制。对于该实施例中使用的载体，按与抗体轻链基因的转录方向相同的方向插入标记基因。VL打靶载体2的序列显示在图24(SEQ ID NO:20)中。

(4)导入和突变小鼠单克隆抗体可变区基因

作为模型，通过载体将源自小鼠单克隆抗体17.2.25(抗半抗原4-羟基-3-硝基苯基乙酰基(NP))的可变区基因导入到DT40中，评估细胞的抗体表达和突变。

(导入小鼠抗体重链可变区基因)

使用TRIzol(Invitrogen)从产生抗NP IgM抗体的杂交瘤中提取总RNA(Kanayama,N.,等人，J.Immunol.169,6865-6874(2002))，所述杂交瘤是从敲入(knock in)了抗NP单克隆抗体17.2.25的抗体重链的小鼠的脾细胞制备的(准单克隆小鼠，Cascalho,M.,等人，Science 272,1649-(1996))。使用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)和oligo-dT引物从RNA合成cDNA。使用cDNA作为模板，与有义引物(VHTF:5'-GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG-3'；SEQ IDNO:21)和具有SpeI位点的反义引物(VHT-Spe_S:5'-ACTAGTACTCACCTGAGGAGACGGTGACT-3'；SEQ ID NO:22)一起通过PCR扩增抗NP抗体重链可变区(VHT)。用SpeI消化PCR片段，将其插入到用PvuII和SpeI消化的VH打靶载体1中(图10A)。

使用DT40-SW作为用于导入构建的打靶载体的宿主细胞，DT40-SW是通过修饰DT40鸡B细胞系产生的，具有自发导入突变到抗体基因中的能力。DT40-SW具有下列特征。

(i)当导入用于在CMV启动子的控制下表达Cre重组酶/雌激素受体融合蛋白的DNA构建体时，细胞组成型地表达无活性的Cre重组酶/雌激素受体融合蛋白。

(ii)内源性AID基因座的两个等位基因之一是缺陷的，另一个被由CAG启动子表达的AID基因取代，并位于2个按相反方向排列的loxP序列之间。

(iii)AID基因依次连接于与AID基因的方向相同IRES、GFP基因和多聚A附加序列，以及与AID基因的方向相反的多聚A附加序列和嘌呤霉素抗性基因，并插入在2个loxP序列之间。

(iv)当向细胞添加4-羟泰米芬时，(i)的Cre重组酶活化，并使含有位于loxP序列之间的AID基因的(ii)或(iii)的DNA构建体倒位。因此，当AID基因按与CAG启动子相同的方向排列时，AID基因被表达；而当它相对于启动子排列的方向相反时，该基因不表达。

(v)对于表达AID基因的细胞，可以作为表达GFP基因的细胞加以分离，同时，对于不表达AID基因的细胞，可以基于嘌呤霉素抗性基因表达所致的药物抗性(Kanayama,N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.327,70-75；JP-A (Kokai)2006-109711)来加以选择。

通过下列方法将打靶载体转染到DT40-SW中。通过BamHI消化将15微克载体线性化，与1x10⁷个DT40-SW细胞混合。将500微升所获得的悬浮液置入具有4mm狭缝的电穿杯中。使用Gene Pulser Xcell(Bio-Rad)，在550V和25μF下进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞悬浮在10ml生长培养基(PRMI1640(Invitrogen)，10%胎牛血清(Invitrogen)和1%鸡血清(Sigma))中，培养24小时。然后，向细胞中加入10ml的2x选择培养基(补充了灭瘟素S(KakenPharmaceutical Co.)的生长培养基)。灭瘟素S的终浓度是20微克/ml。将细胞等分到96孔板中，培养10至14天。

使用终浓度为20微克/ml的灭瘟素S选择获得16个克隆集落。对形成集落的细胞用藻红蛋白标记的抗鸡IgM小鼠单克隆抗体(Southern Biotechnology)进行染色，并使用FACS Calibur(BD Bioscience)分析。当成功地打靶了基因后，细胞变得不能表达抗体重链。因此，选择5个用抗鸡IgM抗体染色为阴性的克隆。为了在基因水平评估这些克隆，在内源性抗体重链基因的等位基因中，对于从VDJ重组获得的等位基因使用有义引物(cVH1F2:5'-GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3'；SEQ ID NO:23)和反义引物(cJH-R:5'-CTTCGGTCCCGTGGCCCCATGCGTCGAT-3'；SEQ ID NO:2)进行扩增；而对于胚胎等位基因则使用有义引物cVH1F2和反义引物(cVH1内含子-R:5'-TTCACCGCCTTGGGTTGCAACGGTGG-3'；SEQ ID NO:24)加以扩增(图10B)。

基于上述结果，选出了3个不产生与VDJ重组后的内源性重链可变区基因对应的条带的克隆(图10B)。这提示，由VDJ重组获得的等位基因被目的基因打靶了。通过基因组Southern印迹分析验证了打靶效应(图10C)。从每个克隆分离基因组DNA。在EcoRI消化后，将DNA电泳，并转化到Hybond N尼龙膜(GE Healthcare)上。然后，使用DIG标记的用于克隆基因座DNA的基因片段作为探针，进行检测。从分析的3个克隆中，选择了克隆C2和C3，因为它们明显显示出由于插入的标记基因而造成的更长的条带。通过流式细胞术，确认了所选定的克隆如载体设计所预期的那样不产生抗体(图11A)。因此，基于细胞表面缺少抗体表达，可以通过选择已实现了外源基因打靶的细胞，来高效制备导入了目的外源基因的细胞。

(表达小鼠抗体重链可变区)

当如前所述(Kanayama,N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.327,70-75(2005))用50nM 4-羟泰米芬处理这些细胞时，通过流式细胞术发现在细胞表面具有恢复的IgM抗体表达的细胞(图11B)，且所述细胞缺少药物抗性。与该结果一致的是，在Southern印迹分析中可见由于缺少药物抗性基因造成的条带迁移(图10D)。用VHT CDR3-特异性抗独特型大鼠单克隆抗体(R2.438；由T.Imanishi-Kari博士提供)染色细胞(Kanayama,N.等人，J.Immunol.169,6865-6874(2002))(图11C)。

观察到的染色强度与用作阳性对照的整合了VHT的小鼠B细胞的强度是可比较的。因此，证实了细胞表达整合到DT40-SW中的VHT基因。在开启抗体表达后，通过有限稀释亚克隆C2和C3克隆。还通过流式细胞术分析亚克隆的细胞的细胞表面抗体表达(图11D)。从每个克隆分离RNA，并从RNA制备cDNA。基因片段使用引物通过PCR扩增。通过测序分析评估可变区基因和恒定区基因之间的剪接。结果证实，附接在可变区基因的3’端的剪接位点如设计地那样在执行功能，因此可变区基因的外显子和恒定区基因的外显子如预期地彼此连接。换言之，证实了通过上述方法导入的外源抗体重链可变区基因可以正常地转录和翻译，从而表达为与鸡抗体重链恒定区的嵌合抗体。虽然验证了表面的抗体表达，但表达水平略低于野生型。这提示因为轻链源自鸡抗体，所以嵌合抗体的表达效率降低。可能的解决方案是用对应于外源抗体重链的轻链取代所述轻链。

(向小鼠抗体重链可变区中导入突变)

为了分析所制备的VHT表达细胞的VHT基因中的突变，通过使用之前报道过的方法(Kanayama,N.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.327,70-75(2005))开启AID基因表达，激活细胞的突变机制。在用4-羟泰米芬处理细胞后，通过流式细胞仪以单细胞分离GFP⁺细胞(即，对突变关键性的AID表达被开启的细胞)，并培养30天。

从培养的细胞中分离基因组DNA。使用引物CVH1F2(5'-GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3'；SEQ ID NO:25)和CJH1R2(5'-GCCGCAAATGATGGACCGAC-3'；SEQ ID NO:26)，通过PCR扩增重链可变区，并将其克隆到pCR-Blunt载体中。通过测序分析克隆。在C2和C3克隆中观察到突变的频率(图12B和C)可与野生型DT40-SW中的突变频率相比较(图12A)。换言之，验证了上述方法可用于导入突变，由此对导入到DT40的鸡重链可变区基因座中的任意外源抗体的可变区基因进行修饰。可以通过使用VH打靶载体2产生相同的效应。

(导入小鼠抗体轻链可变区基因)

从上述生产抗NP IgM抗体的杂交瘤的总RNA中制备cDNA。使用cDNA作为模板，与针对λ1轻链可变区基因的有义引物mIgVL51(5'-ACTCAGGAATCTGCACTCACCACATCACCT-3'；SEQ ID NO:27)和反义引物mIgVL133(5'-GTTCTAGACACTCACCTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCT-3'；SEQ IDNO:28)一起，扩增λ1可变区基因片段。然后，用XbaI消化片段，并插入到VL打靶载体1的HpaI-SpeI位点中。将15微克载体通过用SacI消化线性化，并通过电穿孔导入到如上所述制备的表达小鼠VHT的克隆C2中。和重链的情况一样，对于来自在灭瘟素S选择下形成的克隆(45个克隆)的细胞，通过流式细胞术评估细胞表面的抗体表达。通过选择缺少抗体表达的细胞，获得了10个阳性克隆。从这10个克隆中选择5个克隆，并从细胞中提取基因组DNA。使用下列上游引物：

IgLU-up(5'-TGCCTGGGGTAAGGGTAGTACTCTGTGC-3'；SEQ ID NO:29)和cJL12(5'-AACGGTAGGGGATCCGAGACTAG-3'；SEQ ID NO:30)，

和下列下游引物：BSR1(5'-GAGAAAGGTAGAAGACCCCAAGGACTTTCCTTCAGAATTGC-3'；SEQ ID NO:31)和

cCL3(5'-GCAGAGTCAGCACTAGTTCAGTGTCGTGTT-3'；SEQ ID NO:32)，

通过PCR评估打靶载体的整合(图13B)。

此外，使用PCR评估针对从VJ重组生成的、并产生的抗体等位基因的打靶，使用引物CVLF6(5'-CAGGAGCTCGCGGGGCCGTCACTGATTGCCG-3'；SEQ ID NO:33)和CVLR3(5'-GCGCAAGCTTCCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG-3'；SEQ ID NO:34)(图13C)。

在成功打靶的细胞中观察到了PCR产物的特异性扩增(图13B)。此外，以由于整合到产生抗体的等位基因中而导致的条带损失作为指标来选择克隆(图13C)。结果显示，在所有的克隆中都实现了用目的基因在期望位置的打靶。此外，证实了细胞表面抗体表达作为筛选目的细胞的指标是非常有效的。

(表达抗体轻链可变区基因)

在导入小鼠λ1到具有小鼠VHT的C2中所制备的细胞中，使用了B4克隆进行下列实验。和重链的情况一样，当用4-羟泰米芬处理这些细胞时，通过流式细胞术发现在细胞表面具有恢复的IgM抗体表达的细胞，并且所述细胞缺少药物抗性(图14)。此外，将抗体表达被开启的B4进行有限稀释，并通过流式细胞术评估细胞中的小鼠λ1链可变区的表达。用预期结合小鼠λ链可变区的生物素化大鼠单克隆抗体(抗-Igλ1、λ2和λ3轻链；克隆R26-46；BD Bioscience)处理细胞，然后用藻红蛋白标记的链霉亲和素将其可视化。结果显示，细胞表达小鼠λ链可变区(图15)。用抗独特型抗体也检测到了VHT的表达。因此，可认为导入的小鼠抗体重链和轻链在细胞表面彼此结合地表达。从每个克隆分离RNA，并从RNA制备cDNA。通过PCR扩增和测序分析所扩增的基因片段，验证导入的可变区基因和恒定区基因之间的剪接。使用引物mIgVL51和cCL3评估嵌合轻链基因的mRNA的生成，而使用引物cVL1和cCL3评估内源性IgL基因的mRNA生成。对克隆B4仅扩增了嵌合的轻链cDNA。该结果证实了附接于外源可变区基因的3’端的剪接位点如设计的那样发挥功能，由此可变区基因和恒定区基因的外显子如预期的那样彼此连接(图16)。使用“actin3”(5'-CTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCCAGC-3'；SEQ ID NO:35)和“actin4”(5'-TTCATGAGGTAGTCCGTCAGGTCACGGCCA-3'；SEQ IDNO:36)扩增β-肌动蛋白基因，作为内标。测序分析揭示了在剪接连接处发生了精确的剪接。使用ELISA，测定导入了小鼠VHT/λ1的B4克隆的培养上清液中的分泌抗体。用山羊抗鸡IgM抗体(Bethyl)包被96孔板。使用HRP-标记的山羊抗鸡IgM抗体(Bethyl)，将培养上清液中生产的抗体的量与DT40-SW生产的抗体量比较。结果显示细胞以可与DT40-SW相比较的水平生产抗体(图17A)。此外，通过前述方法将NP与牛血清白蛋白缀合(Kanayama,N.,等人，J.Immunol.169,6865-6874(2002))，用该缀合物作为抗原包被96孔板。使用HRP-标记的山羊抗鸡IgM抗体检测培养上清液中的抗体的抗原结合。产生VHT/λ1抗体的克隆B4的培养上清液表现出与NP缀合抗原的结合，与阳性对照情况相似(图17B)，阳性对照使用HRP-标记的山羊抗小鼠IgM抗体(Vector)分析产生小鼠抗NP IgM抗体的杂交瘤的上清液。同时，由DT40-SW生产的抗体不结合NP缀合抗原。因此，证实了克隆B4产生NP特异性抗体。换言之，显示了通过上述方法导入的外源抗体重链可变区基因可以正常地转录和翻译成为与鸡抗体轻链恒定区的嵌合抗体。此外，本发明人成功的制备了这样的DT40细胞，其表达保留原始功能的嵌合抗体，其中重链和轻链可变区都被小鼠来源的外源抗体的相应区域取代。

(向小鼠抗体轻链可变区中导入突变)

用4-羟泰米芬处理表达小鼠VHT/λ1的B4和B7克隆的细胞。然后，通过流式细胞术按单细胞分离GFP+细胞(即，对诱变至关重要的AID的表达被开启的细胞)，并培养30天。从培养的细胞中分离基因组DNA。使用引物CVLF6(SEQ ID NO:37)和CVLR3(SEQ ID NO:38)，通过PCR扩增轻链可变区，将其克隆到pCR-Blunt载体中并测序。在B4和B7克隆中观察到突变的频率可与野生型DT40-SW中的突变频率相比较(图18)。

换言之，验证了上述方法可用于导入突变，由此对导入到DT40的鸡轻链可变区基因座中的任意外源抗体的可变区基因进行修饰。可以通过使用VL打靶载体2产生相同的效应。

(5)导入鸡抗体轻链可变区

如下所述制备DT40的抗体轻链可变区基因。自从未开启过突变机制的DT40-SW的总RNA中合成cDNA。使用该cDNA作为模板，与有义引物(cVL1:5'-ACTCAGCCGTCCTCGGTGTCAGCAAACCCGGGA-3'；SEQ ID NO:48)和具有SpeI位点的反义引物(cJL1:5'-CGAGACTAGTTCAGCGACTCACCTAGGACGGTCAG-3'；SEQ ID NO:49)一起通过PCR扩增鸡抗体轻链可变区(cVL)。用SpeI消化所获得的PCR片段，将其插入到VL打靶载体1的HpaI-SpeI位点中(图28A)。通过SacI消化将载体线性化，通过电穿孔导入到DT40-SW细胞中。在电穿孔后，用终浓度为20微克/ml的灭瘟素S进行选择。用藻红蛋白标记的抗鸡IgM小鼠单克隆抗体染色形成集落的细胞(54个克隆)，并使用FACS Calibur分析。为了获得被打靶的细胞，用抗鸡IgM抗体染色来选择变得不能表达抗体重链的细胞(3个克隆)。为了在基因水平评估这些克隆，从细胞中提取基因组DNA，并通过使用引物对IgLU-up和cJL12，以及BSR1和cCL3进行PCR来测试打靶载体的整合(图28B)。此外，使用引物CVLF6和CVLR3进行PCR来评估针对由于VJ重组而产生的等位基因的打靶(图28C)。结果显示，在所有的克隆中均实现了使用目的基因的打靶。

从中选择C2克隆。如上所述，当用4-羟泰米芬处理这些克隆时，通过流式细胞术发现在细胞表面上具有恢复的IgM抗体表达的细胞(图29)。

此外，从开启了抗体表达的细胞中，通过流式细胞术按单细胞分离GFP+细胞(即，对诱变至关重要的AID的表达被开启的细胞)，并培养30天。从培养的细胞中分离基因组DNA。使用引物CVLF6和CVLR3，通过PCR扩增轻链可变区，将其克隆到pCR-Blunt载体中并测序。在导入的鸡抗体轻链可变区基因中观察到突变的频率可与野生型DT40-SW中的突变频率相比较(图30)。换言之，验证了通过上述方法以与野生型基因中可比较的突变频率向DT40的鸡轻链可变区基因中导入了突变。

工业实用性

本发明提供了用于向抗体生产细胞的抗体可变区基因的基因座中导入编码期望的氨基酸序列的DNA的打靶载体。

根据本发明，可以通过将编码包含期望的氨基酸序列的多肽的DNA导入到抗体生产细胞的抗体可变区基因的基因座中，在特定条件下产生期望的多肽。

此外，可以利用抗体生产细胞导入突变的能力来产生导入了突变的多肽。

本发明可用于多肽的功能性修饰。

Claims (59)

1.一种将DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组的方法，包括将包含DNA构建体的打靶载体导入抗体生产细胞中的步骤，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

2.权利要求1的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

3.选择细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；和

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞。

4.权利要求3的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶从DNA构建体中被去除。

5.一种制备产生多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA。

6.权利要求5的方法，其中(3)的DNA抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其中(3)的DNA包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，且(3)的DNA能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

7.权利要求5的方法，其中步骤(a)至(c)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从该细胞的基因组DNA中去除所述位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

8.权利要求5至7中任一项的方法，其中所产生的多肽被展示在所述细胞的表面上，和/或被分泌到所述细胞外。

9.权利要求4、6和7中任一项的方法，其中利用所述标记基因的表达作为指标来选择所述细胞。

10.权利要求3、4、6、7和9中任一项的方法，其中利用所述抗体生产细胞中内源性抗体表达的缺失作为指标来选择所述细胞。

11.一种制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向表达AID基因的抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA。

12.权利要求11的方法，其中步骤(a)至(c)定义如下：

(a)通过向表达AID基因的抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从该细胞的基因组DNA中去除位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA。

13.一种制备产生导入了突变的多肽的抗体生产细胞的方法，包括下述步骤：

(a)通过向抗体生产细胞中导入包含DNA构建体的打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，所述抗体生产细胞中AID基因表达能够被人为开启和关闭，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；和

(c)从步骤(b)中选择的细胞的基因组DNA中去除(3)的DNA；

(d)开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

14.权利要求13的方法，其中步骤(a)至(e)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，其中所述打靶载体包含DNA构建体，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除，其中该抗体生产细胞中的内源性AID基因被功能性破坏，且抗体生产细胞包含这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA，

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够通过位点特异性重组酶倒位，并包含外源性AID基因；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而从该细胞的基因组DNA中去除所述位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过使位点特异性重组酶在步骤(b)中选择的细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应而使所述位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA倒位，以开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

15.权利要求13的方法，其中步骤(a)至(e)定义如下：

(a)通过向抗体生产细胞中导入打靶载体而允许DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间同源重组，

其中所述抗体生产细胞中内源性AID基因被功能性破坏，且该抗体生产细胞包含：

DNA构建体，其包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA，和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够通过位点特异性重组酶倒位，并包含外源性AID基因，和

包含在细胞中执行功能的启动子DNA和编码所述位点特异性重组酶的DNA的DNA构建体，

其中在所述抗体生产细胞中，所述位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在没有该胞外刺激的条件下不活化，

其中所述打靶载体包含DNA构建体，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并且能够通过所述位点特异性重组酶从该DNA构建体中被去除；

(b)选择其中在所述DNA构建体与所述抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域之间已发生同源重组的细胞；

(c)通过对步骤(b)中选择的细胞的胞外刺激活化位点特异性重组酶的活性，使所述位点特异性重组酶在该细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，藉此从该细胞的基因组DNA中去除所述位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA；

(d)通过对步骤(b)选择中细胞的胞外刺激活化位点特异性重组酶的活性，使所述位点特异性重组酶在该细胞的基因组中的位点特异性重组酶识别序列处反应，藉此使所述位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA倒位，以开启和关闭AID基因表达；和

(e)选择表达AID基因的细胞。

16.权利要求11至15中任一项的方法，其中所产生的导入了突变的多肽被展示在所述细胞表面上和/或分泌到所述细胞之外。

17.权利要求11至16中任一项的方法，其中在步骤(b)中利用所述标记基因的表达作为指标选择所述细胞。

18.权利要求11至17中任一项的方法，其中在步骤(b)中利用抗体生产细胞中内源性抗体表达的缺失作为指标选择所述细胞。

19.权利要求15的方法，其中所述位点特异性重组酶是位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的蛋白质的融合蛋白；且其中由能够结合雌激素结合结构域的配体充当所述胞外刺激。

20.权利要求19的方法，其中所述雌激素受体或其雌激素结合结构域是小鼠突变型雌激素受体，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突变型雌激素结合结构域；且其中所述能够结合雌激素结合结构域的配体是4-羟泰米芬。

21.权利要求11至20中任一项的方法，其中所述抗体生产细胞具有下列特性：

(a)在该抗体生产细胞中，XRCC3基因的两个等位基因中仅一个是失活的；和

(b)与具有XRCC3基因的两个等位基因的细胞相比，导入点突变的频率是升高的。

22.权利要求21的方法，其中在XRCC3基因的两个等位基因的任一个中，第6个外显子是失活的。

23.权利要求11至22中任一项的方法，其中该抗体生产细胞是B细胞。

24.权利要求23的方法，其中所述B细胞源自鸡。

25.权利要求2、4、6、7、9、10、12、14和15中任一项的方法，其中所述位点特异性重组酶和位点特异性重组酶识别序列的组合是下列(i)或(ii)：

(i)所述位点特异性重组酶是Cre重组酶，且所述位点特异性重组酶识别序列是loxP序列；

(ii)所述位点特异性重组酶是FLP重组酶，且所述位点特异性重组酶识别序列是FRT序列。

26.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

27.权利要求26的方法，其中所述期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

28.权利要求1至25中任一项的方法，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

29.一种用于产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA的方法，包括下述步骤：

(a)通过权利要求5-8和11-24中任一项的方法制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；和

(b)从步骤(a)制备的抗体生产细胞中分离编码所述多肽或导入了突变的多肽的DNA。

30.一种用于产生多肽或导入了突变的多肽的方法，包括下述步骤：

(a)通过权利要求5-8和11-24中任一项的方法制备产生多肽或导入了突变的多肽的抗体生产细胞；和

(b)从步骤(a)生产的抗体生产细胞中或从来自所述细胞的分泌产物中分离所述多肽或导入了突变的多肽。

31.产生多肽或导入了突变的多肽的方法，包括下述步骤：

(a)通过权利要求29的方法产生编码多肽或导入了突变的多肽的DNA；和

(b)分离由步骤(a)生产的DNA编码的多肽。

32.抗体生产细胞，其中包含编码抗体可变区的DNA的区域与DNA构建体同源重组，所述DNA构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)编码期望的氨基酸序列的DNA；和

(3)抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并能够从该DNA构建体中被去除的DNA。

33.权利要求32的细胞，其中(3)的DNA是这样的DNA：其抑制包含所述期望的氨基酸序列的多肽的产生，并位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，且其包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因，并能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除。

34.权利要求32或33的细胞，其中所述抗体生产细胞表达AID基因。

35.权利要求32或33的细胞，其中所述抗体生产细胞是其中AID基因表达能够被人为开启和关闭的细胞。

36.权利要求35的细胞，其中内源性AID基因被功能性破坏，且该细胞包括这样的DNA构建体，所述DNA构建体包含：

在所述细胞中执行功能的启动子DNA；和

位于两个按相反方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间的DNA，该DNA能够通过位点特异性重组酶倒位，并且包含外源性AID基因。

37.权利要求36的细胞，其中所述抗体生产细胞还包含如下所述的DNA构建体，该DNA构建体包含在所述细胞中执行功能的启动子DNA和编码位点特异性重组酶的DNA，其中该位点特异性重组酶在存在胞外刺激的条件下活化，而在缺少该胞外刺激的条件下不活化。

38.权利要求37的细胞，其中所述位点特异性重组酶是位点特异性重组酶与雌激素受体或包含其雌激素结合结构域的蛋白质的融合蛋白。

39.权利要求38的细胞，其中雌激素受体或其雌激素结合结构域是小鼠突变型雌激素受体，其中氨基酸第525位的甘氨酸被精氨酸取代；或者是其小鼠突变型雌激素结合结构域。

40.权利要求32至39中任一项的细胞，其中所述抗体生产细胞具有下列特性：

(a)在所述抗体生产细胞中，XRCC3基因的两个等位基因中仅一个是失活的；和

(b)与具有XRCC3基因的两个等位基因的细胞相比，导入点突变的频率是升高的。

41.权利要求40的细胞，其中在XRCC3基因的两个等位基因的任一个中，第6个外显子是失活的。

42.权利要求32至41中任一项的细胞，其中所述抗体生产细胞是B细胞。

43.权利要求42的细胞，其中所述B细胞源自鸡。

44.权利要求33和36-39中任一项的细胞，其中所述位点特异性重组酶和位点特异性重组酶识别序列的组合是下列(i)或(ii)：

(i)所述位点特异性重组酶是Cre重组酶，且所述位点特异性重组酶识别序列是loxP序列；

(ii)所述位点特异性重组酶是FLP重组酶，且所述位点特异性重组酶识别序列是FRT序列。

45.权利要求32至44中任一项的细胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

46.权利要求45的细胞，其中所述期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

47.权利要求32至44中任一项的细胞，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

48.包含权利要求32至47中任一项的细胞的试剂盒。

49.一种包含DNA构建体的基因打靶载体，所述构建体包含：

(1)在所述细胞中执行功能的启动子DNA；

(2)包含克隆位点的DNA；和

(3)如下所述的DNA：其能够从所述DNA构建体中被去除，并抑制由插入到

(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生；

其中所述基因打靶载体用于将所述DNA构建体与抗体生产细胞的包含编码抗体可变区的DNA的区域同源重组。

50.权利要求49的载体，其中(3)的DNA是如下所述的DNA：其能够通过位点特异性重组酶从所述DNA构建体中被去除，并抑制由插入到(2)的DNA中的DNA编码的、包含期望的氨基酸序列的多肽的产生，且其位于两个按相同方向排列的位点特异性重组酶识别序列之间，并包含在细胞中执行功能的启动子DNA和标记基因。

51.权利要求49或50的载体，其中编码期望的氨基酸序列的DNA插入到所述克隆位点中。

52.权利要求49-51中任一项的载体，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽包含抗体恒定区的氨基酸序列和期望的氨基酸序列。

53.权利要求52的载体，其中所述期望的氨基酸序列是抗体可变区的氨基酸序列。

54.权利要求49-51中任一项的载体，其中所述包含期望的氨基酸序列的多肽是抗体重链或轻链。

55.包含权利要求49-54中任一项的打靶载体的细胞。

56.包含权利要求49-54中任一项的打靶载体的试剂盒。

57.包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列的DNA。

58.包含权利要求57的DNA的载体。

59.包含权利要求57的DNA或权利要求58的载体的细胞。

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